Solution Structures of the cis- and trans-Pro30 Isomers of a Novel 38-Residue Toxin from the Venom of Hadronyche Infensa sp. that Contains a Cystine-Knot Motif within Its Four Disulfide Bonds

The primary sequence and three-dimensional structure of a novel peptide toxin isolated from the Australian funnel-web spider Hadronyche infensa sp. is reported. ACTX-HI:OB4219 contains 38 amino acids, including eight-cysteine residues that form four disulfide bonds. The connectivities of these disulfide bonds were previously unknown but have been unambiguously determined in this study. Three of these disulfide bonds are arranged in an inhibitor cystine-knot (ICK) motif, which is observed in a range of other disulfide-rich peptide toxins. The motif incorporates an embedded ring in the structure formed by two of the disulfides and their connecting backbone segments penetrated by a third disulfide bond. Using NMR spectroscopy, we determined that despite the isolation of a single native homologous product by RP-HPLC, ACTX-HI:OB4219 possesses two equally populated conformers in solution. These two conformers were determined to arise from cis/trans isomerization of the bond preceding Pro30. Full assignment of the NMR spectra for both conformers allowed for the calculation of their structures, revealing, the presence of a triple-stranded antiparallel sheet consistent with the inhibitor cystine-knot (ICK) motif.

Heat-induced changes in UHT milks - Part 1

Raw milk was stored for 0, 2 and 4 days and processed in a UHT pilot plant by either direct or indirect heating. The unstored raw milk was also pasteurised. The thermally induced changes resulting from these treatments were investigated by examining a number of indices of heat damage. Lactulose, furosine, total and free hydroxymethylfurfural (HMF) and acid-soluble beta-lactoglobulin were analysed by high performance liquid chromatography (HPLC) while soluble tryptophan was examined by fluorescence spectroscopy. The directly heated UHT milk showed less heat damage than the indirectly heated milk, while the pasteurised milk displayed the least heat damage. During storage of the UHT milk for 12 weeks at similar to20degreesC, the levels of lactulose remained constant, while the furosine concentration increased. Both the total HMF and undenatured beta-lactoglobulin contents showed a general decrease during storage; however free HMF values initially rose but then decreased after four weeks' storage. As the age of the milk at the time of UHT processing increased, the levels of some of the indicators decreased. It is concluded that lactulose is the most reliable index of heat treatment, as it is virtually unaffected by refrigerated storage of the milk before or ambient storage after UHT processing. Reliance on other indicators may give misleading information on the heat load that UHT milk has received during processing.

Diagnosing the cause of proteolysis in UHT milk

Proteolysis of UHT milk during storage at room temperature is a major factor limiting its shelf-life through changes in its flavour and texture. The latter is characterised by increases in viscosity leading in some cases to gel formation. The enzymes responsible for the proteolysis are the native milk alkaline proteinase, plasmin, and heat-stable, extracellular bacterial proteinases produced by psychrotrophic bacterial contaminants in the milk prior to heat processing. These proteinases react differently with the milk proteins and produce different peptides in the UHT milk. In order to differentiate these peptide products, reversed-phase HPLC and the fluorescamine method were used to analyse the peptides soluble in 12% trichloroacetic acid (TCA) and those soluble at pH 4.6. The TCA filtrate showed substantial peptide peaks only if the milk was contaminated by bacterial proteinase, while the pH 4.6 filtrate showed peptide peaks when either or both bacterial and native milk proteinases caused the proteolysis. Results from the fluorescamine test were in accordance with the HPLC results whereby the TCA filtrate exhibited significant proteolysis values only when bacterial proteinases were present, but the pH 4.6 filtrates showed significant values when the milk contained either or both types of proteinase. A procedure based on these analyses is proposed as a diagnostic test for determining which type of proteinase-milk plasmin, bacterial proteinase, or both-is responsible for proteolysis in UHT milk. (C) 2003 Swiss Society of Food Science and Technology. Published by Elsevier Science Ltd. All rights reserved.

Production of proteinases by psychrotrophic bacteria in raw milk stored at low temperature

Raw milk samples from two different sources were stored at 2degreesC, 4degreesC and 7degreesC for 10 days and the growth of psychrotrophic bacteria, production of proteinase and proteolysis in the milks were measured during storage. Peptide analyses by the fluorescamine method and RP-HPLC were used in determination of proteolysis and proteinase activity. The average times taken for the psychrotroph counts to reach 10(7) cfu/mL at 2degreesC, 4degreesC and 7degreesC were approximately 9, 7 and 4 days, although there was considerable variation in growth rates in the different milks. There was little correlation between psychrotroph counts and either proteolysis or proteinase activity levels. At 2degreesC, no milk stored showed significant proteolysis by the fluorescamine method after 10 days' storage, but significant proteinase activity could be measured in some of these milks at 8 and 10 days. RP-HPLC analysis was a more sensitive means of detecting peptides than the fluorescamine method.

Flavonoids, phenolic acids and abscisic acid in Australian and New Zealand Leptospermum honeys

Flavonoids, phenolic acids and abscisic acid of Australian and New Zealand Leptospermum honeys were analyzed by HPLC. Fifteen flavonoids were isolated in Australian jelly bush honey (Leptospermum polygalifolium), with an average content of 2.22 mg/100 g honey. Myricetin (3,5,7,3',4',5'-hexahydroxyflavone), luteolin (5,7,3',4'-tetrahydroxyflavone) and tricetin (5,7,3',4',5'-pentahydroxyflavone) were the main flavonoids identified. The mean content of total phenolic acids in jelly bush honey was 5.14 mg/100 g honey, with gallic and coumaric acids as the potential phenolic acids. Abscisic acid was quantified as twice the amount (11.6 mg/100 g honey) of the phenolic acids in this honey. The flavonoid profile mainly consisted of quercetin (3,5,7,3',4'-pentahydroxyflavone), isorhamnetin (3,5,7,4'-tetrahydroxyflavone 3'-methyl ethyl), chrysin (5,7-dihydroxyflavone), luteolin and an unknown flavanone in New Zealand manuka (Leptospermum scoparium) honey with an average content of total flavonoids of 3.06 mg/100 g honey. The content of total phenolic acids was up to 14.0 mg/100 g honey, with gallic acid as the main component. A substantial quantity (32.8 mg/100 g honey) of abscisic acid was present in manuka honey. These results showed that flavonoids and phenolic acids could be used for authenticating honey floral origins, and abscisic acid may aid in this authentication. (C) 2002 Published by Elsevier Science Ltd.

Resposta da pressão arterial ao esforço em adolescentes: influência do sobrepeso e obesidade

Artigo original Ergoespirometria

Monitorização ambulatorial da pressão arterial em indivíduos normotensos submetidos a duas sessões únicas de exercícios : resistido e aeróbio

Objetivo: investigar a influência de duas sessões únicas de exercício resistido (circuito com pesos) e aeróbio sobre as alterações pressóricas, em indivíduos sedentários e normotensos. Métodos: foram avaliados pela monitorização numa situação controle, sem realização de exercícios (MAPA 1) 25 indivíduos, após exercício resistido (MAPA 2) e após exercício aeróbio (MAPA 3). Os exercícios resistidos foram realizados sob forma de circuito com pesos, com intensidade de 40% da força máxima individual e os exercícios aeróbicos em cicloergômetro, com intensidade entre 60% e 70% da freqüência cardíaca (FC) máxima alcançada no teste ergométrico. Resultados: a pressão arterial sistólica (PAS) de 24h e sub-períodos vigília e sono não apresentaram variações estatisticamente significantes quando comparada à MAPA2 e MAPA3 e MAPA2 e MAPA3 entre si. A pressão arterial diastólica (PAD) de 24h e diurna apresentaram reduções significantes (P<0,05). A média da freqüência cardíaca de 24h e no período vigília apresentou aumentos significativos (P<0,05) quando comparada a MAPA2 à MAPA3. Conclusão: uma sessão única de exercício resistido em indivíduos normotensos foi suficiente para promover reduções significativas dos níveis tensionais, no período de sono após o exercício, e a de exercício aeróbio nesses mesmos indivíduos, foi mais eficaz em promover reduções significativas dos níveis pressóricos.

Níveis críticos de fósforo em solos cultivados com cana-de-açúcar em Pernambuco

Em Pernambuco, a disponibilidade de P é avaliada sem se considerarem características físicas, químicas, ou, mineralógicas dos solos. Este trabalho teve como objetivos determinar os níveis críticos de P em diferentes solos, utilizando-se diferentes extratores químicos, considerando-se a quantidade e a qualidade da fração argila e relacionar as características físicas, químicas e mineralógicas dos solos com os níveis críticos de P. Os solos foram classificados como: Argissolo Amarelo distrocoeso (PAdx); Latossolo Amarelo distrófico (LAd); Argissolo Amarelo distrófico (PAd); Gleissolo háplico eutrófico (GXve) e Espodossolo cárbico duripânico (EKo). Os tratamentos consistiram em sete doses de P, determinadas de acordo com a capacidade máxima de adsorção de P (CMAP). O delineamento experimental foi em blocos ao acaso, com quatro repetições. Foram coletadas amostras de solo na área útil das parcelas. Essa amostragem foi realizada 30 dias após o plantio e aplicação das doses de P, numa profundidade de 0,0-0,2 m. Nessas amostras, determinaram-se o teor de P pelos extratores Mehlich-1, Mehlich-3, Bray-1 e Resina de Troca Iônica (RTA). Com os teores de P no solo e a produção agrícola, determinaram-se os níveis críticos de P no solo. A RTA extraiu mais P independentemente do tipo de solo. Os níveis críticos de P no solo foram dependentes da CMAP, da quantidade de argila e do P remanescente (P-rem), quando o extrator para avaliação do P disponível foi o Mehlich-1. Os níveis críticos no solo determinados pela RTA não foram dependentes de nenhuma característica química e, ou, física dos solos.

Estabilidade do ácido fólico em suspensão oral extemporânea

Apesar do ácido fólico (AF) ser utilizado em pediatria na prevenção e tratamento de deficiências desta vitamina, não existe actualmente disponível uma forma farmacêutica adequada a doentes pediátricos, o que requer o desenvolvimento de uma preparação líquida extemporânea. A utilização segura destas preparações deve ser suportada por documentação adequada sobre estabilidade física e química. O objectivo do presente trabalho foi investigar a estabilidade do AF numa suspensão oral extemporânea 50 g/ml, preparada a partir de comprimidos disponíveis comercialmente (5 mg). A suspensão de AF foi conservada em recipientes de vidro à temperatura de 2-8 ºC e sob protecção da luz. Cinco amostras independentes foram analisadas no tempo 0 e após 1, 3, 5 e 7 dias. O teor em AF foi determinado através de um método de HPLC em fase reversa, com adequada linearidade, precisão, exactidão e selectividade. A concentração de AF foi superior a 95% em todos os tempos de amostragem e a aparência física, cor e odor da suspensão não sofreram alteração durante o período do estudo. O AF revelou ser estável em suspensão aquosa pelo menos durante 14 dias a 2-8 ºC e ao abrigo da luz, o que poderá permitir a sua utilização em doentes pediátricos.

Desenvolvimento de novas metodologias para determinação de antibióticos em águas de consumo: estudo exploratório

Está hoje bem estabelecido que os antibióticos são constantemente libertados e introduzidos no meio ambiente em consequência da sua extensa utilização na medicina humana e veterinária. A presença destes compostos tem vindo a ser verificada, por diversos autores, em águas subterrâneas, águas de superfície e águas residuais. O impacto que deriva da acumulação destas substâncias a nível ambiental, nomeadamente, situações de toxicidade e/ou desenvolvimento de resistências bacterianas, impõe um controlo sobre a qualidade das águas no que respeita a estas substâncias. Este estudo pretende explorar a aplicabilidade da extracção por fase sólida (SPE) utilizando resinas de fase reversa C-18, para a determinação de tetraciclina (TC), cloranfenicol (CPA) e estreptomicina (STP) em amostras de água padronizadas. A separação cromatográfica foi elevada a cabo por cromatografia líquida de alta pressão com detector de fotodiodos (HPLC-DAD) empregando uma coluna C18 de fase reversa (30cm x 3.9mm, 5pm de tamanho partícula). A monitorização dos antibióticos foi realizada por um varrimento de comprimentos de onda específicos para cada um dos compostos (357, 277, e 257nm para TC, CPA e STP, respectivamente). O solvente de eluição constituiu um factor determinante na extracção dos antibióticos da resina utilizada, tendo sido conseguidas extracções máximas de 77,1% para a TC e de 15,3% para o CPA; não foi conseguida qualquer recuperação para a STP com a resina utilizada. Assim, o método revelou-se eficaz para a análise conjunta dos antibióticos CPA e TC, recomendando-se a análise da STP por um método separado, dada as suas elevadas características polares.

Estudo comparativo de procedimentos experimentais e computacionais para cálculo da lipofilia molecular

Introdução – A lipofilia é uma das propriedades físico-químicas que mais influencia a capacidade de uma molécula se movimentar através de compartimentos biológicos. O coeficiente de partição octanol/água (log P) permite, assim, obter uma estimativa da absorção dos fármacos no organismo. A existência de métodos indirectos para um cálculo rápido do log P pode revelar-se de grande importância na análise de listas de compostos com potencial acção farmacológica, reduzindo-as àqueles que se prevêem ter um melhor comportamento biológico. Objectivos – O propósito deste estudo é dar a conhecer um método cromatográfico de RP-HPLC desenvolvido para a determinação indirecta da lipofilia molecular e avaliar a performance de vários programas de cálculo computacional desse mesmo parâmetro. Metodologias – Seleccionaram-se 25 compostos químicos, avaliou-se o log P de cada um deles por RP-HPLC e confrontaram-se os resultados obtidos com os de sete programas computacionais. Resultados – O método RP-HPLC testado demonstrou ser vantajoso em comparação com o convencional shake flask. O programa de cálculo indirecto que proporcionou resultados mais próximos dos experimentais foi o ALOGPS© 2.1. Conclusões – A escolha ideal para a determinação da lipofilia de compostos cujo log P estimado esteja entre 0 e 6 é, sobretudo no que diz respeito à rapidez e simplicidade do processo, o método experimental indirecto RP-HPLC. Quanto aos métodos computacionais concluiu-se que nenhum dos programas, incluindo o ALOGPS© 2.1, demonstrou ser eficaz na avaliação de isómeros pelo que, para estes compostos, será sempre necessário recorrer ao método shake flask ou RP-HPLC.

Intermittent claudication and physical exercise: effectiveness of a home-based program

Peripheral arterial disease (PAD) as a high incidence in general population and 12% to 20% of population with more than 60 years has already clinical symptoms, such as intermittent claudication (IC), pain, loss of strength and functional incapacity. There are already some studies who refer the possible positive effects of physical exercise in functional consequences of PAD.

Exercício físico e hipertensão

O risco de doença cardiovascular duplica exponencialmente por cada aumento de 20 mmHg na PAS ou 10mmHg na PAD. Benefícios do exercício físico: melhora a depressão; melhora a autoconfiança e a auto-estima; melhora a ansiedade e o stress; melhora capacidades cognitivas; eventual auxílio na evicção de toxicomanias; baixa a pressão arterial; melhora o perfil lipídico: HDL, Triglicéridos e LDL; melhora a sensibilidade à insulina; diminui o stress; baixa o peso (sobretudo à custa da massa gorda); promove a manutenção ou aumento de massa muscular; acção modeladora do apetite; aumenta o metabolismo em repouso após a actividade •Aumenta a termogénese alimentar; aumenta o tónus muscular e o consumo calórico em repouso; aumenta a força; pode motivar para outros comportamentos saudáveis (ex: tabaco); menor incidência de infecções; menor incidência de neoplasias; previne a osteoporose aumentando a massa óssea ou atrasando a sua perda; atrasa certos processos do envelhecimento.

Nanofiltração de águas superficiais contendo disruptores endócrinos

A produção de água para consumo de alta qualidade a partir de águas de superfície envolve a remoção de micropoluentes em associação com matéria orgânica natural (MON) residual. Actualmente os disruptores endócrinos (DE) são um tipo de micropoluentes de especial relevância e que necessitam de investigação ao nível de detecção analítica e de tecnologias de remoção. A nanofiltração (NF) apresenta-se como uma tecnologia mais adaptada à remoção de DE que podem ser de origem natural ou substâncias químicas como o IGEPAL CO-210 ou ainda provenientes da degradação destas como o 4-nonilfenol. A optimização da NF para remoção dos DE é o objectivo principal deste trabalho final de mestrado. Esta foi realizada em termos de tipos de membranas e de modos e condições de operação. Para este efeito foram realizados ensaios com soluções modelo (4-nonilfenol, 4-octilfenol e IGEPAL) e com amostras de águas de superfície, recolhida no Rio Sado, com e sem inoculação de DE. Os ensaios com as soluções modelo foram realizados em modo de recirculação total numa instalação de nanofiltração laboratorial com células planas e uma área superficial de membrana de 13,2 cm2. Os ensaios com as águas de superfície foram realizados em modo de concentração numa instalação semi-piloto, DSS Lab-unit M20, com 360 cm2 de área superficial de membrana. Os ensaios de permeação foram realizados com membranas de nanofiltração fornecidas pela FILMTEC - NF 90, NF200 e NF270 - com permeabilidades hidráulicas a variarem de 3,7 a 15,6 Kg/h/m2/bar. A quantificação dos DE foi realizada recorrendo a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) precedida de uma pré-concentração, os teores em matéria orgânica natural foram quantificados recorrendo à determinação do carbono orgânico total (COT). Para as soluções modelo os solutos 4-nonilfenol, 4-octilfenol e IGEPAL são rejeitados a 100% por todas as membranas. A NF do Rio Sado com e sem inoculação de DE foram efectuadas até taxas de recuperação de 84%. Os fluxos de permeação para as membranas NF270 e NF200 diminuíram de 100 L/h/m 2 e 70 L/h/m2, respectivamente para valores finais de 20 L/h/m2. Na membrana NF90 os fluxos iniciais de 20 L/h/m 2 decresceram até um valor próximo de zero para as taxas de recuperação mais elevadas. As rejeições ao MON para as membranas NF90, NF200 e NF270 foram 94%, 82% e 78% respectivamente. As rejeições aos DE - 4-nonilfenol, 4-octilfenol e IGEPAL - foram sempre superiores a 98% em todos os ensaios.

Cromatografia preparativa: caracterização e purificação de produtos e impurezas com aplicação na indústria de APIs

Neste trabalho efectuou-se o desenvolvimento de métodos de purificação de princípios activos farmacêuticos utilizando a cromatografia preparativa em coluna (eluição batch). Por motivos de confidencialidade as amostras tiveram a denominação de Amostra Projecto A, Amostra Projecto B, Amostra Projecto C e Amostra 2 - Projecto A. Estudou-se a performance de coluna para cada projecto utilizando colunas pré-preparadas e colunas preparadas com a tecnologia DAC (Dynamical Axial Compression). Elaborou-se o procedimento experimental de enchimento de colunas preparativas sob compressão axial. As impurezas isoladas por cromatografia preparativa foram sujeitas a caracterização HPLC e LC-MS. Com colunas pré-preparadas, obteve-se para a amostra do projecto A um rendimento de 70,59% e relativamente à amostra projecto B obteve-se u, rendimento de 15,39%. Relativamente à impureza isolada da amostra do projecto A, o estudo por HPLC revelou 98,69% de pureza, quanto à impureza da amostra projecto B obteve-se 88,80% de pureza. A impureza da amostra do projecto A exibiu por LC-MS a massa de 467,15 enquanto que a impureza da amostra do projecto B obteve 503,31. O enchimento de colunas preparativas sob pressão axial dinâmica foi realizado numa coluna de dimensão 260 X 25 mm, onde 76,60% da coluna foi compactada com o material de enchimento SepTech ST150-C18, 10 µm. A coluna foi testada com a impureza isolada do projecto A. Isolou-se o pico referente à impureza, e por LC-MS verificou-se que a impureza foi isolada eficientemente com 97,20& de pureza e massa 467,15 como indicado anteriormente. Em relação à preparação de colunas com a tecnologia DAC concluímos que, neste caso, é mais vantajoso realizar o enchimento das colunas do que efectuar a compra de colunas pré-preparadas. Com estes resultados pode-se concluir que a cromatografia preparativa é um método eficaz no isolamento de impurezas de APIs (Active Pharmaceutical Ingredients) face a métodos de purificação clássicos que foram realizados previamente noutros estudos. Com futuros desenvolvimentos e investimentos, facilmente poderá tornar-se num método de purificação indispensável na Indústria de Química Fina.