Multibiomarker assessment of cadmium-based quantum dots effects in the marine mussel Mytilus galloprovincialis

Tese de Doutoramento, Ciências do Mar, da Terra e do Ambiente, Ramo: Ciências e Tecnologias do Ambiente, Especialização em Ecotoxicologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016

Physiological Determinants of Invasive Success Linking Distribution Patterns to Metabolic Physiology in Native and Invasive Blue Mussels (genus Mytilus)

In the early 20th century, a blue mussel species from the Mediterranean invaded the California coast and subsequently out-competed the native species south of Monterey Bay. Like other invasive species, Mytilus galloprovincialis has physiological traits that make it successful in habitats formerly occupied by the native M. trossulus, namely its adaptation to warm sea surface temperatures. This study looks at the current genotype distributions and enzymatic activities of field-acclimatized mussels within the hybrid zone where the species co-occur as well as mussels that have been acclimated for four weeks to different temperature and salinity conditions. In the field-acclimatized and laboratory-acclimated mussels, the native species exhibited significantly higher enzyme rates, which may reflect an evolutionary adaptation to compensate to low habitat temperatures. Indeed, the results of the laboratory acclimation indicate that these differences are genetically based. Whether an acclimation capacity exists may require even longer-term acclimation to different temperatures. Current findings suggest that the further spread of the invasive species is likely to be governed in large measure by the potentially counteracting effects of rising temperatures, which would favor the northerly spread of M. galloprovincialis, and increased winter precipitation, which would favor the persistence of M. trossulus. However, the success of M. galloprovincialis during acclimation to ‘dilute’ salinity (25 ppt) suggests that the invasive species can tolerate a greater salinity range than previously thought. Thus, further investigation is needed to build a comprehensive predictive model of the movement of M. galloprovincialis and the hybrid zone along the California coast.

Aspects Of Gametogenesis In The Marine Mussel Mytilus-Edulis-L

Marine bivalve molluscs have in recent years attracted considerable attention for a variety of reasons, not least of which is their importance as a source of food for man. Much of this research has concentrated on studies of reproduction; Mytilus viridis (India: Nagabhushanam & Mane, 1975), M. edulis aoteanus and Aulacomya maoriana (New Zealand: Kennedy, 1977);Choromytilus meridionalis and Aulacomya ater (South Africa: Berry, 1978); Mytilus (= Perna) perna (Brazil: Lunetta, 1969); M. edulis planulatus (Australia: Wilson & Hodgkin, 1967); Mytilus californianus and M. edulis (U.S.A.: Hines, 1979); Mytilus galloprovincialis (France: Lubet, 1959) and M. edulis (U.K.: Chipperfield, 1953; Seed, 1975; Bayne et al. 1978). A review of the literature revealed that in the majority of studies cytology was used as a descriptive tool for the ‘staging’ (Chipperfield, 1953; Lubet, 1957; Seed, 1975, 1976) of the developing gametes and certain anomalies were apparent with regard to the nomenclature of the connective tissue matrix of the mantle lobes.

Eléments de connaissance sur la mortalité et la reproduction de la moule bleue (Mytilus edulis) sur la façade atlantique

Ce document s’inscrit dans le cadre de la problématique des mortalités de moules bleues sur les côtes françaises depuis l’hiver 2014. Il a été conçu comme une contribution aux projets Morbleu (projet de recherche) et Mytilobs (observatoire national sur les traits de vie de la moule). D’un point de vu historique, depuis le début du 20ème siècle, le principale « ennemi » de la moule reste la météo et en particulier, les tempêtes. Une seule crise de mortalité, majeure, est survenue en 1960-61 dans le pertuis Breton. Elle résulte d’une interaction entre le parasite mytilicola intestinalis et des conditions drastiques d’élevage sur bouchots dans la baie de l’Aiguillon. L’évaluation des mortalités de moules est difficile du fait des pratiques d’élevage et des pertes qui en résultent. Lorsque la crise survient en 2014, l’investigation scientifique s’appuie à la fois sur des déclarations (professionnels), des constats (DDTMs), des saisines (Repamo) et des mesures (réseau Mytilobs). L’intensité des mortalités, variable selon les sites et les années (2014 et 2015) est comparée à un référentiel de mortalités issu d’un réseau régional de suivi des mortalités de moules en paniers (Remoula, 2000-2010). En février 2014, les mortalités surviennent dans le pertuis Breton et s’étendent en quelques mois vers le sud (pertuis d’Antioche) et vers le Nord (Côte de Noirmoutier et Baie de Bourgneuf). Les simulations hydrodynamiques montrent la connectivité spatio-temporelle entre le site d’émergence des mortalités et les sites touchés quelques semaines plus tard. Alors qu’il existe plusieurs génomes de Mytililus edulis et des populations hybrides (entre Mytililus edulis et Mytilus galloprovincialis) sur les cotes de la France, seul le génome Mytililus edulis de la cote atlantique semble au départ concerné par ces mortalités. La quasi simultanéité d’occurrence d’épisodes de mortalités de moules en Rade de Brest (en hiver 2014), et sur les gisements profonds de la cote Est du Cotentin (dès le printemps 2014) reste aujourd’hui une énigme scientifique. Lorsque les mortalités surviennent en 2014 et lors de leur reprise en 2015, les moules sont en période de reproduction. Ce rapport synthétise également des résultats acquis sur la reproduction de Mytilus edulis sur la cote atlantique (Arcachon et Pertuis Charentais).

Análisis bioquímico e histoquímico de la variabilidad producida por cambios de temperatura en muestras del banco de especimenes.

[es]En las últimas décadas está proliferando la creación de nuevos Bancos de Especímenes Ambientales. Es fundamental en ellos disponer de métodos de congelación que garanticen la óptima conservación de las muestras, de forma que sean fiables los resultados obt enidos en las diversas investigaciones realizadas con ellas, para ser utilizadas por futuros investigadores. Este trabajo se ha realizado para conseguir dicho objetivo en relación a el BBEBB (Biscay Bay Environmental Bioespecimen Bank) de la Estación Marin a de Plentzia (PIE - U P V/EHU). Como muestra se han utilizado mejillones ( Mytilus galloprovincialis ) y mediante análisis bioquímico e histoquímico se ha estudiado la variabilidad producida por diferentes métodos de congelación en una serie de biomarcadores pr eviamente seleccionados. La conclusión ha sido que los biomarcadores varían dependiendo del método de congelación. Pero, en general, de forma poco significativa. Por lo tanto cualquiera de los procedimientos de congelación puede ser utilizado en los difere ntes biobancos con garantías. No obstante y para una mayor fiabilidad es conveniente reincidir en este trabajo utilizando otras variables como animales de localidades y/o épocas diferentes

Efecto de la calidad de la dieta sobre las eficiencias de selección y absorción del alimento en semillas de mejillón de crecimiento rápido y lento

INGLÉS:Juvenile mussels (Mytilus galloprovincialis) were collected and maintained under restrictive and optimal feeding conditions. After 7 months maintenance fast and slow growth individuals were selected for study of the effect of diet quality on selection efficiencies and absorption of food in fast and slow growth mussels. The objective of this experiment was to confirm that the physiological components responsible for the differentiation were able to vary according to the environmental conditions. The analysis of physiological traits indicates that under conditions of abundant food efficiency and absorption efficiences are the main factors that explain the differences in growth. Under conditions of restricted food are physiological differences that give rise to differences in growth.

Integrated assessment of environmental pollution using diverse sentinel organisms within Basque marine environments

294 p.

Mechanisms of Toxicity of Ag Nanoparticles in Comparison to Bulk and Ionic Ag on Mussel Hemocytes and Gill Cells

Silver nanoparticles (Ag NPs) are increasingly used in many products and are expected to end up in the aquatic environment. Mussels have been proposed as marine model species to evaluate NP toxicity in vitro. The objective of this work was to assess the mechanisms of toxicity of Ag NPs on mussel hemocytes and gill cells, in comparison to ionic and bulk Ag. Firstly, cytotoxicity of commercial and maltose stabilized Ag NPs was screened in parallel with the ionic and bulk forms at a wide range of concentrations in isolated mussel cells using cell viability assays. Toxicity of maltose alone was also tested. LC50 values were calculated and the most toxic Ag NPs tested were selected for a second step where sublethal concentrations of each Ag form were tested using a wide array of mechanistic tests in both cell types. Maltose-stabilized Ag NPs showed size-dependent cytotoxicity, smaller (20 nm) NPs being more toxic than larger (40 and 100 nm) NPs. Maltose alone provoked minor effects on cell viability. Ionic Ag was the most cytotoxic Ag form tested whereas bulk Ag showed similar cytotoxicity to the commercial Ag NPs. Main mechanisms of action of Ag NPs involved oxidative stress and genotoxicity in the two cell types, activation of lysosomal AcP activity, disruption of actin cytoskeleton and stimulation of phagocytosis in hemocytes and increase of MXR transport activity and inhibition of Na-K-ATPase in gill cells. Similar effects were observed after exposure to ionic and bulk Ag in the two cell types, although generally effects were more marked for the ionic form. In conclusion, results suggest that most observed responses were due at least in part to dissolved Ag.

Biochemical biomarkers in samples processed by different methods in Environmental Specimen Banks

In the last decades the creation of new Environmental Specimen Banks (ESB) is increasing due to the necessity of knowing the effects of pollutants in both the environment and human populations. ESBs analyze and store samples in order to understand the effects of chemicals, emerging substances and the environmental changes in biota. For a correct analysis of the effect induced by these variables, there is a need to add biological endpoints, such as biomarkers, to the endpoints based on chemical approaches which have being used until now. It is essential to adapt ESB´s sampling strategies in order to enable scientists to apply new biological methods. The present study was performed to obtain biochemical endpoints from samples stored in the BBEBB (Biscay Bay Environmental Biospecimen Bank) of the Marine Station of Plentzia (PIE - UPV/EHU). The main objective of the present work was to study the variability caused in biochemical biomarkers by different processing methods in mussels (Mytilus galloprovincialis) from two localities (Plentzia and Arriluze) with different pollution history. It can be concluded that the selected biomarkers (glutathione S-transferase and acetylcholinesterase) can be accurately measured in samples stored for years in the ESBs. The results also allowed the discrimination of both sampling sites. However, in a further step, the threshold levels and baseline values should be characterized for a correct interpretation of the results in relation to the assessment of the ecosystem health status.

贝藻混养系统中贝类食物来源的定量分析

应用稳定碳、氮同位素比值法和脂肪酸标志分析法，较为系统地研究了贝藻混养系统中滤食性贝类的食物来源，评估了大型藻类对混养系统及滤食性贝类的物质贡献。主要研究结果如下： 1.综述了典型生态系统中大型藻类和滤食性贝类各自的生态学地位和作用，大型藻类与滤食性贝类不仅在水体营养盐方面存在互利关系，二者在物质循环与收支方面同样具有耦合性，大型藻类提供的颗粒态有机质可以为滤食性贝类提供饵料来源。 2.总结了稳定同位素比值法和脂肪酸标志法在海洋生态系统食物来源及食物网分析中的应用，并建立了两种方法的具体操作规程。 3.分析了栉孔扇贝Chlamys farreri和海带Laminaria japonica混养系统中海带碎屑形成及释放不同阶段的生态学特征，评估了碎屑对扇贝的饵料贡献。海带在6周内释放了自身约27％的碳；碎屑形成及释放过程中C:N比值显著下降，同时伴随着旺盛的细菌降解，碎屑中也发现有大量硅藻类和原生动物存在。稳定同位素分析证实海带碎屑是混养期间扇贝的主要食物来源。 4.查明了春季胶州湾潮间带自然分布的长牡蛎Crassostrea gigas、紫贻贝Mytilus galloprovincialis和湾内浅海筏式养殖栉孔扇贝的可能食物来源。湾内栉孔扇贝饵料组成中浮游硅藻类为最主要部分，同时混杂有陆源有机质和细菌类物质；潮间带自然生长的牡蛎和贻贝饵料组成中，浮游植物占86.2-89.0％，种类组成中除硅藻外还包括一定比例的金藻和甲藻类；潮间带繁盛的孔石莼Ulva pertusa藻床为两种贝类提供了8.7-11.0％的补充食物来源。 5.揭示了桑沟湾贝藻混养海区春、夏季栉孔扇贝饵料来源组成情况及其季节变化，评估了海带养殖区碎屑碳量季节变化及海带来源碳对扇贝组织碳的贡献。结果表明，湾内贝藻混养区碎屑碳量为75.52-265.19 μg l-1，其在水体总颗粒态有机碳中的比例为25.6-73.8％。海带来源碎屑碳对栉孔扇贝组织碳的贡献比例为14.1-42.8％，且与水体碎屑碳比例的季节变化存在极显著相关性(F=0.992, P=0.004)。5月份湾外海带养殖区水体碎屑碳量为110.12-144.71 μg l-1，显著高于湾内无海带区（75.52 μg l-1），湾外养殖的扇贝组织中海带来源碳比例为22.0-24.1％，显著高于湾内单养区扇贝（9.6％）。估算结果表明，桑沟湾每年收获的6967吨（总湿重）栉孔扇贝中，海带提供了约57.1吨碳，换算为海带干物质为219.6吨。脂肪酸标志分析结果表明，2月份至8月份硅藻类在扇贝饵料组成中比例逐渐下降，而细菌类比例逐渐升高。整个采样期间，EPA/DHA比例较低，说明扇贝饵料组成中可能包括高DHA含量的组分。

环境因子对养殖生物白斑综合症传播和分子生物标志物系统的影响研究

本文研究了海洋微藻在白斑综合症(white spot syndrome)暴发中的可能作用，以及阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基苯磺酸钠(SDBS)长期暴露对紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)生物标志物系统的影响(72 d)。 1．海洋微藻在养殖对虾白斑综合症传播中的作用研究 为了证实海洋微藻是否是养殖对虾白斑综合症的传播途径，我们首先将六种海洋微藻：球定边金藻(Isochrysis galbana)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、小球藻(Chlorella sp. )、赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)、锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)和盐藻(Dunaliella salina)，与人工注射感染白斑病毒(white spot syndrome virus)的成体日本囊对虾共同培养，用套氏PCR方法检测共培养的微藻能否携带白斑病毒。在此基础上，进一步研究了共培养后的海洋微藻是否能感染幼体日本囊对虾。研究结果表明，除了H. akashiwo，实验海洋微藻均可携带白斑病毒，但它们携带病毒的能力有明显差异，Chlorella sp.和S. trochoidea携带白斑病毒的能力较强；但是，与白斑病毒的其他携带者（如桡足类等）不同，携带病毒的海洋微藻10天后病毒检测结果均呈阴性。共培养后小球藻组可感染幼体日本囊对虾，但幼体携带病毒的量只能通过二步PCR方法才能检测到。上述结果表明，海洋微藻在WSSV的水平传播途径中具有一定的作用。 2．表面活性剂对紫贻贝生物标志物系统的影响研究 以青岛胶州湾现场调查数据为依据，选择阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基苯磺酸钠(SDBS)作为污染物、以近海底栖生物紫贻贝为受试生物，研究了长期暴露后紫贻贝生化指标(SOD, CAT, GSH, GPx, GST, iNOS, AKP)和遗传毒理指标(AFLP指纹图谱)的变化。实验结果发现: 经过72d不同浓度暴露后，SDBS实验组紫贻贝体内的SOD、CAT和iNOS活性均有显著下降（除CAT 0.1mg/L组外），GSH、GST和GPx在3.0mg /L SDS、SDBS组较各自对照组均有显著升高。SDBS对紫贻贝生化指标影响的显著性水平大于SDS。统计分析显示，SDBS暴露组下GST与GPx呈显著正相关关系，iNOS与SOD也表现出一定正相关,但GSH与CAT、GSH与SOD呈现显著负相关关系。SDS浓度与GST呈显著正相关，而SDBS浓度与CAT呈显著负相关。另外，实验结果发现后闭壳肌中iNOS是一个具有应用前景的阴离子表面活性剂暴露生物标志物。AFLP标记结果统计显示，在实验给定的污染物浓度下，SDBS基因毒性要大于SDS；不同的DNA指纹图谱以及遗传距离图显示不同的污染物造成的DNA损伤是不同的。结果表明，在长期暴露条件(72 d)下，一定浓度的阴离子表面活性剂可以对岗哨生物紫贻贝的SOD, CAT, GSH, GPx, GST, iNOS和AFLP指纹图谱一组指标产生显著影响。

海洋经济动物精子超低温保存的研究

从1949年以来经过近五十年的发展，超低温保存种质细胞技术已经趋于成熟，特别是在家畜推广良种化的过程中发挥重要作用。对海洋动物种质细胞保存研究的范围主要集中在鲑鳟鱼类和牡蛎等少数几种海洋生物上。本研究结合“国家自然科学基金”研究项目，进行了三种贝类和两种鱼类精子的超低温保存实验，得到了它们在液氮（－196 ℃）条件下的适宜保存条件。栉孔扇贝（Chlamys farreri）冻精解冻后复苏比例、受精率和孵化率最高可达到49.39％、42.06％和12.15睦栉孔扇贝精子超低温保存时发生冷冻伤害的温度范围在－30 ℃～－60 ℃；其低温保存的最适降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）的最适浓度为5 ℃，其保存效果优于甘油；样品保存的最佳体积为0.6ml～1ml；解冻精子的最适水温为35 ℃，50 ℃次之，20 ℃最差；用自然海水激活解冻后精子的效果好于低盐度溶液；在0 ℃进行预处理平衡时间不宜太长；在抗冻液中加入蛋黄对保存效果没有改善，并且会对冻精的孵化率有抑制作用；用20 ℃／min和5％DMSO冷冻精子，液氮中保存栉孔扇贝精子55天后其复苏比例达到42.17％。超低温保存紫贻贝（Mytilus galloprovincialis Lamarck）精子，解冻后其复苏比例、受精率和孵化率最高可达到41.63％、69.52％和54.74％。保存紫贻贝精子最适降温速率为5 ℃／min，发生冻伤的温度范围是－20 ℃～－60 ℃；使用抗冻剂DMSO的保存效果好于甘油，且使用抗冻剂DMSO的最适浓度为15％；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH值的溶液；样品体积（在0.2～1ml之间）对保存效果没有影响；采用15％DMSO和5 ℃／min的降温速率处理精子，液氮中保存90天后复苏比例仍达到41.8％。保存菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum （Adams and Reeve））精子的最适降温速率为5 ℃／min，发生冻伤的温度范围是－30 ℃～－60 ℃；抗冻剂DMSO的保存效果好于甘油，也用DMSO与甘油混合使用，使用抗冻剂DMSO的最适浓度为10％；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH的溶液；样品体积（在0.2％～1.6ml之间）对保存效果有显著影响。冷冻保存后精子复苏比例、受精率和孵化率最高达到40.84％、68.87％和47.17％；以最适降温速率和抗冻剂浓度处理精子，并在液氮中保存36天后冻精复苏比例仍可以达到38.54％。黑鲷（Sparus macrocephalus）精子经过超低温保存后复苏率、存活率最高可以达到61.37％和61.4。保存黑鲷精子时发生冷冻伤害的温度范围是－20 ℃～－60 ℃，适宜的降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％；样品体积对保存效果有相关性；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH值的溶液；使用20％DMSO和20 ℃／min降温速率处理，在液氮中保存黑鲷精子66天后解冻，其复苏率和存活率分别为59.81％和58.45％。在液氮中保存真鲷（Pagrosomus major）精子时发生冷冻伤害的温域为－30 ℃～－60 ℃，适宜的降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％；采用低盐度或高pH值的溶液激活冻精的效果不如自然海水。真鲷冻精的复苏率和存活率最高可达到50.73％和62.5；以20 ℃／min和20％DMSO处理真鲷精子，保存在液氮中46天后冻精复苏率和存活率为50.63％和61.02％。通过对多种贝类和鱼类精子的超低温保存实验，不仅获得超低温保存基本条件，并且通过显微镜观察结合前人的研究，对产生冻伤的原因和保护的机理提出了一个模式。

Food sources of three bivalves living in two habitats of Jiaozhou Bay (Qingdao, China): Indicated by lipid biomarkers and stable isotope analysis

Food Sources of three filter-feeding bivalves from two habitats (intertidal oyster Crassostrea gigas, mussel Mytilus galloprovincialis. and subtidal cultured scallop Chlamys farreri) of Jiaozhou Bay (Qingdao,China) were determined by fatty acid and stable isotope in analysis. Cultured scallop was characterized by significant diatom markets such as 16:1/16:0 close to 1 and high ratio of 20:5(n - 3)/22:6(n - 3), hence we assume that the scallop mainly feeds on diatoms. Fatty acid biomarkers specific to bacteria and terrestrial materials were also found in considerable amounts in scallop tissue, which suggested that there were Substantial bacterial and terrestrial input into the food of the species. Intertidal oyster and mussel, however, exhibited significant flagellate marker. 22:6(n - 3). and lower level of diatom markers. which indicated that flagellates are also part of intertidal bivalves' Planktonic food Sources: meanwhile, high level of Chlorophyta fatty acid marker, Sigma 18:2(n - 6) + 18:3(n - 3), suggested that Ulva pertusa (Chlorophyta) seaweed bed supplied important food sources to intertidal bivalves. Additionally, result of stable isotope analysis showed that phytoplankton contributed 86.2 to 89.0% to intertidal bivalves' carbon budget; macroalga U. pertusa origin source had a contribution of MIX, to 11.0%, which indicated its role Lis in important supplemental food source to intertidal bivalves. From this study. it is concluded that the dietary difference of three bivalves probably relates to the different potential food sources in the scallop farm and intertidal zone in Jiaozhou Bay.

Forecasting invasions: resource use by mussels informs invasion patterns along the South African coast

Invasive species are often more able to rapidly and efficiently utilise resources than natives, and comparing per capita resource use at different resource densities among invaders and trophically analogous natives could allow for reliable predictions of invasiveness. In South Africa, invasion by the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis has transformed wave-exposed shores, negatively affecting native mussel species. Currently, South Africa is experiencing a second mussel invasion with the recent detection of the South American Semimytilus algosus. We tested per capita uptake of an algal resource by invading M. galloprovincialis, S. algosus, and the native Aulacomya atra at different algal concentrations and temperatures, representing the west and south coasts of South Africa, to examine whether their per capita resource use could be a predictor of their spread and subsequent invasiveness. Regardless of temperature, M. galloprovincialis was the most efficient consumer, significantly reducing algal cells compared to the other species when the resource was presented in both low and high starting densities. Furthermore, these findings aligned with a greater biomass of M. galloprovincialis on the shore in comparison with the other species. Resource use by the new invader S. algosus was dependent on the density of resource and, although this species was efficient at low algal concentrations at cooler temperatures, this pattern broke down at higher algal densities. This was once more reflected in lower biomass in surveys of this species along the cool west coast. We therefore forecast that S. algosus will be become established along the south coast; however, we also predict that M. galloprovincialis will maintain dominance on these shores.

Levels and biological effects of selected EDC's in the portuguese coast

Os compostos orgânicos de estanho (OTs), de entre os quais se destaca o tributilestanho (TBT), encontram-se amplamente dispersos no meio aquático devido à sua intensa utilização como agente biocida em tintas antivegetativas. Estudos anteriores sobre a poluição por organoestanhos em Portugal demonstraram que estes compostos se encontram presentes não só na linha de costa mas também em zonas da plataforma, sendo as zonas portuárias (onde se incluem portos comerciais, portos de pesca, marinas e estaleiros navais) os principais focos de poluição. A presente tese tem como objectivo investigar o estado actual da poluição por organoestanhos na costa Portuguesa confirmando se os padrões espaciais acima descritos se mantêm, por meio da quantificação de diversos OTs, nomeadamente, butilestanhos, fenilestanhos e octilestanhos. Assim, os níveis destes compostos foram avaliados em populações de Mytilus galloprovincialis e Nassarius reticulatus ao longo da costa continental Portuguesa, com particular incidência na Ria de Aveiro onde se quantificaram os níveis de OTs em mexilhões, gastrópodes e sedimentos, recolhidos numa malha de amostragem mais densa. A distribuição espacial dos organoestanhos foi determinada utilizando o bivalve M. galloprovincialis como espécie bioindicadora. Os níveis totais de estanho (SnT) foram quantificados nos tecidos do mexilhão e relacionados com os níveis totais de OTs nos mesmos tecidos, incluindo monobutilestanho (MBT), dibutilestanho (DBT), tributilestanho (TBT), difenilestanho (DPhT), trifenilestanho (TPhT), monoctilestanho (MOcT) e dioctilestanho (DOct). A contribuição dos OTs para os valores de estanho total (SnT) foi superior nas estações de amostragem localizadas no interior de portos onde atingiram proporções próximas dos 50%. De entre estes, os butilestanhos (BuTs=MBT+DBT+TBT) contribuíram em média com 98.6% para o valor total de OTs, tendo sido detectados em todas as amostras analisadas. Os valores mais elevados foram registados no interior ou na proximidade de portos, corroborando a ideia anterior de que constituem importantes focos de poluição. A variação das concentrações de TBT no mexilhão situou-se entre os 0,9 e 720 ng Sn.g-1 de peso seco (ps). Estes valores são, em 69% das estações amostradas, superiores ao valor do proposto pela OSPAR (4,9 ng TBT-Sn.g-1 ps) para tecidos de mexilhão o que sugere a forte probabilidade de ocorrência de efeitos adversos sobre os ecossistemas. Os níveis de OTs foram também quantificados em tecidos de N. reticulatus recolhidos ao longo da costa em 2008 Os butilestanhos representaram a maioria dos compostos organoestânicos quantificados e os níveis mais elevados foram novamente detectados no interior ou nas imediações de portos. Os valores de TBT nos tecidos deste gastrópode variaram entre 3,5 e 380 ng Sn.g-1 ps, representando uma percentagem média de 50,4% do total de butilestanhos. Simultaneamente, os níveis de imposex foram também avaliados e relacionados com os valores deste composto nos tecidos. As distribuições espaciais de imposex e de TBT seguiram a mesma tendência, sendo que em todos os locais amostrados foram encontradas fêmeas afectadas. Os valores de VDSI (índice da sequência do vaso deferente) variaram entre 0,2 e 4,4. Em 91% dos locais os valores de VDSI foram superiores a 0,3 (definido pela OSPAR como o valor de VDSI em N. reticulatus acima do qual o objectivo de qualidade ecológica não é atingido), confirmando a suspeição da existência de efeitos adversos nos ecossistemas. Em todos os compartimentos analisados na Ria de Aveiro, os butilestanhos foram os principais contribuintes para estanho orgânico total. A utilização do imposex em N. reticulatus como biomarcador da poluição por TBT permitiu determinar um gradiente decrescente desde o interior da Ria (onde se situa a zona portuária) até zonas costeiras adjacentes. O mesmo gradiente foi observado relativamente às concentrações de TBT em tecidos de mexilhão. Para os sedimentos, as concentrações de TBT são bastante variáveis com valores entre 2,7 e 1780 ng Sn.g-1 ps encontrando-se significativamente correlacionadas com o conteúdo em matéria orgânica da amostra. Em todas as amostras analisadas os níveis de TBT são elevados e superiores ao valor inferior (provisório) de EAC (critério de avaliação ambiental) proposto pela OSPAR (0,004 ng TBT-Sn.g-1 ps). A análise da evolução temporal da poluição por TBT ao longo da costa foi concretizada por meio da comparação entre níveis de organoestanhos em N. reticulatus em amostras de 2008 e 2003 e também através da comparação dos níveis de imposex registados em campanhas realizadas naqueles dois anos. Os resultados obtidos indicam a ocorrência de reduções significativas nas concentrações de TBT, DBT e MBT, assim como uma diminuição significativa nos valores de VDSI entre 2003 e 2008. Os resultados obtidos sugerem que a redução verificada se deve à implementação do Regulamento 782/2003 da Comunidade Europeia, que tem por objectivo a erradicação das descargas e emissões de TBT para o ambiente a partir dos sistemas antivegetativos A diminuição da poluição por TBT ao longo dos últimos anos foi acompanhada por um aumento no número de fêmeas com um vaso deferente, mas sem pénis (imposex do tipo b): 3,5% em 2000, 11% em 2003 e 24% em 2008. Um aumento no número de locais onde se registou o fenómeno também é evidente: dois em 2000, sete em 2003 e treze em 2008. A proporção de fêmeas b no estádio 1 de VDS apresentou igual tendência com aumento de 38% em 2000 para 65% em 2008. O aumento no número de fêmeas com esta via parece estar associado à diminuição da poluição por TBT. Face à esperada diminuição da presença do composto no meio ambiente, devido à sua proibição, o aumento de fêmeas com imposex do tipo b é previsível. A ocorrência de compostos xenoestrogénicos no ambiente aquático foi também estudada e os níveis de estrona (E1), 17α-e 17β-estradiol (E2), 17α- etinilestradiol (EE2), bisfenol-A (BPA) e nonilfenol (NP) foram quantificados em efluentes de estações de tratamento de águas residuais (ETARs) localizadas na região de Aveiro, bem como no efluente final descarregado no Oceano Atlântico, através de um emissário submarino (S. Jacinto), sendo amostras recolhidas na entrada da Ria e ao largo usadas como referência. Os níveis de hormonas esteróides e compostos fenólicos registados nos locais de referência são baixos. De entre as hormonas esteróides os níveis mais elevados foram registados para a estrona, com valores máximos de 85.3 ng.L- 1 . Os níveis mais elevados de compostos fenólicos foram detectados em efluentes industriais (máximos de NP e BPA de 2410 ng.L-1 e 897 ng.L-1 , respectivamente). Os resultados obtidos sugerem que os níveis de compostos xenoestrogénicos em locais de referência são baixos e não parecerem acarretar risco ecológico, no entanto o mesmo não será verdadeiro para as imediações do emissário de S. Jacinto que liberta efluentes com concentrações muito elevadas de E1, NP e BPA. Foram realizadas experiências laboratoriais de forma a elucidar o papel do receptor retinóico X (RXR) no mecanismo de indução de imposex (presentemente o mecanismo que demonstra maior promessa na explicação do desencadear deste fenómeno). Fêmeas de Nucella lapillus e N. reticulatus foram injectadas com TBT em etanol ou com ácido 9-cis- retinóico em FBS (soro fetal bovino) tendo-se procedido à sua observação nos 30 dias subsequentes. Tanto o TBT como o 9CRA induziram o desenvolvimento de imposex em N. lapillus e N. reticulatus. Aumentos significativos nos valores de VDSI e FPL entre o controlo de etanol e o tratamento de TBT e o controlo de FBS e o tratamento de 9CRA foram registados. Os resultados obtidos fornecem novas provas do envolvimento da via de sinalização associada ao RXR no desenvolvimento de imposex em ambas as espécies.