Interactions of ingested food, beverage, and tobacco components involving human cytochrome P4501A2, 2A6, 2E1, and 3A4 enzymes

Human cytochrome P450 (P450) enzymes are involved in the oxidation of natural products found in foods, beverages, and tobacco products and their catalytic activities can also be modulated by components of the materials. The microsomal activation of aflatoxin B1 to the exo-3,9-epoxide is stimulated by flavone and 7,8-benzoflavone, and attenuated by the flavonoid naringenin, a major component of grapefruit. P4502E1 has been demonstrated to play a potentially major role in the activation of a number of very low-molecular weight cancer suspects, including ethyl carbamate (urethan), which is present in alcoholic beverages and particularly stone brandies. The enzyme (P4502E1) is also known to be inducible by ethanol. Tobacco contains a large number of potential carcinogens. In human liver microsomes a significant role for P4501A2 can be demonstrated in the activation of cigarette smoke condensate. Some of the genotoxicity may be due to arylamines. P4501A2 is also inhibited by components of crude cigarette smoke condensate. The tobacco-specific nitrosamines are activated by a number of P450 enzymes. Of those known to be present in human liver, P4501A2, 2A6, and 2E1 can activate these nitrosamines to genotoxic products.

Cytochrome p450 1b1, a new keystone in gene-environment interactions related to human head and neck cancer?

Alcohol consumption and tobacco smoking are major causes of head and neck cancers, and regional differences point to the importance of research into gene-environment interactions. Much interest has been focused on polymorphisms of CYP1A1 and of GSTM1 and GSTT1, but a number of studies have not demonstrated significant effects. This has mostly been ascribed to small sample sizes. In general, the impact of polymorphisms of metabolic enzymes appears inconsistent, with some reports of weak-to-moderate associations, and with others of no elevation of risks. The classical cytochrome P450 isoenzyme considered for metabolic activation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) is CYP1A1. A new member of the CYP1 family, CYP1B1, was cloned in 1994, currently representing the only member of the CYP1B subfamily. A number of single nucleotide polymorphisms of the CYP1B1 gene have been reported. The amino acid substitutions Val432Leu (CYP1B1*3) and Asn453Ser (CYP1B1*4), located in the heme binding domain of CYP1B1, appear as likely candidates to be linked with biological effects. CYP1B1 activates a wide range of PAH, aromatic and heterocyclic amines. Very recently, the CYP1B1 codon 432 polymorphism (CYP1B1*3) has been identified as a susceptibility factor in smoking-related head-and-neck squamous cell cancer. The impact of this polymorphic variant of CYP1B1 on cancer risk was also reflected by an association with the frequency of somatic mutations of the p53 gene. Combined genotype analysis of CYP1B1 and the glutathione transferases GSTM1 or GSTT1 has pointed to interactive effects. This provides new molecular evidence that tobacco smoke-specific compounds relevant to head and neck carcinogenesis are metabolically activated through CYP1B1 and is consistent with a major pathogenetic relevance of PAH as ingredients of tobacco smoke.

Re-evaluation of the effect of smoking on the methylation of N-terminal valine in haemoglobin

In view of the established extrapulmonary cancer sites targeted by smoking a multiplicity of compounds, and mechanisms might be involved. It has been debated that smoking caused increased incidence of N-methylvaline at the N-terminus of haemoglobin. Because this could indicate a relevance of methylating nitrosamines in tobacco smoke, data are presented from an industrial cohort of 35 smokers and 21 non-smokers repeatedly monitored between 1994 and 1999. In general, N-methylvaline adduct levels in haemoglobin of smokers were approximately 50% higher than those of non-smokers. The smoking-induced methylation of haemoglobin is likely to be caused by dimethylnitrosamine (N-nitroso-dimethylamine), a major nitrosamine in side-stream tobacco smoke. The biomonitoring data emphasise the potential value of N-methylvaline as a smoking-related biomarker and call for intensified research on tobacco smoke compounds that lead to macromolecular methylation process.

In the Solanaceae, a hierarchy of bHLHs confer distinct target specificity to the anthocyanin regulatory complex

The anthocyanin biosynthetic pathway is regulated by a transcription factor complex consisting of an R2R3 MYB, a bHLH, and a WD40. Although R2R3 MYBs belonging to the anthocyanin-activating class have been identified in many plants, and their role well elucidated, the subgroups of bHLH implicated in anthocyanin regulation seem to be more complex. It is not clear whether these potential bHLH partners are biologically interchangeable with redundant functions, or even if heterodimers are involved. In this study, AcMYB110, an R2R3 MYB isolated from kiwifruit (Actinidia sp.) showing a strong activation of the anthocyanin pathway in tobacco (Nicotiana tabacum) was used to examine the function of interacting endogenous bHLH partners. Constitutive expression of AcMYB110 in tobacco leaves revealed different roles for two bHLHs, NtAN1 and NtJAF13. A hierarchical mechanism is shown to control the regulation of transcription factors and consequently of the anthocyanin biosynthetic pathway. Here, a model is proposed for the regulation of the anthocyanin pathway in Solanaceous plants in which AN1 is directly involved in the activation of the biosynthetic genes, whereas JAF13 is involved in the regulation of AN1 transcription.

Host-delivered RNAi: An effective strategy to silence genes in plant parasitic nematodes

Root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) are obligate, sedentary endoparasites that infect many plant species causing large economic losses worldwide. Available nematicides are being banned due to their toxicity or ozone-depleting properties and alternative control strategies are urgently required. We have produced transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants expressing different dsRNA hairpin structures targeting a root-knot nematode (Meloidogyne javanica) putative transcription factor, MjTis11. We provide evidence that MjTis11 was consistently silenced in nematodes feeding on the roots of transgenic plants. The observed silencing was specific for MjTis11, with other sequence-unrelated genes being unaffected in the nematodes. Those transgenic plants able to induce silencing of MjTis11, also showed the presence of small interfering RNAs. Even though down-regulation of MjTis11 did not result in a lethal phenotype, this study demonstrates the feasibility of silencing root-knot nematode genes by expressing dsRNA in the host plant. Host-delivered RNA interference-triggered (HD-RNAi) silencing of parasite genes provides a novel disease resistance strategy with wide biotechnological applications. The potential of HD-RNAi is not restricted to parasitic nematodes but could be adapted to control other plant-feeding pests.

Mechanism of gallic acid biosynthesis in bacteria (Escherichia coli) and walnut (Juglans regia)

Gallic acid (GA), a key intermediate in the synthesis of plant hydrolysable tannins, is also a primary anti-inflammatory, cardio-protective agent found in wine, tea, and cocoa. In this publication, we reveal the identity of a gene and encoded protein essential for GA synthesis. Although it has long been recognized that plants, bacteria, and fungi synthesize and accumulate GA, the pathway leading to its synthesis was largely unknown. Here we provide evidence that shikimate dehydrogenase (SDH), a shikimate pathway enzyme essential for aromatic amino acid synthesis, is also required for GA production. Escherichia coli (E. coli) aroE mutants lacking a functional SDH can be complemented with the plant enzyme such that they grew on media lacking aromatic amino acids and produced GA in vitro. Transgenic Nicotiana tabacum lines expressing a Juglans regia SDH exhibited a 500% increase in GA accumulation. The J. regia and E. coli SDH was purified via overexpression in E. coli and used to measure substrate and cofactor kinetics, following reduction of NADP(+) to NADPH. Reversed-phase liquid chromatography coupled to electrospray mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) was used to quantify and validate GA production through dehydrogenation of 3-dehydroshikimate (3-DHS) by purified E. coli and J. regia SDH when shikimic acid (SA) or 3-DHS were used as substrates and NADP(+) as cofactor. Finally, we show that purified E. coli and J. regia SDH produced GA in vitro.

Evaluación de productos naturales para el manejo del gorgojo del frijol (Acanthoscelides obtectus say) y el gorgojo del maiz (Sitophilus zeamais M)

El trabajo se realizó en el laboratorio del Programa Nacional de Postcosecha / INTA , de Junio de 1997 a Diciembre de 1997. El objetivo fue generar información sobre los productos botánicos; Paraíso (Melia Azederach L ), Zorrillo (Petiveria Alliceae L), Tabaco (Nicotiana tabacum,L), Amarguito (Tecoma stan L), Ajo (Alium sativum L) y el producto natural ceniza de diferentes especies de madera, para el control de plagas en granos almacenados. Para ejecutar el estudio se utilizó una población de gorgojos de frijol y maíz existente en el laboratorio del Programa Nacional de Postcosecha /INTA. El frijol y el maíz previo a ser utilizado para el cultivo y bioensayo se fumigó en un silo metálico de un quintal de capacidad con fosfamina siguiendo las recomendaciones del Programa Nacional de Postcosecha. La forma de utilización de los productos fue; Paraíso (5%), semilla seca a la sombra y molida, Zorrillo (5%), raices seca a la sombra y molida, Tabaco (5%),venas seca a la sombra y molida, Amarguito (5%), hojas seca a la sombra y molida, Ajo (4%), bulbo seco a la sombra y molido y ceniza (25%) de diferentes especies de madera, la cual fue recolectada de diferentes de productores, se utilizó el producto Actellic 2% como testigo comparativo. Se utilizó frascos plástico de dos litros de volumen como unidad experimental en las cuales se introdujeron 1500 granos de maíz y frijol, se utilizaron tres repeticiones por tratamiento. Se utilizaron gorgojos de dos semana de edad. En el bioensayo del frijol el mejor tratamiento de los productos evaluados fue el Paraíso (5%), presentando un porcentaje de daño final del 46% y un porcentaje de pérdida de peso final de 9%, los productos que mostraron menor infestación inicial fue la ceniza y el Amarguito presentando una infestación inicial de 6 y 25 insectos respectivamente. En el bioensayo del maíz el mejor de los tratamientos evaluados fue la ceniza 25%, la cual presentó un porcentaje de daño final de 1.33%, un porcentaje de pérdida de peso final de 0.21%, los tratamientos donde hubo menor infestación inicial fue en el Amarguito y el Tabaco con 15 y 18 insectos respectivamente.

Análisis de riesgo de plagas de importancia fitosanitaria para Nicaragua en la importación de semilla de cebolla (Allium cepa L.) procecedente de Canadá

El presente Análisis de riesgo de Plagas (ARP) se realizó en el Centro Nacional de Diagnóstico Fitosanitario (CNDF) y Cuarentena del MAG-FOR en Managua, Nicaragua, e1 cual tuvo por objetivo evaluar el riesgo de introducción, establecimiento y dispersión de plagas de importancia fitosanitaria para Nicaragua en semilla de cebolla (Allium cepa L.) importada de Canadá, así como determinar las medidas adecuadas de protección fitosanitarias para evitar la introducción de las mismas a Nicaragua. De un listado inicial de 18 plagas, sólo 6 plagas son sujetas a evaluación y manejo del riesgo después de pasar por las tres etapas de evaluación de un ARP según la Norma Centroamericana del OIRSA, por considerarse que estas presentan capacidad biológica y de comportamiento, así como rangos óptimos de temperaturas que se asemejan a las condiciones de clima de las zonas productoras de Allium cepa L. del país. (Anexo1). El cuadro 1 contiene la lista de las plagas no sujetas a Evaluación del Riesgo Puccinia allii ( DC) Rudolphi y Urocistis Cepulae. Frost que causan la Roya y el carbón de la cebolla respectivamente son consideradas plagas específicas de los cultivos del género Allium P. allí es considerada plaga de bajo riesgo de introducción al país siendo la limitante para su establecimiento que su óptimo de temperatura ( 1 O" a 15" C), no se asemeja a las condiciones de temperatura de las zonas productoras del país( Anexo l ), mientras que U. cepulae es considerado como un hongo muy peligroso capaz de provocar pérdidas en la producción de hasta 80 por ciento tiene alta probabilidad de establecimiento v diseminación en las zonas productoras del país va que las condiciones de edafoclímaticas (16-22" C y pH 5-8) le favorecen( Anexo 1) Botryotinia squamosa. Viennot-Bourgín es un hongo que causa la pudrición blanda de la cebolla, se considera una plaga especifica de cultivos del género Allium con probabilidad alta de establecimiento v disemmac1ón en las zonas productoras de cebolla del país ya que el rango superior óptimo de temperatura (23" C) se asemeja a las condiciones de temperatura de las mismas (Anexo 11. Sclerotium cepivorum. Berkeley (1841 ). Es un hongo que causa la pudrición blanca de la cebolla y es considerado una plaga general de corto rango de hospedero quien además de atacar a cultivos del género Allium ataca también a lycopersicum esculentum (tomate) puede causar pérdidas en la producción de hasta un 70 por ciento (promedio) Y, con riesgo Alto de establecimiento en el país ya que temperaturas de 1 0"-20" C y baja humedad 40%. (pariona et. al) inclusive 30"- 5"C cuando hay humedad (Agrios 1985) y pH desde 1.4 a 8.8 le favorecen y las condiciones edafoclimáticas de las zonas productoras de cebolla del país se asemejan (Anexo ll). El nemátodo Ditylenchus dipsaci es un endoparásito destructor, y es considerado plaga general de cultivos del género Allium que ataca otros cultivos como cucurbitáceas. Zea mays (Maíz), Solanum tuberosum (Papa) y Nicotiana Tabacum (Tabaco). Es capaz de reducir la producción hasta un 75 por ciento (promedio) y la probabilidad de ingreso al país es media, a pesar de que su óptimo de temperatura (15º C) no se asemejan a la temperatura de las zonas productoras de cebolla del país. se considera de gran importancia sus características como: gran capacidad reproductiva es endoparásito y podemos encontrarlo dentro de cualquier parte de la planta inclusive dentro de la semilla. Aphelenchoides fragariae es un nematodo que tiene por hospedero secundario a Allium cepa. L puede ser capaz de ocasionar pérdidas en la producción de hasta 66.5% (promedio), es considerado plaga general de cultivos del género Allium con baja probabilidad de ingreso al país, va que su hospedero primario es la fresa y no se reportan daños en cebolla (no preferencia por Allium cepa L que es hospedero secundario) Todas estas plagas son consideradas de categoría A 1 1 para Nicaragua (no presentes en el país), lo que justifica plenamente la realización de este ARP a fin de tomar las medidas pertinentes que acompañen la importación de semilla y así evitar la introducción de nuevas plagas de difícil control.

Caracterización biológica y molecular de geminivirus que afectan el cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum Mill) en Nicaragua

El objetivo del presente trabajo consistió en la caracterización biológica y molecular de geminivirus que afectan el cultivo del tomate (Licopersicon esculentum Mili.), el estudio se realizó en la Universidad Nacional Agraria (UNA), en el período de enero 2001 a enero 2002. Se efectuó en tres fases: la primera fase de invernadero, donde se utilizaron plantas de tomate de la variedad UC-82, crías de mosca blanca (Bemisia tabaci Genn), fuente original del aislado del geminivirus de Condega, con el objetivo de caracterizar biológicamente el geminivirus, a través de periodos de adquisición, inoculación y retención, previamente para la realización de estos periodos, se determinó el porcentaje de transmisibilidad de la colonia de mosca blanca, el cual fue de 45% Jo que indicó que para asegurar la transmisibilidad del virus fue necesario usar 5 moscas por planta. Los períodos de adquisición e inoculación fueron los tiempos de 2, 5, 10 y 30 minutos, 1, 2, 4, 8, 10, 12, 18, 24 y 48 horas con 3 repeticiones de cada periodo, los datos obtenidos de estos periodos fueron analizados mediante un análisis de regresión logístico binario, resultando que el vector fue capaz de adquirir y transmitir el virus tanto en 1 O minutos (40% y 33%) como en 48 horas (60% y 66.66%) respectivamente, respecto al periodo de retención se estableció realizándose un promedio de los porcentajes de severidad de las 3 repeticiones mostrando como resultado que el vector conservó su capacidad de transmisión del virus hasta el sexto día con 45.07% de transmisibilidad, también se evaluaron 5 especies de la familia solanáceas injertándolas con plantas afectadas con el genminivirus de Condega, para conocer cuáles son hospederas del virus, resultando la especie Nicotiana tabacum cv. Benthamiana con síntomas del virus. En esta misma fase se evaluaron 4 materiales de tomate (55, 111, 148, 112) usando como testigo la variedad UC-82, se utilizó un Diseño Completamente al Azar (DCA) y se evaluó la variable severidad de la enfermedad a los datos obtenidos a través de ANDEVA y separación de medias según Duncan, estos materiales se evaluaron mediante cuatro tratamientos (inoculaciones), el primero a los 7 ddt, el segundo a los 14 ddt, el tercero a los 21 ddt y el último tratamiento fueron las plantas sin inocular (testigos), el análisis indicó que la variedad UC-82 fue la más susceptible ante el complejo mosca blanca-geminivirus presentando mayores porcentajes de severidad y el material 112 resultó el más resistente, con menos porcentajes de severidad. La segunda fase se realizó fuera del invernadero, evaluándose ante el complejo mosca blanca-geminivirus 3 materiales, incluyendo la variedad UC-82 como testigo. Se utilizó un Diseño completamente al Azar, tomando en cuenta las variables severidad, incidencia y población de mosca blanca, A los datos obtenidos se les realizó ANDEVA y separación de medias según Duncan, el que mostró que el material 55 fue el mejor, ya que presentó menos porcentaje de severidad (40%), el peor material fue lavar. UC-82 ya que mostró 58.75% de severidad, con relación a la incidencia todos los materiales evaluados resultaron al final de los muestreos con igual porcentaje de incidencia (!00%) y en el caso de la población de mosca blanca la variedad UC-82 fue la que presentó más adultos por planta en comparación con el resto de materiales. La tercera fase fue realizada en el laboratorio de biología molecular en la UNA y Suecia con el propósito de caracteri7ar molecularmente los geminivirus de Condega., Santa Lucía y Sébaco, secuenciando un fragmento de 1200 pares de bases del componente A para comparar a través de las secuencias de nucleótidos los porcentajes de similitud que existen entre ellos, dando como resultado que el geminivirus de Sébaco con el de Santa Lucía alcanzó mayor porcentaje de similitud con un 95.2 con respecto al geminivirus de Condega que obtuvo un 89.0%.

Determinación del período de adquisición, inoculación y retención del geminivirus transmitido por la mosca blanca (Bemisia tabaci Genn) en el cultivo de tomate (Licopersicon esculentum Mill) en el Valle de Sébaco

El objetivo del presente trabajo consistió en la caracterización biológica de un geminivirus que afectó el cultivo del tomate ( Licpersicon esculentum Mill ). El estudio se realizó en la Universidad Nacional Agraria (UNA), en el periodo de enero 2001 - enero del 2002. Esta i nvestigación se realizó en tres fases: la primera de invernadero, donde se cultivaron plantas de tomate de la variedad UC - 82, se improvisó una cría de moscas blancas ( Bemisia tabaci Genn) vector del geminivirus en estudio y donde se estuvo reproduciendo el geminivirus de Sébaco en las plantas de tomate de la variedad ya mencionada, que servirían posteriormente como fuente de inóculo, esto se hizo por medio de injertos e inoculaciones, con el propósito de caracterizarlo biológicamente determinando los periodos de adquisición, inoculación, retención así como el rango de hospedero. Para este estudio se determinó a demás el porcentaje de infectividad de las colonias de moscas blancas, el cual fue de 66.6%, lo que indicó que se necesitaban cinco moscas por tratamiento, ya que estas garantizarían que al menos tres de ellas serían portadoras del geminivirus una vez que han adquirido el virus de la fuente de inóculo. Los tratamientos consistían en los diferentes tiempos expresados en horas como 0.08, 0.16, 1, 2, 4, 8, 10, 12, 18, 24, 48, h con tres repeticiones para cada uno de ellos. La fase de laboratorio de vectores consistió en llevar a cabo prácticamente los periodos de adquisición, inoculación y retención, los cuales dieron como resultados que B.tabaci necesita alimentarse de una planta infestada tan sólo 0.16 h que es equivalente a 10 minutos para adquirir el virus y que necesita un mismo tiempo para transmitirlo una vez que se ha alimentado en una planta sana. Respecto al periodo de retención el vector es capaz de retener las partículas virales hasta un séptimo día y que a medida que pasan los días la capacidad de transmisión disminuye. En el estudio era también objetivo conocer cual era el rango de hospedante que tenía el geminivirus de Sébaco, por lo que se evaluaron 5 especies de la familia Solanácea, injertándolas con plantas infestadas del cultivo del tomate, resultando la especie Nicotiana tabacum cv Benthamiana con síntomas del virus. La última fase se llevó a cabo en el laboratorio de Biología Molecu lar donde se analizó a través de la técnica de PCR la presencia y ausencia de geminivirus en las plantas con las que se estuvo trabajando en el transcurso de la investigación. Finalmente los resultados obtenidos en los diferentes periodos fueron analizados mediante un análisis de Regresión Logística Binaria, ya que los datos eran categóricos, es decir, cuyas respuestas son de sí o no en otras palabras presencia o ausencia del geminivirus, donde la presencia era igual a uno y la ausencia de este mismo igual a cero.

La Agricultura de las Antillas: Un aporte substancial al mundo

A partir del 12 de octubre de 1492, el mundo ya no fue el mismo. El almirante Cristóbal Colón tocada tierras de un nuevo continente, al que llamaría América. Cuando descubrió Las Antillas, encontró que estas islas estaban habitadas por diversas tribus donde la agricultura era el epicentro de sus vidas, de sus usos y costumbres. De ella se han heredado muchas y se encuentran vigentes de uso cotidiano. El presente trabajo hace descripción de algunas de estas vigencias y se citan ejemplos de su variada influencia como los nombres de: maní (Arachis hypogea L.), maíz (lea mays L.) guanábana (Annona muricata L.), pitahaya (Hyfocereus undatus B & G) y tabaco (Nicotiana tabacum L.), en usos particulares en el caso del mamey (Mammea americana L.), icaco (Chysobafanus icaco L.) y yuca (Manihot esculenta C.), con propósito alimenticio el quequisque (Xanthosoma sagittifolium Shott), batata (lpomoea batatas L.) y topee tambo (Caffathea affonia) y de origen autóctono como la piña (Ananas comosus L.), nancite (Byrsonima crassifolia H.B.K.), guayaba (Psidium guajava L.), coco (Cocos nucifera L.), caímito (Chysophylum caimito L.), guayacán (Guayacum sanctum L.) y la caoba ( Swietenia microphyfa L.).

小麦肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）基因的分离和功能分析

作为植物界广泛存在的一类酚类聚合物，木质素是陆生植物正常生长发育过程中非常重要的生物大分子，而且与人类的生活息息相关。利用分子生物学手段和基因工程方法，从小麦中分离木质素生物合成途径的关键酶-肉桂酰辅酶A还原酶基因（CCR），研究肉桂酰辅酶A还原酶基因在木质素代谢途径中的调控规律，从其催化的限速步骤入手，来调控木质素的合成，有效的改变木质素的组成、含量和结构，是改善木质素在植物生长发育中的作用乃至开发木质素资源的关键所在。本文就小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因的分离、表达特征及其在木质素合成途径中的作用开展了研究工作。 首先用RACE方法从小麦中克隆了CCR的两个cDNA的部分序列，序列分析表明它们编码的蛋白具有CCR的典型特点，GC含量高于均60%，两者在核酸水平和蛋白水平的同源性为76%和 69%，证明在小麦中至少存在着两个CCR基因。通过 RT-PCR和Northern 杂交确定W-cr6和W-cr19在小麦的发育中具有不同的表达特征，W-cr6主要在茎中表达，而W-cr19的表达集中在根中。以W-cr6为探针，从cDNA文库中筛选到一个全长1317bp的cDNA，命名为TaCCR1。TaCCR1包括开放阅读框 (ORF) 1047bp、5′端侧翼 72bp和3′端侧翼198bp的非翻译序列。TaCCR1能够编码由349个氨基酸组成的蛋白质，预期的分子量为37.4kD。同源性比较显示TaCCR1基因在核酸水平和蛋白质水平与其他物种的CCR基因的同源性高于60%。 为了分析CCR在木质素合成中的作用，用TaCCR1构建了用于转化烟草的正义和反义表达载体pStCCR和pAtCCR、用于转化小麦的正义和反义表达载体pBSC1和pBAC1。通过农杆菌介导得到了30株反义转基因烟草和12株正义转基因烟草。由于外源基因的抑制作用，转基因烟草在形态、木质素组成和含量、木质部显微结构上都程度不同的发生了变化。正义和反义的转基因株系呈现出株型矮化、木质素含量下降、木质部导管细胞壁受到破坏等现象。同时利用花粉管通道法转化小麦种子5000多粒，部分处理经过初步的PCR和 Southern分子鉴定获得了1株转基因株系，需要对其遗传、生理和形态特征做进一步的研究。 本文还对木质素对小麦茎杆的机械强度的影响做了初步的探讨，得到的结果是小麦茎杆的木质素含量、维管束的数量、茎杆有效的横界面积与其最大弯曲应力存在着正相关，而维管束的结构、密度对茎杆的最大弯曲应力没有明显的影响，从而为通过CCR基因来改善小麦茎杆的抗倒特性建立了生理学基础。

普通烟草与毛曼陀罗族间体细胞杂交的研究

采用PEG／DMSO融合法，从普通烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthi nc)叶肉和毛曼陀罗(Datura innoxia Mill.)茎或叶愈伤组织原生质体融合获得I5株花盆中健康生长的族间体细胞杂种植株;其中11株是在没有选择压力的条件下获得，4株则是在有IOA和R6G选择系统存在下获得。同时获得一株试管开花且形态异常的植株和一株花盆中生长的嵌合植株。lOmM IOA和I5μ g／ml R6G均能分别有效地抑制烟草叶肉和毛曼陀罗愈伤组织原生质体的分裂;10% DMSO能显著提高原生质体融合率;PEG种类并不重要，但浓度则很重要;BAP较ZT，KT对植株分化有更好的诱导效果。杂种的形态、细胞、同工酶、Southern杂交，花粉育性分析结果如下：1、l5株杂种较双亲普遍株型矮小，生长缓慢，形态接近烟草但不很正常，根据形态特征可分为两种类型：(1)共有8株，其叶片大小、形状、颜色、开花习惯、花类型（单花）等均与毛曼陀罗接近，但子房败育;(2)共有7株，其株型、叶片形状、颜色、光滑度、花形状、类型（圆锥状花序）、颜色更接近烟草，但少数杂种开单花或先单花后圆锥状花序或先单花后两种花并存，且开花时间不一，部分子房败育。2、杂种染色体数目大都在60～90之间，个别者较少(48条)或较多(125条)，没有一株为双二倍体(2n=96)，并全部为混倍体。3、15株杂种植株均有双亲的细胞色素氧化酶同工酶特征谱带;大部分都有双亲的过氧化物酶同工酶特征谱带，少都仅具烟草的谱带。4、Hae Ⅲ／水稻rDNA的Southern杂交分析表明杂种1较双亲多一条谱带，杂种2较双亲也多一条弱带，其它杂种尚待定。5、花粉活力测定表明毛曼陀罗（种子再生而来）的为99%，烟草（原生质体再生而来）为80～90%，而杂种的为24～61%，育性普遍低于双亲。

体细胞无性系变异与烟草抗黑胫病细胞突变体的筛选

体细胞无性系变异是植物组织培养过程中发生的一种较为普遍的现象，这种现象在遗传学理论和育种实践上都很值得研究。应用这种变异进行筛选人们已经获得了一大批生产上有广泛意义的细胞突变体。但对于无性系变异发生的机理，人们虽然也进行了详细研究，提出了不少假说，但一直未能给出一个较为全面的解释。有些解释仍然建立在推测的基础上，有待进一步的研究。在这些解释中，利用转座子活化进行解释是最使人感兴趣的一种，也是较有说服力的一种。我们的实验分为两个部分，一是对无性系变异发生与转座子的关系进行了初步的探索,一是利用体细胞无性系变异筛选烟草黑胫病细胞突变体的应用进行了研究。 对转座因子的转活性进行分析，通常采用标记基因的表型检测。本实验用农杆菌双元载体pSLJ721（Ac∷GUS）转化烟草（品种：红花大金元）， 然后对转基因烟草的愈伤组织进行GUS酶活性的组织化学分析。通过GUS活性变化来分析转座活性。结果表明组织培养可以增强转座子的活性。间接证明转座子活化是体细胞无性系变异的原因之. 本论文实验方面的另一部分是体细胞无性系变异在烟草抗黑茎病研究上的应用。烟草黑茎病是由烟草致病疫霉引起的一种烟草主要病害。首先从云南地区黑胫病病区分离、纯化黑胫病（Phytophythora parasitica via. Nicotina）病原菌，同时利用红花大金元为实验对象，以组织培养中自然发生的元性系变异为基础，以50％以及80％的黑胫病病菌粗毒素为选择压力，筛选出抗黑胫病毒素的烟草株系，用离体叶片法和茎部接种法进一步鉴定其对黑胫病病菌的抗性。最后进行田间检测以期获得综合性状优良的抗黑胫病细胞突变体。另外我们还利用随机引物扩增多态DNA（RAPD）分析技术，对选择到的九个抗病株系和六株对照的DNA进行分析。在使用的70种随机引物中，共有57个引物产生可检测扩增产物，产生306条搁增带，其中有多态性的条带数为51条，突变体的平均RAPD条带变异率为1.85％，其中有两个RAPD条带（CYA－17－100和Sangon03-350）为突变体所特有，可初步判断为抗黑胫病的RAPD标记。对突变体和对照植株叶片水溶性蛋白SDS电泳观察到一些条带的变异，但没有找到突变体特异的共同条带。

转基因植物生产生物可降解塑料PHB的研究-phbA功能鉴定、多价表达载体的构建及转基因植物的获得

聚-β-羟基链烷酸（PHA）是许多微生物作为碳源、能源的一类贮藏性聚酯，具有广泛的应用价值。该聚酯可被微生物完全降解且有与塑料相似的性质，因而研究并提高PHA在植物中的合成为解决环境污染提供了新的解决途径。 聚-β-羟基于酸酯（PHB）是研究的最早、研究的最清楚的一种PHA。用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）中合成PHB的一个关键酶——3-酮硫裂解酶基因phbA。DNA序列分析表明所克隆的基因与国外报道序列同源性很高，只有一个碱基对的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率，构建了带有导肽基因的组成型表达载体，由根癌农杆菌介导转化烟草（Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38）得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明导肽可以将外源蛋白定位于质体，phbA基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实了转基因烟草中phbA编码的3-酮硫裂解酶可以催化乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。 将携有导肽序列的phbC（编码PHB合酶）和phbB（编码乙酰乙酰-CoA还原酶）连入pBIB-HYG得到组成型表达载体pZCB，用冻融法转入根癌农杆菌，介导转化烟草。烟草为已获得的具有卡那霉素抗性整合并表达phbA的转基因烟草。通过二次转化将携有潮霉素抗性的phbB基因和phbC基因导入已整合phbA的烟草，各基因均由质体导肽控制，最后得到整合PHB合成的三个酶基因的转基因烟草。转基因烟草经PCR、PCR-Southern检测，初步确定整合phbB和phbC烟草植株。以气相色谱初步分析，转基因烟草中PHB的含量可达鲜重的0.233%。 结果表明phbB和phbC基因可以在真核表达系统中编码相应的蛋白。通过色素分析、荧光动力学等手段分析了PHB在叶绿体中的累积对其功能的影响。 为了提高底物乙酰-CoA的供应能力及减少惰性聚酯对植物体的伤害，分离了种子特异性启动子和质体导肽序列，利用忆经克隆的合成PHB的三个关键酶基因，通过一系列DNA重组，分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合phbC、phbB的二价表达载体pSCB及嵌合phbC、phbA、phbB的三价表达载体pSCAB，并由导肽将基因表达产物定位于质体。经根癌农杆菌介导转化油菜（Brassica napus L.) H165，获得转基因油菜植株，并进行了PCR、Southern blot及RT-PCR-DNA杂交等分检测。结果表明，三基因已经分别整合到相应的转基因油菜中，并已在转录水平表达。同时转化了油菜不育系、恢复系和保持系，获得批量转化株，并移入温室栽培。