Novos sistemas terapêuticos de administração transcutânea

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Levels and biological effects of selected EDC's in the portuguese coast

Os compostos orgânicos de estanho (OTs), de entre os quais se destaca o tributilestanho (TBT), encontram-se amplamente dispersos no meio aquático devido à sua intensa utilização como agente biocida em tintas antivegetativas. Estudos anteriores sobre a poluição por organoestanhos em Portugal demonstraram que estes compostos se encontram presentes não só na linha de costa mas também em zonas da plataforma, sendo as zonas portuárias (onde se incluem portos comerciais, portos de pesca, marinas e estaleiros navais) os principais focos de poluição. A presente tese tem como objectivo investigar o estado actual da poluição por organoestanhos na costa Portuguesa confirmando se os padrões espaciais acima descritos se mantêm, por meio da quantificação de diversos OTs, nomeadamente, butilestanhos, fenilestanhos e octilestanhos. Assim, os níveis destes compostos foram avaliados em populações de Mytilus galloprovincialis e Nassarius reticulatus ao longo da costa continental Portuguesa, com particular incidência na Ria de Aveiro onde se quantificaram os níveis de OTs em mexilhões, gastrópodes e sedimentos, recolhidos numa malha de amostragem mais densa. A distribuição espacial dos organoestanhos foi determinada utilizando o bivalve M. galloprovincialis como espécie bioindicadora. Os níveis totais de estanho (SnT) foram quantificados nos tecidos do mexilhão e relacionados com os níveis totais de OTs nos mesmos tecidos, incluindo monobutilestanho (MBT), dibutilestanho (DBT), tributilestanho (TBT), difenilestanho (DPhT), trifenilestanho (TPhT), monoctilestanho (MOcT) e dioctilestanho (DOct). A contribuição dos OTs para os valores de estanho total (SnT) foi superior nas estações de amostragem localizadas no interior de portos onde atingiram proporções próximas dos 50%. De entre estes, os butilestanhos (BuTs=MBT+DBT+TBT) contribuíram em média com 98.6% para o valor total de OTs, tendo sido detectados em todas as amostras analisadas. Os valores mais elevados foram registados no interior ou na proximidade de portos, corroborando a ideia anterior de que constituem importantes focos de poluição. A variação das concentrações de TBT no mexilhão situou-se entre os 0,9 e 720 ng Sn.g-1 de peso seco (ps). Estes valores são, em 69% das estações amostradas, superiores ao valor do proposto pela OSPAR (4,9 ng TBT-Sn.g-1 ps) para tecidos de mexilhão o que sugere a forte probabilidade de ocorrência de efeitos adversos sobre os ecossistemas. Os níveis de OTs foram também quantificados em tecidos de N. reticulatus recolhidos ao longo da costa em 2008 Os butilestanhos representaram a maioria dos compostos organoestânicos quantificados e os níveis mais elevados foram novamente detectados no interior ou nas imediações de portos. Os valores de TBT nos tecidos deste gastrópode variaram entre 3,5 e 380 ng Sn.g-1 ps, representando uma percentagem média de 50,4% do total de butilestanhos. Simultaneamente, os níveis de imposex foram também avaliados e relacionados com os valores deste composto nos tecidos. As distribuições espaciais de imposex e de TBT seguiram a mesma tendência, sendo que em todos os locais amostrados foram encontradas fêmeas afectadas. Os valores de VDSI (índice da sequência do vaso deferente) variaram entre 0,2 e 4,4. Em 91% dos locais os valores de VDSI foram superiores a 0,3 (definido pela OSPAR como o valor de VDSI em N. reticulatus acima do qual o objectivo de qualidade ecológica não é atingido), confirmando a suspeição da existência de efeitos adversos nos ecossistemas. Em todos os compartimentos analisados na Ria de Aveiro, os butilestanhos foram os principais contribuintes para estanho orgânico total. A utilização do imposex em N. reticulatus como biomarcador da poluição por TBT permitiu determinar um gradiente decrescente desde o interior da Ria (onde se situa a zona portuária) até zonas costeiras adjacentes. O mesmo gradiente foi observado relativamente às concentrações de TBT em tecidos de mexilhão. Para os sedimentos, as concentrações de TBT são bastante variáveis com valores entre 2,7 e 1780 ng Sn.g-1 ps encontrando-se significativamente correlacionadas com o conteúdo em matéria orgânica da amostra. Em todas as amostras analisadas os níveis de TBT são elevados e superiores ao valor inferior (provisório) de EAC (critério de avaliação ambiental) proposto pela OSPAR (0,004 ng TBT-Sn.g-1 ps). A análise da evolução temporal da poluição por TBT ao longo da costa foi concretizada por meio da comparação entre níveis de organoestanhos em N. reticulatus em amostras de 2008 e 2003 e também através da comparação dos níveis de imposex registados em campanhas realizadas naqueles dois anos. Os resultados obtidos indicam a ocorrência de reduções significativas nas concentrações de TBT, DBT e MBT, assim como uma diminuição significativa nos valores de VDSI entre 2003 e 2008. Os resultados obtidos sugerem que a redução verificada se deve à implementação do Regulamento 782/2003 da Comunidade Europeia, que tem por objectivo a erradicação das descargas e emissões de TBT para o ambiente a partir dos sistemas antivegetativos A diminuição da poluição por TBT ao longo dos últimos anos foi acompanhada por um aumento no número de fêmeas com um vaso deferente, mas sem pénis (imposex do tipo b): 3,5% em 2000, 11% em 2003 e 24% em 2008. Um aumento no número de locais onde se registou o fenómeno também é evidente: dois em 2000, sete em 2003 e treze em 2008. A proporção de fêmeas b no estádio 1 de VDS apresentou igual tendência com aumento de 38% em 2000 para 65% em 2008. O aumento no número de fêmeas com esta via parece estar associado à diminuição da poluição por TBT. Face à esperada diminuição da presença do composto no meio ambiente, devido à sua proibição, o aumento de fêmeas com imposex do tipo b é previsível. A ocorrência de compostos xenoestrogénicos no ambiente aquático foi também estudada e os níveis de estrona (E1), 17α-e 17β-estradiol (E2), 17α- etinilestradiol (EE2), bisfenol-A (BPA) e nonilfenol (NP) foram quantificados em efluentes de estações de tratamento de águas residuais (ETARs) localizadas na região de Aveiro, bem como no efluente final descarregado no Oceano Atlântico, através de um emissário submarino (S. Jacinto), sendo amostras recolhidas na entrada da Ria e ao largo usadas como referência. Os níveis de hormonas esteróides e compostos fenólicos registados nos locais de referência são baixos. De entre as hormonas esteróides os níveis mais elevados foram registados para a estrona, com valores máximos de 85.3 ng.L- 1 . Os níveis mais elevados de compostos fenólicos foram detectados em efluentes industriais (máximos de NP e BPA de 2410 ng.L-1 e 897 ng.L-1 , respectivamente). Os resultados obtidos sugerem que os níveis de compostos xenoestrogénicos em locais de referência são baixos e não parecerem acarretar risco ecológico, no entanto o mesmo não será verdadeiro para as imediações do emissário de S. Jacinto que liberta efluentes com concentrações muito elevadas de E1, NP e BPA. Foram realizadas experiências laboratoriais de forma a elucidar o papel do receptor retinóico X (RXR) no mecanismo de indução de imposex (presentemente o mecanismo que demonstra maior promessa na explicação do desencadear deste fenómeno). Fêmeas de Nucella lapillus e N. reticulatus foram injectadas com TBT em etanol ou com ácido 9-cis- retinóico em FBS (soro fetal bovino) tendo-se procedido à sua observação nos 30 dias subsequentes. Tanto o TBT como o 9CRA induziram o desenvolvimento de imposex em N. lapillus e N. reticulatus. Aumentos significativos nos valores de VDSI e FPL entre o controlo de etanol e o tratamento de TBT e o controlo de FBS e o tratamento de 9CRA foram registados. Os resultados obtidos fornecem novas provas do envolvimento da via de sinalização associada ao RXR no desenvolvimento de imposex em ambas as espécies.

Progesterone actions in protein phosphorylation in the central nervous system

O presente trabalho propõe-se esclarecer o papel que a progesterona e os seus metabolitos exercem no sistema nervoso central. Nos últimos anos, com a descoberta da síntese local de esteróides no cérebro, a progesterona, assim como outras hormonas sexuais, ganharam uma relevância crescente em fenómenos tais como plasticidade neuronal e neuroprotecção. Ainda que já se comece a entender o papel de muitas hormonas no cérebro, tal como o estrogénio, o papel da progesterona continua menos conhecido. Deste modo, o nosso trabalho centrou-se na elucidação dos efeitos da progesterona em fenómenos de sobrevivência celular, plasticidade neuronal/sináptica. Graças à colaboração com um grupo pioneiro em estudos sobre hormonas sexuais neuroactivas, o presente trabalho fornece uma importante contribuição ao entendimento do papel desta hormona no sistema nervoso central. Este trabalho fornece novos dados, relativamente ao papel da progesterona e dos seus metabolitos reduzidos na regulação de vias de sinalização associadas com sobrevivência celular, tal como Akt/PI3K e ERK. Também é analisado o efeito do tratamento hormonal na expressão e estado de fosforilação da proteína Tau, sendo ainda motivo de estudo cinases e fosfatases envolvidas nestes mecanismos.

Characterisation of gas and particle emissions from wildfires

Os incêndios florestais são uma importante fonte de emissão de compostos gasosos e de aerossóis. Em Portugal, onde a maioria dos incêndios ocorre no norte e centro do país, os incêndios destroem todos os anos milhares de hectares, com importantes perdas em termos económicos, de vidas humanas e qualidade ambiental. As emissões podem alterar consideravelmente a química da atmosfera, degradar a qualidade do ar e alterar o clima. Contudo, a informação sobre as caraterísticas das emissões dos incêndios florestais nos países do Mediterrâneo é limitada. Tanto a nível nacional como internacional, existe um interesse crescente na elaboração de inventários de emissões e de regulamentos sobre as emissões de carbono para a atmosfera. Do ponto de vista atmosférico da monitorização atmosférica, os incêndios são considerados um desafio, dada a sua variabilidade temporal e espacial, sendo de esperar um aumento da sua frequência, dimensão e severidade, e também porque as estimativas de emissões dependem das caraterísticas dos biocombustíveis e da fase de combustão. O objetivo deste estudo foi quantificar e caraterizar as emissões de gases e aerossóis de alguns dos mais representativos incêndios florestais que ocorreram no centro de Portugal nos verões de 2009 e de 2010. Efetuou-se a colheita de amostras de gases e de duas frações de partículas (PM2.5 e PM2.5-10) nas plumas de fumo em sacos Tedlar e em filtros de quartzo acoplados a um amostrador de elevado volume, respetivamente. Os hidrocarbonetos totais (THC) e óxidos de carbono (CO e CO2) nas amostras gasosas foram analisados em instrumentos automáticos de ionização de chama e detetores não dispersivos de infravermelhos, respetivamente. Para algumas amostras, foram também quantificados alguns compostos de carbonilo após reamostragem do gás dos sacos Tedlar em cartuchos de sílica gel revestidos com 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH), seguida de análise por cromatografia líquida de alta resolução. Nas partículas, analisou-se o carbono orgânico e elementar (técnica termo-óptica), iões solúveis em água (cromatografia iónica) e elementos (espectrometria de massa com plasma acoplado por indução ou análise instrumental por ativação com neutrões). A especiação orgânica foi obtida por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa após extração com recurso a vários solventes e separação dos extratos orgânicos em diversas classes de diferentes polaridades através do fracionamento com sílica gel. Os fatores de emissão do CO e do CO2 situaram-se nas gamas 52-482 e 822-1690 g kg-1 (base seca), mostrando, respetivamente, correlação negativa e positiva com a eficiência de combustão. Os fatores de emissão dos THC apresentaram valores mais elevados durante a fase de combustão latente sem chama, oscilando entre 0.33 e 334 g kg-1 (base seca). O composto orgânico volátil oxigenado mais abundante foi o acetaldeído com fatores de emissão que variaram desde 1.0 até 3.2 g kg-1 (base seca), seguido pelo formaldeído e o propionaldeído. Observou-se que as emissões destes compostos são promovidas durante a fase de combustão latente sem chama. Os fatores de emissão de PM2.5 e PM10 registaram valores entre 0.50-68 e 0.86-72 g kg-1 (base seca), respetivamente. A emissão de partículas finas e grosseiras é também promovida em condições de combustão lenta. As PM2.5 representaram cerca de 90% da massa de partículas PM10. A fração carbonosa das partículas amostradas em qualquer dos incêndios foi claramente dominada pelo carbono orgânico. Foi obtida uma ampla gama de rácios entre o carbono orgânico e o carbono elementar, dependendo das condições de combustão. Contudo, todos os rácios refletiram uma maior proporção de carbono orgânico em relação ao carbono elementar, típica das emissões de queima de biomassa. Os iões solúveis em água obtidos nas partículas da pluma de fumo contribuíram com valores até 3.9% da massa de partículas PM2.5 e 2.8% da massa de partículas de PM2.5-10. O potássio contribuiu com valores até 15 g mg-1 PM2.5 e 22 g mg-1 PM2.5-10, embora em massa absoluta estivesse maioritariamente presente nas partículas finas. Os rácios entre potássio e carbono elementar e entre potássio e carbono orgânico obtidos nas partículas da pluma de fumo enquadram-se na gama de valores relatados na literatura para emissões de queima de biomassa. Os elementos detetados nas amostras representaram, em média, valores até 1.2% e 12% da massa de PM2.5 e PM2.5-10, respetivamente. Partículas resultantes de uma combustão mais completa (valores elevados de CO2 e baixos de CO) foram caraterizadas por um elevado teor de constituintes inorgânicos e um menor conteúdo de matéria orgânica. Observou-se que a matéria orgânica particulada é composta principalmente por componentes fenólicos e produtos derivados, séries de compostos homólogos (alcanos, alcenos, ácidos alcanóicos e alcanóis), açúcares, biomarcadores esteróides e terpenóides, e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. O reteno, um biomarcador das emissões da queima de coníferas, foi o hidrocarboneto aromático dominante nas amostras das plumas de fumo amostradas durante a campanha que decorreu em 2009, devido ao predomínio de amostras colhidas em incêndios em florestas de pinheiros. O principal açúcar anidro, e sempre um dos compostos mais abundantes, foi o levoglucosano. O rácio levoglucosano/OC obtido nas partículas das plumas de fumo, em média, registaram valores desde 5.8 a 23 mg g-1 OC. Os rácios levoglucosano/manosano e levoglucosano/(manosano+galactosano) revelaram o predomínio de amostras provenientes da queima de coníferas. Tendo em conta que a estimativa das emissões dos incêndios florestais requer um conhecimento de fatores de emissão apropriados para cada biocombustível, a base de dados abrangente obtida neste estudo é potencialmente útil para atualizar os inventários de emissões. Tem vindo a ser observado que a fase de combustão latente sem chama, a qual pode ocorrer simultaneamente com a fase de chama e durar várias horas ou dias, pode contribuir para uma quantidade considerável de poluentes atmosféricos, pelo que os fatores de emissão correspondentes devem ser considerados no cálculo das emissões globais de incêndios florestais. Devido à falta de informação detalhada sobre perfis químicos de emissão, a base de dados obtida neste estudo pode também ser útil para a aplicação de modelos no recetor no sul da Europa.

Liver-like biosensor: immobilized CYP3A4 sensors as tools for ligand binding and enzyme activity measurements

Cytochromes P450 constitute a super-family of enzymes involved in the metabolism of Xenobiotics, where human cytochrome P450 3A4 is the most abundant of all P450s, accounting for about 50% of all human liver cytochromes. This membrane anchored protein is responsible for the metabolization of a wide array of environmental drugs and intoxicants, mainly due to its haem domain properties, and active site cavity volume. These properties make this protein an excellent subject for biosensor application, although CYO3A4 enzyme is also famous for its instability. Enzyme inactivation at room temperature is a normal conversion process that this enzyme undergoes, that may hamper any biosensing approach.

Compostos de origem marinha com ação anti-inflamatória

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Reações adversas gastrointestinais: causas, prevenção e tratamento

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Impacto de andrógenos sobre a proliferação e atividade de fibroblastos e células epiteliais em cultura celular

Pós-graduação em Odontologia - FOAR

Prevalência da Automedicação nos alunos do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas da ULHT

A automedicação é uma prática cada vez mais comum em todo o mundo e quando praticada de forma responsável oferece diversos benefícios, nomeadamente uma maior autonomia das populações na gestão da sua saúde. No entanto, o consumo de medicamentos não deve ser banalizado e a orientação e aconselhamento por parte de um profissional de saúde como o farmacêutico será sempre uma mais-valia, na medida em que proporciona uma automedicação responsável, eficaz e segura. O presente trabalho teve como principais objectivos, determinar a prevalência da automedicação nos alunos do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias e avaliar os factores associados a esta prática. Nesse sentido, foi desenvolvido um estudo descritivo transversal, com base num questionário aplicado a esta população. Os dados recolhidos foram posteriormente sujeitos a tratamento estatístico através do programa SPSS®. Considerando uma amostra de 138 indivíduos, os resultados mostraram que a prevalência da automedicação foi de 95,7%. Os principais sintomas que motivaram o recurso à automedicação foram os estados gripais e constipações (14,2%), as dores menstruais (11,1%), a tosse/rouquidão (10,2%), cefaleias (9,5%), febre (8.6%), rinorreia e congestão nasal (6,7%) e a rinite alérgica (5,1%). Os medicamentos mais usados, nos últimos dois anos, foram os anti-inflamatórios não esteróides (19,4%), os analgésicos e antipiréticos (19,2%), os descongestionantes nasais (12,8%), os antitússicos e expectorantes (11,8%), os anti-histamínicos (9,5%) e as vitaminas e sais minerais (7,9%). A grande maioria dos inquiridos (89,9%) mostrou-se consciente dos possíveis riscos inerentes à automedicação. Ainda assim, 29% afirmou já se ter automedicado, usando medicamentos sujeitos a receita médica.

Análise morfológica neural e da densidade de espinhos dendríticos da amígdala medial de ratas durante o ciclo estral

A amígdala medial (AMe) é um núcleo superficial do complexo amigdalói-de, ocupando seu aspecto rostromedial. A AMe modula uma série de comportamen-tos, além de modular a memória e o aprendizado associado a estímulos olfativos e visuais. Em ratos, é uma estrutura sexualmente dimórfica e está dividida em quatro subnúcleos: ântero-dorsal (AMeAD), ântero-ventral (AMeAV), póstero-dorsal (AMePD) e póstero-ventral (AMePV). A AMe apresenta células com características morfológicas variadas e receptores para hormônios gonadais amplamente e heterogeneamente distribuídos entre todos os seus subnúcleos. O presente trabalho teve como obje-tivos caracterizar a morfologia dos neurônios dos subnúcleos AMeAD, AMeAV, AMePD e AMePV de ratas na fase de diestro e verificar a densidade de espinhos dendríticos de neurônios dos subnúcleos AMeAD, AMePD e AMePV de ratas nas fa-ses de diestro, pró-estro, estro e metaestro. Para tal, foram utilizadas ratas Wistar (N=24) que, após a identificação da fase do ciclo estral, foram anestesiadas e per-fundidas, tiveram seus encéfalos retirados e seccionados (cortes coronais de espes-sura de 100 e 200 µm), submetidos à técnica de Golgi. A seguir, os neurônios foram selecionados e desenhados com auxílio de câmara clara acoplada a um fotomicroscópio. Na avaliação da morfologia dos neurônios, observou-se que eles são do tipo multipolar, células estreladas e bitufted, sendo encontrados em todos os subnúcleos da AMe de ratas na fase de diestro além de células com corpos celulares arredondados, fusiformes, piriformes, ovais e com características piramidais. Para a quanti-ficação da densidade de espinhos dendríticos, foram desenhados os primeiros 40 µm de 8 ramos dendríticos de 6 fêmeas por fase do ciclo estral e por subregião da AMe. Os resultados da contagem dos espinhos dendríticos foram submetidos a ANOVA de uma via e ao teste de Newman-Keuls. Verificou-se que, em diestro, a densidade de espinhos nas regiões AMeAD, AMePD e AMePV, foi maior quando comparada às demais fases do ciclo estral. Além disso, em diestro, a AMePD apresentou a maior densidade quando comparada com as regiões AMeAD e AMePV. O estudo mostrou que os neurônios da AMe de ratas estudadas na fase de diestro apresentaram morfologia variada e a densidade de espinhos dendríticos va-riou na AMeAD, AMePD e AMePV durante o ciclo estral de ratas, especialmente na AMePD. Os resultados obtidos sugerem a plasticidade induzida por esteróides se-xuais na morfologia e na fisiologia da AMe de ratas.

Papel da angiotensina II na resposta da prolactina ao estresse em ratas lactantes

Este trabalho investigou o efeito da Angiotensina II central na redução das concentrações de prolactina em ratas lactantes em resposta ao estresse e a influência dos esteróides gonadais nesse mecanismo. Ratas Wistar lactantes foram divididas em 2 grupos: fêmeas no 7° e 20° dias de lactação. Os grupos do 7° dia foram divididos em 4 subgrupos cada: A) fêmeas que não sofreram microinjeção no ARC e sem estresse; B) fêmeas sem microinjeção no arqueado e submetidas ao estresse; C) fêmeas submetidas à microinjeção de losartan no arqueado e ao estresse; D) fêmeas submetidas à microinjeção de solução salina no arqueado e ao estresse. Os grupos do 20° dia foram divididos em 3 subgrupos cada: A) fêmeas que não sofreram microinjeção no arqueado e sem estresse; B) fêmeas sem microinjeção no arqueado e submetidas ao estresse; C) fêmeas submetidas à microinjeção de losartan no arqueado e ao estresse. As microinjeções de losartan (0,2 µl, 10-9 M) e salina (0,2 µl) foram realizadas 3 dias após a canulação do arqueado e 15 minutos antes do estresse (vapores de éter por 1 minuto); 5 minutos após o estresse, os animais foram decapitados, o sangue coletado e o plasma foi utilizado para dosagem por radioimunoensaio de prolactina, progesterona e estradiol. Os resultados foram analisados pelo teste de variância ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Newman-Keuls. A diferença entre duas médias foi testada pelo teste t de Student, com p<0,05 adotado como critério de significância. Ocorreu uma redução significativa nas concentrações basais de prolactina e progesterona em fêmeas no 20° em comparação ao 7° dia de lactação, enquanto que as concentrações basais de estradiol permaneceram inalteradas. O estresse agudo induziu uma redução nas concentrações de PRL em fêmeas no 7° e 20° dias, que foi impedida pela microinjeção de losartan no arqueado no 7° dia pós-parto. No 20° dia, contudo, o losartan falhou em impedir essa queda. Esses resultados demonstram que a Angiotensina II central possui efeito modulador na queda da secreção de prolactina em resposta a estresse agudo em ratas lactantes no 7° dia pós-parto, cujas concentrações de prolactina são elevadas; entretanto, isso parece não ser observado em ratas lactantes no 20° dia, cujas concentrações de prolactina e progesterona já estão significantemente reduzidas, indicando que esse efeito é dependente de progesterona e das concentrações de prolactina pré-estresse.

Alterações endócrinas do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas em ratas manipuladas no período neonatal

A manipulação no período neonatal tem sido utilizada há algumas décadas como modelo experimental para analisar os mecanismos pelos quais variações precoces no ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas estáveis na vida adulta. Nos ratos, a manipulação neonatal consiste do manuseio suave dos filhotes nos primeiros dias de vida em geral, durante as duas semanas após o parto. Quando adultos, os animais submetidos a essa manipulação apresentam uma menor secreção de glicocorticóides pela adrenal quando expostos a estímulos estressores, e um retorno mais rápido à concentração plasmática basal quando comparados aos ratos não manipulados. Trabalhos prévios demonstram que além de alterar o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, a manipulação pode alterar o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas, ratas manipuladas apresentam ciclos anovulatórios e uma diminuição do comportamento sexual. Com isso, o nosso objetivo nesse trabalho foi analisar o perfil de secreção de estradiol e progesterona em ratas manipuladas no período neonatal nas quatro fases do ciclo estral, como também, verificar o efeito da manipulação sobre as concentrações plasmáticas de LH e FSH em ratas ovariectomizadas e com reposição hormonal No experimento I foram estudados dois grupos de ratas adultas: não manipuladas (fêmeas que nos 10 primeiros dias de vida não foram tocadas pelo experimentador ou tratador); e manipuladas (ratas que nos 10 primeiros dias pós-parto foram diariamente manipuladas pelo experimentador por 1 minuto, retornando para a mãe logo em seguida). Quando adultas, o ciclo estral das ratas foi controlado, e aquelas com 3 a 4 ciclos regulares seguidos tiveram a veia jugular externa canulada em cada uma das fases do ciclo estral (metaestro, diestro, estro e proestro). No dia seguinte ao da cirurgia às 8 horas da manhã, iniciaram-se as coletas de sangue (800µL) de 3 em 3 horas. O sangue foi centrifugado, o plasma coletado e destinado ao radioimunoensaio para estradiol e progesterona. As ratas cujo sangue foi coletado no proestro tiveram o número de óvulos contados na manhã seguinte. No experimento II, as ratas manipuladas e não manipuladas foram ovariectomizadas e 3 semanas após receberam injeções subcutâneas de estradiol por 3 dias consecutivos às 9 horas da manhã, no quarto dia receberam progesterona às 10 horas e às 11 horas tiveram a veia jugular canulada Neste mesmo dia às 13 horas, iniciaram-se as coletas de sangue (600µL) que foram realizadas de hora em hora, até às 18 horas. O sangue foi centrifugado o plasma coletado e destinado ao radioimunoensaio para LH e FSH. Os resultados mostraram que as ratas manipuladas no período neonatal apresentam uma redução nas concentrações plasmáticas de estradiol no proestro e de progesterona no metaestro e no estro comparadas às não manipuladas. O número de óvulos encontrados na manhã do estro está reduzido nas ratas manipuladas quando comparado às não manipuladas, confirmando resultados prévios. A alteração destes esteróides gonadais pode explicar a redução do número de óvulos das fêmeas manipuladas. As concentrações plasmáticas de LH e de FSH não são diferentes entre os dois grupos, indicando que a responsividade do eixo hipotálamo-hipófise parece não ser alterada pela manipulação, no entanto é necessário realizar mais experimentos para que afirmações possam ser feitas a respeito da responsividade do eixo.

Efeito das prostaglandinas ciclopentenônicas sobre a expressão gênica do fator nuclear PPAR-γ, do receptor de scavenger CD36 e proteínas de apoptose em macrófagos : implicações para a fisiopatologia da aterosclerose

Considerando que as doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade e morbidade em países ocidentais, a aterosclerose se destaca pelo fato de predispor os pacientes ao infarto do miocárdio, a acidentes vasculares cerebrais e a doenças vasculares periféricas. Neste contexto, a oxidação de lipoproteínas do plasma, particularmente LDL, é um dos fatores de risco para eventos cardiovasculares, pois é reconhecida e internalizada por macrófagos, ocasionando a sua diferenciação em foam cells. Diversos fatores participam deste processo de diferenciação, como a expressão de receptores de scavenger CD 36, proporcionando aumento na captação de LDL oxidada, aumento na síntese endógena de colesterol e ativação de fatores nucleares que iniciam a transcrição de proteínas específicas e fatores de crescimento que disparam a aterogênese. Os fenômenos celulares relacionados à apoptose também são de especial importância, tanto no desenvolvimento da lesão aterosclerótica como na estabilidade da placa e formação de trombos. As prostaglandinas (PGs) ciclopentenônicas (CP-PGs), em particular a PGA2 e a 15-desóxi-∆12,14-PGJ2 são uma classe especial de PGs que, em diminutas concentrações, disparam a expressão das proteínas de choque térmico (hsp), que são citoprotetoras. Além disso, CP-PGs bloqueiam a ativação do fator nuclear pró-inflamatório NF-κB tornando-as potentes agentes antiinflamatórios. Embora as PGs das famílias A e J guardem uma série de características em comum, a 15-desóxi-∆12,14- PGJ2 é o ligante fisiológico do fator nuclear pró-aterogênico PPAR-γ, enquanto as PGs da família A ativam apenas a via citoprotetora das hsp. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das CP-PGs sobre a expressão gênica de fatores relacionados à diferenciação de macrófagos em foam cells, bem como proteínas reguladoras do processo de apoptose, em células da linhagem pró-monocítica humana U937. Para tal, as células foram tratadas com CPPGs em presença e/ou ausência de LDL nat e LDL ox, o RNA foi extraído para a realização de RT-PCR para PPAR-γ, CD 36, HMG-CoA redutase e proteínas de apoptose Caspase 3, p53 e Bcl-xL. O tratamento estatístico utilizado foi análise de variância (ANOVA one-way) e teste “t” de student, com resultados expressos como médias + desvios-padrão da média, com P<0,05. Os resultados obtidos demontraram que as CP-PGs PGA2 (20µM-24h) e PGJ2 (1,5µM-24h) inibiram a expressão gênica do fator nuclear PPAR- γ (64 % (PGA2), 88 % (15- d-PGJ2)) nas células U937, em presença de LDL oxidada, quando comparado ao controle. PGA2 inibiu a expressão de HMG-CoA redutase (33 %), enzima chave da síntese de colesterol intracelular, e o tratamento com as CP-PGs também inibiu a apoptose nas células tratadas em presença de LDL oxidada. Os dados sugerem que as CP-PGs apresentam grande potencial para o tratamento da aterosclerose, já que, além de apresentarem efeito antiinflamatório, inibem a expressão do fator nuclear pró-aterogênico PPAR-γ, do receptor de scavenger CD36 (apenas a 15-desóxi-∆12,14-PGJ2) e da enzima HMG-CoA redutase. O bloqueio da apoptose nas células estudadas pode estar relacionado à citoproteção oferecida por estas PGs. Embora investigações in vivo deste laboratório tenham mostrado a eficácia do tratamento com CP-PGs em camundongos portadores de aterosclerose, estudos adicionais são necessários para esclarecer-se o efeito antiaterogênico das mesmas.

Efeitos do estresse agudo e a participação do sistema angiotensinérgico sobre a função reprodutiva em ratas : comportamento sexual, ovulação e lactação

A função reprodutiva constitui-se em um dos diversos estados no qual o estresse pode atuar exercendo efeitos deletérios que colocam em risco a integridade individual e a manutenção da espécie. Dentre os diversos peptídeos que atuam controlando os processos reprodutivos, a angiotensina II (Ang II) possui um papel destacado pela sua atuação no controle de hormônios hipofisários, além de uma importante participação na regulação das respostas ao estresse. Considerando a importância dos mecanismos que controlam as funções reprodutivas e as evidências da influência do estresse sobre esses processos, esta tese teve como objetivo estudar os possíveis efeitos do estresse agudo sobre diferentes aspectos da função reprodutiva em fêmeas e a participação do sistema angiotensinérgico nesses mecanismos. Para isso, foi avaliada a resposta ao estresse de diversos hormônios com funções reprodutivas como a prolactina, o hormônio luteinizante e a progesterona em diferentes fases do processo reprodutivo. A participação do sistema angiotensinérgico foi avaliada através da utilização de antagonistas da Ang II e da quantificação da densidade de receptores de Ang II em núcleos do sistema nervoso central como o núcleo arqueado, o locus coeruleus, o núcleo pré-óptico mediano e o órgão subfornicial em modelos experimentais com diferentes concentrações de estradiol e progesterona. O presente estudo demonstrou que o estresse agudo provoca uma redução na concentração plasmática de prolactina em ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol e progesterona e lactantes, sendo esta resposta mediada pelos receptores AT1 de Ang II no núcleo arqueado. Os esteróides gonadais aumentam a densidade destes receptores de Ang II no núcleo arqueado e a progesterona parece ser a principal moduladora desta regulação. Além disso, esse aumento também ocorre no locus coeruleus, núcleo pré-óptico mediano e órgão subfornicial, já que o tratamento de ratas ovariectomizadas com estradiol e progesterona provoca um aumento na densidade de receptores de Ang II nestes núcleos. Já o estresse agudo na manhã do proestro provocou uma redução nas concentrações plasmáticas de hormônio luteinizante, progesterona e prolactina na tarde do proestro, juntamente com uma redução na ovulação, sendo estes efeitos mediados pelos receptores AT1 de Ang II. A aplicação de um estresse agudo por contenção durante 1 hora na tarde do proestro provocou uma redução no comportamento sexual, porém esses efeitos não são mediados pelo sistema angiotensinérgico. Em conjunto, esses resultados permitem concluir que o estresse agudo provoca alterações em diferentes aspectos do processo reprodutivo em fêmeas, incluindo efeitos deletérios sobre a lactação, o comportamento sexual, a geração dos picos hormonais pré-ovulatórios e a ovulação. O sistema angiotensinérgico tem uma participação efetiva em diversos mecanismos envolvidos na resposta ao estresse e parece ser um importante regulador dessas respostas.

Efeitos da manipulação neonatal sobre a concentração plasmática de hormônios da reprodução e a densidade de receptores de angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas

A manipulação neonatal é um modelo experimental utilizado para avaliar o modo pelo qual interferências precoces na vida do animal podem alterar funções neuroendócrinas e comportamentos na vida adulta. O procedimento de manipulação neonatal, além de alterar a atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (eixo HPA) em ratos machos e fêmeas, pode causar profundas mudanças na função reprodutiva de ratas adultas. De fato, há evidências de que a manipulação neonatal diminui a atividade do eixo HPA através da redução da síntese e secreção de hormônios que são liberados quando os animais são expostos ao estresse na vida adulta e, além disso, induz à presença de ciclos anovulatórios e diminui a receptividade sexual de ratas. Considerando essas alterações induzidas pela manipulação neonatal que são relacionadas à função reprodutiva de ratas, essa tese teve por objetivo estudar as possíveis causas da alteração no comportamento sexual e ovulação induzidas pela manipulação neonatal. Para isto, além de estudar o perfil hormonal desses animais, o que incluiu os esteróides gonadais, as gonadotrofinas e a prolactina (PRL) em diferentes fases e horários do ciclo estral, o conteúdo do hormônio liberador de gonadotrofinas (LHRH) em algumas regiões do sistema nervoso central (SNC) e na eminência mediana (EM); foi avaliada a possível participação do sistema angiotensinérgico central, através da análise da densidade dos receptores de angiotensina II (Ang II) pela técnica de auto-radiografia, na mediação dos efeitos da manipulação neonatal sobre a função do eixo hipotálamo-hipófise-gônada (eixo HPG) e do eixo HPA. O presente estudo confirmou dados obtidos em nosso laboratório sobre a redução do comportamento sexual e da ovulação em ratas manipuladas no período neonatal. Na tarde do proestro, período no qual ocorrem os eventos necessários para a ovulação na próxima fase do ciclo estral, os resultados mostram que os animais do grupo manipulado têm redução significativa da concentração plasmática de estradiol, de gonadotrofinas e de PRL, assim como um aumento no conteúdo de LHRH na área pré-óptica medial (APOM). A manipulação neonatal também reduziu a concentração plasmática de progesterona analisada após o coito que pode ser decorrente da reduzida estimulação vaginocervical recebida por essas ratas, já que houve uma redução significativa da freqüência de intromissão realizada pelo macho sobre as ratas do grupo manipulado. A densidade de receptores de Ang II na APOM e no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) também foi alterada pela manipulação neonatal, pois houve redução significativa na densidade desses receptores nessas duas regiões. Em conclusão, a manipulação neonatal reduz profundamente a atividade do eixo HPG e essa alteração é causada por modificações nas concentrações de estradiol no plasma que, por sua vez, pode alterar a secreção de LHRH, de gonadotrofinas e de PRL, comprometendo dessa maneira a ovulação e a receptividade sexual. Contribuindo para os efeitos deletérios da manipulação neonatal sobre a função reprodutiva em ratas, este procedimento pode alterar a implantação do blastocisto devido à redução da secreção de progesterona observada após o coito no grupo manipulado. Alguns dos efeitos da manipulação neonatal parecem ser mediados pelo sistema angiotensinérgico central, como o aumento do conteúdo de LHRH na APOM e a diminuída resposta do eixo HPA observada em animais manipulados submetidos a situações estressantes na vida adulta.