Intrinsic uncoupling in the ATP synthase of Escherichia coli. Studies on WT and ����-truncated mutants

The H+/ATP ratio in the catalysis of ATP synthase has generally been considered a fixed parameter. However, Melandri and coworkers have recently shown that, in the ATP synthase of the photosynthetic bacterium Rb.capsulatus, this ratio can significantly decrease during ATP hydrolysis when the concentration of either ADP or Pi is maintained at a low level (Turina et al., 2004). The present work has dealt with the ATP synthase of E.coli, looking for evidence of this phenomenon of intrinsic uncoupling in this organism as well. First of all, we have shown that the DCCD-sensitive ATP hydrolysis activity of E.coli internal membranes was strongly inhibited by ADP and Pi, with a half-maximal effect in the submicromolar range for ADP and at 140 ����M for Pi. In contrast to this monotonic inhibition, however, the proton pumping activity of the enzyme, as estimated under the same conditions by the fluorescence quenching of the ����pH-sensitive probe ACMA, showed a clearly biphasic progression, both for Pi, increasing from 0 up to approximately 200 ����M, and for ADP, increasing from 0 up to a few ����M. We have interpreted these results as indicating that the occupancy of ADP and Pi binding sites shifts the enzyme from a partially uncoupled state to a fully coupled state, and we expect that the ADP- and Pi-modulated intrinsic uncoupling is likely to be a general feature of prokaryotic ATP synthases. Moreover, the biphasicity of the proton pumping data suggested that two Pi binding sites are involved. In order to verify whether the same behaviour could be observed in the isolated enzyme, we have purified the ATP synthase of E.coli and reconstituted it into liposomes. Similarly as observed in the internal membrane preparation, in the isolated and reconstituted enzyme it was possible to observe inhibition of the hydrolytic activity by ADP and Pi (with half-maximal effects at few ����M for ADP and at 400 ����M for Pi) with a concomitant stimulation of proton pumping. Both the inhibition of ATP hydrolysis and the stimulation of proton pumping as a function of Pi were lost upon ADP removal by an ADP trap. These data have made it possible to conclude that the results obtained in E.coli internal membranes are not due to the artefactual interference of enzymatic activities other than the ones of the ATP synthase. In addition, data obtained with liposomes have allowed a calibration of the ACMA signal by ����pH transitions of known extent, leading to a quantitative evaluation of the proton pumping data. Finally, we have focused our efforts on searching for a possible structural candidate involved in the phenomenon of intrinsic uncoupling. The ����-subunit of the ATP-synthase is known as an endogenous inhibitor of the hydrolysis activity of the complex and appears to undergo drastic conformational changes between a non-inhibitory form (down-state) and an inhibitory form (up-state)(Rodgers & Wilce, 2000; Gibbons et al., 2000). In addition, the results of Cipriano & Dunn (2006) indicated that the C-terminal domain of this subunit played an important role in the coupling mechanism of the pump, and those of Capaldi et al. (2001), Suzuki et al. (2003) were consistent with the down-state showing a higher hydrolysis-to-synthesis ratio than the up-state. Therefore, we decided to search for modulation of pumping efficiency in a C-terminally truncated ���� mutant. A low copy number expression vector has been built, carrying an extra copy of uncC, with the aim of generating an ����-overexpressing E.coli strain in which normal levels of assembly of the mutated ATP-synthase complex would be promoted. We have then compared the ATP hydrolysis and the proton pumping activity in membranes prepared from these ����-overexpressing E.coli strains, which carried either the WT ���� subunit or the ����88-stop truncated form. Both strains yielded well energized membranes. Noticeably, they showed a marked difference in the inhibition of hydrolysis by Pi, this effect being largely lost in the truncated mutant. However, pre-incubation of the mutated enzyme with ADP at low nanomolar concentrations (apparent Kd = 0.7nM) restored the hydrolysis inhibition, together with the modulation of intrinsic uncoupling by Pi, indicating that, contrary to wild-type, during membrane preparation the truncated mutant had lost the ADP bound at this high-affinity site, evidently due to a lower affinity (and/or higher release) for ADP of the mutant relative to wild type. Therefore, one of the effects of the C-terminal domain of ���� appears to be to modulate the affinity of at least one of the binding sites for ADP. The lack of this domain does not appear so much to influence the modulability of coupling efficiency, but instead the extent of this modulation. At higher preincubated ADP concentrations (apparent Kd = 117nM), the only observed effects were inhibition of both hydrolysis and synthesis, providing a direct proof that two ADP-binding sites on the enzyme are involved in the inhibition of hydrolysis, of which only the one at higher affinity also modulates the coupling efficiency.

Use of solvents and environmental friendly materials for applications in Green Chemistry

The present Thesis studies three alternative solvent groups as sustainable replacement of traditional organic solvents. Some aspects of fluorinated solvents, supercritical fluids and ionic liquids, have been analysed with a critical approach and their effective ���greenness��� has been evaluated from the points of view of the synthesis, the properties and the applications. In particular, the attention has been put on the environmental and human health issues, evaluating the eco-toxicity, the toxicity and the persistence, to underline that applicability and sustainability are subjects with equal importance. The ���green��� features of fluorous solvents and supercritical fluids are almost well-established; in particular supercritical carbon dioxide (scCO2) is probably the ���greenest��� solvent among the alternative solvent systems developed in the last years, enabling to combine numerous advantages both from the point of view of industrial/technological applications and eco-compatibility. In the Thesis the analysis of these two classes of alternative solvents has been mainly focused on their applicability, rather than the evaluation of their environmental impact. Specifically they have been evaluated as alternative media for non-aqueous biocatalysis. For this purpose, the hydrophobic ion pairing (HIP), which allows solubilising enzymes in apolar solvents by an ion pairing between the protein and a surfactant, has been investigated as effective enzymatic derivatisation technique to improve the catalytic activity under homogeneous conditions in non conventional media. The results showed that the complex enzyme-surfactant was much more active both in fluorous solvents and in supercritical carbon dioxide than the native form of the enzyme. Ionic liquids, especially imidazolium salts, have been proposed some years ago as ���fully green��� alternative solvents; however this epithet does not take into account several ���brown��� aspects such as their synthesis from petro-chemical starting materials, their considerable eco-toxicity, toxicity and resistance to biodegradation, and the difficulty of clearly outline applications in which ionic liquids are really more advantageous than traditional solvents. For all of these reasons in this Thesis a critical analysis of ionic liquids has been focused on three main topics: i) alternative synthesis by introducing structural moieties which could reduce the toxicity of the most known liquid salts, and by using starting materials from renewable resources; ii) on the evaluation of their environmental impact through eco-toxicological tests (Daphnia magna and Vibrio fischeri acute toxicity tests, and algal growth inhibition), toxicity tests (MTT test, AChE inhibition and LDH release tests) and fate and rate of aerobic biodegradation in soil and water; iii) and on the demonstration of their effectiveness as reaction media in organo-catalysis and as extractive solvents in the recovery of vegetable oil from terrestrial and aquatic biomass. The results about eco-toxicity tests with Daphnia magna, Vibrio fischeri and algae, and toxicity assay using cultured cell lines, clearly indicate that the difference in toxicity between alkyl and oxygenated cations relies in differences of polarity, according to the general trend of decreasing toxicity by decreasing the lipophilicity. Independently by the biological approach in fact, all the results are in agreement, showing a lower toxicity for compounds with oxygenated lateral chains than for those having purely alkyl lateral chains. These findings indicate that an appropriate choice of cation and anion structures is important not only to design the IL with improved and suitable chemico-physical properties but also to obtain safer and eco-friendly ILs. Moreover there is a clear indication that the composition of the abiotic environment has to be taken into account when the toxicity of ILs in various biological test systems is analysed, because, for example, the data reported in the Thesis indicate a significant influence of salinity variations on algal toxicity. Aerobic biodegradation of four imidazolium ionic liquids, two alkylated and two oxygenated, in soil was evaluated for the first time. Alkyl ionic liquids were shown to be biodegradable over the 6 months test period, and in contrast no significant mineralisation was observed with oxygenated derivatives. A different result was observed in the aerobic biodegradation of alkylated and oxygenated pyridinium ionic liquids in water because all the ionic liquids were almost completely degraded after 10 days, independently by the number of oxygen in the lateral chain of the cation. The synthesis of new ionic liquids by using renewable feedstock as starting materials, has been developed through the synthesis of furan-based ion pairs from furfural. The new ammonium salts were synthesised in very good yields, good purity of the products and wide versatility, combining low melting points with high decomposition temperatures and reduced viscosities. Regarding the possible applications as surfactants and biocides, furan-based salts could be a valuable alternative to benzyltributylammonium salts and benzalkonium chloride that are produced from non-renewable resources. A new procedure for the allylation of ketones and aldehydes with tetraallyltin in ionic liquids was developed. The reaction afforded high yields both in sulfonate-containing ILs and in ILs without sulfonate upon addition of a small amount of sulfonic acid. The checked reaction resulted in peculiar chemoselectivity favouring aliphatic substrates towards aromatic ketones and good stereoselectivity in the allylation of levoglucosenone. Finally ILs-based systems could be easily and successfully recycled, making the described procedure environmentally benign. The potential role of switchable polarity solvents as a green technology for the extraction of vegetable oil from terrestrial and aquatic biomass has been investigated. The extraction efficiency of terrestrial biomass rich in triacylglycerols, as soy bean flakes and sunflower seeds, was comparable to those of traditional organic solvents, being the yield of vegetable oils recovery very similar. Switchable polarity solvents as been also exploited for the first time in the extraction of hydrocarbons from the microalga Botryococcus braunii, demonstrating the efficiency of the process for the extraction of both dried microalgal biomass and directly of the aqueous growth medium. The switchable polarity solvents exhibited better extraction efficiency than conventional solvents, both with dried and liquid samples. This is an important issue considering that the harvest and the dewatering of algal biomass have a large impact on overall costs and energy balance.

Polymer controlled mineralization of zinc phosphate hydrates and applications in corrosion protection, catalysis and biomedicine

ZUSAMMENFASSUNG Die Tauglichkeit von Hybridmaterialien auf der Basis von Zinkphosphathydrat-Zementen zum Einsatz als korrosionshemmende anorganische Pigmente oder zur prothetischen und konservierenden Knochen- und Zahntherapie wird weltweit empirisch seit den neunziger Jahren intensiv erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden zuerst Referenzproben, d.h. alpha-und beta-Hopeite (Abk. a-,b-ZPT) dank eines hydrothermalen Kristallisationsverfahrens in w��sserigem Milieu bei 20��C und 90��C hergestellt. Die Kristallstruktur beider Polymorphe des Zinkphosphattetrahydrats Zn3(PO4)2 ��� 4 H2O wurde komplett bestimmt. Einkristall-strukturanalyse zeigt, da�� der Hauptunterschied zwischen der alpha-und ���beta-Form des Zinkphosphattetrahydrats in zwei verschiedenen Anordnungen der Wasserstoffbr��cken liegt. Die entsprechenden drei- und zweidimensionalen Anordnungen der Wasserstoffbr��cken der a-und b-ZPT induzieren jeweils unterschiedliches thermisches Verhalten beim Aufw��rmen. W��hrend die alpha-Form ihr Kristallwasser in zwei definierten Stufen verliert, erzeugt die beta-Form instabile Dehydratationsprodukt. Dieses entspricht zwei unabh��ngigen, aber nebeneinander ablaufenden Dehydratationsmechanismen: (i) bei niedrigen Heizraten einen zweidimensionalen Johnson-Mehl-Avrami (JMA) Mechanismus auf der (011) Ebene, der einerseits bevorzugt an Kristallkanten stattfindet und anderseits von existierenden Kristalldefekten auf Oberfl��chen gesteuert wird; (ii) bei hohen Heizraten einem zweidimensionalen Diffusionsmechanismus (D2), der zuerst auf der (101) Ebene und dann auf der (110) Ebene erfolgt. Durch die Betrachtung der ZPT Dehydratation als irreversibele heterogene Festk��rperstufenreaktion wurde dank eines �����hnlichen Endprodukt���-Protokolls das Dehydratationsphasendiagramm aufgestellt. Es beschreibt die m��glichen Zusammenh��nge zwischen den verschiedenen Hydratationszust��nden und weist auf die Existenz eines ��bergangszustandes um 170��C (d.h. Reaktion b-ZPT ��� a-ZPT) hin. Daneben wurde auch ein gezieltes chemisches ��tzverfahren mit verd��nnten H3PO4- und NH3 L��sungen angewendet, um die ersten Stufe des Herausl��sens von Zinkphosphat genau zu untersuchen. Allerdings zeigen alpha- und beta-Hopeite charakteristische hexagonale und kubische ��tzgruben, die sich unter kristallographischer Kontrolle verbreitern. Eine zuverl��ssige Beschreibung der Oberf��chenchemie und Topologie konnte nur durch AFM und FFM Experimente erfolgen. Gleichzeitig konnte in dieser Weise die Oberfl��chendefektdichte und-verteilung und die Volumenaufl��sungsrate von a-ZPT und b-ZPT bestimmt werden. Auf einem zweiten Weg wurde eine innovative Strategie zur Herstellung von basischen Zinkphosphatpigmenten erster und zweiter Generation (d.h. NaZnPO4 ��� 1H2O und Na2ZnPO4(OH) ��� 2H2O) mit dem Einsatz von einerseits oberfl��chenmodifizierten Polystyrolatices (z.B. produziert durch ein Miniemulsionspolymerisationsverfahren) und anderseits von Dendrimeren auf der Basis von Polyamidoamid (PAMAM) beschritten. Die erhaltene Zeolithstruktur (ZPO) hat in Abh��ngigkeit von steigendem Natrium und Wassergehalt unterschiedliche kontrollierte Morphologie: hexagonal, w��rfelf��rmig, herzf��rmig, sechsarmige Sterne, lanzettenf��rmige Dendrite, usw. Zur quantitativen Evaluierung des Polymereinbaus in der Kristallstruktur wurden carboxylierte fluoreszenzmarkierte Latices eingesetzt. Es zeigt sich, da�� Polymeradditive nicht nur das Wachstum bis zu 8 ��m.min-1 reduzierten. Trotzdem scheint es auch als starker Nukleationsbeschleuniger zu wirken. Dank der Koordinationschemie (d.h. Bildung eines sechszentrigen Komplexes L-COO-������������Zn-PO4*H2O mit Ligandenaustausch) konnten zwei einfache Mechanismen zur Wirkung von Latexpartikeln bei der ZPO Kristallisation aufgezeigt werden: (i) ein Intrakorona- und (ii) ein Extrakorona-Keimbildungsmechanismus. Weiterhin wurde die Effizienz eines Kurzzeit- und Langzeitkorrosionschutzes durch ma��geschneiderte ZPO/ZPT Pigmente und kontrollierte Freisetzung von Phosphationen in zwei N��herungen des Ausl��sungsgleichgewichts abgesch��tzt: (i) durch eine Auswaschungs-methode (thermodynamischer Prozess) und (ii) durch eine pH-Impulsmethode (kinetischer Prozess. Besonders deutlich wird der Ausfl��sungs-F��llungsmechanismus (d.h. der Metamorphismus). Die wesentliche Rolle den Natriumionen bei der Korrosionshemmung wird durch ein passendes zusammensetzungsabh��ngiges Aufl��sungsmodell (ZAAM) beschrieben, das mit dem Befund des Salzspr��hteste und der Feuchtigkeitskammertests konsistent ist. Schlie��lich zeigt diese Arbeit das herausragende Potential funktionalisierter Latices (Polymer) bei der kontrollierten Mineralisation zur Herstellung ma��geschneiderter Zinkphosphat Materialien. Solche Hybridmaterialien werden dringend in der Entwicklung umweltfreundlicher Korrosionsschutzpigmente sowie in der Dentalmedizin ben��tigt.

N-Heterocyclic carbene complexes of silver, rhodium and iron: structures, dynamics and catalysis

The research performed in the framework of this Master Thesis has been directly inspired by the recent work of an organometallic research group led by Professor Maria Cristina Cassani on a topic related to the structures, dynamics and catalytic activity of N-heterocyclic carbene-amide rhodium(I) complexes1. A series of [BocNHCH2CH2ImR]X (R = Me, X = I, 1a���; R = Bz, X = Br, 1b���; R = trityl, X = Cl, 1c���) amide-functionalized imidazolium salts bearing increasingly bulky N-alkyl substituents were synthetized and characterized. Subsequently, these organic precursors were employed in the synthesis of silver(I) complexes as intermediate compounds on a way to rhodium(I) complexes [Rh(NBD)X(NHC)] (NHC = 1-(2-NHBoc-ethyl)-3-R-imidazolin-2-ylidene; X = Cl, R = Me (3a���), R = Bz (3b���), R = trityl (3c���); X = I, R = Me (4a���)). VT NMR studies of these complexes revealed a restricted rotation barriers about the metal-carbene bond. However, while the rotation barriers calculated for the complexes in which R = Me, Bz (3a���,b��� and 4a) matched the experimental values, this was not true in the trityl case 3c���, where the experimental value was very similar to that obtained for compound 3b��� and much smaller with respect to the calculated one. In addition, the energy barrier derived for 3c��� from line shape simulation showed a strong dependence on the temperature, while the barriers measured for 3a���,b��� did not show this effect. In view of these results and in order to establish the reasons for the previously found inconsistency between calculated and experimental thermodynamic data, the first objective of this master thesis was the preparation of a series of rhodium(I) complexes [Rh(NBD)X(NHC)] (NHC = 1-benzyl-3-R-imidazolin-2-ylidene; X = Cl, R = Me, Bz, trityl, tBu), containing the benzyl substituent as a chiral probe, followed by full characterization. The second objective of this work was to investigate the catalytic activity of the new rhodium compounds in the hydrosilylation of terminal alkynes for comparison purposes with the reported complexes. Another purpose of this work was to employ the prepared N-heterocyclic ligands in the synthesis of iron(II)-NHC complexes.

Diffusivity and enzymatic activity control the exchange of carbonyl sulfide (COS) between soils and the atmosphere

Carbonylsulfid (COS) ist eines der stabilsten reduzierten schwefelhaltigen Spurengase in der Atmosph��re. In der gut durchmischten Troposph��re bewegt sich seine Konzentration um 500 ppt. COS spielt eine wichtige Rolle in der Produktion von stratosph��rischem Aerosol und im Ozon Zyklus. Dieses Spurengas hat eine Vielfalt an nat��rlichen und anthropogenen Quellen, denen gleichstarke Senken, darunter die dominanten wie Vegetation und Boden, gegen��ber stehen. Die St��rke der Senken ist trotz langj��hriger Forschungen immer noch Gegenstand der Diskussionen. Daher ist es wichtig die kontrollierenden Parameter zu charakterisieren. Alle Austauschmessungen vor 1990 vermuteten B��den als Quelle von COS, was aber durch Castro and Galloway (1991) klar widerlegt wurde. Heute werden B��den in Erg��nzung zur Vegetation grunds��tzlich als Senke betrachtet. Vor diesem Hintergrund wurden Bodenproben auf den Austausch von Carbonylsulfid mit der Atmosph��re unter verschiedenen Umgebungsbedingungen untersucht. Drei Ackerb��den aus Deutschland, China und Finnland und zwei Waldb��den aus Sibirien und Surinam konnten parametrisiert werden in Relation zur atmosph��rischen Umgebungskonzentration, Temperatur und Bodenfeuchte (WC). Neben Umgebungskonzentration und Bodenfeuchte, scheinen Bodenstruktur und enzymatische Aktivit��t die Richtung und Gr����e des Austauschflusses zu kontrollieren. Die ��bereinstimmenden Optima f��r boreale B��den in Relation zum wassergef��llten Porenvolumen des Bodens (WFPS) und die Linearit��t zwischen Depositionsgeschwindigkeit (Vd) und Bulk density lassen auf eine Dominanz der Abh��ngigkeit der COS-Aufnahme von der durch WFPS bestimmten Diffusionsf��higkeit schlie��en. WFPS ist abh��ngig von WC, Bodenstruktur und Bodenporosit��t. In Erg��nzung zu diesen eher physikalischen Parametern konnte die Carboanhydrase (CA) als kontrollierendes Enzym in B��den identifiziert werden. Erste Versuche zur direkten Bestimmung der CA in den untersuchten B��den erlaubten eine erste, aber noch sehr ungenaue Absch��tzung der Enzymaktivit��t.

N-Heterocyclic carbene complexes of rhodium: structures, dynamics and catalysis

A series of imidazolium salts of the type [BocNHCH2CH2ImR]X (Boc = t-Bu carbamates; Im = imidazole) (R = Me, X = I, 1a; R = Bn, X = Br, 1b; R = Trityl, X = Cl, 1c) and [BnImR���]X (R��� = Me, X = Br, 1d; R��� = Bn, X = Br, 1e; R��� = Trityl, X = Cl, 1g; R��� = tBu, X = Br, 1h) bearing increasingly bulky substituents were synthetized and characterized. Subsequently, these precursors were employed in the synthesis of silver(I)-N-heterocyclic (NHC) complexes as transmetallating reagents for the preparation of rhodium(I) complexes [RhX(NBD)(NHC)] (NHC = 1-(2-NHBoc-ethyl)-3-R-imidazolin-2-ylidene; X = Cl; R = Me, 4a; R = Bn, 4b; R = Trityl, 4c; X = I, R = Me, 5a; NHC = 1-Bn-3-R���-imidazolin-2-ylidene; X = Cl; R��� = Me, 4d, R��� = Bn, 4e, R��� = Trityl, 4g; R��� = tBu, 4h). VT NMR studies of these complexes revealed a restricted rotation barriers about the metal-carbene bond. While the rotation barriers calculated for the complexes in which R = Me, Bn (4a,b,d,e and 5a) matched the experimental values, this was not true for the complexes 4c,g, bearing a trityl group for which the values are much smaller than the calculated ones. Energy barriers for 4c,g, derived from a line shape simulation, showed a strong dependence on the temperature while for 4h the rotational energy barrier is stopped at room temperature. The catalytic activity of the new rhodium compounds was investigated in the hydrosilylation of terminal alkynes and in the addition of phenylboronic acid to benzaldehyde. The imidazolium salts 1d,e were also employed in the synthesis of new iron(II)-NHC complexes. Finally, during a six-months stay at the University of York a new ligand derived from Norharman was prepared and employed in palladium-mediated cross-coupling.

Hyperverzweigte Lacton-Copolymere: enzymatische Synthese, Charakterisierung und Darstellung strukturierter Polymernetzwerke = (Hyperbranched lactone copolymers by enzyme catalysis: synthesis, characterization and preparation of structured polymer networks)

Hyperverzweigte Polymere erfuhren in den letzten Jahren immer mehr Beachtung, da sie im Vergleich zu ihren linearen Analoga besondere Eigenschaften besitzen. Im Jahre 2002 wurde die erste enzymkatalysierte Darstellung hyperverzweigter Poly(epsilon-caprolacton)e (hb-PCL) beschrieben. Hier erm��glichte das Konzept der konkurrierenden ring��ffnenden Polymerisation und Polykondensation die Kontrolle der Eigenschaften des dargestellten Polymers. Detaillierte Untersuchungen in Hinblick auf Grenzen und M��glichkeiten, aber auch die Synthese im Technikumsma��stab sind wesentliche Aspekte dieser Arbeit. Au��erdem wird ein neues Konzept eingef��hrt, das Reknitting genannt wurde. Ziel desselben ist das Recycling kommerziellen, linearen PCLs mittels Umesterung zu hb-PCL durch Enzymkatalyse. Diese hb-PCLs zeigen vergleichbare Eigenschaften zu den aus den Comonomeren dargestellten. Ausgehend von hb-PCL sollte eine geeignete Route zu methacrylierten Vernetzerverbindungen entwickelt werden. Aus Mischungen derselben mit 2-Hydroxyethylmethacrylat wurden komplexe Netzwerkarchitekturen durch Copolymerisation erhalten. Diese Netzwerke wurden in Hinblick auf ihre mechanisch physikalischen Eigenschaften untersucht. Zuletzt wurden Screeningexperimente an anderen zyklischen Estern durchgef��hrt, da ein Transfer des oben vorgestellten Konzepts angestrebt wurde. Zwei neue hyperverzweigte Polymerklassen, hb-Poly(delta-valerolacton) und hb-Polytrimethylencarbonat wurden detaillierter untersucht und in Ihren Eigenschaften mit hb-PCL verglichen.

Biochemical analysis of the phosphatase domain of the human soluble epoxide hydrolase (sEH)

Die l��sliche Epoxidhydrolase (sEH) geh��rt zur Familie der Epoxidhydrolase-Enzyme. Die Rolle der sEH besteht klassischerweise in der Detoxifikation, durch Umwandlung potenziell sch��dlicher Epoxide in deren unsch��dliche Diol-Form. Haupts��chlich setzt die sEH endogene, der Arachidons��ure verwandte Signalmolek��le, wie beispielsweise die Epoxyeicosatrienoic acid, zu den entsprechenden Diolen um. Daher k��nnte die sEH als ein Zielenzym in der Therapie von Bluthochdruck und Entz��ndungen sowie diverser anderer Erkrankungen eingesetzt werden. rnDie sEH ist ein Homodimer, in dem jede Untereinheit aus zwei Dom��nen aufgebaut ist. Das katalytische Zentrum der Epoxidhydrolaseaktivit��t befindet sich in der 35 kD gro��en C-terminalen Dom��ne. Dieser Bereich der sEH s wurde bereits im Detail untersucht und nahezu alle katalytischen Eigenschaften des Enzyms sowie deren dazugeh��rige Funktionen sind in Zusammenhang mit dieser Dom��ne bekannt. Im Gegensatz dazu ist ��ber die 25 kD gro��e N-terminale Dom��ne wenig bekannt. Die N-terminale Dom��ne der sEH wird zur Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie von Hydrolasen gez��hlt, jedoch war die Funktion dieses N-terminal Dom��ne lange ungekl��rt. Wir haben in unserer Arbeitsgruppe zum ersten Mal zeigen k��nnen, dass die sEH in S��ugern ein bifunktionelles Enzym ist, welches zus��tzlich zur allgemein bekannten Enzymaktivit��t im C-terminalen Bereich eine weitere enzymatische Funktion mit Mg2+-abh��ngiger Phosphataseaktivit��t in der N-terminalen Dom��ne aufweist. Aufgrund der Homologie der N-terminalen Dom��ne mit anderen Enzymen der HAD Familie wird f��r die Aus��bung der Phosphatasefunktion (Dephosphorylierung) eine Reaktion in zwei Schritten angenommen.rnUm den katalytischen Mechanismus der Dephosphorylierung weiter aufzukl��ren, wurden biochemische Analysen der humanen sEH Phosphatase durch Generierung von Mutationen im aktiven Zentrum mittels ortsspezifischer Mutagenese durchgef��hrt. Hiermit sollten die an der katalytischen Aktivit��t beteiligten Aminos��urereste im aktiven Zentrum identifiziert und deren Rolle bei der Dephosphorylierung spezifiziert werden. rnrnAuf Basis der strukturellen und m��glichen funktionellen ��hnlichkeiten der sEH und anderen Mitgliedern der HAD Superfamilie wurden Aminos��uren (konservierte und teilweise konservierte Aminos��uren) im aktiven Zentrum der sEH Phosphatase-Dom��ne als Kandidaten ausgew��hlt.rnVon den Phosphatase-Dom��ne bildenden Aminos��uren wurden acht ausgew��hlt (Asp9 (D9), Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124), Lys160 (K160), Asp184 (D184), Asp185 (D185), Asn189 (N189)), die mittels ortsspezifischer Mutagenese durch nicht funktionelle Aminos��uren ausgetauscht werden sollten. Dazu wurde jede der ausgew��hlten Aminos��uren durch mindestens zwei alternative Aminos��uren ersetzt: entweder durch Alanin oder durch eine Aminos��ure ��hnlich der im Wildtyp-Enzym. Insgesamt wurden 18 verschiedene rekombinante Klone generiert, die f��r eine mutante sEH Phosphatase Dom��ne kodieren, in dem lediglich eine Aminos��ure gegen��ber dem Wildtyp-Enzym ersetzt wurde. Die 18 Mutanten sowie das Wildtyp (Sequenz der N-terminalen Dom��ne ohne Mutation) wurden in einem Expressionsvektor in E.coli kloniert und die Nukleotidsequenz durch Restriktionsverdau sowie Sequenzierung best��tigt. Die so generierte N-terminale Dom��ne der sEH (25kD Untereinheit) wurde dann mittels Metallaffinit��tschromatographie erfolgreich aufgereinigt und auf Phosphataseaktivit��t gegen��ber des allgemeinen Substrats 4-Nitophenylphosphat getestet. Diejenigen Mutanten, die Phosphataseaktivit��t zeigten, wurden anschlie��end kinetischen Tests unterzogen. Basiered auf den Ergebnissen dieser Untersuchungen wurden kinetische Parameter mittels vier gut etablierter Methoden berechnet und die Ergebnisse mit der ���direct linear blot��� Methode interpretiert. rnDie Ergebnisse zeigten, dass die meisten der 18 generierten Mutanten inaktiv waren oder einen Gro��teil der Enzymaktivit��t (Vmax) gegen��ber dem Wildtyp verloren (WT: Vmax=77.34 nmol-1 mg-1 min). Dieser Verlust an Enzymaktivit��t lie�� sich nicht durch einen Verlust an struktureller Integrit��t erkl��ren, da der Wildtyp und die mutanten Proteine in der Chromatographie das gleiche Verhalten zeigten. Alle Aminos��ureaustausche Asp9 (D9), Lys160 (K160), Asp184 (D184) und Asn189 (N189) f��hrten zum kompletten Verlust der Phosphataseaktivit��t, was auf deren katalytische Funktion im N-terminalen Bereich der sEH hindeutet. Bei einem Teil der Aminos��ureaustausche die f��r Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124) und Asn185 (D185) durchgef��hrt wurden, kam es, verglichen mit dem Wildtyp, zu einer starken Reduktion der Phosphataseaktivit��t, die aber dennoch f��r die einzelnen Proteinmutanten in unterschiedlichem Ausma�� zu messen war (2 -10% and 40% of the WT enzyme activity). Zudem zeigten die Mutanten dieser Gruppe ver��nderte kinetische Eigenschaften (Vmax allein oder Vmax und Km). Dabei war die kinetische Analyse des Mutanten Asp11 ��� Asn aufgrund der nur bei dieser Mutanten detektierbaren starken Vmax Reduktion (8.1 nmol-1 mg-1 min) und einer signifikanten Reduktion der Km (Asp11: Km=0.54 mM, WT: Km=1.3 mM), von besonderem Interesse und impliziert eine Rolle von Asp11 (D11) im zweiten Schritt der Hydrolyse des katalytischen Zyklus.rnZusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass alle in dieser Arbeit untersuchten Aminos��uren f��r die Phosphataseaktivit��t der sEH n��tig sind und das aktive Zentrum der sEH Phosphatase im N-terminalen Bereich des Enzyms bilden. Weiterhin tragen diese Ergebnisse zur Aufkl��rung der potenziellen Rolle der untersuchten Aminos��uren bei und unterst��tzen die Hypothese, dass die Dephosphorylierungsreaktion in zwei Schritten abl��uft. Somit ist ein kombinierter Reaktionsmechanismus, ��hnlich denen anderer Enzyme der HAD Familie, f��r die Aus��bung der Dephosphorylierungsfunktion denkbar. Diese Annahme wird gest��tzt durch die 3D-Struktur der N-terminalen Dom��ne, den Ergebnissen dieser Arbeit sowie Resultaten weiterer biochemischer Analysen. Der zweistufige Mechanismus der Dephosphorylierung beinhaltet einen nukleophilen Angriff des Substratphosphors durch das Nukleophil Asp9 (D9) des aktiven Zentrums unter Bildung eines Acylphosphat-Enzym-Zwischenprodukts, gefolgt von der anschlie��enden Freisetzung des dephosphorylierten Substrats. Im zweiten Schritt erfolgt die Hydrolyse des Enzym-Phosphat-Zwischenprodukts unterst��tzt durch Asp11 (D11), und die Freisetzung der Phosphatgruppe findet statt. Die anderen untersuchten Aminos��uren sind an der Bindung von Mg 2+ und/oder Substrat beteiligt. rnMit Hilfe dieser Arbeit konnte der katalytischen Mechanismus der sEH Phosphatase weiter aufgekl��rt werden und wichtige noch zu untersuchende Fragestellungen, wie die physiologische Rolle der sEH Phosphatase, deren endogene physiologische Substrate und der genaue Funktionsmechanismus als bifunktionelles Enzym (die Kommunikation der zwei katalytischen Einheiten des Enzyms) wurden aufgezeigt und diskutiert.rn

Specific enzymatic cleavage and payload release from peptide-based hybrid nanocapsules

Within this thesis, new approaches for the concepts of peptide-polymer conjugates and peptide-based hybrid nanomaterials are investigated. In the first part, the synthesis of a triblock polymer-peptide-polymer is carried out following a typical peptide coupling reaction, both in solution and on solid-phase. The peptide sequence is chosen, so that it is cleaved by an enzyme preparation of trypsin. End-functionalized polystyrene is used as a model hydrophobic polymer and coupled to the peptide sequence. The results show successful coupling reactions in both methods, while the solid phase method produced a more defined product. Suspensions, consisting of peptide-polymer conjugates particles, are prepared in water by ultrasonication. In contact with the enzyme, the peptide constituting the conjugated particles is cleaved. This demonstrates the enzymatic cleavage in heterophase of enzymatic sequence bond to hydrophobic polymers, and is of great interest for the encapsulation and delivery of hydrophobic molecules.rnA second approach is the preparation of peptide-based hybrid nanocapsules. This is achieved by interfacial polyaddition in inverse miniemulsion with the peptide sequence functionalized with additional amino acids. A method suitable to the use of a peptide sequence for interfacial polyaddition was developed. It is shown that, the polarity of the dispersed phase influences the structures prepared, from particle-like to polymeric shell with a liquid core.rnThe peptide sequence is equipped with a FRET pair (more exactly, an internally-quenched fluorescent system) which allows the real-time monitoring of the enzymatic cleavage of the recognition site. This system shows the successful cleavage of the peptide-based nanocapsules when trypsin preparation is added to the suspensions. A water-soluble fluorescent polymer is efficiently entrapped and its possible use as marker for the capsules is highlighted. Furthermore, a small water-soluble fluorescent dye (SR-101) is successfully encapsulated and the encapsulation efficiency as a function of the functionality of the peptide and the amount of comonomer equivalent (toluene diisocyanate) is studied. The dye is encapsulated at such a high concentration, that self-quenching occurs. Thus, the release of the encapsulated dye triggered by the enzymatic cleavage of the peptide results in a fluorescence recovery of the dye. The fluorescence recovery of the FRET pair in the peptide and of the encapsulated dye correlate well.rnFinally, nanocapsules based on a hepsin-cleavable peptide sequence are prepared. Hepsin is an enzyme, which is highly upregulated in prostate cancer cells. The cleavage of the nanocapsules is investigated with healthy and ���cancerous��� (hepsin-expressing) cell cultures. The degradation, followed via fluorescence recovery of the FRET system, is faster for the suspensions introduced in the hepsin expressing cell cultures.rnIn summary, this work tackles the domain of responsive nanomaterials for drug delivery from a new perspective. It presents the adaptation of the miniemulsion process for hybrid peptide-based materials, and their successful use in preparing specific enzyme-responsive nanoparticles, with hydrophilic payload release properties.rn

Organic/inorganic polyoxometalate-based hybrids for oxidation catalysis and energy conversion

This thesis work has been carried out during the Erasmus exchange period at the ���Universit�� Paris 6 ��� Pierre et Marie Curie���, in the ���Edifices PolyM��talliques ��� EPOM��� team, leaded by Prof. Anna Proust, belonging to the ���Institut Parisien de Chimie Mol��culaire���, under the supervision of Dr. Guillaume Izzet and Dr. Geoffroy Guillemot. The redox properties of functionalized Keggin and Dawson POMs have been exploited in photochemical, catalytic and reactivity tests. For the photochemical purposes, the selected POMs have been functionalized with different photoactive FGs, and the resulting products have been characterized by CV analyses, luminescence tests and UV-Vis analyses. In future, these materials will be tested for hydrogen photoproduction and polymerization of photoactive films. For the catalytic purposes, POMs have been firstly functionalized with silanol moieties, to obtain original coordination sites, and then post-functionalized with TMs such as V, Ti and Zr in their highest oxidation states. In this way, the catalytic properties of TMs were coupled to the redox properties of POM frameworks. The redox behavior of some of these hybrids has been studied by spectro-electrochemical and EPR methods. Catalytic epoxidation tests have been carried out on allylic alcohols and n-olefins, employing different catalysts and variable amounts of them. The performances of POM-V hybrids have been compared to those of VO(iPrO)3. Finally, reactivity of POM-VIII hybrids has been studied, using styrene oxide and ethyl-2-diazoacetate as substrates. All the obtained products have been analyzed via NMR techniques. Cyclovoltammetric analyses have been carried out in order to determine the redox behavior of selected hybrids.