Mechanismen zur Suppression der experimentellen akuten Graft-versus-Host-Disease

Die Transplantation von allogenen h��matopoetischen Stammzellen stellt f��r viele Patienten mit h��matologischen Erkrankungen, wie beispielsweise akuter Leuk��mie, oftmals die einzige kurative Therapieoption dar. Die Erkennung von Empf��ngerantigenen durch immunkompetente Zellen des Spenders bietet dabei die Basis f��r erw��nschte Graft-versus-Tumor-Effekte, verursacht jedoch h��ufig au��erdem die unerw��nschte Graft-versus-Host Disease (GvHD), eine mitunter schwerwiegende Komplikation. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle Mechanismen zur Hemmung alloreaktiver CD4+ und CD8+ T-Zellen (TZ) und folglich zur Hemmung der akuten GvHD in einem experimentellen GvHD-Modell untersucht, welches auf dem Transfer von allogenen Zellen zwischen MHC-inkompatiblen Mausst��mmen basiert. Die vorliegende Arbeit weist zum Einen darauf hin, dass das Fehlen MyD88- und TRIF-vermittelter Toll-like-Rezeptor-Signale zumindest im Rahmen des hier verwendeten Transplantationsmodells nicht zwingend zu einer Hemmung der akuten GvHD f��hrt. Zum Anderen konnte belegt werden, dass CD4+ CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) kompetente Suppressoren der durch alloreaktive CD4+ und CD8+ TZ ausgel��sten akuten GvHD darstellen. In weiterf��hrenden Experimenten ist gezeigt worden, dass die Tregs sich verschiedener Mechanismen bedienen, um ihre Zielzellen zu inhibieren. Das suppressive Zytokin Interleukin-10 kann als l��slicher Mediator zumindest in vitro offenbar eine Rolle bei der Treg-vermittelten Suppression alloreaktiver TZ spielen. Da jedoch auch Tregs aus Interleukin-10-defizienten Spendern die GvHD-Entstehung in den Empf��ngern abschw��chen konnten, m��ssen noch weitere Mechanismen involviert sein. Es konnte in einer gemischten Leukozyten Reaktion in vitro eine zellkontaktabh��ngige Kommunikation mittels gap junctions haupts��chlich zwischen den Tregs und den allogenen Dendritischen Zellen (DCs) nachgewiesen werden, welche prinzipiell den Transfer von cAMP m��glich macht. Die Kommunikation zwischen Tregs und DCs resultierte in einem supprimierten Ph��notyp der DCs, gekennzeichnet durch eine verminderte Expression kostimulatorischer Molek��le auf ihrer Oberfl��che. Solche supprimierten DCs k��nnen als Folge die alloreaktiven Spender-TZ vermutlich nicht aktivieren. Das cAMP-erh��hende Rolipram konnte in einer gemischten Leukozyten Reaktion in vitro die Proliferation alloreaktiver CD4+ und CD8+ TZ hemmen. Daneben konnte die Treg-vermittelte Suppression alloreaktiver TZ und der GvHD in vivo durch die zus��tzliche Verabreichung von Rolipram noch gesteigert werden. Im letzten Kapitel dieser Arbeit wurde beschrieben, dass die alleinige Aktivierung alloreaktiver CD8+ TZ ausreichend ist, um eine akute GvHD auszul��sen. In diesem Zusammenhang konnte nachgewiesen werden, dass CD4+ CD25+ Tregs die akute GvHD auch in einer scheinbar MHC-II-unabh��ngigen Weise hemmen k��nnen. Zusammenfassend belegt die vorliegende Arbeit, dass Tregs in einem MHC-inkompatiblen Transplantationsmodell alloreaktive CD4+ und CD8+ TZ und folglich die Entstehung einer GvHD effizient hemmen k��nnen. Bei der Hemmung der GvHD kommen wahrscheinlich verschiedene Mechanismen zum Tragen. Zumindest in vivo scheint von Tregs produziertes Interleukin-10 eine untergeordnete Rolle bei der Suppression alloreaktiver TZ und der GvHD zu spielen, hierbei steht vermutlich vielmehr der cAMP-abh��ngige Suppressionsmechanismus im Vordergrund.

Exploring the function of IL-10, BTLA and DCs as regulators of immune responses

This thesis focuses on different aspects of immune regulation, both at the cellular and molecular levels. More specifically, this work concentrates on the importance of Interleukin-10, B and T Lymphocyte Attenuator (BTLA), and dendritic cells in respect to immune regulation, with special emphasis on autoimmunity. In this thesis, we show that the cellular source of IL10 production can dramatically influence the outcome of an autoimmune response. We show that T cell-derived IL10 plays an important role in controlling the viability of recently activated T cells, allowing them to become fully functional T effector cells. T cell-specific IL10-deficient mice failed to induce EAE when immunized with MOG peptide. Furthermore, when re-challenged with MOG or other stimuli, these T cells exhibited increased apoptosis rates. Here we report for the first time the generation of a novel mouse model that allows the conditional over-expression of BTLA. We show that BTLA can negatively regulate CD4+ T cells responses, when expressed by the T cells themselves. BTLA over-expression by CD8+ T cells or dendritic cells, however, resulted in enhanced viral clearance. In this study, we show that depletion of DCs, either early on from birth or later in adulthood, does not prevent EAE induction, but instead leads to a lower state of tolerance and stronger immune response. We also show that DCs are responsible for the upregulation of PD-1 on antigen-specific T cells and subsequently induce the formation of Tregs during immune responses.

In vivo konditionale Depletion von latentem murinen Cytomegalovirus

Die Lunge stellt einen Hauptort der CMV-Latenz dar. Die akute CMV-Infektion wird durch infiltrierende antivirale CD8 T-Zellen terminiert. Das virale Genom verbleibt jedoch im Lungengewebe in einem nicht replikativen Zustand, der Latenz, erhalten. Es konnte bereits gezeigt werden, dass w��hrend der Latenz die Major Immediate Early- (MIE) Gene ie1- und ie2 sporadisch transkribiert werden. Bisher konnte diese beginnende Reaktivierung latenter CMV-Genome nur in einer Momentaufnahme gezeigt werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001; Simon et al., 2005; zur ��bersicht: Reddehase et al., 2008). Die sporadische Expression der MIE-Gene f��hrt jedoch zur Pr��sentation eines antigenen IE1-Peptids und somit zur Stimulation antiviraler IE1-Peptid-spezifischer CD8 T-Zellen, die durch ihre Effektorfunktion die beginnende Reaktivierung wieder beenden. Dies f��hrte uns zu der Hypothese, dass MIE-Genexpression ��ber einen Zeitraum betrachtet (period prevalence) h��ufiger stattfindet als es in einer Momentaufnahme (point prevalence) beobachtet werden kann.rnrnUm die H��ufigkeit der MIE-Genexpression in der Dynamik in einem definierten Zeitraum zu erfassen, sollte eine Methode entwickelt werden, welche es erstmals erm��glicht, selektiv und konditional transkriptionell aktive Zellen sowohl w��hrend der akuten Infektion als auch w��hrend der Latenz auszul��schen. Dazu wurde mit Hilfe der Zwei-Schritt BAC-Mutagenese ein rekombinantes death-tagged Virus hergestellt, welches das Gen f��r den Diphtherie Toxin Rezeptor (DTR) unter Kontrolle des ie2-Promotors (P2) enth��lt. Ist der P2 transkriptionell aktiv, wird der DTR an der Zelloberfl��che pr��sentiert und die Zelle wird suszeptibel f��r den Liganden Diphtherie Toxin (DT). Durch Gabe von DT werden somit alle Zellen ausgel��scht, in denen virale Genome transkriptionell aktiv sind. Mit zunehmender Dauer der DT-Behandlung sollte also die Menge an latenten viralen Genomen abnehmen.rnrnIn Western Blot-Analysen konnte das DTR-Protein bereits 2h nach der Infektion nachgewiesen werden. Die Pr��sentation des DTR an der Zelloberfl��che wurde indirekt durch dessen Funktionalit��t bewiesen. Das rekombinante Virus konnte in Fibroblasten in Gegenwart von DT nicht mehr replizieren. In akut infizierten Tieren konnte die virale DNA-Menge durch eine einmalige intraven��se (i.v.) DT-Gabe signifikant reduziert werden. Verst��rkt wurde dieser Effekt durch eine repetitive i.v. DT-Gabe. Auch w��hrend der Latenz gelang es, die Zahl der latenten viralen Genome durch repetitive i.v. und anschlie��ende intraperitoneale (i.p.) DT-Gabe zu reduzieren, wobei wir abh��ngig von der Dauer der DT-Gabe eine Reduktion um 60\% erreichen konnten. Korrespondierend zu der Reduktion der DNA-Menge sank auch die Reaktivierungsh��ufigkeit des rekombinanten Virus in Lungenexplantatkulturen. rnrnrnUm die Reaktivierungsh��ufigkeit w��hrend der Latenz berechnen zu k��nnen, wurde durch eine Grenzverd��nnungsanalyse die Anzahl an latenten viralen Genomen pro Zelle bestimmt. Dabei ergab sich eine Kopienzahl von 9 (6 bis 13). Ausgehend von diesen Ergebnissen l��sst sich berechnen, dass, bezogen auf die gesamte Lunge, in dem getesteten Zeitraum von 184h durch die DT-Behandlung 1.000 bis 2.500 Genome pro Stunde ausgel��scht wurden. Dies entspricht einer Ausl��schung von 110 bis 280 MIE-Gen-exprimierenden Lungenzellen pro Stunde. Damit konnte in dieser Arbeit erstmals die Latenz-assoziierte Genexpression in ihrer Dynamik dargestellt werden.rn

An interferon regulatory factor element controls the major immune modulator of murine cytomegalovirus

Immune modulation by herpesviruses, such as cytomegalovirus, is critical for the establishment of acute and persistent infection confronting a vigorous antiviral immune response of the host. Therefore, the action of immune-modulatory proteins has long been the subject of research, with the final goal to identify new strategies for antiviral therapy.rnIn the case of murine cytomegalovirus (mCMV), the viral m152 protein has been identified to play a major role in targeting components of both the innate and the adaptive immune system in terms of infected host-cell recognition in the effector phase of the antiviral immune response. On the one hand, it inhibits cell surface expression of RAE-1 and thereby prevents ligation of the activating natural killer (NK)-cell receptor NKG2D. On the other hand, it decreases cell surface expression of peptide-loaded MHC class I molecules thereby preventing antigen presentation to CD8 T cells. Ultimately, the outcome of CMV infection is determined by the interplay between viral and cellular factors.rnIn this context, the work presented here has revealed a novel and intriguing connection between viral m152 and cellular interferon (IFN), a key cytokine of the immune system: rnthe m152 promoter region contains an interferon regulatory factor element (IRFE) perfectly matching the consensus sequence of cellular IRFEs.rnThe biological relevance of this regulatory element was first suggested by sequence comparisons revealing its evolutionary conservation among various established laboratory strains of mCMV and more recent low-passage wild-derived virus isolates. Moreover, search of the mCMV genome revealed only three IRFE sites in the complete sequence. Importantly, the functionality of the IRFE in the m152 promoter was confirmed with the use of a mutant virus, representing a functional deletion of the IRFE, and its corresponding revertant virus. In particular, m152 gene expression was found to be inhibited in an IRFE-dependent manner in infected cells. Essentially, this inhibition proved to have a severe impact on the immune-modulatory function of m152, first demonstrated by a restored direct antigen presentation on infected cells for CD8 T-cell activation. Even more importantly, this effect of IRFE-mediated IFN signaling was validated in vivo by showing that the protective antiviral capacity of adoptively-transferred, antigen-specific CD8 T cells is also significantly restored by the IRFE-dependent inhibition of m152. Somewhat curious and surprising, the decrease in m152 protein simultaneously prevented an enhanced activation of NK cells in acute-infected mice, apparently independent of the RAE-1/NKG2D ligand/receptor interaction but rather due to reduced ���missing-self��� recognition.rnTaken together, this work presents a so far unknown mechanism of IFN signaling to control mCMV immune modulation in acute infection.rnrn

Untersuchung von T-Zell-vermittelten Immunantworten in der murinen und humanen kutanen Leishmaniasis

F��r die Ausheilung von L. major-Infektionen ist eine effektive Th1-/Tc1-Antwort unerl��sslich. Dennoch sind bis heute nicht alle Mechanismen der sch��tzenden Immunabwehr beim Menschen und in der Maus endg��ltig gekl��rt. Deshalb bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit darin, Th1-/Tc1-Antworten und damit die Schnittstelle zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem eingehender zu untersuchen. F��r diesen Ansatz wurde zun��chst der Einfluss des genetischen Hintergrundes auf den Verlauf der Infektion anhand von BALB/c- und C57BL/6-Zellen analysiert. Als entscheidender Faktor f��r Heilung und Suszeptibilit��t wurde mit Hilfe von Knochenmarkschim��ren die Herkunft der T und/oder B Zellen identifiziert. Erst die Aktivierung durch Th1-/Tc1-Zellen versetzt L. major-infizierte Makrophagen in die Lage, die intrazellul��ren Parasiten abzut��ten. In diesem Aktivierungsprozess spielt die TNF-induzierte Signalweiterleitung ��ber den TNF-Rezeptor 1 (TNF-R1) eine wichtige Rolle. TNF-R1 ist mit dem Signalmolek��l FAN assoziiert. In dieser Arbeit konnte anhand von M��usen, denen FAN fehlt, die Involvierung dieses Molek��ls in der Induktion eines Th1-Zytokinsprofils und in der Kontrolle der Parasitenzahl sowie der lokalen Begrenzung der Infektion gezeigt werden. Weiterhin wurde unter Verwendung immundefizienter M��use die Realisierbarkeit eines PBMC-Transfermodells gepr��ft. Ein solches wird zur Validierung an M��usen gewonnener Erkenntnisse und als pr��klinisches Testsystem der humanen kutanen Leishmaniasis dringend ben��tigt. In allen getesteten St��mmen lie�� sich durch den Transfer humaner PBMC die L. major-Infektion beeinflussen. Humane CD4+ und CD8+ T-Zellen waren an den Infektionsstellen pr��sent und es konnten antigenspezifische Immunreaktionen nnachgewiesen werden. Das PBMC-Transfermodell konnte durch die Transplantation humaner Haut auf immundefiziente M��use zus��tzlich entscheidend verbessert werden. In diesen Transplantaten lie��en sich L. major-Infektionen etablieren und durch zus��tzlichen Transfer von PBMC die Zahl humaner CD45+ Zellen an der Infektionsstelle deutlich steigern. In ihrer Gesamtheit tr��gt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verst��ndnis der Determinanten von Heilung und Suszeptibilit��t der kutanen Leishmaniasis bei und zeigt neue Ansatzpunkte f��r eine Beeinflussung des Krankheitsverlaufes auf. Die Etablierung eines pr��klinischen Testmodells der humanen Leishmaniasis ist entscheidend, um das Wissen ��ber die murine Leishmaniasis auf die humane Erkrankung zu ��bertragen. So kann dem dauerhaften Problem der Entwicklung von Vakzinen an M��usen, die keine Wirksamkeit gegen die humane Erkrankung zeigen, begegnet werden. Ein vollst��ndig etabliertes Modell wird es erm��glichen, der humanen Erkrankung zugrundeliegende Mechanismen zu untersuchen und Patienten-spezifisch aber auch allgemeing��ltig Vakzinierungs-Ans��tze und Therapien unter experimentellen Bedingungen zu testen.

Pr��klinische Evaluierung von therapeutischer Vakzinierung zur Effizienzsteigerung der adoptiven Immuntherapie von Cytomegalovirus-Erkrankungen

Klinische Manifestationen einer Cytomegalovirus (CMV)-Infektion gef��hrden den therapeutischen Erfolg der h��matopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT). Dabei stellt insbesondere die Reaktivierung von latentem CMV im HSCT-Rezipienten das h��ufigste Infektionsrisiko dar. Die Inzidenz der CMV-Erkrankung kann durch Rekonstitution adoptiv transferierter CMV-spezifischer CD8 T-Zellen im HSCT-Rezipienten reduziert werden. Das Modell der sogenannten adoptiven Immuntherapie wurde zun��chst im murinen Modell entwickelt und bereits in klinischen Studien best��tigt. Jedoch ist der adoptive Transfer (AT) aufgrund der nur limitiert zur Verf��gung stehenden therapeutisch effektiven Zellzahlen zurzeit in der klinischen Routine nicht einsetzbar.rnZiel dieser Arbeit war daher die pr��klinische Evaluierung einer Kombinationstherapie aus AT einer limitierten Anzahl CMV-spezifischer T-Zellen und deren in vivo Expansion durch therapeutische Vakzinierung nach HSCT. Zur Testung dieser Therapie wurde ein murines Modell auf der Grundlage von rekombinanten murinen CMV (mCMV) und rekombinanten HCMV Dense Bodies (DB) etabliert. Beide exprimieren das gut charakterisierte MHC-Klasse-I Kb-restringierte SIINFEKL-Peptid (OVA257-264) des Ovalbumins (OVA) bzw. die Funktions-verlustmutante SIINFEKA als Modellantigen. In den rekombinanten mCMV, mCMV-��m157Luc/m164-SIINFEKL/-A (mCMV-SIINFEKL/-A), wurde mittels orthotopen Peptid-austauschs das m164257-265 Peptid des gp36,5/m164 Proteins deletiert und durch das SIINFEKL- bzw. SIINFEKA-Peptid ersetzt. Anhand von Priming-Analysen konnte gezeigt werden, dass nach Infektion von C57BL/6 M��usen mit mCMV-SIINFEKL SIINFEKL-spezifische T-Zellen nachweisbar sind und das im CMV-Genom integrierte SIINFEKL funktional prozessiert und pr��sentiert wird. Parallel hierzu konnte nach Immunisierung mit DB-SIINFEKL in vivo ein SIINFEKL-spezifisches CD8 T-Zell-Priming induziert werden. In weiteren Experimenten konnte nach DB-SIINFEKL-Immunisierung im poplitealen Lymphknoten sowie in der Milz eine Proliferation von adoptiv transferierten CD8 T-Zellen beobachtet werden. Die anschlie��enden Challenge-Versuche zeigten, dass eine DB-SIINFEKL-Immunisierung epitopspezifisch vor einer hoch dosierten Challenge-Infektion mit mCMV-SIINFEKL sch��tzt. Im AT-Modell konnte gezeigt werden, dass adoptiv transferierte OT-I Zellen h��matoablativ behandelte Rezipienten epitopspezifisch vor einer mCMV-SIINFEKL-Infektion sch��tzen k��nnen, wobei der erzielte Schutz durch zus��tzliche Vakzinierung mit DB-SIINFEKL deutlich verbessert werden konnte. Im Anschluss konnte im HSCT-Rezipienten erstmals eine durch zus��tzliche Vakzinierung signifikante Verbesserung des protektiven Potenzials adoptiv transferierter OT-I Zellen best��tigt werden. Diese Verst��rkung der Protektion erm��glicht die Reduktion der Anzahl der f��r den Schutz ben��tigten Zellzahl und erh��ht damit die Effizienz der adoptiven Immuntherapie.

Generation of FLT3-ITD-reactive T-cell populations from different sources

Approximately 25% of acute myeloid leukemias (AMLs) carry internal tandem duplications (ITD) of various lengths within the gene encoding the FMS-like tyrosine kinase receptor 3 (FLT3). Although varying duplication sites exist, most of these length mutations affect the protein��s juxtamembrane domain. FLT3-ITDs support leukemic transformation by constitutive phosphorylation resulting in uncontrolled activation, and their presence is associated with worse prognosis. As known form previous work, they represent leukemia- and patient-specific neoantigens that can be recognized by autologous AML-reactive CD8+ T cells (Graf et al., 2007; Graf et al., unpublished). Herein, in patient FL, diagnosed with FLT3-ITD+ AML and in first complete remission after induction chemotherapy, T cells against her leukemia��s individual FLT3-ITD were detected at a frequency up to 1.7x10-3 among peripheral blood CD8+ T lymphocytes. This rather high frequency suggested, that FLT3-ITD-reactive T cells had been expanded in vivo due to the induction of an anti-leukemia response.rnrnCell material from AML patients is limited, and the patients�� anti-leukemia T-cell repertoire might be skewed, e.g. due to complex previous leukemia-host interactions and chemotherapy. Therefore, allogeneic sources, i.e. buffy coats (BCs) from health donors and umbilical cord blood (UCB) donations, were exploited for the presence and the expansion of FLT3-ITD-reactive T-cell populations. BC- and UCB-derived CD8+ T cells, were distributed at 105 cells per well on microtiter plates and, were stimulated with antigen-presenting cells (APCs) transfected with in vitro-transcribed mRNA (IVT-mRNA) encoding selected FTL3-ITDs. APCs were autologous CD8- blood mononuclear cells, monocytes or FastDCs.rnrnBuffy coat lymphocytes from 19 healthy individuals were analyzed for CD8+ T-cell reactivity against three immunogenic FLT3-ITDs previously identified in patients VE, IN and QQ and designated as VE_, IN_ and QQ_FLT3-ITD, respectively. These healthy donors carried at least one of the HLA I alleles known to present an ITD-derived peptide from one of these FLT3-ITDs. Reactivities against single ITDs were observed in 8/19 donors. In 4 donors the frequencies of ITD-reactive T cells were determined and were estimated to be in the range of 1.25x10-6 to 2.83x10-7 CD8+ T cells. These frequencies were 1,000- to 10,000-fold lower than the frequency of autologous FLT3-ITD-reactive T cells observed in patient FL. Restricting HLA I molecules were identified in two donors. In one of them, the recognition of VE_FLT3-ITD was found to be restricted by HLA-C*07:02, which is different from the HLA allele restricting the anti-ITD T cells of patient VE. In another donor, the recognition of IN_FLT3-ITD was restricted by HLA-B*35:01, which also had been observed in patient IN (Graf et al., unpublished). By gradual 3��-fragmentation of the IN_FLT3-ITD cDNA, the 10-mer peptide CPSDNEYFYV was identified as the target of allogeneic T cells against IN_FLT3-ITD. rnLymphocytes in umbilical cord blood predominantly exhibit a na��ve phenotype. Seven UCB donations were analyzed for T-cell responses against the FLT3-ITDs of patients VE, IN, QQ, JC and FL irrespective of their HLA phenotype. ITD-reactive responses against all stimulatory FLT3-ITDs were observed in 5/7 UCB donations. The frequencies of T cells against single FLT3-ITDs in CD8+ lymphocytes were estimated to be in the range of 1.8x10-5 to 3.6x10-6, which is nearly 15-fold higher than the frequencies observed in BCs. Restricting HLA I molecules were identified in 4 of these 5 positive UCB donations. They were mostly different from those observed in the respective patients. But in one UCB donation T cells against the JC_FLT3-ITD had exactly the same peptide specificity and HLA restriction as seen before in patient JC (Graf et al., 2007). Analyses of UCB responder lymphocytes led to the identification of the 10-mer peptide YESDNEYFYV, encoded by FL_FLT3-ITD, that was recognized in association with the frequent allele HLA-A*02:01. This peptide was able to stimulate and enrich ITD-reactive T cells from UCB lymphocytes in vitro. Peptide responders not only recognized the peptide, but also COS-7 cells co-transfected with FL_FLT3-ITD and HLA-A*02:01.rnrnIn conclusion, T cells against AML- and individual-specific FLT3-ITDs were successfully generated not only from patient-derived blood, but also from allogeneic sources. Thereby, ITD-reactive T cells were detected more readily and at higher frequencies in umbilical cord blood than in buffy coat lymphocytes. It occurred that peptide specificity and HLA restriction of allogeneic, ITD-reactive T cells were identical to autologous patient-derived T cells. As shown herein, allogeneic, FLT3-ITD-reactive T cells can be used for the identification of FLT3-ITD-encoded peptides, e.g. for future therapeutic vaccination studies. In addition, these T cells or their receptors can be applied to adoptive transfer.

Charakterisierung der Latenz des murinen Cytomegalovirus in vivo

Die prim��re, produktive Cytomegalovirus (CMV)-Infektion wird im immunkompetenten Patienten effizient durch antivirale CD8+ T-Zellen kontrolliert. Das virale Genom besitzt jedoch die F��higkeit, in einem nicht replikativen, Latenz genannten Zustand, in gewissen Zelltypen zu persistieren, ohne dass infekti��se Nachkommenviren produziert werden. Die molekularen Mechanismen, welche der Etablierung und Aufrechterhaltung der Latenz zugrundeliegen, sind noch weitestgehend unbekannt. Es gibt Hinweise darauf, dass zellul��re Verteidigungsmechanismen die Zirkularisierung und Chromatinisierung viraler Genome hervorrufen und dadurch die virale Genexpression gr����tenteils verhindert wird (Marks & Spector, 1984; Reeves et al., 2006).rnAllerdings liegen die Genome nicht in einem komplett inaktiven Zustand vor. Vielmehr konnte f��r das murine CMV (mCMV) bereits die sporadische Transkription der Gene ie1 und ie2 w��hrend der Latenz nachgewiesen werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001).rnIn der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende in vivo Latenz-Analyse zur Charakterisierung der viralen Transkription in einer Kinetik anhand der alle drei kinetischen Klassen repr��sentierenden Transkripte IE1, IE3, E1, m164, M105 und M86 vorgenommen.rnNach Latenz-Etablierung, verifiziert durch Abwesenheit von infekti��sem Virus, konnten alle getesteten Transkripte in der Lunge quantifiziert werden. Interessanterweise war die transkriptionelle Aktivit��t zu keinem Analyse-Zeitpunkt mit der klassischen IE-E-L-Kinetik der produktiven Infektion kompatibel. Stattdessen lag eine stochastische Transkript-Expression vor, deren Aktivit��t mit voranschreitender Zeit immer weiter abnahm.rnW��hrend der Latenz exprimierte Transkripte, die f��r antigene Peptide kodieren, k��nnen infizierte Zellen f��r das Immunsystem sichtbar machen, was zu einer fortw��hrenden Restimulation des memory T-Zell-pools f��hren w��rde. Durch zeitgleiche Analyse der Transkript-Expression, sowie der Frequenzen Epitop-spezifischer CD8+ T-Zellen w��hrend der Latenz (IE1, m164, M105), wurde eine m��glicher Zusammenhang zwischen der transkriptionellen Aktivit��t und der Expansion des memory T-Zell-pools untersucht. Die weitere Charakterisierung von Subpopulationen der Epitop-spezifischen CD8+ T-Zellen identifizierte die SLECs (short-lived-effector cells; CD127low CD62Llow KLRG1high) als die dominante Population in Lunge und Milz w��hrend der mCMV-Latenz.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit sollte untersucht werden, ob IE-Genexpression zur Etablierung von Latenz notwendig ist. Mit Hilfe der Rekombinanten mCMV-��ie2-DTR, die die Gensequenz des Diphtherietoxin-Rezeptors (DTR) anstelle des Gens ie2 tr��gt, konnten infizierte, DTR exprimierende Zellen durch eine DT-Applikation konditional depletiert werden.rnIm latent infizierbaren Zelltyp der Leber, den LSECs (liver sinusoidal endothelial cells) wurde die virale Load durch 90-st��ndige DT���Applikation nach mCMV-��ie2-DTR Infektion auf das Level latent infizierter LSECs reduziert. Diese Daten sprechen f��r die Hypothese eines von Beginn an inaktiven Genoms, das keine IE-Genexpression zur Latenz-Etablierung ben��tigt. Zus��tzlich stellt dieser Ansatz ein neues Tier-Modell zur Latenz-Etablierung dar. Verringerte Wartezeiten bis zur vollst��ndigen Latenz-Etablierung, im Vergleich zum bisherigen Knochenmarktransplantations-Modell, k��nnten anfallende Tierhaltungskosten erheblich reduzieren und das Voranschreiten der Forschung beschleunigen.

Regulatory T cell-mediated suppression of Th9 cell development and effector function

T helper (Th) 9 cells are an important subpopulation of the CD4+ T helper cells. Due to their ability to secrete Interleukin-(IL-)9, Th9 cells essentially contribute to the expulsion of parasitic helminths from the intestinal tract but they play also an immunopathological role in the course of asthma. Recently, a beneficial function of Th9 cells in anti-tumor immune responses was published. In a murine melanoma tumor model Th9 cells were shown to enhance the anti-melanoma immune response via the recruitment of CD8+ T cells, dendritic cells and mast cells. In contrast to Th9 effector cells regulatory T cells (Tregs) are able to control an immune response with the aid of different suppressive mechanisms. Based on their ability to suppress an immune response Tregs are believed to be beneficial in asthma by diminishing excessive allergic reactions. However, concerning cancer they can have a detrimental function because Tregs inhibit an effective anti-tumor immune reaction. Thus, the analysis of Th9 suppression by Tregs is of central importance concerning the development of therapeutic strategies for the treatment of cancer and allergic diseases and was therefore the main objective of this PhD thesis.rnIn general it could be demonstrated that the development of Th9 cells can be inhibited by Tregs in vitro. The production of the lineage-specific cytokine IL-9 by developing Th9 cells was completely suppressed at a Treg/Th9 ratio of 1:1 on the transcriptional (qRT-PCR) as well as on the translational level (ELISA). In contrast, the expression of IRF4 that was found to strongly promote Th9 development was not reduced in the presence of Tregs, suggesting that IRF4 requires additional transcription factors to induce the differentiation of Th9 cells. In order to identify such factors, which regulate Th9 development and therefore represent potential targets for Treg-mediated suppressive mechanisms, a transcriptome analysis using ���next-generation sequencing��� was performed. The expression of some genes which were found to be up- or downregulated in Th9 cells in the presence of Tregs was validated with qRT-PCR. Time limitations prevented a detailed functional analysis of these candidate genes. Nevertheless, the analysis of the suppressive mechanisms revealed that Tregs probably suppress Th9 cells via the increase of the intracellular cAMP concentration. In contrast, IL-9 production by differentiated Th9 cells was only marginally affected by Tregs in vitro and in vivo analysis (asthma, melanoma model). Hence, Tregs represent very effective inhibitors of Th9 development whereas they have only a minimal suppressive influence on differentiated Th9 cells.rn

Molekulare Grundlagen der Immunkontrolle des murinen Cytomegalovirus in Gegenwart viruskodierter Immunevasine

Die Kontrolle der Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) wird prim��r durch antivirale CD8 T-Zellen vermittelt. W��hrend der Koevolution zwischen Virus und Wirt wurden Immunevasionsmechanismen entwickelt, die direkt die Expression der Peptid-MHC-Klasse-I-Komplexe an der Zelloberfl��che beeinflussen und es dem Virus erm��glichen, der Immunkontrolle des Wirtes zu entkommen. Da HCMV und das murine CMV (mCMV) zum Teil analoge Strategien zur Modulation des MHC-Klasse-I-Antigen-Pr��sentationswegs entwickelt haben, wurde in der vorliegenden Arbeit auf das experimentelle Modell mit mCMV zur��ckgegriffen. Die f��r die Immunevasion verantwortlichen Genprodukte m04/gp34, m06/gp48 und m152/gp40 werden aufgrund ihres regulatorischen Einflusses auf die Antigenpr��sentation als vRAPs (viral regulators of antigen presentation) bezeichnet. Diese interferieren mit dem Transport Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Molek��le und reduzieren in ihrer konzertierten Wirkung die Pr��sentation viraler Peptide an der Zelloberfl��che.rnDie Transplantation h��matopoietischer Zellen nach Immunoablation stellt eine etablierte Therapieform bei malignen h��matologischen Erkrankungen dar. Zwischen Immunoablation und der Rekonstitution des Immunsystems sind die Empf��nger der transferierten Zellen stark immunsupprimiert und anf��llig f��r eine CMV-Erkrankung bei Reaktivierung des Virus. Neben der Gabe antiviraler Medikamente ist der adoptive Transfer antiviraler CD8 T-Zellen eine vielversprechende Therapiem��glichkeit, um reaktivierende CMV zu kontrollieren, bis das k��rpereigene Immunsystem wieder funktionsf��hig ist. Obwohl im murinen Modell sehr wohl etabliert, stellen im humanen System die eingeschr��nkte Wirkung und die Notwendigkeit der konsequenten Gabe hoher Zellzahlen gewisse logistische Schwierigkeiten dar, welche die Methode bisher von der klinischen Routine ausschlie��en.rnDas murine Modell sagte eine Rolle von IFN-�� voraus, da Depletion dieses Zytokins zu einer verminderten Schutzwirkung gegen die mCMV-Infektion f��hrt.rnIm ersten Teil dieser Arbeit sollte ein m��glicher inhibitorischer Effekt von m04 auf m152 untersucht werden, der bei der Rekombinanten ��m06W beobachtet wurde. Mit neu generierten Viren (��m06L1+2) konnte dieser Effekt allerdings nicht best��tigt werden. Bei ��m06W fehlte jedoch eine h��her N-glykosylierte Isoform des m152-Proteins. Um zu untersuchen, ob die N-Glykosylierung von m152 f��r seine Funktion notwendig ist, wurde ein rekombinantes Virus generiert, das in Folge einer Deletion aller 3 N-Glykosylierungssequenzen nur eine nicht-glykosylierte Isoform des m152-Proteins bilden kann. In ��bereinstimmung mit der zwischenzeitlich publizierten Kristallstruktur das Komplexes von m152 und dem Liganden RAE-1 des aktivierenden NK-Zellrezeptors NKG2D konnte erstmals gezeigt werden, dass die Funktionen von m152 in der adaptiven und in der angeborenen Immunit��t auch von der nicht N-glykosylierten Isoform wahrgenommen werden k��nnen.rnIm zweiten Teil der Arbeit sollte mit Hilfe eines Sets an vRAP Deletionsmutanten der Einfluss von IFN �� auf die einzeln oder in Kombination exprimierten vRAPs untersucht werden. Es zeigte sich, dass Vorbehandlung der Zellen mit IFN-�� die Antigenprozessierung nach Infektion stark erh��ht und die vRAPs dann nicht mehr in der Lage sind, die Pr��sentation aller Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Komplexe zu verhindern. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass vorher nicht-sch��tzende CD8 T-Zellen Schutz vermitteln k��nnen, wenn das Gewebe der Rezipienten konstitutiv mit IFN-�� versorgt wird. Die zus��tzliche Gabe von IFN-�� stellt daher eine vielversprechende M��glichkeit dar, den adoptiven Transfer als Therapie in der klinischen Routine einzusetzen.

Untersuchungen zur antitumoralen Wirkungsweise eines bispezifischen MCSP-CD3 Antik��rpers in vitro und im humanisierten Tumormausmodell

Humanes MCSP ist ein gut charakterisiertes Tumorantigen, das auf der Mehrzahl aller malignen Melanome hoch exprimiert wird, und stellt somit eine gute Zielstruktur f��r immuntherapeutische Ans��tze dar. rnInnerhalb der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkmechanismen eines neuen bispezifischen Antik��rpers, der gegen humanes MCSP und CD3 auf T-Zellen gerichtet ist, in vitro und im humanisierten Tumormausmodell in vivo untersucht. In humanen T Zellkokulturen induzierte der bispezifische MCSP-CD3 Antik��rper in Gegenwart MCSP-positiver Melanomzellen konzentrationsabh��ngige T-Zellaktivierung, Sekretion von Zytokinen und effiziente Tumorzelllyse durch CD4- und CD8-positive T-Zellen. Die induzierte Lyse war hierbei unabh��ngig von der T-Zellrezeptorspezifit��t sowie kostimulatorischen Molek��len und allein abh��ngig von der Expression des Tumorantigens sowie CD3 auf den T-Zellen. Wie hier diskutiert, liegt es nahe, dass die Freisetzung lytischer Molek��le (Perforin und Granzym-B) durch CD8- und auch CD4 positiver T-Zellen den Hauptmechanismus in der Lyse der Melanomzellen darstellt. rnUm die Wirksamkeit in vivo testen zu k��nnen, wurde ein humanisiertes Tumormausmodell etabliert. Die Injektion humaner h��matopoetischer Stammzellen in neugeborene Rag2-/-gc-/- M��use f��hrte zur Entwicklung funktioneller T-Zellen im murinen Thymus, welche lymphatische Organe besiedelten. In vitro induzierten die T-Zellen humanisierter M��use in Anwesenheit des bispezifischen MCSP-CD3 Antik��rpers ebenfalls konzentrationsabh��ngige Lyse der Melanomzellen. Wie hier gezeigt, induzierte die Injektion humaner Melanomzellen in humanisierte M��use keine messbare Absto��ungsreaktion. Unter Behandlung mit MCSP-CD3 wurde zwar eine erh��hte Anzahl humaner T-Zellen im Tumorgewebe nachgewiesen, jedoch verf��gte die verwendete Melanomzelllinie ��ber eine geringe basale T Zellinfiltration, geringe Vaskularisierung und ein nodul��res Wachstumsverhalten. Wie innerhalb dieser Arbeit diskutiert, kann durch die Kombination mit Therapien, die eine erh��hte T-Zellinfiltration in das Tumorgewebe erm��glichen, die Wirksamkeit von bispezifischen Antik��rpern m��glicherweise gesteigert werden. rn

Detrimental effects of exuberant and restrained immune responses against the central nervous system in the context of multiple sclerosis and glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most aggressive astrocytic tumor of the central nervous system (CNS) in adults. The standard treatment consisting of surgery, followed by a combinatorial radio- and chemotherapy, is only palliative and prolongs patient median survival to 12 to 15 months. The tumor subpopulation of stem cell-like glioma-initiating cells (GICs) shows resistance against radiation as well as chemotherapy, and has been suggested to be responsible for relapses of more aggressive tumors after therapy. The efficacy of immunotherapies, which exploit the immune system to specifically recognize and eliminate malignant cells, is limited due to strong immunosuppressive activities of the GICs and the generation of a specialized protective microenvironment. The molecular mechanisms underlying the therapy resistance of GICs are largely unknown. rnThe first aim of this study was to identify immune evasion mechanisms in GICs triggered by radiation. A model was used in which patient-derived GICs were treated in vitro with fractionated ionizing radiation (2.5 Gy in 7 consecutive passages) to select for a more radio-resistant phenotype. In the model cell line 1080, this selection process resulted in increased proliferative but diminished migratory capacities in comparison to untreated control GICs. Furthermore, radio-selected GICs downregulated various proteins involved in antigen processing and presentation, resulting in decreased expression of MHC class I molecules on the cellular surface and diminished recognition potential by cytotoxic CD8+ T cells. Thus, sub-lethal fractionated radiation can promote immune evasion and hamper the success of adjuvant immunotherapy. Among several immune-associated proteins, interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3) was found to be upregulated in radio-selected GICs. While high expression of IFITM3 was associated with a worse overall survival of GBM patients (TCGA database) and increased proliferation and migration of differentiated glioma cell lines, a strong contribution of IFITM3 to proliferation in vitro as well as tumor growth and invasiveness in a xenograft model could not be observed. rnMultiple sclerosis (MS) is the most common autoimmune disease of the CNS in young adults of the Western World, which leads to progressive disability in genetically susceptible individuals, possibly triggered by environmental factors. It is assumed that self-reactive, myelin-specific T helper cell 1 (Th1) and Th17 cells, which have escaped the control mechanisms of the immune system, are critical in the pathogenesis of the human disease and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). It was observed that in vitro differentiated interleukin 17 (IL-17) producing Th17 cells co-expressed the Th1-phenotypic cytokine Interferon-gamma (IFN-��) in combination with the two respective lineage-associated transcription factors ROR��t and T-bet after re-isolation from the CNS of diseased mice. Pathogenic molecular mechanisms that render a CD4+ T cell encephalitogenic have scarcely been investigated up to date. rnIn the second part of the thesis, whole transcriptional changes occurring in in vitro differentiated Th17 cells in the course of EAE were analyzed. Evaluation of signaling networks revealed an overrepresentation of genes involved in communication between the innate and adaptive immune system and metabolic alterations including cholesterol biosynthesis. The transcription factors Cebpa, Fos, Klf4, Nfatc1 and Spi1, associated with thymocyte development and na��ve T cells were upregulated in encephalitogenic CNS-isolated CD4+ T cells, proposing a contribution to T cell plasticity. Correlation of the murine T-cell gene expression dataset to putative MS risk genes, which were selected based on their proximity (�� 500 kb; ensembl database, release 75) to the MS risk single nucleotide polymorphisms (SNPs) proposed by the most recent multiple sclerosis GWAS in 2011, revealed that 67.3% of the MS risk genes were differentially expressed in EAE. Expression patterns of Bach2, Il2ra, Irf8, Mertk, Odf3b, Plek, Rgs1, Slc30a7, and Thada were confirmed in independent experiments, suggesting a contribution to T cell pathogenicity. Functional analysis of Nfatc1 revealed that Nfatc1-deficient CD4+ T cells were restrained in their ability to induce clinical signs of EAE. Nfatc1-deficiency allowed proper T cell activation, but diminished their potential to fully differentiate into Th17 cells and to express high amounts of lineage cytokines. As the inducible Nfatc1/��A transcript is distinct from the other family members, it could represent an interesting target for therapeutic intervention in MS.rn

Synthese und Charakterisierung von Polymer-Wirkstoff-Antik��rper-Konjugaten zur Anwendung in der Krebsimmuntherapie

Polymere Wirkstoffsysteme gewinnen im Bereich der biomedizinischen Forschung immer gr����eres Interesse. Vielversprechende Systeme f��r die Entwicklung von neuartigen Krebs-immun��therapien stellen insbesondere Polymer-Konjugate dar. Das ideale Polymer-Konjugat besitzt eine Gr����e zwischen 10 nm und 100 nm, ist nicht zytotoxisch und zeigt keine Aggregation in humanem Blutserum. In der vorliegenden Arbeit wurde die Synthese und Charakterisierung von Polymer-Wirkstoff-Konjugaten zur Anwendung in der Krebsimmuntherapie behandelt. Erstes Ziel der Arbeit war es, geeignete polymere Tr��gersysteme f��r die in vivo Anwendung zu finden. Hierzu wurde zun��chst die Stabilit��t verschiedener potentieller polymerer Tr��ger-systeme (Nanohydrogele, Succinyliertes-Poly-L-Lysin (B��rste), ELP-B��rsten und Poly(2-oxazolin)b��rsten) in humanem Serum untersucht. Weiterhin wurde die unspezifische Zellaufnahme in murinen dendritischen Zellen (DCs) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem neutrale bzw. zwitterionische Partikel eine hohe Serumstabilit��t sowie keine unspezifische Zellaufnahme zeigen. Um eine gezielte Adressierung der DCs des Immunsystems zu erreichen und dadurch eine Immunantwort gegen��ber einem bestimmten Krebs Zelltyp zu induzieren, wurden Biokonjugate - auf Basis der Succinylierten-Poly-L-Lysin-(B��rste) sowie der Azid-funktionalisierten Poly(2-oxazolin)b��rste (POx) ��� entwickelt, da diese Polymerb��rsten keine bzw. kaum unspezifische Aufnahme in DCs zeigen. Hierbei diente der Antik��rper aDEC205 der gezielten Adressierung von CD8+ DCs. Die weiteren bioaktiven Komponenten waren das tumorassoziierte Antigen (TAA) mit der Kernsequenz SIINFEKL zur Induktion einer spezifischen Immunantwort sowie der immunaktivierende TLR9 Ligand, CpG1826. Die Komponenten wurden nacheinander an die Fluoreszenz-markierten Polymere kon��jugiert. Die Konjugation des Antik��rpers erfolgte nach vorangegangener DIBO-Modifizierung ��ber kupferfreie Click-Chemie. Mit einer optimierten Aufarbeitungsmethodik gelang es, aggregat-freie, unimere DIBO-modifizierte aDEC205 Antik��rper zu isolieren. F��r die succinylierten Poly-L-Lysine konnten keine eindeutigen sowie reproduzierbaren Ergebnisse erhalten werden, sodass sich im weiteren Verlauf der Arbeit auf die POx konzentriert wurde. Die Konjugation von aDEC205 an POx wurde mittels verschiedener physiko-chemischer Methoden (UV-VIS, SDS-PAGE, FCS, GPC, CLSM und FACS) gezeigt. Mit Hilfe von ���Specific-Hybridization-Internalisation-Sensor��� Experimenten konnte eine spezifische Aufnahme des Konjugats in CD8+ DCs nachgewiesen werden. rnDie Konjugation von Antigen und CpG erfolgte ebenso nach entsprechender Modifizierung ��ber kupferfreie Click-Chemie. SDS-PAGE, UV-VIS und FCS best��tigten eine erfolgreiche Kopplung. T-Zell-Proliferationsversuche ergaben f��r Antigen enthaltende Polymer-Konjugate eine CD8+ T-Zell-Aktivierung. Des Weiteren zeigten die POx keine bemerkenswerte Toxizit��t und deren Konjugate keine Aggregation in humanem Serum. rnrnDar��ber hinaus wurde der Einfluss verschiedener Polymertopologien auf ihre Biodistribution sowie Blutzirkulation untersucht. F��r die nach GPC-Fraktionierung erhaltenen verschiedenen Polymerfraktionen - hochmolekulare wurmartige Polymerb��rsten, ellipsoidartige Polymer-b��rsten und niedermolekulare kugelf��rmige Molek��le - konnten vielversprechende Ergebnisse erhalten werden.

Improving adoptive T cell therapies of cancer by ectopic expression of miR181a to repress inhibitory phosphatases

Adoptive T cell therapy using antigen-specific T lymphocytes is a powerful immunotherapeutic approach against cancer. Nevertheless, many T cells against tumor-antigens exhibit only weak anti-tumoral response. To overcome this barrier it is necessary to improve the potency and anti-tumoral efficacy of these T cells. Activation and activity of T cells are tightly controlled to inhibit unwanted T cell responses and to reduce the risk of autoimmunity. Both are regulated by extrinsic signals and intrinsic mechanisms which suppress T cell activation. The intrinsic mechanisms include the expression of phosphatases that counteract the activation-inducing kinases. Modifying the expression of these phosphatases allows the targeted modulation of T cell reactivity. MicroRNAs (miRNAs) are regulatory small noncoding RNA molecules that control gene expression by targeting messenger RNAs in a sequence specific manner. Gene-specific silencing plays a key role in diverse biological processes, such as development, differentiation, and functionality. miR181a has been shown to be highly expressed in immature T cells that recognize low-affinity antigens.rnThe present study successfully shows that ectopic expression of miR181a is able to enhance the sensitivity of both murine and human T cells. In CD4+ T helper cells as well as in CD8+ cytotoxic T cells the overexpression of miR181a leads to downregulation of multiple phosphatases involved in the T cell receptor signaling pathway. Overexpression of miR181a in human T cells achieves a co-stimulatory independent activation and has an anti-apoptotic effect on CD4+ T helper cells. Additionally, increasing the amount of miR181a enhances the cytolytic activity of murine CD8+ TCRtg T cells in an antigen-specific manner.rnTo test miR181a overexpressing T cells in vivo, a mouse tumor model using a B cell lymphoma cell line (A20-HA) expressing the Influenza hemagglutinin (Infl.-HA) antigen was established. The expression of model antigens in tumor cell lines enables targeted elimination of tumors using TCRtg T cells. The transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells alone has no positive effect neither on tumor control nor on survival of A20-HA tumor-bearing mice. In contrast, the co-transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ and CD4+ T cells leads to improved tumor control and prolongs survival of A20-HA tumor-bearing mice. This effect is characterized by higher amounts of effector T cells and the expansion of Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells.rnAll effects were achieved by changes in expression of several genes including molecules involved in T cell differentiation, activation, and regulation, cytotoxic effector molecules, and receptors important for the homing process of T cells in miR181a overexpressing T cells. The present study demonstrates that miR181a is able to enhance the anti-tumoral response of antigen-specific T cells and is a promising candidate for improving adoptive cell therapy.

Individualisierte Krebstherapie : pr��klinischer ���proof of concept��� einer mutationsspezifischen Immuntherapie

Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das ver��nderte Proteinprodukt vom Immunsystem als ���fremd��� erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen f��r die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore k��nnen individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu kl��ren, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenit��t zu testen. F��r diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer L��nge von 27 Aminos��uren genutzt, in denen die mutierte Aminos��ure zentral positioniert war. Durch die L��nge der Peptide k��nnen prinzipiell alle m��glichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver M��use sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabh��ngigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgef��hrt. Die Immunph��notypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivit��t induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien best��tigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen k��nnen. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 best��tigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rn��beraschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabh��ngigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop f��r das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt n��her zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erh��hte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der fr��hen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien best��tigt. Daran anschlie��end wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-�� ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-�� sekretieren. Dass diese spezifische IFN-�� Aussch��ttung f��r den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-�� -/- K.O. M��usen best��tigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von ���escape���-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die f��r ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren k��nnen. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivit��ten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es m��glich ist, unabh��ngig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit pr��klinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen f��r die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. ��berraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabsto��ungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn