A SUBSET OF 3´ TO 5´ EXORIBONUCLEASES ARE THE PRIMARY ENZYMES RESPONSIBLE FOR THE DEGRADATION OF PGPG IN CYCLIC DI-GMP SIGNALING

Bis-(3´-5´)-cyclic dimeric guanosine monophosphate, or cyclic di-GMP (c-di-GMP) is a ubiquitous bacterial second messenger that regulates processes such biofilm formation, motility, and virulence. C-di-GMP is synthesized by diguanylate cyclases (DGCs), while phosphodiesterases (PDE-As) end signaling by linearizing c-di-GMP to 5ʹ-phosphoguanylyl-(3ʹ,5ʹ)-guanosine (pGpG), which is then hydrolyzed to two GMPs by previously unidentified enzymes termed PDE-Bs. To identify the PDE-B responsible for pGpG turnover, a screen for pGpG binding proteins in a Vibrio cholerae open reading frame library was conducted to identify potential pGpG binding proteins. This screen led to identification of oligoribonuclease (Orn). Purified Orn binds to pGpG and can cleave pGpG to GMP in vitro. A deletion mutant of orn in Pseudomonas aeruginosa was highly defective in pGpG turnover and accumulated pGpG. Deletion of orn also resulted in accumulation c-di-GMP, likely through pGpG-mediated inhibition of the PDE-As, causing an increase in c-di-GMP-governed auto-aggregation and biofilm. Thus, we found that Orn serves as the primary PDE-B enzyme in P. aeruginosa that removes pGpG, which is necessary to complete the final step in the c-di-GMP degradation pathway. However, not all bacteria that utilize c-di-GMP signaling also have an ortholog of orn, suggesting that other PDE-Bs must be present. Therefore, we asked whether RNases that cleave small oligoribonucleotides in other species could also act as PDE-Bs. NrnA, NrnB, and NrnC can rapidly degrade pGpG to GMP. Furthermore, they can reduce the elevated aggregation and biofilm formation in P. aeruginosa ∆orn. Together, these results indicate that rather than having a single dedicated PDE-B, different bacteria utilize distinct RNases to cleave pGpG and complete c-di-GMP signaling. The ∆orn strain also has a growth defect, indicating changes in other regulatory processes that could be due to pGpG accumulation, c-di-GMP accumulation, or another effect due to loss of Orn. We sought to investigate the genetic pathways responsible for these growth defect phenotypes by use of a transposon suppressor screen, and also investigated transcriptional changes using RNA-Seq. This work identifies that c-di-GMP degradation intersects with RNA degradation at the point of the Orn and the functionally related RNases.

Études de la liaison du complexe Ku aux télomères et du délai de croissance des survivants de type I chez Saccharomyces cerevisiae

L’extrémité des chromosomes linéaires est une structure nucléoprotéique très conservée chez les organismes eucaryotes. Elle est constituée du télomère et des régions sous-télomériques répétées (STR) qui sont placées en amont du télomère. Chez la levure bourgeonnante, on trouve deux types de télomère, les télomères XY’ et les télomères X, qui se distinguent par la nature des STR positionnées en amont des répétitions télomériques. Le télomère et les STR sont liés par pas moins de dix protéines qui vont participer au maintien et à la régulation de l’extrémité chromosomique nécessaires à la stabilité du génome. Le télomère protège ainsi le chromosome de dégradations ou encore de fusions avec d’autres chromosomes. Le maintien de la taille du télomère est assuré par la télomérase, une transcriptase inverse, qui permet l’ajout de répétitions pour pallier leur perte lors de la phase de réplication durant le cycle cellulaire. Lorsque la télomérase est absente, deux types particuliers de cellules, les survivants de type I et les survivants de type II, peuvent maintenir leurs télomères grâce aux mécanismes de recombinaison homologue. Chez l’humain, les répétitions télomériques sont également liées par un certain nombre de protéines nécessaires au maintien de la stabilité de l’extrémité chromosomique. L’implication des télomères dans les processus de cancérisation, de vieillissement, mais également dans des maladies congénitales fait de cette structure un pivot dans le domaine de la recherche fondamentale. Dans 10 % des cas de cancers, l’allongement n’est pas dû à une réactivation de la télomérase comme c’est en général le cas, mais est inhérent à des processus de recombinaison homologue, comme chez la levure. Les homologies de séquences, de protéines, mais aussi de mécanismes de régulation des télomères avec les cellules humaines, font de S. cerevisiae un excellent modèle d’étude. Cette thèse se divise en trois chapitres. Les deux premiers traitent de l’interaction du complexe yKu avec les télomères de type XY’ dans le chapitre 1 puis de son interaction avec les télomères de type X dans le chapitre 2. Le chapitre 3 traite du comportement d’un type de survivant chez S. cerevisiae. Le chapitre 1 porte donc sur l’analyse des sites de liaison aux télomères XY’ du complexe yKu par la technique de ChEC in vivo. yKu intervient dans de nombreux processus de régulation des télomères, mais aussi dans un mécanisme de réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBs), la NHEJ (Non homologous end-joining). Les résultats présentés dans cette partie appuient un modèle dans lequel yKu aurait plusieurs sites de liaison aux télomères et dans les répétitions télomériques interstitielles. Nous supposons que la liaison du complexe se ferait lors de la formation d’une cassure de type « one-sided break » générée à la suite du passage de la fourche de réplication à l’intérieur des répétitions télomériques. Le chapitre 2 est également une étude des sites de liaison par la technique de ChEC in vivo du complexe yKu, mais cette fois-ci aux télomères X. Les observations faites dans cette partie viennent corroborer les résultats du chapitre 1 de la liaison de yKu à la jonction entre le télomère et les STRs, de plus elle met en évidence des interactions potentielles du complexe avec les éléments X laissant supposer l’existence d’un potentiel repliement du télomère sur la région sous-télomérique chez la levure. Enfin, le chapitre 3 est axé sur l’étude du comportement des survivants de type I, des cellules post-sénescences qui maintiennent leurs télomères par un processus de recombinaison homologue, le mécanisme de BIR (break-induced replication) en l’absence de télomérase. Les survivants de type I présentent une croissance lente liée à un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M qui dépend de la protéine de contrôle Rad9, dont l’activité est en général induite par des cassures double-brin. Ce chapitre a permis d’apporter des précisions sur la croissance lente probablement inhérente à un berceau télomérique très restreint chez ce type cellulaire.

Study of tRNA modifying enzymes and codon usage bias in cancer

Recent evidences indicate that tRNA modifications and tRNA modifying enzymes may play important roles in complex human diseases such as cancer, neurological disorders and mitochondrial-linked diseases. We postulate that expression deregulation of tRNA modifying enzymes affects the level of tRNA modifications and, consequently, their function and the translation efficiency of their tRNA corresponding codons. Due to the degeneracy of the genetic code, most amino acids are encoded by two to six synonymous codons. This degeneracy and the biased usage of synonymous codons cause alterations that can span from protein folding to enhanced translation efficiency of a select gene group. In this work, we focused on cancer and performed a meta-analysis study to compare microarray gene expression profiles, reported by previous studies and evaluate the codon usage of different types of cancer where tRNA modifying enzymes were found de-regulated. A total of 36 different tRNA modifying enzymes were found de-regulated in most cancer datasets analyzed. The codon usage analysis revealed a preference for codons ending in AU for the up-regulated genes, while the down-regulated genes show a preference for GC ending codons. Furthermore, a PCA biplot analysis showed this same tendency. We also analyzed the codon usage of the datasets where the CTU2 tRNA modifying enzyme was found deregulated as this enzyme affects the wobble position (position 34) of specific tRNAs. Our data points to a distinct codon usage pattern between up and downregulated genes in cancer, which might be caused by the deregulation of specific tRNA modifying enzymes. This codon usage bias may augment the transcription and translation efficiency of some genes that otherwise, in a normal situation, would be translated less efficiently.

Understanding the role of auxins and oxidative enzymes on adventitious root formation in olive (olea europaea L.) cultivars

Olive (Olea europaea L.), one of the main crops in the Mediterranean basin, is mainly propagated by cuttings, a classical propagation method that relies on the ability of the cuttings to form adventitious roots. While some cultivars are easily propagated by this technique, some of the most interesting olive cultivars are considered difficult-to-root which poses a challenge for their preservation and commercialization. Therefore, increasing the current knowledge on adventitious root formation is extremely important for species like olive. This research focuses on evaluating the role of free auxins and oxidative enzymes on adventitious root formation of two olive cultivars with different rooting ability - ‘Galega vulgar’ (difficult-to-root) and ‘Cobrançosa’ (easy-to-root). In this context, free auxin levels and enzyme activities were determined in in vitro-cultured ‘Galega vulgar’ microshoots and in semi-hardwood cuttings of cvs. ‘Galega vulgar’ and ‘Cobrançosa’. To attain this goal, an analytical method for the quantification of free indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA) was developed, which is based on dispersive liquid-liquid microextraction followed by microwave derivatization (DLLME-MAD) and gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. The developed method was validated in terms of linearity, recovery, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) and proved to be useful in the analysis of two very different types of plant tissues. The results from auxin quantification in olive samples point at a relationship between free auxin levels and rooting ability of both microshoots and semihardwood cuttings. A defective IBA-IAA conversion, resulting in a peak of free IAA during initiation phase, seems to be associated with low rooting ability. Likewise, differences in the activity of oxidative enzymes also appear to be related with rooting ability. Higher polyphenol oxidases (PPO) activity is likely related with an easyto- root behavior, while the opposite is true for peroxidases (POX) (including IAA oxidase (IAAox)) activity. A possible hypothesis for adventitious root formation in olive microcuttings is presented herein for the first time. Free auxins, oxidative enzymes, alternative oxidase (AOX) and reactive oxygen species (ROS) are some of the factors that may be involved in this highly complex physiological process. Interestingly, while temporal changes in auxin levels were similar between microshoots and semihardwood cuttings, the conclusions obtained from enzyme activity results in microshoots didn’t translate to semi-hardwood tissues, showing the emerging need for adaptation of classical agronomical research studies to modern techniques; Resumo: Procurando compreender o papel das auxinas e enzimas oxidativas na formação de raízes adventícias em cultivares de oliveira (Olea europaea L.) A oliveira (Olea europaea L.) é uma das principais culturas da bacia Mediterrânica e é propagada maioritariamente por estacaria, um processo altamente dependente da capacidade das estacas para formar raízes adventícias. Enquanto algumas cultivares são fáceis de propagar desta forma, algumas das cultivares de oliveira mais interessantes são consideradas difíceis de enraizar, o que dificulta a sua preservação e comercialização e torna extremamente importante aprofundar o conhecimento sobre o enraizamento adventício desta espécie. Este trabalho foca-se na avaliação do papel das auxinas livres e das enzimas oxidativas na formação de raízes adventícias em duas cultivares de oliveira com diferente capacidade de enraizamento - ‘Galega vulgar’ (difícil de enraizar) e ‘Cobrançosa’ (fácil de enraizar). Neste contexto, determinaram-se os níveis de auxinas livres e as actividades de enzimas oxidativas em microestacas de ‘Galega vulgar’ cultivadas in vitro bem como em estacas semi-lenhosas das cvs. ‘Galega vulgar’ e ‘Cobrançosa’. Para tal foi necessário desenvolver uma metodologia analítica para a quantificação de ácido indol-3-acético (IAA) e ácido indol-3-butírico (IBA), baseada em microextracção dispersiva líquido-líquido (DLLME) seguida de derivatização em microondas (MAD) e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC/MS). O método desenvolvido foi validado em termos de linearidade, recuperação, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ), e mostrou-se eficaz na análise de dois tipos de tecidos vegetais bastante diferentes. Os resultados da análise de auxinas em amostras de oliveira apontam para uma possível relação entre os níveis de auxinas livres e a capacidade de enraizamento, tanto em microestacas como em estacas semi-lenhosas. Uma conversão IBA-IAA deficiente, que resulta num pico de IAA durante a fase de iniciação, parece estar associada à baixa capacidade de enraizamento. Por outro lado, a capacidade de enraizamento também parece estar relacionada com diferenças na actividade de enzimas oxidativas. Comportamentos fáceis de enraizar estão associados a actividade mais elevada das polifenoloxidases (PPO), enquanto o oposto é verdade para a actividade das peroxidases (POX) (incluindo a IAA oxidase (IAAox)). Neste trabalho propõe-se pela primeira vez uma possível explicação para o enraizamento adventício em microestacas de oliveira. Auxinas livres, enzimas oxidativas, oxidase alternativa (AOX) e espécies reactivas de oxigénio (ROS) são alguns dos factores envolvidos neste processo fisiológico altamente complexo. Curiosamente, enquanto as alterações temporais nos níveis de auxinas foram semelhantes entre microestacas e estacas semi-lenhosas, o mesmo não se observou relativamente à actividade enzimática, o que mostra a necessidade de adaptação dos estudos agronómicos tradicionais às técnicas correntes.

Suivi par élastographie ultrasonore après réparation endovasculaire d’anévrisme aorto-iliaque : étude de faisabilité in vivo

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde et les anévrismes de l’aorte abdominale (AAAs) font partie de ce lot déplorable. Un anévrisme est la dilatation d’une artère pouvant conduire à la mort. Une rupture d’AAA s’avère fatale près de 80% du temps. Un moyen de traiter les AAAs est l’insertion d’une endoprothèse (SG) dans l’aorte, communément appelée la réparation endovasculaire (EVAR), afin de réduire la pression exercée par le flux sanguin sur la paroi. L’efficacité de ce traitement est compromise par la survenue d’endofuites (flux sanguins entre la prothèse et le sac anévrismal) pouvant conduire à la rupture de l’anévrisme. Ces flux sanguins peuvent survenir à n’importe quel moment après le traitement EVAR. Une surveillance par tomodensitométrie (CT-scan) annuelle est donc requise, augmentant ainsi le coût du suivi post-EVAR et exposant le patient à la radiation ionisante et aux complications des contrastes iodés. L’endotension est le concept de dilatation de l’anévrisme sans la présence d’une endofuite apparente au CT-scan. Après le traitement EVAR, le sang dans le sac anévrismal coagule pour former un thrombus frais, qui deviendra progressivement un thrombus plus fibreux et plus organisé, donnant lieu à un rétrécissement de l’anévrisme. Il y a très peu de données dans la littérature pour étudier ce processus temporel et la relation entre le thrombus frais et l’endotension. L’étalon d’or du suivi post-EVAR, le CT-scan, ne peut pas détecter la présence de thrombus frais. Il y a donc un besoin d’investir dans une technique sécuritaire et moins coûteuse pour le suivi d’AAAs après EVAR. Une méthode récente, l’élastographie dynamique, mesure l’élasticité des tissus en temps réel. Le principe de cette technique repose sur la génération d’ondes de cisaillement et l’étude de leur propagation afin de remonter aux propriétés mécaniques du milieu étudié. Cette thèse vise l’application de l’élastographie dynamique pour la détection des endofuites ainsi que de la caractérisation mécanique des tissus du sac anévrismal après le traitement EVAR. Ce projet dévoile le potentiel de l’élastographie afin de réduire les dangers de la radiation, de l’utilisation d’agent de contraste ainsi que des coûts du post-EVAR des AAAs. L’élastographie dynamique utilisant le « Shear Wave Imaging » (SWI) est prometteuse. Cette modalité pourrait complémenter l’échographie-Doppler (DUS) déjà utilisée pour le suivi d’examen post-EVAR. Le SWI a le potentiel de fournir des informations sur l’organisation fibreuse du thrombus ainsi que sur la détection d’endofuites. Tout d’abord, le premier objectif de cette thèse consistait à tester le SWI sur des AAAs dans des modèles canins pour la détection d’endofuites et la caractérisation du thrombus. Des SGs furent implantées dans un groupe de 18 chiens avec un anévrisme créé au moyen de la veine jugulaire. 4 anévrismes avaient une endofuite de type I, 13 avaient une endofuite de type II et un anévrisme n’avait pas d’endofuite. Des examens échographiques, DUS et SWI ont été réalisés à l’implantation, puis 1 semaine, 1 mois, 3 mois et 6 mois après le traitement EVAR. Une angiographie, un CT-scan et des coupes macroscopiques ont été produits au sacrifice. Les régions d’endofuites, de thrombus frais et de thrombus organisé furent identifiées et segmentées. Les valeurs de rigidité données par le SWI des différentes régions furent comparées. Celles-ci furent différentes de façon significative (P < 0.001). Également, le SWI a pu détecter la présence d’endofuites où le CT-scan (1) et le DUS (3) ont échoué. Dans la continuité de ces travaux, le deuxième objectif de ce projet fut de caractériser l’évolution du thrombus dans le temps, de même que l’évolution des endofuites après embolisation dans des modèles canins. Dix-huit anévrismes furent créés dans les artères iliaques de neuf modèles canins, suivis d’une endofuite de type I après EVAR. Deux gels embolisants (Chitosan (Chi) ou Chitosan-Sodium-Tetradecyl-Sulfate (Chi-STS)) furent injectés dans le sac anévrismal pour promouvoir la guérison. Des examens échographiques, DUS et SWI ont été effectués à l’implantation et après 1 semaine, 1 mois, 3 mois et 6 mois. Une angiographie, un CT-scan et un examen histologique ont été réalisés au sacrifice afin d’évaluer la présence, le type et la grosseur de l’endofuite. Les valeurs du module d’élasticité des régions d’intérêts ont été identifiées et segmentées sur les données pathologiques. Les régions d’endofuites et de thrombus frais furent différentes de façon significative comparativement aux autres régions (P < 0.001). Les valeurs d’élasticité du thrombus frais à 1 semaine et à 3 mois indiquent que le SWI peut évaluer la maturation du thrombus, de même que caractériser l’évolution et la dégradation des gels embolisants dans le temps. Le SWI a pu détecter des endofuites où le DUS a échoué (2) et, contrairement au CT-scan, détecter la présence de thrombus frais. Finalement, la dernière étape du projet doctoral consistait à appliquer le SWI dans une phase clinique, avec des patients humains ayant déjà un AAA, pour la détection d’endofuite et la caractérisation de l’élasticité des tissus. 25 patients furent sélectionnés pour participer à l’étude. Une comparaison d’imagerie a été produite entre le SWI, le CT-scan et le DUS. Les valeurs de rigidité données par le SWI des différentes régions (endofuite, thrombus) furent identifiées et segmentées. Celles-ci étaient distinctes de façon significative (P < 0.001). Le SWI a détecté 5 endofuites sur 6 (sensibilité de 83.3%) et a eu 6 faux positifs (spécificité de 76%). Le SWI a pu détecter la présence d’endofuites où le CT-scan (2) ainsi que le DUS (2) ont échoué. Il n’y avait pas de différence statistique notable entre la rigidité du thrombus pour un AAA avec endofuite et un AAA sans endofuite. Aucune corrélation n’a pu être établie de façon significative entre les diamètres des AAAs ainsi que leurs variations et l’élasticité du thrombus. Le SWI a le potentiel de détecter les endofuites et caractériser le thrombus selon leurs propriétés mécaniques. Cette technique pourrait être combinée au suivi des AAAs post-EVAR, complémentant ainsi l’imagerie DUS et réduisant le coût et l’exposition à la radiation ionisante et aux agents de contrastes néphrotoxiques.

Régulation épigénétique de la défense antioxydante et de l'Angiopoietin-like 2 dans le contexte du vieillissement et des maladies cardiovasculaires

Suite à l’exposition à des facteurs de risque incluant la malnutrition, la dyslipidémie, la sédentarité et les désordres métaboliques, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont caractérisées par un état pro-oxydant et pro-inflammatoire, et une dérégulation de l’expression de divers facteurs responsables de l’homéostasie de l’environnement rédox et inflammatoire. L’implication d’enzymes antioxydantes telles que les superoxyde dismutases (SOD) et les glutathion peroxydases (Gpx), ainsi que la contribution de médiateurs pro-inflammatoires tels que l’angiopoietin-like 2 (Angptl2) ont été rapportées dans le cadre des MCV. Toutefois, les mécanismes moléculaires sensibles aux facteurs de risque et menant au développement des MCV sont peu connus. L’épigénétique est un mécanisme de régulation de l’expression génique sensible aux stimuli extracellulaires et pourrait donc contribuer au développement des MCV. La méthylation de l’ADN est un des mécanismes épigénétiques pouvant varier tant de manière gène-spécifique qu’à l’échelle génomique, et la conséquence de tels changements sur l’expression des gènes ciblés dépend du site de méthylation. Puisqu’il a été démontré que des variations au niveau de la méthylation de l’ADN peuvent être associées à divers contextes pathologiques incluant les MCV, le but de nos travaux était d’étudier le lien entre la méthylation de gènes antioxydants et pro-inflammatoires avec leurs répercussions fonctionnelles biologiques en présence de facteurs de risques associés aux MCV, tels que le vieillissement, la dyslipidémie et la sédentarité. Dans la première étude, nous avons observé que dans l’artère fémorale de souris vieillissantes, la méthylation au niveau du promoteur du gène Sod2, codant pour l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase de type 2 (SOD2 ou MnSOD), diminue avec l’âge. Ceci serait associé à l’induction de l’expression de MnSOD, renforçant ainsi la défense antioxydante endogène. Le vieillissement étant associé à une accumulation de la production de radicaux libres, nous avons étudié la vasodilatation dépendante de l’endothélium qui est sensible au stress oxydant. Nous avons observé que la capacité vasodilatatrice globale a été maintenue chez les souris âgées, aux dépens d’une diminution des facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) et d’une contribution accentuée de la voie du monoxyde d’azote (NO). Nous avons ensuite utilisé deux approches visant à réduire les niveaux de stress oxydant in vivo, soit la supplémentation avec un antioxydant, la catéchine, et l’exposition chronique à de l’exercice physique volontaire. Ces interventions ont permis de prévenir à la fois les changements au niveau de la fonction endothéliale et de l’hypométhylation de Sod2. Cette première étude démontre donc la sensibilité de la méthylation de l’ADN à l’environnement rédox. Dans la deuxième étude, nous avons démontré une régulation de l’expression de l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase 1 (Gpx1) en lien avec la méthylation de son gène codant, Gpx1, dans un contexte de dyslipidémie sévère. Nos résultats démontrent que dans le muscle squelettique de souris transgéniques sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 est hyperméthylé, ce qui diminue l’expression de Gpx1 et affaiblit la défense antioxydante endogène. Chez ces souris, l’exercice physique chronique a permis d’augmenter l’expression de Gpx1 en lien avec une hypométhylation transitoire de son gène. Cette étude démontre que le stress oxydant associé à la dyslipidémie sévère altère les mécanismes de défense antioxydante, en partie via un mécanisme épigénétique. De plus, on observe également que l’exercice physique permet de renverser ces effets et peut induire des changements épigénétiques, mais de manière transitoire. La troisième étude avait pour but d’étudier la régulation de l’Angptl2, une protéine circulante pro-inflammatoire, dans le contexte des MCV. Nous avons observé que chez des patients coronariens, la concentration circulante d’Angptl2 est significativement plus élevée que chez des sujets sains et ce, en lien avec une hypométhylation de son gène, ANGPTL2, mesurée dans les leucocytes circulants. Nous sommes les premiers à démontrer qu’en réponse à l’environnement pro-inflammatoire associé à une MCV, l’expression de l’Angptl2 est stimulée par un mécanisme épigénétique. Nos études ont permis d’identifier des nouvelles régions régulatrices différentiellement méthylées situées dans les gènes impliqués dans la défense antioxydante, soit Sod2 en lien avec le vieillissement et Gpx1 en lien avec la dyslipidémie et l’exercice. Nous avons également démontré un mécanisme de régulation de l’Angptl2 dépendant de la méthylation d’ANGPTL2 et ce, pour la première fois dans un contexte de MCV. Ces observations illustrent la nature dynamique de la régulation épigénétique par la méthylation de l’ADN en réponse aux stimuli environnementaux. Nos études contribuent ainsi à la compréhension et l’identification de mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du phénotype pathologique suite à l’exposition aux facteurs de risque, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Optimization of Enzymes Inactivation in High Pressure Processes

The demand of highest quality foods in terms of taste and their properties preservation without the use of additives is constantly increasing. Consequently, new approaches to food processing have been developed, as for example high-pressure technology which has proven to be very valuable because it allows to maintain good properties of food like some vitamins and, at the same time, to reduce some undesirable bacteria. This technology avoids the use of high temperatures during the process (not like Pasteurization), which may have adverse effect on some nutritional properties of the food, its flavour, etc. The models for some enzymatic inactivations, which depend on the pressure and temperature profiles are presented. This work deals with the optimization of the inactivation of certain enzymes when high pressure treatment on food processing is applied. The optimization algorithms will minimize the inactivation not only of a certain isolated enzyme but also to several enzymes that can be involved simultaneously in the high-pressure process.

Influence of enzymes and technology on the composition of Cobrançosa and Galega vulgar virgin olive oils

Doutoramento em Engenharia Alimentar - Instituto Superior de Agronomia - UL

Influence of Pseudomonas putida AF7 inoculation on soil enzymes.

There has been some concern about the environmental impact of microbial agents. Pseudomonas may be used as bioremediator and as biopesticide. In this study, we report the use of soil enzyme assays as biological indicator of possible negative effects in soil functioning after the P. putida AF7 inoculation. For that, P. putida AF7 was originally isolated from the rizosphere of rice and was inoculated on three soil types: Rhodic Hapludox (RH), Typic Hapludox (TH); and Arenic Hapludult (AH). The acid phosphatase, b-glucosidase and protease enzymes activities were measured for three period of evaluation (7, 14 and 21 days). In general, the enzymatic activities pre- sented variation among the tested soils. The highest activities of b-glucosidase and acid phosphatase were observed in the RH and AH soils, while the protease activity was higher in the TH soil. Also, the soil charac- teristics were measured for each plot. The activity of enzymes from the carbon cycle was positively correlated with the N and the P and the enzyme from the nitrogen cycle was negatively correlated with N and C.org. The presented data indicate that soil biochemical properties can be an useful tool for use as an indicator of soil perturba- tions by microbial inoculation in a risk assessment.

Strategies for the one-step immobilization–purification of enzymes as industrial biocatalysts

In this review, we detail the efforts performed to couple the purification and the immobilization of industrial enzymes in a single step. The use of antibodies, the development of specific domains with affinity for some specific supports will be revised. Moreover, we will discuss the use of domains that increase the affinity for standard matrices (ionic exchangers, silicates). We will show how the control of the immobilization conditions may convert some unspecific supports in largely specific ones. The development of tailor-made heterofunctional supports as a tool to immobilize–stabilize–purify some proteins will be discussed in deep, using low concentration of adsorbent groups and a dense layer of groups able to give an intense multipoint covalent attachment. The final coupling of mutagenesis and tailor made supports will be the last part of the review.

Importance of the Support Properties for Immobilization or Purification of Enzymes

Immobilization and purification of enzymes are usual requirements for their industrial use. Both purification and immobilization have a common factor: they use a solid activated support. Using a support for enzyme purification means having mild conditions for enzyme release and a selective enzyme–support interaction is interesting. When using a support for immobilization, however, enzyme desorption is a problem. The improvement of enzyme features through immobilization is a usual objective (e.g., stability, selectivity). Thus, a support designed for enzyme purification and a support designed for enzyme immobilization may differ significantly. In this review, we will focus our attention on the requirements of a support surface to produce the desired objectives. The ideal physical properties of the matrix, the properties of the introduced reactive groups, the best surface activation degree to reach the desired objective, and the properties of the reactive groups will be discussed.

Création de mutants cdc5 en vue de l’identification des substrats de PLK/Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN.

Les kinases de la famille Polo (PLK) jouent un rôle majeur durant le cycle cellulaire, notamment en promouvant des processus essentiels tels que l’entrée en phase M et la sortie du cycle cellulaire. Elles sont également impliquées dans plusieurs cancers et ont un fort pouvoir tumorigène. Notre laboratoire a récemment montré que Cdc5 (la kinase PLK chez Saccharomyces cerevisiae) est également nécessaire pour l'adaptation aux dommages à l'ADN, et que la cible critique de Cdc5 au cours de ce processus pourrait être une cible peu conventionnelle localisée aux centrosomes de levures. Dans le but d’identifier ce substrat, une analyse intégrale du phosphoprotéome de PLK/Cdc5 par spectrométrie de masse devra être réalisée. Pour ce faire, un allèle CDC5 sensible à la température, c’est-à-dire une version mutante qui devient inactive à température élevée, devra être utilisée. Cet allèle devra être thermosensible à 30°C, afin de s’assurer qu’il sera le seul à être inactivé à cette température et que, par conséquent, seuls les substrats de Cdc5 seront identifiés. À cet effet, nous avons généré deux allèles cdc5 thermosensibles à 30°C : cdc5-17 et cdc5-18, puis analysé leur cycle cellulaire à 32°C. Les résultats de cette analyse ont montré que l’exposition des cellules à 32°C résulte en leur blocage en fin de mitose sous la forme bourgeonnée, témoignant d’un défaut dans la promotion de la sortie de la mitose. Ce défaut est causé par la mutation du gène CDC5 dont la protéine favorise la sortie de la mitose via deux voies : la voie du MEN (Mitotic Exit Network) et la voie du FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 et cdc5-18 représentent des outils biologiques précieux qui permettront de mieux analyser le phosphoprotéome de PLK/Cdc5 et de mener à l’identification des cibles de Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN. Étant donné que l’adaptation aux dommages à l’ADN causés par des chimiothérapies représente l’un des facteurs permettant la prolifération des tumeurs cancéreuses, cette découverte serait un grand pas dans la lutte contre le cancer.

Création de mutants cdc5 en vue de l’identification des substrats de PLK/Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN

Les kinases de la famille Polo (PLK) jouent un rôle majeur durant le cycle cellulaire, notamment en promouvant des processus essentiels tels que l’entrée en phase M et la sortie du cycle cellulaire. Elles sont également impliquées dans plusieurs cancers et ont un fort pouvoir tumorigène. Notre laboratoire a récemment montré que Cdc5 (la kinase PLK chez Saccharomyces cerevisiae) est également nécessaire pour l'adaptation aux dommages à l'ADN, et que la cible critique de Cdc5 au cours de ce processus pourrait être une cible peu conventionnelle localisée aux centrosomes de levures. Dans le but d’identifier ce substrat, une analyse intégrale du phosphoprotéome de PLK/Cdc5 par spectrométrie de masse devra être réalisée. Pour ce faire, un allèle CDC5 sensible à la température, c’est-à-dire une version mutante qui devient inactive à température élevée, devra être utilisée. Cet allèle devra être thermosensible à 30°C, afin de s’assurer qu’il sera le seul à être inactivé à cette température et que, par conséquent, seuls les substrats de Cdc5 seront identifiés. À cet effet, nous avons généré deux allèles cdc5 thermosensibles à 30°C : cdc5-17 et cdc5-18, puis analysé leur cycle cellulaire à 32°C. Les résultats de cette analyse ont montré que l’exposition des cellules à 32°C résulte en leur blocage en fin de mitose sous la forme bourgeonnée, témoignant d’un défaut dans la promotion de la sortie de la mitose. Ce défaut est causé par la mutation du gène CDC5 dont la protéine favorise la sortie de la mitose via deux voies : la voie du MEN (Mitotic Exit Network) et la voie du FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 et cdc5-18 représentent des outils biologiques précieux qui permettront de mieux analyser le phosphoprotéome de PLK/Cdc5 et de mener à l’identification des cibles de Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN. Étant donné que l’adaptation aux dommages à l’ADN causés par des chimiothérapies représente l’un des facteurs permettant la prolifération des tumeurs cancéreuses, cette découverte serait un grand pas dans la lutte contre le cancer.

Kinetic modelling of in vitro data of PI3K, mTOR1, PTEN enzymes and on-target inhibitors Rapamycin, BEZ235, and LY294002

The phosphatidylinositide 3-kinases (PI3K) and mammalian target of rapamycin-1 (mTOR1) are two key targets for anti-cancer therapy. Predicting the response of the PI3K/AKT/mTOR1 signalling pathway to targeted therapy is made difficult because of network complexities. Systems biology models can help explore those complexities but the value of such models is dependent on accurate parameterisation. Motivated by a need to increase accuracy in kinetic parameter estimation, and therefore the predictive power of the model, we present a framework to integrate kinetic data from enzyme assays into a unified enzyme kinetic model. We present exemplar kinetic models of PI3K and mTOR1, calibrated on in vitro enzyme data and founded on Michaelis-Menten (MM) approximation. We describe the effects of an allosteric mTOR1 inhibitor (Rapamycin) and ATP-competitive inhibitors (BEZ2235 and LY294002) that show dual inhibition of mTOR1 and PI3K. We also model the kinetics of phosphatase and tensin homolog (PTEN), which modulates sensitivity of the PI3K/AKT/mTOR1 pathway to these drugs. Model validation with independent data sets allows investigation of enzyme function and drug dose dependencies in a wide range of experimental conditions. Modelling of the mTOR1 kinetics showed that Rapamycin has an IC50 independent of ATP concentration and that it is a selective inhibitor of mTOR1 substrates S6K1 and 4EBP1: it retains 40% of mTOR1 activity relative to 4EBP1 phosphorylation and inhibits completely S6K1 activity. For the dual ATP-competitive inhibitors of mTOR1 and PI3K, LY294002 and BEZ235, we derived the dependence of the IC50 on ATP concentration that allows prediction of the IC50 at different ATP concentrations in enzyme and cellular assays. Comparison of the drug effectiveness in enzyme and cellular assays showed that some features of these drugs arise from signalling modulation beyond the on-target action and MM approximation and require a systems-level consideration of the whole PI3K/PTEN/AKT/mTOR1 network in order to understand mechanisms of drug sensitivity and resistance in different cancer cell lines. We suggest that using these models in systems biology investigation of the PI3K/AKT/mTOR1 signalling in cancer cells can bridge the gap between direct drug target action and the therapeutic response to these drugs and their combinations.

Influence of Pseudomonas putida AF7 inoculation on soil enzymes.

Pseudomonas may use as bioremediator and as biopesticide. The use of soil enzymatic assays as biological indicator of possible negative effects in soil functioning was evaluated after P.putida AF7 inoculation. For that, AF7 was originally isolated from the rizosphere of rice and was inoculated on three soils: Rhodic Hapludox (RH), Typic Hapludox (TH); and Arenic Hapludult (AH). Soil characteristics were measured in each plot. Acid phosphatase, ?-glucosidase and protease activities were measured at 7, 14 and 21 days. The enzyme activity waved during the experimental period but there is a significant reduction of ?-glucosidase activity in RH soil on day 14. Corg was positively correlated to the activities of ?-glucosidase and protease. The presented data indicate that soil biochemical properties may be useful as indicator of soil perturbations.