Efectes del fotoperíode sobre la qualitat espermàtica de mascles porcins Sus domesticus

En el presente estudio se analizan los efectos de los fotoperiodos ambientales de otoño e invierno y los fotoperiodos experimentales de 24, 12 y 0 horas de luz artificial sobre la calidad del semen de machos reproductores porcinos de raza Landrace. El estudio se realizó sobre 30 machos postpuberales de 8 meses de edad y testados con el fin de comprobar la homogeneidad. Los machos fueron distribuidos aleatóriamente en los 3 grupos de luz artificial durante 3 meses. El tratamiento de 12 horas de luz artificial fue considerado como grupo control. Previamente al inicio de cada tratamiento, se sometió a cada grupo de machos al fotoperiodo ambiental correspondiente a la época del año; así, se caracterizó también la calidad seminal en otoño e invierno, manteniendo la temperatura constante. La nave experimental que acogió a los machos tiene una superficie de 100 m2 y una altura de 3,5 m. Un pasillo central divide la nave en dos hileras de 5 y 6 celdas respectivamente. En una de las celdas pequeñas se instaló el maniquí y fue utilizada para las extracciones de semen. La iluminación artificial se consiguió con la instalación de 6 lámparas fluorescentes en el techo del pasillo central que proporcionaron una luz homogénea superior a 200 lux. Así mismo, la nave se mantuvo en todo momento a 21±1ºC y la humedad relativa osciló entre el 60-75%. A todos los verracos se les proporcionó una dieta nutritiva y equilibrada y se les sometió a un regimen de extracciones de semen de 2 veces por semana, habiendo sido previamente entrenados en la monta del maniquí. Les muestras de semen fueron recogidas según la técnica de la mano enguantada (Martín, 1982; Daza, 1992) y se analizaron los siguientes parámetros: el volumen y el pH seminales, la concentración, la vitalidad y la motilidad espermáticas, la resistencia acrosómica de los espermatozoides, la morfología espermàtica a partir de la frecuencia de los espermatozoides maduros, inmaduros y aberrantes, la producción testicular y el número de dosis seminales. Se analizó, además, bioquímicamente el plasma seminal al principio y al final de cada tratamiento experimental de luz artificial a partir de la concentración de proteína total, de la identificación de residuos fosforilados de proteína y del contenido de azúcares. También se determinaron los índices de fertilidad y prolificidad. El volumen y el pH de los eyaculados se utilizaron como marcadores del estado funcional de las glándulas sexuales accesorias; la concentración espermàtica como un indicador de la actividad testicular (Pinart y col., 1999). La vitalidad y la motilidad espermáticas fueron estimadores del grado de diferenciación del espermatozoide tanto a nivel testicular como epididimario; la resistencia acrosómica fue utilizada para valorar el nivel de diferenciación de la membrana acrosómica durante la espermiogénesis y/o maduración epididimària (Briz i col., 1996; Pinart i col., 1999). Referente a la morfología espermática, los espermatozoides inmaduros fueron marcadores de anomalías en la maduración de éstos a lo largo del conducto epididimario y los espermatozoides aberrantes se utilizaron como marcadores de una diferenciación defectuosa a nivel de testículo (anomalías primarias) y a nivel de conducto epididimario (anomalías secundarias) (Briz i col., 1996). La concentración de proteína total se utilizó para valorar la integridad funcional de las membranas del espermatozoide y la actividad de las glándulas sexuales accesorias. La identificación de proteínas con residuos de tirosina fosforilados fue un estimador de la viabilidad celular y la actividad de las glándulas sexuales, y el contenido de azúcares como un indicador de la producción de las vesículas seminales. La determinación del volumen y el pH de los eyaculados se realizó en las instalaciones de la granja a partir de semen fresco el mismo día de la extracción. El resto de parámetros se analizaron en el laboratorio durante las 48 horas posteriores a la extracción a partir de semen diluido en BTS (diluyente de Bestville) (Daza, 1992) y transportado y conservado a 15ºC. Las muestras fueron previamente filtradas con el fin de eliminar la tapioca. El estudio estadístico de los resultados obtenidos se realizó a partir del análisis de la varianza (ANOVA) con un nivel de significación de =0,05. En cuanto al estudio comparativo de los fotoperiodos ambientales estacionales se ha observado un incremento significativo del pH del eyaculado en los machos expuestos a otoño (P0,0001), mientras que el volumen seminal se mantiene en valores similares en ambos tratamientos (P=0,1650). La concentración espermàtica, la producción espermàtica y el número de dosis seminales que se pueden preparar a partir de un eyaculado se duplica en los verracos sometidos al fotoperiodo de primavera (P0,0001). La vitalidad y la motilidad espermáticas no experimentan cambios significativos entre tratamientos (P=0,3440 y P=0,9220, respectivamente). La resistencia osmótica de los acrosomas desciende únicamente en los machos expuestos a condiciones estacionales de otoño (P0,0001). En referencia a la morfología espermàtica aunque no se observan diferencias entre primavera y otoño (P0,05), sí se detecta un incremento de los porcentajes de espermatozoides inmaduros y aberrantes en ambos fotoperiodos estacionales, y en especial en los machos expuestos a condiciones fotoperiódicas de otoño. Según los resultados obtenidos en este estudio la calidad seminal de los verracos es inferior en el fotoperiodo de otoño debido a un descenso de la concentración y la producción espermáticas, un aumento del pH seminal, una disminución de la resistencia de la membrana acrosómica y a un incremento en la frecuencia de espermatozoides inmaduros y aberrantes. Parece ser, pues, que en el otoño tiene lugar la disminución de la producción testicular, cambios en la actividad de las glándulas sexuales accesorias y disfunciones en el proceso de diferenciación testicular y epididimària de los espermatozoides y especialmente del acrosoma. En relación a los resultados obtenidos en el estudio de los diferentes fotoperiodos artificiales se observa que la iluminación continua provoca un aumento significativo del volumen del eyaculado en el primer y segundo mes de tratamiento (P0,0001), disminuyendo en el tercer mes. La oscuridad absoluta no modifica este parámetro (P0,05). En cuanto al pH seminal la iluminación continua provoca un incremento progresivo del valor del pH a lo largo del periodo experimental (P0,0001), mientras que la oscuridad absoluta tiene un efecto más irregular. La exposición de los machos a iluminación continua y a oscuridad absoluta se manifiesta en un descenso de la concentración y la producción espermáticas que se mantiene hasta el segundo mes de tratamiento (P0,0001), observándose un incremento en el tercer mes de exposición de los machos a oscuridad absoluta (P=0,1010). De todas maneras, este descenso es mas severo en los machos sometidos a iluminación continua ya que no presentan recuperación. La vitalidad y la motilidad espermáticas no se ven alteradas por la iluminación continua y la oscuridad absoluta, ni tampoco el contenido de los azúcares mayoritarios del plasma seminal (P0,005). La glucosa aparece como un azúcar minoritario y sí que presenta concentraciones inferiores en los tratamientos experimentales de luz continua y de oscuridad absoluta (P0,0001 y P=0,0002, respectivamente). La resistencia osmótica de los acrosomas desciende en ambos tratamientos artificiales extremos de luz continua y oscuridad total (P0,0001), aunque en los machos expuestos a iluminación continua se produce una recuperación a partir del segundo mes de tratamiento (P=0,4930). Dado que tampoco se han observado diferencias significativas en las concentraciones de proteína total (P0,05), es probable que las anomalías de la membrana acrosómica se originen durante el proceso de espermiogénesis y/o maduración epididimària. La exposición de los verracos a oscuridad absoluta no altera la morfología espermàtica de los eyaculados, aunque se observa un aumento de la frecuencia de espermatozoides con anomalías en la forma de la cola en el primer mes (P0,0001), y un aumento de la frecuencia de espermatozoides inmaduros con gota distal y de espermatozoides con anomalías en el número de colas en el tercer mes de experimentación (P=0,0030 y P0,0001). La luz continua, sin embargo, provoca un incremento de la frecuencia de espermatozoides inmaduros con gota distal (P0,0001) y de espermatozoides con anomalías en la forma de la cola (P=0,0040) ya en el primer mes. El fotoperiodo provoca un descenso de la fertilidad de los machos expuestos a oscuridad absoluta en el tercer mes de tratamiento (P0,0001) y un incremento de ésta en los machos sometidos a iluminación continua (P=0,0005). La prolificidad no se ve modificada por ambas condiciones extremas de luz artificial (P0,05). Así pues, los resultados obtenidos demuestran que el fotoperiodo afecta la actividad testicular, provoca alteraciones en la actividad de las glándulas sexuales accesorias, altera el proceso de expulsión de la gota citoplasmática y provoca anomalías en el proceso de diferenciación de la cola tanto a nivel testicular como epididimario, siendo los verracos expuestos a luz continua más sensibles a estos parámetros que los verracos sometidos a oscuridad absoluta. El fotoperiodo, sin embargo, no altera de forma esencial la integridad de las membranas del espermatozoide ni la capacidad fecundante de éste.

Pèptids biarílics a partir de 4-iodofenilalanina o 3-iodotirosina per borilació i reacció de Suzuki-Miyaura en fase sòlida. Avaluació de l'activitat antimicrobiana

En aquesta tesi doctoral es va estudiar la preparació de pèptids biarílics en fase sòlida. En primer lloc, es varen borilar residus de fenilalanina o tirosina presents a la seqüència peptídica a través d’una reacció de Miyaura. A continuació, es varen arilar els boronats resultants a través d’una reacció de Suzuki-Miyaura sota irradiació de microones, utilitzant diversos halurs d’aril i haloaminoàcids. La metodologia trobada es va estendre a la preparació de pèptids biarílics cíclics. Aquesta aproximació presenta l’avantatge d’evitar la síntesi en dissolució i la purificació del boronoaminoàcid. A més, permet la preparació d’una àmplia diversitat de pèptids biarílics a partir d’un únic boronopèptid. L’avaluació de l’activitat biològica dels pèptids sintetitzats va permetre idenficar seqüències actives enfront dels bacteris Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, i Pseudomonas syringae, que són responsables de malalties greus en plantes d’interès econòmic com pereres i pomeres, i que varen resultar ser molt poc tòxics enfront cèl•lules eucariotes.

Efeito da fenilalanina sobre a atividade da creatina quinase em córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos

A fenilcetonúria (PKU) é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causada pela deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase hepática (PAH) que converte fenilalanina (Phe) em tirosina. Caracteriza-se clinicamente por retardo mental severo e, em alguns pacientes, por convulsões e eczema cutâneo. Bioquimicamente os pacientes afetados por esta doença apresentam acúmulo de Phe e seus metabólitos no sangue e nos tecidos. Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. O metabolismo energético cerebral é caracterizado por níveis altos e variáveis de síntese e de utilização de ATP. O cérebro contém altos níveis de creatinaquinase (CK), uma enzima que transferere reversivelmente um grupo fosforil entre ATP e creatina e entre ADP e fosfocreatina (PCr). Considerando que a CK parece estar envolvida em certas condições patológicas relacionadas com deficiência de energia cerebral e sabendo que a PKU está associada à redução de produção e de utilização de energia pelo cérebro, no presente trabalho verificamos a atividade da CK em homogeneizado total de córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos Wistar submetidos aos modelos experimentais agudo e crônico de hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e da α-metil-DL-fenilalanina (MePhe), um inibidor da PAH, nas mesmas estruturas de ratos Wistar de 22 dias de idade não tratados. Nossos resultados mostraram uma redução significativa na atividade da CK nas estruturas cerebrais estudadas de ratos sujeitos a HPA. Também verificamos que Phe e MePhe inibiram in vitro a atividade da CK nas mesmas estruturas. O estudo da interação cinética entre Phe e MePhe, sugere a existência de um único sítio de ligação na CK para os dois compostos. Considerando a importância da CK para a manutenção do metabolismo energético cerebral, nossos resultados sugerem que a alteração da homeostasia energética pode contribuir para a neurotoxicidade da Phe na PKU.

Estresse neonatal, expressão do medo e sistema dopaminérgico em ratos

A estimulação neonatal tem sido utilizada como modelo experimental para examinar os mecanismos pelos quais variações precoces do ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas duradouras. Buscou-se estudar os efeitos do estresse neonatal sobre duas abordagens: comportamental e imunoistoquímica. Na primeira, foram avaliados em ratos adultos (90-110 dias) dois paradigmas de medo: inato (campo aberto, N=48) e aprendido, (condicionamento clássico N=48); enquanto na segunda abordagem realizou-se a técnica imunoistoquímica (N=15) na substância nigra compacta (SNCo) e área tegmental ventral (VTA) para detecção da enzima precursora da dopamina, a tirosina hidroxilase (TH). Foram utilizados ratos da variedade Wistar, que do 1º ao 10º dia de vida foram submetidos a 3 tipos de intervenção: manipulação (retirados do ninho por 3min sendo tocados gentilmente por 1 min); separação (retirados do ninho por 3h, e mantidos a temperatura de 33ºC); e grupo controle (sem intervenções do experimentador ou do tratador). O condicionamento clássico (treino) foi constituído por 10 pareamentos de 1 estímulo incondicionado (EI, choque elétrico –0,8mA) com 2 estímulos condicionados ou neutros (EC, som e luz) em 2 sessões de 5 pareamentos cada. A duração de cada emissão do EC foi de 5s sendo no último segundo associada ao EI. O teste foi realizado 24h após o treino, e consistiu de emissões de EC com mesma duração e intervalo por um período total de 30 min. No experimento 2, foi utilizado um campo aberto de 1m2 no qual os ratos permaneceram por 5 min. Em ambos experimentos os comportamentos eram registrados em vídeo e analisados através do programa Noldus. Os resultados (X±EPM) foram analisados por uma ANOVA, post-hoc Newman Keuls ou Kruskal Wallis post-hoc Dunn (p<0,05). Nos experimentos comportamentais foram observados os seguintes resultados: no medo aprendido houve diminuição da duração (s) do comportamento de imobilização (491±54); da duração de rearing (58±13) e da latência para extinção do condicionamento do grupo manipulado (591±434) comparado ao controle (718±73; 22±6; 1020±843 respectivamente) e no campo aberto houve aumento da duração e freqüência da locomoção e rearing (97.6±8; 4.3±1 e 64.3±5; 31±2), diminuição da duração de autolimpeza (4.2±1) e aumento da freqüência de entradas no centro do campo aberto (4.3±0,8) no grupo manipulado comparado ao controle (69±7; 30±3 e 48±6; 21.5±2; 19±5; 2.2±0.6, respectivamente). Na análise Imunoistoquímica não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos quanto imunomarcação de TH nas áreas estudadas. Foi confirmada a diminuição da inibição comportamental no campo aberto como conseqüência da manipulação. A manipulação neonatal também reduziu as respostas do medo condicionado, ratos manipulados no período neonatal expressam, quando adultos, menor expressão de medo aprendido e tem a extinção da aprendizagem aversiva mais acelerada. Curiosamente não foram observados efeitos da separação materna sobre as repostas de medo inato ou aprendido. Embora a dopamina do sistema mesocorticolímbico module as respostas comportamentais alteradas, nenhum dos modelos de intervenção estudados afetaram a intensidade de marcação deste neurotransmissor.

Avaliação epidemiológica da triagem neonatal para fenilcetonúria no Rio Grande do Sul - 1986-2003 : um estudo de coorte

A fenilcetonúria clássica (PKU), que afeta 1: 10.000 nascimentos em populações caucasianas, é um erro inato do metabolismo determinado pela deficiência da enzima hepática fenilalaninahidroxilase (PAH), com o conseqüente bloqueio na conversão de fenilalanina (Phe) em Tirosina (Tyr) e aumento da concentração plasmática de Phe. A PKU foi descrita há 70 anos pelo médico norueguês Asbjörn Folling. Desde então muitas foram as descobertas a seu respeito, como a caracterização e mapeamento do seu gene, a identificação de mutações, a determinação da estrutura da enzima, características clínicas e bioquímicas dos afetados, correlações genótipo-fenótipo, a identificação do risco teratogênico quando da condição materna, o estabelecimento da triagem neonatal e ainda o seu tratamento. Se não diagnosticada e tratada precocemente, a PKU causa retardo mental, microcefalia, espasmos infantis, odor de rato na urina e hipopigmentação de pele, cabelos e olhos, além de outros sinais e sintomas. Com o objetivo de identificar a população submetida à triagem neonatal no Rio Grande do Sul (Brasil), a incidência de Fenilcetonúria e de outras hiperfenilalaninemias e correlacionar época do diagnóstico, início do tratamento e desfecho clínico, elaborou-se este estudo delineado como uma coorte ambispectiva que avaliou 54 pacientes fenilcetonúricos entre 6 meses a 16 anos de idade. Foram realizadas entrevistas telefônicas com os responsáveis indagando-se alguns dados demográficos e outros relativos à patologia. Crianças de 6 meses a 7 anos foram avaliadas com relação aos marcos do DNPM. Acima dessa idade, foram investigados sobre escolaridade e presença de sintomas neurológicos. Após análise estatística e estratificação da amostra por ano de nascimento, não se observou uma tendência histórica do diagnóstico ter se tornado mais precoce ou de o controle laboratorial ter se tornado melhor com o passar dos anos. Foi encontrada associação entre o controle de Phe e a cognição, mas não a entre a idade do diagnóstico e a evolução clínica.

Efeitos do estresse hipo e hiperosmótico sobre as características do receptor à insulina e sobre a captação de glicose em branquias do caranguejo Chasmagnathus granulata

Neste trabalho investigou-se as características do receptor à insulina e a capacidade de captação de glicose nas brânquias do caranguejo Chasmagnathus granulata aclimatado a diferentes tempos (24, 72 e 144 horas) de estresse hiper e hiposmótico. Primeiramente, o cDNA do receptor para insulina foi parcialmente clonado e seqüenciado em brânquias posteriores de Chasmagnathus granulata. A seqüência peptídica mostrou a presença de 39 aminoácidos e foi designada CGIRLTK (C. granulata insulina receptor-like tyrosine kinase). Esta seqüência apresentou significativa homologia com o domínio tirosina quinase da subunidade b dos receptores para insulina de mamíferos (69%) e de Drosophila (74%). Sítios de ligação à insulina foram caracterizados nas membranas plasmáticas das brânquias através do estudo de ligação com 125I-insulina. A atividade tirosina quinase foi determinada pela capacidade do CGIRLTK de fosforilar o substrato sintético poly (Glu; Tyr 4:1). A captação de glicose foi avaliada pela captação de [14C] 2-deoxi-D-glicose pelo tecido branquial. Nas brânquias posteriores a insulina bovina estimulou significativamente a fosforilação do CGIRLTK nos animais aclimatados a 20‰ de salinidade (controle), já nas brânquias anteriores este estímulo não foi observado. O estresse hiperosmótico (34 ‰ de salinidade) levou a uma diminuição do número e da afinidade dos receptores à insulina nas brânquias posteriores, bem como a uma redução na atividade tirosina quinase. A captação de glicose não mudou durante os tempos de estresse osmótico estudados Esses resultados mostram que o estresse hiperosmótico modifica a sinalização da insulina, causando um estado de resistência à insulina nas brânquias posteriores. Nenhuma mudança foi observada na concentração dos receptores à insulina nas brânquias posteriores de caranguejos aclimatados durante 24 horas ao estresse hiposmótico (0‰). Contudo, foi observada uma redução na afinidade dos receptores pela insulina bovina. A fosforilação do CGIRLTK diminui às 24 horas de estresse e retornou aos valores basais às 144horas. A captação de glicose não foi alterada significativamente. Os resultados sugerem que o estresse hiposmótico modifica as características do CGIRLTK nas brânquias posteriores de C. granulata de forma tempo-dependente. Essas mudanças são parte dos ajustes necessários à sobrevivência à baixa salinidade. Nas brânquias anteriores, durante aclimatação ao estresse hiperosmótico, foi observada redução da concentração e da capacidade de fosforilação dos receptores insulínicos. Contudo, a insulina bovina não estimulou a fosforilação nas brânquias anteriores durante o estresse Nenhuma alteração foi observada na concentração e na afinidade de receptores à insulina nas brânquias anteriores após 24 horas de estresse hiposmótico. A fosforilação do receptor à insulina diminuiu após 24 horas de estresse e voltou aos valores basais após 72 horas. A capacidade de captação de glicose, por sua vez, não foi modificada em função de mudanças na osmoliridade do ambiente. Assim como no estresse hiperosmótico, a insulina bovina não estimulou a fosforilação nas brânquias anteriores no estresse hiposmótico. Os resultados deste trabalho demonstram que o estresse osmótico modifica as características do CGILRTK e conseqüentemente a transdução do sinal insulínico nas brânquias. As respostas às alterações de salinidade dependem do tipo de estresse ao qual o animal é submetido e da brânquia estudada (anterior ou posterior). As mudanças observadas no sinal insulínico fazem parte dos ajustes necessários para a regulação osmótica frente às mudanças ambientais de salinidade.

Estrógeno e pré-condicionamento : efeitos neuroprotetores e possíveis mecanismos de ação em modelos in vitro e in vivo de isquemia cerebral

As bases moleculares da neuroproteção contra a isquemia mediada por estrógeno continuam obscuras, assim como os mecanismos envolvendo a tolerância ao dano isquêmico subseqüente induzida por pré-condicionamento. Neste trabalho foi estudado se as vias de sinalização celular da PI3-K (fosfatidil inositol 3-quinase) e da MEK/ERK 1/2 estariam envolvidas na neuroproteção induzida por estrógeno, bem como alguns parâmetros de estresse oxidativo, especificamente o conteúdo de radicais livres, um índice de dano oxidativo a proteínas e a capacidade antioxidante total. Também foi estudado o possível envolvimento dos transportadores de glutamato (EAAT1 e EAAT2) e dos receptores de estrógeno (ERα e ERβ) nos efeitos neuroprotetores do estrógeno e do pré-condicionamento. Para este fim, foram utilizados os modelos in vitro de culturas organotípicas de fatias hipocampais e fatias hipocampais preparadas a fresco expostas à privação de oxigênio e glicose (POG) e o modelo in vivo de hipóxia-isquemia neonatal. Em culturas tratadas tanto aguda como cronicamente com 17β-estradiol, a morte celular induzida por POG foi diminuída acentuadamente quando comparada com as culturas tratadas apenas com veículo. Este efeito neuroprotetor foi evitado por LY294002 (inibidor de PI3-K), mas não por PD98059 (inibidor de MEK/ERK 1/2). Ambos os protocolos de tratamento com estradiol induziram a fosforilação/ativação da proteína quinase B (PKB/Akt) e a fosforilação/inativação da glicogênio sintase quinase-3β (GSK-3β). Em um estudo similar, o imunoconteúdo do receptor estrogênico ERα diminuiu após POG em culturas tratadas tanto com estradiol quanto veículo, enquanto que o receptor ERβ aumentou apenas nas culturas tratadas com estradiol expostas ou não à POG. Não foram observadas alterações no imunoconteúdo dos transportadores de glutamato (EAATs) em nenhum dos tratamentos in vitro. Em fatias de hipocampo de cérebro de ratas ovariectomizadas que receberam reposição de estradiol, a morte celular foi reduzida em comparação ao grupo de ratas que não recebeu a reposição hormonal. Neste mesmo modelo, observou-se que a POG aumentou a produção de radicais livres nos dois grupos, porém não foram observadas diferenças na capacidade antioxidante total. Por outro lado, a reposição de estradiol evitou a redução nos conteúdos de triptofano e tirosina causada por POG. No modelo in vivo, o cérebro de ratos neonatos foi protegido contra a hipóxia-isquemia pelo précondicionamento hipóxico. Em paralelo, o pré-condicionamento aumentou o imunoconteúdo dos transportadores de glutamato EAAT2 e do receptor estrogênico ERα em córtex e diminuiu os níveis de EAAT2 em estriado, mas não afetou os níveis de EAAT1 e ERβ. Já no modelo in vitro de pré-condicionamento, nas culturas organotípicas de hipocampo pré-condicionadas, 15 min de POG induziu tolerância acentuada a um período subseqüente de 45 min de POG, porém não foram detectadas alterações nos transportadores de glutamato nem nos receptores estrogênicos. Juntos, os resultados sugerem que na isquemia a neuroproteção induzida por estrógeno pode envolver a via de sinalização celular da fostatidil inositol 3-quinase (PI3-K), a prevenção do dano oxidativo a proteínas e a regulação dos receptores estrogênicos ERα e ERβ, enquanto que a tolerância à isquemia cerebral induzida por pré-condicionamento pode envolver a regulação dos transportadores de glutamato EAAT2 e receptores estrogênicos ERα.

Aminoácidos plasmáticos e intracelulares em insuficiência renal crônica : aminoácidos em uremia

Com o objetivo de investigar o padrão dos aminoácidos plasmáticos e intracelulares em 15 indivíduos normais e em 50 pacientes urêmicos em tratamento conservador, em hemodiálise (HD) e em diálise peritoneal ambulatorial contínua (CAPD) foram obtidas em jejum amostras de sangue venoso e, por biópsia, amostras musculares do músculo quadríceps femoral. Todas as amostras foram analisadas através de cromatografia líquida de alta performance (HPLC). A avaliação nutricional dos indivíduos normais e dos pacientes urêmicos teve por base peso, altura, peso corporal relativo, índice de massa corporal magra e de gordura foram analisadas pela Bioimpedância, albumina sérica, taxa de catabolismo protéico e nitrogênio ureico. Os resultados do estudo demonstraram que, entre os aminoácidos plasmáticos essenciais de cadeia ramificada, a leucina (p=0,006) e a valina (p=0,002) eram baixas nos pacientes urêmicos, principalmente em tratamento conservador. Os outros aminoácidos plasmáticos essenciais: triptofano foi mais baixo nos urêmicos, principalmente em HD (p<0,0001), a tirosina mais baixa nos urêmicos, principalmente, em tratamento conservador (p=0,008) e a metionina mais baixa nos pacientes em HD (p=0,027). Com relação aos aminoácidos plasmáticos não-essenciais, a serina estava mais baixa em todos os pacientes urêmicos, principalmente nos HD (p<0,0001) e a citrulina estava elevada em todos os pacientes urêmicos, principalmente em HD (p=0,036). Quanto aos aminoácidos intracelulares essenciais, a valina (p=0,001) e a leucina (p=0,003) estavam baixas nos pacientes urêmicos, principalmente, em CAPD; já no grupo em tratamento conservador estava baixa a concentração de lisina (p=0,049) e alto a concentração de triptofano (p<0,0001). Com relação aos aminoácidos intracelulares não essenciais, a serina estava baixa em todos os grupos de urêmicos (p=0,008), principalmente em CAPD e a arginina mais elevada, principalmente em HD (p=0,002). mais alta em relação aos demais grupos urêmicos. Em conclusão, nessa população de pacientes urêmicos relativamente bem nutrida, reduções ou elevações significativas de aminoácidos plasmáticos nem sempre foram acompanhados de altos títulos a nível intracelular. Entretanto, valina e leucina estiveram reduzidos nos tres grupos urêmicos tanto a nível plasmático como intracelular. Não foi observada correlação entre o grau de acidose metabólica (concentração de bicarbonato sérico) e as concentrações dos aminoácidos de cadeia ramificada, valina, leucina e isoleucina nos indivíduos urêmicos.

Caracterização dos neurônios envolvidos na ventilação pulmonar de Megalobulimus abbreviatus (Gastropoda: Pulmonata)

O uso de moluscos gastrópodes para estudos neurobiológicos é vantajoso porque seu sistema nervoso e comportamentos são intermediários em complexidade quando comparados a outros animais. Os padrões de atividade derivados do sistema nervoso central (SNC) são modulados por informações periféricas provenientes de vários quimio e mecanorreceptores, os quais desempenham funções importantes na manutenção da homeostase interna. Assim, juntos, elementos centrais e periféricos permitem ao animal modular seu comportamento respiratório de acordo com suas demandas metabólicas. O objetivo deste trabalho originou-se da necessidade da compreensão da atividade respiratória do caracol pulmonado terrestre Megalobulimus abbreviatus, da identificação dos neurônios do sistema nervoso central envolvidos no seu controle, bem como da organização da inervação de uma estrutura-chave envolvida no comportamento respiratório deste animal, o pneumóstoma. Realizou-se a identificação dos neurônios do SNC que controlam o pneumóstoma através de marcação retrógrada pelo nervo parietal posterior direito com cloreto de cobalto e biocitina; a descrição da morfologia e da histologia da região do pneumóstoma, assim como a análise da presença de monoaminas (método do ácido glioxílico), atividade acetilcolinesterásica (AChE, técnica de Karnovsky & Roots) e de imunorreatividade a FMRF-amida (imunoistoquímica) nesta região. Também foi realizada a investigação sobre uma provável relação entre o sistema dopaminérgico, serotoninérgico e peptidérgico (FMRF-amida) com os neurônios identificados por marcação retrógrada nos gânglios nervosos centrais, através da comparação entre os neurônios retrogradamente marcados com neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase (TH), serotonina (5-HT) e FMRF-amida. Neurônios retrogradamente marcados foram encontrados nos gânglios pedais, pleural direito, parietal direito e visceral. Encontrou-se na superfície do tegumento do pneumóstoma um epitélio constituído de uma única camada de células cilíndricas, com microvilosidades ou cílios como terminação apical, envolvido por uma camada muscular bem desenvolvida. Foi possível verificar que a organização da inervação na região do pneumóstoma está constituída de uma rede neural para suprir a camada muscular e ramos neurais mais finos que estão mais densamente distribuídos em um plexo na camada epitelial e subepitelial adjacente, onde corpos celulares neuronais foram identificados (catecolaminérgicos ou com atividade AChE). A análise do padrão de inervação do pneumóstoma, juntamente com os dados da comparação entre neurônios retrogradamente marcados e imunorreativos no SNC, permitiu concluir-se que o neuropeptídeo FMRF-amida parece ter uma grande importância na regulação motora da região do pneumóstoma, assim como a 5-HT, que provavelmente possui uma função motora ou modulatória nesta região, enquanto que a participação da dopamina no controle respiratório deve ser principalmente sensorial, responsável pelas informações provindas do tegumento do pneumóstoma.

Efeito de aminoácidos acumulados na felilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose sobre a atividade da piruvatoquinase em córtex cerebral de ratos

A cistinose é uma desordem sistêmica de estocagem autossômica recessiva hereditária rara, causada pelo transporte deficiente de cistina através da membrana lisossomal.. O acúmulo excessivo de cistina dentro dos lisossomos leva à destruição tecidual por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. O acúmulo de cistina no sistema nervoso central pode provocar sintomas neurológicos tais como: convulsões, tremores e retardo mental. A hipertriptofanemia é uma desordem metabólica rara, provavelmente causada por um bloqueio na conversão do triptofano a quinurenina, acumulando triptofano e alguns de seus metabólitos no plasma e tecidos dos pacientes. Os pacientes apresentam retardo mental leve a moderado com respostas afetivas exageradas, mudanças periódicas de humor, comportamento hipersexual, e ataxia, além de erosões cutâneas de hipersensibilidade e retardo no crescimento. A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade da enzima fenilalanina hidroxilase hepática que converte fenilalanina em tirosina. Esta doença é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de fenilalanina e seus metabólitos, fenilpiruvato, fenillactato, fenilacetato, feniletilamina e O-hidroxifenilacetato no sangue e outros tecidos. Pacientes não tratados podem apresentar severo retardo mental e psicomotor e, em alguns pacientes, irritabilidade, movimentos despropositados, reflexos diminuídos dos tendões, convulsões, formação deficiente de mielina e microcefalia. Apesar de haver um consenso sobre o papel da fenilalanina no dano cerebral, os mecanismos pelos quais a fenilalanina é neurotóxica parece serem múltiplos e ainda pouco conhecidos. Estas 3 doenças: fenilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose são caracterizadas como Erros Inatos do Metabolismo. Os pacientes afetados por qualquer uma destas patologias apresentam uma característica clínica comum: o dano cerebral. Considerando que o metabolismo energético parece estar alterado nas três doenças e que a piruvatoquinase é uma enzima crucial para o metabolismo da glicose e liberação/armazenamento de energia para o cérebro, decidimos estudar o efeito dos três aminoácidos acumulados nestas doenças (fenilalanina, triptofano e cistina) sobre a atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos, já que a alteração da atividade dessa enzima poderia contribuir para o dano cerebral característico nestes pacientes. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a o fenilalanina e o triptofano inibem a atividade da piruvtoquinase e que esta inibição pode pode ser prevenida por alanina. Quanto à cistina, os estudos in vitro mostraram que este aminoácido inibe a atividade da piruvatoquinase por dois mecanismos distintos, um dos quais parece envolver os grupos tiólicos da enzima e que pode ser prevenido e revertido pela cisteamina. Os estudos cinéticos sugeriram que a piruvatoquinase possui um sítio de ligação para aminoácidos (e talvez para alguns derivados de aminoácidos, como o fenilpiruvato) regulando a atividade da enzima. Se a inibição da atividade da piruvatoquinase também ocorrer nos pacientes afetados pelas doenças estudadas, é possível que medidas tais como a suplementação dietética de alanina e de glicose para os pacientes com fenilcetonúria e hipertriptofanemia e de cisteamina para os pacientes com cistinose, sejam benéficas. Entretanto, mais estudos são necessários antes de considerar o uso de tais medidas para os pacientes.

Indução de síntese de homoglobina em células K562 por doxorrubicina e aclarrubicina : em busca de um mecanismo comum

As leucemias são neoplasias que afetam o sistema hematopoiético e compreendem 2,53% dos casos de câncer relatados. Entre as leucemias, 27,95% correspondem a casos de leucemia mielóide crônica (LMC), que apresenta como marcador genético o cromossomo Philadelphia (Ph). Presente em mais de 80% dos casos, o cromossomo Ph é derivado da translocação t(9;22) (q34;q11), que origina um gene híbrido entre a região 5´ do gene bcr e 3´do gene abl. O produto deste gene é uma proteína Bcr-Abl na qual a atividade reguladora e nuclear do domínio tirosina quinase, originado da proteína Abl, torna-se constitutiva e citoplasmática. Estas mudanças na atividade tirosina quinase afetam diferentes vias de sinalização, com consequências em vários processos celulares como adesão, proliferação e apoptose. Em nível fisiológico, foi mostrado tanto in vitro quanto in vivo que as células hematopoiéticas precursoras Ph+ se diferenciam principalmente em células eritróides. Entretanto, quase 70% dos pacientes com LMC sofrem anemia, mostrando que, as células Ph+ diferenciadas em células eritróides não conseguem amadurecer até hemácias funcionais. Isto faz da LMC um bom modelo para o estudo da diferenciação de células eritróides e suas características, como os fatores que afetam a sintese de hemoglobina (Hb). A linhagem K562 é uma linhagem celular eritroleucêmica Ph+, amplamente utilizada como modelo para estudar drogas com capacidade anti-proliferativa e/ou indutoras da síntese de hemoglobina fetal. Entre estas drogas encontram-se a aclarrubicina (ACLA) e doxorrubicina (DOX) que, embora sejam análogos químicos pertencentes à família das antraciclinas, possuem mecanismos de ação diferentes e ainda não completamente esclarecidos. Neste trabalho, foram investigados vários aspectos da biologia das células K562 durante o tratamento com estas drogas. Foi observado que o tratamento com DOX produz um aumento de tamanho nas células e bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, afetando também grandemente a viabilidade celular, com 70% de células mortas no sétimo dia de tratamento. Já durante o tratamento com ACLA a viabilidade, tamanho e ciclo celular foram menos afetados, com aproximadamente 15% de células mortas no sétimo dia de tratamento e um bloqueio transitório do ciclo na fase G1. No entanto, as duas drogas causaram um aumento significativo da síntese de hemoglobina, principalmente DOX que induziu um aumento quase duas vezes maior que o induzido por ACLA. A análise da expressão gênica realizada através da técnica de differential display mostrou várias bandas diferencialmente representadas e com diversas cinéticas de expressão, apresentando semelhanças e diferenças quando são comparados os dois tratamentos ou células tratadas e controle. Destas bandas, 26 estão sequenciadas mostrando genes envolvidos em vários processos celulares como dano do DNA, resistência a drogas, processamento do RNA e codificação de proteinas relacionadas com ferro. Das bandas sequenciadas, 7 foram validadas por RT-PCR (ndrg1, erk2, nf2l2, atp6ap1, rfc1, phf20 e zkscan) sendo observado um aumento na sua expressão durante o tratamento, com exceção de ndrg1 para o qual a expressão foi induzida em vez de aumentada e nf2l2 onde a diferença com o controle foi pequena e não permitiu validar este gene como diferencialmente expresso. Com o objetivo de procurar por mecanismos comuns entre os vários indutores da síntese de hemoglobina em células K562, estes genes foram também analisados durante o tratamento destas células com os indutores hidroxiuréia e dGTP. Além de induzirem a expressão de hemoglobina, os dois tratamentos provocaram um aumento no tamanho das células tratadas e um bloqueio no ciclo celular na fase S. Visando futuros trabalhos envolvendo os genes diferencialmente expressos, foi ainda otimizado um sistema de transferência gênica por eletroporação. Para isto foram testados varios parâmetros como campo elétrico, resistência, capacitância, meios de eletroporação, manipulação das células e uso de inibidores de DNAses. Como resultado, foi alcançado com o eletroporador padrão uma eficiência de transfecção de 81%, similar àquela alcançada pelo nucleoporator (eletroporador de última geração). As condições estabelecidas foram 750 V/cm, resistência infinita, 500 μF, meio RPMI1640, centrifugação e sulfato de zinco pós-pulso. A relação das antraciclinas e a hidroxiuréia, assim como de outros indutores da síntese de hemoglobina, com o ferro intracelular, juntamente com a diferença na expressão, durante o tratamento, de genes afetados direta ou potencialmente pela não disponibilidade de ferro intracelular, nos permitiu gerar uma hipótese para a via de sinalização que leva à síntese de hemoglobina. Nesta, sinais de falta ou não disponibilidade de ferro nas células ativariam a maquinaria celular para a captação e internalização do ferro extra-celular, simultaneamente com síntese de proteínas que utilizam o ferro para realizar as suas funções biológicas, entre elas a hemoglobina. Do mesmo modo, propomos a via de sinalização do ferro como um alvo potencialmente afetado por drogas indutoras da síntese de hemoglobina, como as antraciclinas, cujos alvos são ainda pouco conhecidos. Contudo, mais genes desta via de sinalização, bem como outros indutores, deveram ser estudados para saber se a síntese de hemoglobina pode ser induzida por drogas mais específicas e com menos efeitos colaterais que aquelas usadas atualmente para o tratamento de câncer e outras doenças.

Biologia do gene pheA de Mycobacterium tuberculosis : clonagem, seqüenciamento e superexpressão do seu produto - a proteína prefenato desidratase

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Aspectos anatômicos do olho e neuroquímicos da retina do mocó (Kerodon rupestris)

The visual system is an important link between the animal and the environment, com profound influences on the habits and lifestyle in various habitats. Adaptive mechanismsto the temporal niche are present in the visual system of many vertebrates, involving changins in ocular dimensios and design, retinal cell distribution and organization of neurochemical circuits related to the retinal resolution or sensitivity. The sensory system of the eye is represented by the retina, whose organization is responsible by receipty, initial analysis, and transmission of the information to the brain. The knowledge of the position of the eyes in the head and the distribution of retinal cells allow to identify adaptive aspects of each species to its visual field, which is characteristic to the ecological niche it occupies. In this research, we study eye anatomical characteristics and retina neurochemical features of the rock cavy (Kerodon rupestris), a tipical Brazilian rodent from the suborder Hystricomorpha, family Caviidae. The rock cavy has lateral eyes well constitute bony orbit and well differentiated extrinsic muscle. The study of the descriptive and morphometric anatomy of the showed mean values of axial diameter 10.7±0,5mm and equatorial diameter 11.6±0.7mm. The pupil is slit shaped and the lens has mean axial diameter 5.4±0.03 mm, corresponding to ~45% of the axial diameter of the eye. The posterior nodal distance and the retinal magnification factor were estimated at 6.74 mm e 118 μm/grau, respectively. Flat mounts were processed for Nissl stain, and the topographic distribution of ganglion cells showed a moderate visual band, just below the optic disc, with higher density in the ventral retina. Retinal vertical sections and flat mounts were processed for immunohistochemistry to visualize tyrosine hydroxilase (TH) and thus two types of TH+ cells were detected. Type 1 cells had strong TH-immunoreactivity, the body cell varied from 120.047 to 269.373 μm2 stratifying in the sublamina 1 of the IPL. Type 2 cells were weakly TH-imunoreactive, had cell body located mostly in the IPL, varying from 54.848 to 177.142 μm2, constituting ~10% of the TH+ cells. Both cell types exhibited similar topographic distribution with higher density found in a horizontal band along of the naso-temporal axis in the dorsal retina. The total population of dopaminergic cells was 2,156±469,4 cells, occupying an average area of 198,164 μm2. The presence of cones and rods was detected by immunohistochemistry in vertical sections and flat mounts. S cones density is around 10 times smaller than L cones, with different degree of spatial organization. Other retinal neuronal populations of the rock cavy were also detected in vertical sections with specific markers. Comparative analysis of the anatomical characteristics of the rock cavy eye 12 suggest that it was designed to acquire higher sensitivity to light, at expense of image sharpness, compatible with a vision at mesopic conditions. Additionally, the distribution of the 2 subtypes of dopaminergic cells in a naso-temporal band in the dorsal retina seems suitable to a gain in sensitivity, coherent with an animal with predominantly crepuscular activity pattern

Participação do circuito dopaminérgico nas alterações do comportamento de medo inato de camundongos infectados pelo Toxoplasma gondii

The protozoan parasite Toxoplasma gondii transforms the innate aversion of rats for cat urine into a fatal attraction, that increases the likelihood of the parasite completing its life cycle in the cat s intestine. The neural circuits implicated in innate fear, anxiety, and learned fear all overlap considerably, raising the possibility, that T. gondii may disrupt all of these nonspecifically. In this study, we evaluated immunoreactivity for tyrosine hydroxylase (TH) in areas associated with innate fear of infected male swiss mice. The latent Toxoplasma infection converted the aversion of mice to feline odors into attraction. This loss of fear is remarkably specific, as demonstrated by Vyas et al (2007), because infection did not diminish learned fear, anxiety-like behavior, olfaction, or nonaversive learning. However, the neurochemical mechanism related to alterations in innate fear due to T. gondii infection remains poorly studied. 20 mice were inoculated with bradyzoites (25 cysts) from a Toxoplasma gondii (Me-49 strain). The brains were removed after 60 days, sectioned and processed for TH immunohistochemistry. The correlation between the amount of cysts per area and the densitometric analysis of neurotransmitter reactivity was low in the areas implicated in innate fear of infected animals, when comparated with noninfected controls

Efeitos da estimulação ambiental sobre os aspectos motores, cognitivos e neuronais em um modelo farmacológico progressivo da doença de Parkinson

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior