大鼠脑胶质瘤干细胞分离及作为树突状细胞治疗抗原来源的研究

脑胶质瘤是原发性恶性脑肿瘤中最常见的一类肿瘤，其具有较差的预后性和高致死率。尽管包括手术、化疗及放疗在内的综合治疗水平在不断提高，但由于胶质瘤细胞的高度侵袭性导致治疗结果仍未得到明显改善，病人常常在治疗后很短时间内发生复发。近年来在肿瘤发生的领域提出了一个新的理论，即肿瘤干细胞理论。这个理论认为，肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新、无限增殖及分化潜能的细胞，这部分细胞虽然只占少部分，但却是肿瘤发生、发展的关键。本研究主要探讨了利用化疗药物秋水仙素分离大鼠胶质瘤细胞中的干细胞样肿瘤细胞（Stem-like Cancer Cell, SLCC）的可行性，负载胶质瘤SLCC的树突状细胞疫苗在体外对肿瘤细胞的杀伤能力，以及对秋水仙素处理胶质瘤细胞的基因组不稳定性的初步探索。 C6大鼠胶质瘤细胞经不同剂量水平（0、0.5、1.0、2.0μg/ml）的秋水仙素处理后，大部分细胞发生凋亡，剩下存活的细胞经过免疫荧光染色发现其表达干细胞标志分子Nestin，提示可能是SLCC。流式和RT-PCR实验表明，经过秋水仙素处理后的存活的C6细胞表达干细胞标志分子nestin，sox2和bmi1，并且其数量随着秋水仙素浓度的增加而增加。 树突状疫苗是一种脑肿瘤的生物治疗方法。本实验通过分离大鼠的树突状细胞和淋巴细胞，体外培养并用经不同剂量组处理分离的SLCC全蛋白刺激一周后，使用MTT法检测激活的细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）体外对肿瘤细胞的杀伤效果。结果表明，经药物分离的SLCC组诱导的CTL效果明显大于对照组，提示脑胶质瘤SLCC可以作为树突状疫苗免疫治疗的新靶点。 此外RT-PCR证明经秋水仙素处理后的胶质瘤细胞中mad2水平明显升高，表明化疗药物可能增加了肿瘤细胞中基因组不稳定性，从而导致SLCC的聚集。 综上，本实验证明了利用化疗药物秋水仙素可以分离大鼠胶质瘤细胞C6中的SLCC细胞，且该分离可能与肿瘤细胞基因组不稳定性提高有关。同时，利用负载SLCC全蛋白的树突状细胞激活的T淋巴细胞在体外具备比对照组更强的细胞杀伤能力。这些结果为以脑胶质瘤SLCC最为靶点的免疫治疗方法开发提供了基础依据。

Anti-CTLA-4 treatment induces IL-10-producing ICOS+ regulatory T cells displaying IDO-dependent anti-inflammatory properties in a mouse model of colitis.

BACKGROUND AND AIMS: Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) has been shown to act as a negative regulator of T cell function and has been implicated in the regulation of T helper 1 (Th1)/Th2 development and the function of regulatory T cells. Tests were carried out to determine whether anti-CTLA-4 treatment would alter the polarisation of naive T cells in vivo. METHODS: Mice were treated with anti-CTLA-4 monoclonal antibody (mAb) (UC10-4F10) at the time of immunisation or colonic instillation of trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS). The cytokines produced by lymph node cells after in vitro antigenic stimulation and the role of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) and of interleukin-10 (IL-10) were tested, and the survival of mice was monitored. RESULTS: Injection of anti-CTLA-4 mAb in mice during priming induced the development of adaptive CD4(+) regulatory T cells which expressed high levels of ICOS (inducible co-stimulator), secreted IL-4 and IL-10. This treatment inhibited Th1 memory responses in vivo and repressed experimental intestinal inflammation. The anti-CTLA-4-induced amelioration of disease correlated with IDO expression and infiltration of ICOS(high) Foxp3(+) T cells in the intestine, suggesting that anti-CTLA-4 acted indirectly through the development of regulatory T cells producing IL-10 and inducing IDO. CONCLUSIONS: These observations emphasise the synergy between IL-10 and IDO as anti-inflammatory agents and highlight anti-CTLA-4 treatment as a potential novel immunotherapeutic approach for inducing adaptive regulatory T cells.

Rapid complete response of metastatic melanoma in a patient undergoing ipilimumab immunotherapy in the setting of active ulcerative colitis.

While blockade of the cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) T cell regulatory receptor has become a commonly utilized strategy in the management of advanced melanoma, many questions remain regarding the use of this agent in patient populations with autoimmune disease. We present a case involving the treatment of a patient with stage IV melanoma and ulcerative colitis (UC) with anti-CTLA-4 antibody immunotherapy. Upon initial treatment, the patient developed grade III colitis requiring tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) blocking antibody therapy, however re-treatment with anti-CTLA-4 antibody following a total colectomy resulted in a rapid complete response accompanied by the development of a tracheobronchitis, a previously described extra-intestinal manifestation of UC. This case contributes to the evolving literature on the use of checkpoint inhibitors in patients also suffering from autoimmune disease, supports future clinical trials investigating the use of these agents in patients with autoimmune diseases, and suggests that an understanding of the specific molecular pathways involved in a patient's autoimmune pathology may provide insight into the development of more effective novel combinatorial immunotherapeutic strategies.

The CTLA4 + 49A/G and CT60 polymorphisms and chronic inflammatory arthropathies in Northern Ireland

Rheumatoid and juvenile idiopathic arthritis (RA, JIA) are chronic inflammatory arthropathies with an autoimmune background. The cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) protein plays a key role in the down-regulation of T cell activation. We analyzed the CTLA4 +49A/G and CT60 polymorphisms in cohorts of Northern Irish RA and JIA patients and healthy control subjects using restriction fragment length polymorphism methods. The +49 A allele was increased in RA (61.2%; P=0.02; OR=1.28; 95% C.I.=1.04-1.58) and JIA (61.8%; P=0.14) patients compared to the control population (55.3%). No significant association was observed for the CT60 polymorphism. Haplotype analysis revealed a significantly different distribution of +49 A/G-CT60 haplotypes in RA and JIA patients compared to controls (P value

Total serum IL-12 and IL-12p40, but not IL-12p70, are increased in the serum of older subjects; relationship to CD3(+)and NK subsets

Interleukin 12 (IL-12), a central cytokine acting on T and natural killer (NK) cells, directs proliferation of activated T lymphocytes towards a Th1 phenotype. The heterodimeric molecule IL-12p70, equates with IL-12 biological activity, while IL-12p40 may antagonize IL-12 and inhibit cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vitro. This study characterizes age-related changes in serum total IL-12, IL-12p70 and IL-12p40 relating them with CD3(+), NK and related subsets from subjects, aged 30-96 years. Total IL-12, IL-12p40 and the IL-12p40/IL-12p70 ratio, but not IL-12p70, increased significantly with age (P

Potential approaches for more successful dendritic cell-based immunotherapy.

INTRODUCTION: Dendritic cells (DCs) are the most important antigen-presenting cell population for activating antitumor T-cell responses; therefore, they offer a unique opportunity for specific targeting of tumors. AREAS COVERED: We will discuss the critical factors for the enhancement of DC vaccine efficacy: different DC subsets, types of in vitro DC manufacturing protocol, types of tumor antigen to be loaded and finally different adjuvants for activating them. We will cover potential combinatorial strategies with immunomodulatory therapies: depleting T-regulatory (Treg) cells, blocking VEGF and blocking inhibitory signals. Furthermore, recommendations to incorporate these criteria into DC-based tumor immunotherapy will be suggested. EXPERT OPINION: Monocyte-derived DCs are the most widely used DC subset in the clinic, whereas Langerhans cells and plasmacytoid DCs are two emerging DC subsets that are highly effective in eliciting cytotoxic T lymphocyte responses. Depending on the type of tumor antigens selected for loading DCs, it is important to optimize a protocol that will generate highly potent DCs. The future aim of DC-based immunotherapy is to combine it with one or more immunomodulatory therapies, for example, Treg cell depletion, VEGF blockage and T-cell checkpoint blockage, to elicit the most optimal antitumor immunity to induce long-term remission or even cure cancer patients.

Correlates of protective immunity against hepatitis C virus

Le virus de l’hépatite C (VHC) infecte ~185 millions d’individus dans le monde. Malgré le développement des nouvelles thérapies dirigées contre le VHC, on compte deux millions de nouvelles infections chaque année, en particulier dans les pays sous-développés et les populations marginalisées. Comme pour la plupart des virus à infection chronique, le développement d’un vaccin prophylactique efficace est limité par le manque de caractérisation des déterminants de la mémoire immunitaire protectrice lors des épisodes de réinfection naturelle chez les êtres humains. Le VHC représente un modèle unique au sein des virus à infection chronique pour étudier l’immunité protectrice. En effet ~30% des patients infectés par le VHC peuvent être guéris suite à un premier épisode d’infection spontanément. Dans cette thèse, nous avons étudié l’immunité protectrice contre le VHC dans une cohorte d’utilisateurs de drogues par injection qui sont à risque d’être infectés ou réinfectés. Notre hypothèse est que la majorité des patients qui ont résolu une première infection par le VHC sont protégés contre le développement d’une infection chronique s’ils sont réexposés. Cette immunité protectrice est associée à la présence des cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles qui possèdent des fréquences, magnitudes et avidités élevées. La capacité protectrice des cellules T mémoire contre les séquences variables du VHC est dépendante de la diversité et flexibilité du répertoire de leurs récepteurs de cellules T (TCR), qui reconnaissent les séquences variables des épitopes ciblés. Notre premier objectif était de définir et détailler les déterminants de l’immunité protectrice conférée par les cellules T spécifiques du VHC. Nos résultats ont montré que la protection pendant l’épisode de réinfection était associée à une augmentation de la magnitude et du spectre des réponses spécifiques par les cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles, ainsi que par l’apparition d’une population de cellules T tétramère+ CD8+ effectrices qui expriment faiblement le marqueur CD127 (CD127lo) lors du pic de la réponse. Chez les patients qui ont développé une infection chronique pendant l’épisode de réinfection, nous avons observé une expansion très limitée des cellules T CD4 et CD8. Le séquençage des épitopes ciblés par les cellules T CD8 chez ces patients qui sont non-protégés a montré que les séquences de ces épitopes sont différentes des séquences de référence qui étaient utilisées pour tous les essais immunologiques de cette étude. Le deuxième objectif était d’analyser la dynamique du répertoire des TCRs des cellules T CD8 spécifiques chez les patients protégés versus les patients non-protégés. Nos résultats ont montré que le répertoire des cellules T CD8 spécifiques est plus focalisé que chez les patients protégés. En plus, nous avons observé que les clonotypes qui forment le répertoire chez les patients protégés sont distincts de ceux chez les patients non-protégés. Ces clonotypes chez les patients protégés ont montré de plus grandes avidité et polyfonctionnalité que leurs homologues chez les patients non-protégés. En conclusion, nos résultats suggèrent que la protection contre le développement d’une infection chronique pendant l’épisode de réinfection par le VHC est associée à une augmentation de la magnitude, du spectre et de la fonctionnalité des réponses des cellules T spécifiques, ainsi qu’à un répertoire des TCRs plus focalisé composé des clonotypes distincts qui possèdent de plus grandes avidité et polyfonctionnalité que chez les patients non-protégés. L’homologie des séquences des souches virales entre les différents épisodes de l’infection est un déterminant majeur de l’établissement d’une protection efficace. Ces résultats ont donc des implications très importantes pour le développement d’un vaccin prophylactique contre le VHC et d’autres virus à infection chronique.

Les immunoglobulines intraveineuses et la réponse spécifique des cellules T dans la prévention de la maladie lymphoproliférative post-greffe associée au virus Epstein-Barr chez les enfants greffés de cellules souches hématopoïétiques.

La maladie lymphoproliférative post-greffe (MLP) est une complication grave chez les greffés (d’organes solides ou de cellules souches hématopoïétiques) immunosupprimés suite à l'infection par le virus Epstein-Barr (VEB). En l’absence d'une réponse efficace des lymphocytes T cytotoxiques, les cellules B infectées par le VEB peuvent proliférer et donner lieu à la MLP. Dans le cas des receveurs de greffe immunosupprimés, les cellules B infectées par le VEB de façon lytique, produisent activement de nouveaux virions. Ces derniers infectent les cellules B voisines, entraînant leur expansion polyclonale. La gp350, une protéine du cycle lytique située dans l'enveloppe virale, joue un rôle important dans l'infection par le VEB. Elle interagit avec le récepteur CD21 exprimée à la surface des cellules B pour permettre l’entrée du virus. Ainsi, des anticorps neutralisants anti-gp350 sont considérés être des acteurs clés dans le blocage de l'infection, empêchant ainsi le développement de la MLP. L'effet protecteur des immunoglobulines intraveineuses (IgIV) à titre prophylactique contre le VEB et la MLP chez les greffés de cellules souches hématopoïétiques n’est pas clairement démontré. Par conséquent, le premier objectif de cette thèse a proposé d'évaluer l'efficacité des IgIV contre l'infection par le VEB et la MLP chez les receveurs de cellules souches hématopoïétiques. Le deuxième objectif a proposé de déterminer, en utilisant la technique ELISpot, si la présence d'une réponse forte des lymphocytes T contre l'antigène précoce BMLF1 du cycle lytique du VEB pourrait constituer un marqueur de protection contre la MLP chez les greffés de cellules souches hématopoïétiques. Les résultats ont montré d'une part que, si les IgIV peuvent neutraliser efficacement l'infection par le VEB in vitro, ils ne protègent pas efficacement les patients greffés contre l'infection par le VEB in vivo. D'autre part, l'étude de la réponse des lymphocytes T contre des antigènes du VEB a démontré que les cellules T de certains patients sont capables de reconnaître l'antigène lytique BMLF1. Cette réponse spécifique des lymphocytes T peut s’avérer un bon marqueur de la protection contre la MLP. Les résultats de cette thèse démontrent que l’infection lytique au VEB joue un rôle fondamental dans le développement de la MLP. Les données indiquent également que la présence d'une réponse spécifique des lymphocytes T contre un antigène du cycle lytique du VEB peut constituer un bon marqueur de la protection contre la MLP. Cependant, le traitement des patients recevant des greffes de cellules souches hématopoïétiques avec les IgIV n’apparaît pas efficace dans la prévention de la MLP.

Carga viral de seis tipos de Virus del Papiloma Humano de alto riesgo y su asociacion con lesiones cervicales

Introducción: La infección por un tipo de Virus del Papiloma Humano de alto riesgo (VPH-AR), es el factor principal en el desarrollo de Cáncer de Cérvix (CC). La carga viral puede modular esta asociación, por lo que resulta importante su cuantificación y el establecimiento de su relación con lesiones precursoras de CC. Metodología: 60 mujeres con lesiones escamosas intraepiteliales (LEI) y 120 mujeres sin LEI, confirmadas por colposcopia, fueron incluidas en el estudio. Se determinó la carga viral de 6 tipos de VPH-AR, mediante PCR en tiempo real. Se estimaron OR crudos y ajustados para evaluar la asociación entre la carga viral de cada tipo y las lesiones cervicales. Resultados: 93.22% de mujeres con LEI y 91.23% de mujeres negativas, fueron positivas para al menos un tipo de VPH. VPH-18 y VPH-16 fueron los tipos más prevalentes, junto con VPH-31 en mujeres sin LEI. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas de las cargas virales entre éstos dos grupos, aunque se observó un mayor carga viral en lesiones para algunos tipos virales. Una mayor frecuencia de lesiones se asoció a infecciones con carga baja de VPH-16 (ORa: 3.53; IC95%: 1.16 – 10.74), en comparación a mujeres con carga alta de VPH-16, (ORa: 2.63; IC95%: 1.09 – 6.36). En infecciones por VPH-31, la presencia de carga viral alta, se asoció con una menor frecuencia de lesiones (ORa: 0.34; IC95%: 0.15 – 0.78). Conclusiones: La prevalencia tipo-específica de VPH se corresponde con las reportadas a nivel mundial. La asociación entre la carga viral del VPH y la frecuencia de LEI es tipo específica y podría depender de la duración de la infección, altas cargas relacionadas con infecciones transitorias, y bajas cargas con persistentes. Este trabajo contribuye al entendimiento del efecto de la carga viral en la historia natural del CC; sin embargo, estudios prospectivos son necesarios para confirmar estos resultados.

CD27 mediates interleukin-2-independent clonal expansion of the CD8+ T cell without effector differentiation

The clonal expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to microbial infections is essential for adaptive immunity. Although IL-2 has been considered to be primarily responsible for this process, quantitatively normal expansion occurs in the absence of IL-2 receptor signaling. Here, we show that ligating CD27 on CD8+ T cells that have been stimulated through the T cell receptor causes their expansion in the absence of IL-2 by mediating two distinct cellular processes: enhancing cell cycling and promoting cell survival by maintaining the expression of IL-7 receptor alpha. This pathway for clonal expansion of the CD8+ T cell is not associated with the development of a capacity either for production of IFN-gamma or for cytotoxic T lymphocyte function and, therefore, is uncoupled from differentiation. Furthermore, ligating CD27 increases the threshold concentration at which IL-2 induces IFN-gamma-producing capability by the CD8+ T cell, suggesting that CD27 signaling may suppress effector differentiation. Finally, CD8+ T cells that have been stimulated by the TCR/CD27 pathway maintain their capacity for subsequent expansion and effector differentiation in response to a viral challenge in vivo. Thus, the TCR/CD27 pathway enables the CD8+ T cell to replicate by a process of self-renewal, which may contribute to the continuous generation of new effector CD8+ T cells in persistent viral infections.

Relation of pretreatment sequence diversity in NS5A region of HCV genotype 1 with immune response between pegylated-INF/ribavirin therapy outcomes

Hepatitis C virus (HCV) infection frequently persists despite substantial virus-specific immune responses and the combination of pegylated interferon (INF)-alpha and ribavirin therapy. Major histocompatibility complex class I restricted CD8+ T cells are responsible for the control of viraemia in HCV infection, and several studies suggest protection against viral infection associated with specific HLAs. The reason for low rates of sustained viral response (SVR) in HCV patients remains unknown. Escape mutations in response to cytotoxic T lymphocyte are widely described; however, its influence in the treatment outcome is ill understood. Here, we investigate the differences in CD8 epitopes frequencies from the Los Alamos database between groups of patients that showed distinct response to pegylated alpha-INF with ribavirin therapy and test evidence of natural selection on the virus in those who failed treatment, using five maximum likelihood evolutionary models from PAML package. The group of sustained virological responders showed three epitopes with frequencies higher than Non-responders group, all had statistical support, and we observed evidence of selection pressure in the last group. No escape mutation was observed. Interestingly, the epitope VLSDFKTWL was 100% conserved in SVR group. These results suggest that the response to treatment can be explained by the increase in immune pressure, induced by interferon therapy, and the presence of those epitopes may represent an important factor in determining the outcome of therapy.

The central repeat domain 1 of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) latency associated-nuclear antigen 1 (LANA1) prevents cis MHC class I peptide presentation

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Relation of pretreatment sequence diversity in NS5A region of HCV genotype 1 with immune response between pegylated-INF/ribavirin therapy outcomes

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Epstein-Barr virus (EBV) nuclear antigen (EBNA)-4 mutation in EBV-associated malignancies in three different populations

Different ethnic groups with a high human leukocyte antigen (HLA)-A11 prevalence have been shown to experience a high rate of Epstein-Barr virus (EBV) infection, EBV-associated malignancies, and Epstein-Barr nuclear antigen (EBNA)-4 mutations. The epitopes 393-408 and 416-424 of EBNA-4 are major antigenic epitopes that elicit an HLA-A11 cytotoxic T lymphocyte (CTL) response to EBV infection. Mutations selectively involving one or more nucleotide residues in these epitopes affect the antigenicity of EBNA-4, because the mutant EBV strains are not recognized by the HLA-A11-restricted CTLs. To investigate these mutations in common EBV-associated malignancies occurring in different populations, we studied the mutation rate of epitopes 393-408 and 416-424 of EBNA-4 in 25 cases of EBV-associated Hodgkin's disease (HD), nine cases of AIDS-related non-Hodgkin's lymphoma, and 37 cases of EBV-associated gastric carcinoma (GC) from the United States, Brazil, and Japan. We found one or more mutations in these two epitopes in 50% (6/12) of United States HD, 15% (2/13) of Brazilian HD, 50% (6/12) United States GC and 28% (7/25) Japanese GC, and 22% (2/9) of United States AIDS-lymphoma. Similar mutations were found in 30% (3/10) of United States reactive, 0% (0/6) of Brazilian reactive, and 25% (2/8) Japanese reactive tissues. The most frequent amino acid substitutions were virtually identical to those seen in previously reported isolates from EBV-associated nasopharyngeal carcinomas and Burkitt's lymphomas occurring in high prevalence HLA-A11 regions. However, only 2/28 (7%) mutations occurred in HLA-A11-positive patients. Our studies suggest that: 1) EBNA-4 mutations are a common phenomenon in EBV-associated HD, GC, and AIDS-lymphoma; 2) the mutation rate does not vary in these geographic areas and ethnic groups; 3) EBNA-4 mutations in EBV-associated United States and Brazilian HD, United States and Japanese GC, and United States AIDS lymphomas are not related to patients' HLA-A11 status.