Detecção e genotipagem de astrovírus em amostras fecais de aves de produção procedentes de diferentes criações comerciais brasileiras

Os astrovírus são agentes virais associados com enteropatias e infecções extra-intestinais em aves, ocasionando prejuízos no desenvolvimento produtivo e saúde animal. Porém, são escassos os estudos no Brasil que visem a detecção e caracterização deste vírus com maior amplitude. Nesse contexto, detectaram-se e caracterizaram-se cepas de astrovírus a partir de 60 amostras fecais de aves procedentes de diferentes criações comerciais brasileiras (postura, corte e matrizes), mediante o emprego de uma reação PanAstrovírus como triagem inicial, que consistiu numa reação de RT-hemi-nested-PCR, visando a amplificação e posterior sequenciamento de um segmento parcial do gene RdRp (RNA polimerase dependente de RNA) do gene ORF1b, uma região gênica conservada entre todos os astrovírus. Subsequentemente, nas amostras positivas na triagem, realizou-se a amplificação, clonagem e sequenciamento do gene ORF2 codificante do capsídeo viral, analisado mediante análise filogenética. Os dados obtidos demonstraram uma frequência de infecção por astrovírus em 48,3% (29/60) das amostras analisadas. As espécies virais detectadas foram as seguintes: Avastrovírus 2 (Avian Nephritis Virus, ANV) em 72,4% (21/29), Chicken Astrovírus (CAstV) em 6,8% (2/29) e Avastrovírus 1 (Turkey Astrovírus tipo 1, TAstV-1) em 20,8% (6/29) das amostras positivas. O sequenciamento total do gene ORF2 foi possível em oito amostras (8/21) positivas a ANV, em uma amostra (1/6) positiva a TAstV-1 e uma amostra (1/2) positiva para CAstV. A análise deste gene revelou, nas sequências ANV, a presença de três genótipos bem diferenciados, segundo critérios do Astroviridae Study Group, sendo que um deles, agrupou-se dentro do genótipo 5. Além disso, quando analisado com sequências procedentes de outras regiões, as sequências deste estudo formaram seis clusters, dois deles, relacionados com sequências procedentes de Austrália e Reino Unido. O análise do ORF2 em CAstV, revelou também um agrupamento com cepas procedentes do Reino Unido. Já o análise da ORF2 de TAstV-1, revelou divergência genética com cepas isoladas em Estados Unidos, que foram as únicas sequências disponíveis no GenBank. O presente estudo traz a luz vários dados epidemiológicos concernentes aos astrovírus aviário de origem brasileira o que permitirá a realização de outros estudos relacionados a epidemiologia deste vírus, seus possíveis riscos potenciais em saúde pública e a adoção de medidas de controle direcionadas a este agente

Avaliação de fatores virológicos associados ao desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (CHC) em pacientes com hepatite B crônica

O objetivo principal deste estudo foi avaliar fatores virais associados com a evolução para o carcinoma hepatocelular (CHC) em pacientes com hepatite B crônica. Para tanto caracterizamos os subgenótipos do HBV, investigamos a ocorrência de mutações nos genes pré-core/core do HBV associadas à presença de CHC avaliamos por análise filogenética a associação de linhagens virais com a ocorrência de CHC e por fim a associação de outros fatores de risco com o desenvolvimento de CHC. Foram incluídos 119 amostras de soro de pacientes com infecção crônica pelo HBV, destas amostras 60 pertencem ao grupo 1 (CHC), que são pacientes com diagnóstico confirmado de carcinoma hepatocelular e 59 amostras pertencem ao grupo 2 (sem CHC) que são pacientes com hepatite crônica sem detecção prévia de nódulos hepáticos. Foram obtidas informações acerca da idade, sexo e naturalidade. Além disso, os pacientes responderam a um questionário sobre fatores de riscos associados ao desenvolvimento de CHC. Foram realizados exames bioquímicos, sorológicos, determinação da carga viral, e amplificação por nested PCR e sequenciamento das regiões S/polimerase e pré-core/core do genoma viral para posterior caracterização dos genótipos/subgenótipos do HBV e pesquisa de mutações associadas com evolução da doença hepática. Em relação à idade e sexo não houve grande variação entre os grupos. Quanto à naturalidade a maioria era procedente da região sudeste, seguido pela região nordeste; e por fim seis pacientes eram procedentes de outros países. Com base no sobrenome dos pacientes avaliou-se também a frequência de etnia oriental na casuística estudada, que foi similar nos 2 grupos. O perfil sorológico HBeAg negativo foi o mais frequente nos dois grupos de pacientes, assim como níveis de carga viral abaixo de 2.000 UI/mL. Em relação aos exames bioquímicos foram observadas diferenças estatisticamente significantes nos níveis séricos de AFP (p= 0,0013), FA (p= 0,0003) e GGT (p= 0,005). Dentre os fatores de risco analisados neste estudo, o consumo de amendoim foi o único que apresentou significância estatística (p= 0,003). A região S/pol foi amplificada e sequenciada com sucesso em 58 amostras (28 do grupo 1 e 30 do grupo 2). Entre as 58 amostras analisadas 4 genótipos e 8 subgenótipos do HBV foram identificados, sendo o subgenótipo A1 o mais frequente nos dois grupos. Não se observou diferença estatisticamente significante na distribuição dos subgenótipos entre os dois grupos de pacientes. Na topologia da árvore filogenética construída com sequências do HBV isoladas dos pacientes incluídos neste estudo e sequências disponíveis no GenBank não se observou padrões de agrupamento associados com o perfil clinico do paciente (com e sem CHC). Foram obtidas sequências de boa qualidade da região précore/ core em 44 amostras, sendo 20 amostras do grupo 1 e 24 do grupo 2. Diversas das mutações investigadas foram identificadas na região précore/ core, as quais foram avaliadas estatisticamente para verificar a existência de diferença na frequência das mesmas entre os grupos de pacientes estudados. Entre as mutações identificadas se destacaram com significância estatística as seguintes mutações: T1768A (p= 0,006), a combinação das mutações C1766T + T1768A (p= 0,043) e G1888H (p= 0,05). Na análise de regressão logística simples foi possível identificar que a chance de um paciente do grupo 2 desenvolver CHC aumenta 14,7 vezes na presença de infecção por cepas do HBV com a mutação T1768A, enquanto que a infecção com cepas do HBV que albergam a mutação G1888H reduz tal chance 2,5 vezes

Detecção dos herpesvirus humanos na mucosa oral de pacientes irradiados para tratamento de carcinoma epidermoide em região de cabeça e pescoço

A radioterapia para tratamento das neoplasias malignas em região de cabeça e pescoço é acompanhada de diversas complicações, decorrentes do comprometimento dos tecidos radiossensíveis localizados próximos ao tumor. Entre essas complicações a mucosite é a que merece maior destaque. A mucosite é uma reação tóxica inflamatória da mucosa oral causada pelo tratamento citorredutivo induzido pela radioterapia (RT) ou pela quimioterapia (QT). Ela manifesta-se com sinais de edema, eritema, úlcera e formação pseudomembrana, resultando em sintomas de ardência, que pode progredir para dor intensa e consequente prejuízo na alimentação e comunicação verbal. Infecções bacterianas, fúngicas ou virais podem acometer a mucosa bucal irradiada e exacerbar a manifestação da mucosite oral por meio da ativação de fatores de transcrição da resposta inflamatória. Existem poucos dados na literatura sobre a participação dos herpesvirus humanos na mucosite oral induzida pela radioterapia. A proposta desse trabalho foi avaliar a excreção oral dos herpesvirus humanos (HSV-1, HSV-2, EBV, CMV, VZV, HHV6, HHV7 e HHV8) e sua possível associação com o desenvolvimento e agravamento da mucosite oral, em pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide (CEC) de boca e orofaringe, submetidos à radioterapia associado à quimioterapia. Nesse estudo foram analisadas 158 amostras de lavado bucal, de 20 pacientes, submetidos à radioterapia para CEC em região de cabeça e pescoço, coletadas semanalmente, durante todo o tratamento. Foi realizada a extração do DNA dessas amostras e em seguida sua amplificação através da PCR utilizando dois conjuntos de primers: HSVP1/P2 para os subtipos HSV-1, HSV-2, EBV, CMV e HHV-8 e o VZVP1/P2 para os subtipos VZV, HHV-6 e HHV-7. As amostras positivas foram submetidas à digestão enzimática com enzimas de restrição BamHI e BstUI para determinação específica de cada um dos oito herpesvirus. Foi também avaliada clinicamente, a mucosite oral, em cada uma das coletas, seguindo os critérios da OMS e NCIC. As análises da amostra mostraram a excreção do EBV, HHV-6 e HHV-7, em todas as semanas de tratamento radioterápico, enquanto que a excreção do HSV1 não pode ser observada no momento da triagem. Considerando-se todos os períodos em conjunto (Triagem, semanas de radioterapia e Controle), a maior frequência foi de pacientes que excretaram EBV (55,0%), seguida daqueles que excretaram HHV-7 (20,5%). A frequência de excreção de EBV foi significativamente maior do que a dos demais vírus (Teste ?2, p<0.001 para todos os cruzamentos). A frequência de excreção de HHV-7 foi significativamente maior do que a de HSV-1 (5,9%) e HHV-6 (5,5%) (Teste ?2, p=0.001 para ambos os cruzamentos). Não houve diferenças estatísticas significantes entre as frequências de HSV-1 e HHV-6. Como conclusão, verificou-se uma correlação positiva entre a excreção oral do EBV e a presença de mucosite induzida pela associação de radioterapia e quimioterapia com graus >=2, sobretudo se considerarmos as três últimas semanas de radioterapia, período este em que a severidade da mucosite foi estatisticamente maior. Esses achados nos possibilitam inferir que o ambiente inflamatório local de mucosites com grau >=2 seja mais favorável para excreção oral do EBV.

Análise multigênica de rotavírus do grupo A em suínos

Os rotavírus do grupo A (RVA) são importantes causadores de diarreias virais em crianças e animais jovens de diferentes espécies, com impactos na saúde pública e animal. Visando contribuir para o entendimento e prevenção das rotaviroses assim como suas possíveis relações zoonóticas, caracterizou-se os 11 segmentos de dsRNA de rotavírus codificadores das proteínas estruturais e não estruturais presentes em amostras fecais positivas de suínos coletadas nos anos de 2012-2013, em 2 estados brasileiros. Mediante o emprego de RT-PCR, sequenciamento nucleotídico e análises filogenéticas, todos os segmentos genéticos oriundos de 12 amostras de RVA detectados em suínos foram analisados e comparados com os de outras amostras descritas previamente. As sequências obtidas para os genes codificadores das proteínas NSP2, NSP3 e VP6 contemplaram a open reading frame (ORF) completa do gene, enquanto que a ORF parcial foi determinada para os genes codificadores das proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, VP7, NSP1, NSP4, NSP5 e NSP6. Os genotipos de rotavírus suíno provenientes das regiões amostradas concordam com os mais frequentemente descritos nesta espécie animal, apresentando, assim, uma matriz genética suína com a maioria dos segmentos pertencentes à constelação genotípica 1, com exceção dos genes codificadores das proteínas VP6 e NSP1, os quais foram os genotipos I5 e A8, respectivamente. Apesar de predominar o genotipo 1 (Wa-like) nas sequências deste estudo, a análise genômica sugere a existência de uma variação intragenotípica no genoma do rotavírus do grupo A atualmente circulante nas populações suína amostradas dos estados de São Paulo e Mato Grosso. Adicionalmente, buscou-se identificar os aminoácidos relacionados com a adaptação dos rotavírus no hospedeiro e assinaturas genéticas que distinguissem RVA suíno e humano. Para isso, as sequências obtidas neste estudo foram comparadas com outras cepas de RVA detectadas nestas duas espécies e pertencentes ao genotipo 1 (Wa-like) disponíveis no Genbank. Como resultados foram encontrados mais de 75 sítios de mudanças deaminoácidos que diferenciam RVA suíno e humano além de sítios de substituiçãopresentes em algumas proteínas virais que frequentemente covariaram entre elas. Estes resultados proporcionam um maior entendimento da diversidade viral circulante em unidades de produção suína e uma melhor compreensão dos animaiscomo reservatórios genéticos de cepas de rotavírus emergentes em humanos.

Caracterização de nanopartículas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipossoma e avaliação da eficiência de entrega gênica a células de mamífero.

Em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA, a eficiência e a segurança dos vetores que transportam o material genético terapêutico possuem papel fundamental. Vetores não virais são considerados mais seguros, mas menos eficientes em relação aos vetores virais. Em parte, isso se deve à falta de estudos sistemáticos e comparativos no que diz respeito às características físico-químicas desses vetores quando em soluções biológicas e o efeito delas sobre a eficiência de entrega gênica. O objetivo deste trabalho é avaliar o efeito do pH, da força iônica e do tipo tampão de complexação sobre as características físico-químicas de nanopartículas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipofectamina, visando à entrega gênica para diferentes linhagens celulares. Para isso, nanopartículas formadas em diferentes condições foram caracterizadas através de ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta. Os estudos indicaram que o pH, a força iônica, o tipo de tampão e a presença de meio de cultura e soro no ambiente de complexação alteram significativamente o tamanho, a polidispersidade e o potencial zeta das partículas formadas. Finalmente, buscou-se avaliar o efeito dessas características sobre a eficiência de transfecção in vitro de células de macrófagos IC21 e células HeLa. Os estudos de transfecção em células Hela indicam que tanto a composição como as condições de formação das partículas influenciam significativamente a eficiência de transfecção.

Análise de ligação do gene de resistência Zym-2 com marcadores microssatélites e reação de acessos de meloeiro ao Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)

As viroses causam perdas significativas na cultura do melão. Dentre essas, o vírus do mosaico amarelo da abobrinha-de-moita (Zucchini yellow mosaic virus- ZYMV) possui grande importância para a cultura e é encontrado em todos os locais de plantio de cucurbitáceas. O controle desse vírus através da resistência genética é a forma mais eficiente de manejo. O acesso PI414723 é a única fonte de resistência de meloeiro ao ZYMV. Essa resistência é oligogênica e supostamente condicionada por três genes dominantes: Zym-1, Zym-2 e Zym-3. A localização cromossômica do gene Zym-1 já foi confirmada no grupo de ligação 2, próximo ao marcador CMAG36. Entretanto, a localização de Zym-2 ainda carece de confirmação experimental, muito embora existam evidências de sua localização no grupo de ligação 10 (LGX). Sendo assim, um dos objetivos do presente trabalho foi confirmar a localização do gene Zym-2 através de análises de ligação com marcadores microssatélites (SSRs). Para tanto, foi utilizada uma população F2 derivada do cruzamento PI414723 x \'Védrantais\'. As plantas foram inoculadas mecanicamente com o isolado RN6-F, patótipo 0, duas vezes em um intervalo de 24 h. A confirmação da infecção e a quantificação dos títulos virais nas plantas F2 foram realizadas através do teste PTA-ELISA. O DNA genômico das plantas foi extraído da primeira folha verdadeira e utilizado nas reações de PCR com primers específicos para SSRs selecionados pertencentes ao LGX. Observou-se uma distribuição assimétrica de classes de absorbância e maior frequência de indivíduos F2 na classe com menor valor (0,1 a 0,2), sugerindo a existência de um gene de efeito maior. O teste chi-quadrado mostrou que todos os marcadores segregaram na frequência esperada (1:2:1), exceto o marcador CMCT134b. A ligação do Zym-2 aos marcadores foi confirmada por meio de regressão linear simples. Dos marcadores analisados, a regressão linear foi significativa para MU6549 e CMBR55, com p-valores de 0,011 e 0,0054, respectivamente. As análises de ligação mostraram que as ordens e as distâncias entre os marcadores condizem com os mapas presentes na literatura. Um segundo objetivo do estudo foi o de avaliar a reação ao ZYMV de 42 acessos de meloeiro oriundos da região Nordeste do Brasil, com o intuito de explorar novas fontes de resistência. Foram realizados dois experimentos utilizando a mesma metodologia citada anteriormente. O título viral médio entre os acessos variou de 0,123 a 0,621 no experimento 1 e de 0,019 a 0,368 no experimento 2. Alguns acessos apresentaram consistentemente baixos títulos virais, próximos aos do acesso resistente PI414723 e dos controles negativos (plantas não inoculadas da cultivar \'Védrantais\'). Portanto, estes acessos mostram-se como potenciais fontes de resistência ao vírus para o emprego em programas de melhoramento.

Middle East respiratory syndrome coronavirus neutralising serum antibodies in dromedary camels: a comparative serological study

A new betacoronavirus-Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV)-has been identified in patients with severe acute respiratory infection. Although related viruses infect bats, molecular clock analyses have been unable to identify direct ancestors of MERS-CoV. Anecdotal exposure histories suggest that patients had been in contact with dromedary camels or goats. We investigated possible animal reservoirs of MERS-CoV by assessing specific serum antibodies in livestock. METHODS: We took sera from animals in the Middle East (Oman) and from elsewhere (Spain, Netherlands, Chile). Cattle (n=80), sheep (n=40), goats (n=40), dromedary camels (n=155), and various other camelid species (n=34) were tested for specific serum IgG by protein microarray using the receptor-binding S1 subunits of spike proteins of MERS-CoV, severe acute respiratory syndrome coronavirus, and human coronavirus OC43. Results were confirmed by virus neutralisation tests for MERS-CoV and bovine coronavirus. FINDINGS: 50 of 50 (100%) sera from Omani camels and 15 of 105 (14%) from Spanish camels had protein-specific antibodies against MERS-CoV spike. Sera from European sheep, goats, cattle, and other camelids had no such antibodies. MERS-CoV neutralising antibody titres varied between 1/320 and 1/2560 for the Omani camel sera and between 1/20 and 1/320 for the Spanish camel sera. There was no evidence for cross-neutralisation by bovine coronavirus antibodies. INTERPRETATION: MERS-CoV or a related virus has infected camel populations. Both titres and seroprevalences in sera from different locations in Oman suggest widespread infection. FUNDING: European Union, European Centre For Disease Prevention and Control, Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Leishmaniose em Lobo Ibérico

Quando falamos de vida selvagem em Portugal, pensamos logo no Lobo Ibérico (Canis lupus signatus), que ao longo das últimas décadas tem vindo a sofrer um notório declínio populacional, apenas contrariado pelas medidas protecionistas entretanto implementadas. A diminuição do número de lobos em Portugal resulta principalmente da perseguição direta a que foram sujeitos e da destruição do seu habitat natural. Outra causa de redução/extinção de pequenas populações locais e fragmentadas de grandes carnívoros em outras partes no mundo tem sido as doenças infeciosas. Sendo monitorização da presença de patologias em animais silvestres fundamental no controle das zoonoses emergentes e na conservação das espécies. Neste contexto pretendeu-se elaborar um estudo de determinação da ocorrência de Leishmaniose, no Lobo Ibérico. Assim, recolheram-se aleatoriamente 42 amostras de sangue a lobos residentes no Parque Nacional Peneda-Gerês que, posteriormente foram testadas recorrendo-se ao método de ELISA. Através desta técnica, detetou-se que das 42 amostras testadas apenas uma amostra (2,4%) possuía anticorpos anti-leishmania. Um dos motivos para a obtenção de resultados pouco significativos poderá dever-se ao reduzido leque amostral. Concluímos, então, que são necessários estudos adicionais para avaliar a importância do Lobo Ibérico na transmissão e propagação da Leishmaniose.

Terapia génica: conceitos e aplicações na medicina dentária

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz

Veículos e vetores em terapia génica

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz

Compendium of measures to prevent disease associated with animals in public settings, 2005 /

"March 25, 2005."

Bibliography of foot-and-mouth disease in man, 1695-1965 /

Kept up to date by supplements.

Captive Primate Safety Act of 2005 : report (to accompany S. 1509).

"June 19, 2006."

Rabies, zoonosis surveillance.

Mode of access: Internet.

Co-circulação dos vírus dengue tipo 1, 2 e 4 nos Estados do Rio Grande do Norte e Paraíba, 2013

Dengue is a viral disease transmitted by female mosquitoes from genus Aedes, the principal urban vector is Aedes aegypti. Actually dengue has caused, in global scale, substantial morbidity and mortality. Four serotypes (antigenically distinct) are known: DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. The objective of this study was described the epidemiological profile dengue in the states of Rio Grande do Norte (RN) and Paraíba (PB), 2013. For that, suspected cases of dengue were studied, received for Laboratory of Molecular Biology of infectious disease and cancer (LADIC-UFRN) from different Health Units from RN and PB between January and December of 2013. The viral RNA was obtained from serum samples of patient from health units from RN and PB. It were studied 478 suspected cases of dengue , 252 (52,7%) from Rio Grande do Norte and 226 (47,3%) from Paraíba, showeds a global rate of infection global prevalence of 29,7% (142/478). The co-circulation of three serotypes was observed: DENV-1 (9,8% [14/142]), DENV-2 (3,5% [5/142]) and DENV-4 (86,7% [123/142]). People between 21-30 years old were the most affected by the disease during all the period of the study, representing 63,7% of the cases in both states. The genus most affected was female, representing 63,3% of cases in both states. Pau dos Ferros, Rio Grande do Norte, had the highest circulation of disease, with 8,2% (8/97) of cases. In Paraíba, the city most affected was João Pessoa, with (80% (36/45) of cases. The months with the biggest viral circulation in RN and PB were March and August, respectively. These results are very important to understanding the dengue viral activity in RN and PB, providing data that can guide control actions of this disease in support to local control programs