Treatment failure in celiac disease due to coexistent exocrine pancreatic insufficiency

A 17-year-old white adolescent had a history of chronic diarrhea, delayed puberty, and growth failure. Investigations excluded cystic fibrosis, Shwachman syndrome, and endocrine causes of growth failure. Severe steatorrhea was diagnosed from fecal fat studies, and a jejunal suction biopsy showed total villus atrophy, consistent with a diagnosis of celiac diseases. Following introduction of a gluten-free diet, his appetite and growth improved, but he continued to have abdominal discomfort and loose offensive bowel motions. One year later, severe steatorrhea was present. A repeat jejunal biopsy showed partial recovery of villus architecture. Serum immunoreactive trypsinogen level was low, which was highly suggestive of exocrine pancreatic failure. Results of quantitative pancreatic stimulation test confirmed the presence of primary pancreatic insufficiency. After introduction of oral pancreatic enzyme supplements with meals, his gastrointestinal symptoms resolved and growth velocity accelerated. Previously, primary pancreatic insufficiency has only been described in elderly patients with long-standing untreated celiac disease. This case, however, emphasizes that pancreatic failure can occur with celiac disease at any age. Determination of a serum immunoreactive trypsinogen level should be considered a useful screening tool for pancreatic insufficiency in patients with celiac disease who have not responded to a gluten-free diet.

Long-term outcome and extraintestinal manifestations in congenital chloride diarrhea

The rare autosomal recessive disease congenital chloride diarrhea (CLD) is caused by mutations in the solute carrier family 26 member 3 (SLC26A3) gene on chromosome 7q22.3-31.1. SLC26A3 encodes for an apical epithelial chloride-bicarbonate exchanger, the intestinal loss of which leads to profuse chloride-rich diarrhea, and a tendency to hypochloremic and hypokalemic metabolic alkalosis. Although untreated CLD is usually lethal in early infancy, the development of salt substitution therapy with NaCl and KCl in the late 1960s made the disease treatable. While the salt substitution allows normal childhood growth and development in CLD, data on long-term outcome have remained unclarified. One of the world s highest incidences of CLD 1:30 000 to 1:40 000 occurs in Finland, and CLD is part of the Finnish disease heritage. We utilized a unique sample of Finnish patients to characterize the long-term outcome of CLD. Another purpose of this study was to search for novel manifestations of CLD based on the extraintestinal expression of the SLC26A3 gene. This study on a sample of 36 patients (ages 10-38) shows that the long-term outcome of treated CLD is favorable. In untreated or poorly treated cases, however, chronic contraction and metabolic imbalance may lead to renal injury and even to renal transplantation. Our results demonstrate a low-level expression of SLC26A3 in the human kidney. Although SLC26A3 may play a minor role in homeostasis, post-transplant recurrence of renal changes shows the unlikelihood of direct transporter modulation in the pathogenesis of CLD-related renal injury. Options to resolve the diarrheal symptoms of CLD have been limited. Unfortunately, our pilot trial indicated the inefficacy of oral butyrate as well. This study reveals novel manifestations of CLD. These include an increased risk for hyperuricemia, inguinal hernias, and probably for intestinal inflammation. The most notable finding of this study is CLD-associated male subfertility. This involves a low concentration of poorly motile spermatozoa with abnormal morphology, high seminal plasma chloride with a low pH, and a tendency to form spermatoceles. That SLC26A3 immunoexpression appeared at multiple sites of the male reproductive tract in part together with the main interacting proteins cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and sodium-hydrogen exchanger 3 (NHE3) suggests novel sites for the cooperation of these proteins. As evidence of the cooperation, defects occurring in any of these transporters are associated with reduced male fertility. Together with a finding of high sweat chloride in CLD, this study provides novel data on extraintestinal actions of the SLC26A3 gene both in the male reproductive tract and in the sweat gland. These results provide the basis for future studies regarding the role of SLC26A3 in different tissues, especially in the male reproductive tract. Fortunately, normal spermatogenesis in CLD is likely to make artificial reproductive technologies to treat infertility and even make unassisted reproduction possible.

Expression of the receptor guanylyl cyclase C and its ligands in reproductive tissues of the rat: A potential role for a novel signaling pathway in the epididymis

Guanylyl cyclase C (GC-C) is a membrane-associated form of guanylyl cyclase and serves as the receptor for the heat-stable enterotoxin (ST) peptide and endogenous ligands guanylin, uroguanylin, and lymphoguanylin. The major site of expression of GC-C is the intestinal epithelial cell, although GC-C is also expressed in extraintestinal tissue such as the kidney, airway epithelium, perinatal liver, stomach, brain, and adrenal glands. Binding of ligands to GC-C leads to accumulation of intracellular cGMP, the activation of protein kinases G and A, and phosphorylation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel that regulates salt and water secretion. We examined the expression of GC-C and its ligands in various tissues of the reproductive tract of the rat. Using reverse transcriptase and the polymerase chain reaction, we demonstrated the presence of GC-C, uroguanylin, and guanylin mRNA in both male and female reproductive organs. Western blot analysis using a monoclonal antibody to GC-C revealed the presence of differentially glycosylated forms of GC-C in the caput and cauda epididymis. Exogenous addition of uroguanylin to minced epididymal tissue resulted in cGMP accumulation, suggesting an autocrine or endocrine activation of GC-C in this tissue. Immunohistochemical analyses demonstrated expression of GC-C in the tubular epithelial cells of both the caput epididymis and cauda epididymis. Our results suggest that the GC-C signaling pathway could converge on CFTR in the epididymis and perhaps control fluid and ion balance for optimal sperm maturation and storage in this tissue.

Familial Diarrhea Syndrome Caused by an Activating GUCY2C Mutation

BACKGROUND Familial diarrhea disorders are, in most cases, severe and caused by recessive mutations. We describe the cause of a novel dominant disease in 32 members of a Norwegian family. The affected members have chronic diarrhea that is of early onset, is relatively mild, and is associated with increased susceptibility to inflammatory bowel disease, small-bowel obstruction, and esophagitis. METHODS We used linkage analysis, based on arrays with single-nucleotide polymorphisms, to identify a candidate region on chromosome 12 and then sequenced GUCY2C, encoding guanylate cyclase C (GC-C), an intestinal receptor for bacterial heat-stable enterotoxins. We performed exome sequencing of the entire candidate region from three affected family members, to exclude the possibility that mutations in genes other than GUCY2C could cause or contribute to susceptibility to the disease. We carried out functional studies of mutant GC-C using HEK293T cells. RESULTS We identified a heterozygous missense mutation (c.2519G -> T) in GUCY2C in all affected family members and observed no other rare variants in the exons of genes in the candidate region. Exposure of the mutant receptor to its ligands resulted in markedly increased production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). This may cause hyperactivation of the cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR), leading to increased chloride and water secretion from the enterocytes, and may thus explain the chronic diarrhea in the affected family members. CONCLUSIONS Increased GC-C signaling disturbs normal bowel function and appears to have a proinflammatory effect, either through increased chloride secretion or additional effects of elevated cellular cGMP. Further investigation of the relevance of genetic variants affecting the GC-C-CFTR pathway to conditions such as Crohn's disease is warranted. (Funded by Helse Vest Western Norway Regional Health Authority] and the Department of Science and Technology, Government of India.)

Successful treatment of biofilm infections using shock waves combined with antibiotic therapy

Many bacteria secrete a highly hydrated framework of extracellular polymer matrix on suitable substrates and embed within the matrix to form a biofilm. Bacterial biofilms are observed on many medical devices, endocarditis, periodontitis and lung infections in cystic fibrosis patients. Bacteria in biofilm are protected from antibiotics and >1,000 times of the minimum inhibitory concentration may be required to treat biofilm infections. Here, we demonstrated that shock waves could be used to remove Salmonella, Pseudomonas and Staphylococcus biofilms in urinary catheters. The studies were extended to a Pseudomonas chronic pneumonia lung infection and Staphylococcus skin suture infection model in mice. The biofilm infections in mice, treated with shock waves became susceptible to antibiotics, unlike untreated biofilms. Mice exposed to shock waves responded to ciprofloxacin treatment, while ciprofloxacin alone was ineffective in treating the infection. These results demonstrate for the first time that, shock waves, combined with antibiotic treatment can be used to treat biofilm infection on medical devices as well as in situ infections.

Aspectos bioéticos del trasplante con donantes vivos

Resumen: El 4 de junio de 2010 se solicita al Comité de Bioética del Hospital Privado de Córdoba, Argentina, una consulta para que se analicen los aspectos éticos de un trasplante pulmonar lobar bilateral, con donante vivo relacionado para dos hermanas gemelas de 17 años con diagnóstico de fibrosis quística (Acta 172). Este caso nos permite revisar dos ejes esenciales de la constitución de la Bioética como son las funciones y actuación de los comités de Bioética en las instituciones hospitalarias, y la licitud de los trasplantes de órganos cuando hay donantes vivos. Se justificará la actuación del Comité de Bioética en este caso, analizando los puntos a tener en cuenta y los recaudos y recomendaciones que habrían de considerarse frente a esta situación planteada.

Condições mecânicas do sistema respiratório em adultos com fibrose cística: estudo pela espirometria, pletismografia e técnica de oscilações forçadas

A fibrose cística (FC) é a doença autossômica recessiva mais comum na população branca que leva à redução na expectativa de vida. A doença pulmonar é a maior causa de morbidade e mortalidade. A relevância do presente estudo se dá diante de alguns fatores: aumento drástico da sobrevida média nos últimos 60 anos na FC, a fisiopatologia pulmonar não é bem compreendida, ausência de estudos reportados na literatura, até o momento, utilizando a técnica de oscilações forçadas (TOF) exclusivamente em adultos com FC. Assim sendo os objetivos deste estudo são: analisar as alterações da mecânica respiratória em adultos com FC através da espirometria, pletismografia e TOF; correlacionar os resultados da TOF aos espirométricos e pletismográficos e avaliar a sensibilidade e especificidade da TOF nestes indivíduos. É um estudo de corte transversal descritivo, no qual foram analisados dois grupos de indivíduos: controle (n=23) e FC (n=27). Os resultados foram expressos através média desvio-padrão. As técnicas funcionais respiratórias foram realizadas na seguinte sequência: TOF, espirometria, pletismografia. Na pletismografia foram avaliados os parâmetros: CPT (capacidade pulmonar total), CRF (capacidade residual funcional) e VR (volume residual), CRF/CPT e VR/CPT, resistência (Rva) e condutância específica das vias aéreas (SGva). Na espirometria: volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1), capacidade vital forçada (CVF), fluxo expiratório entre 25% e 75% (FEF25%-75%) da CVF (FEF25%-75%) e razões VEF1/CVF (%) e FEF/CVF (%). Na TOF: propriedades resistivas do sistema respiratório- R0 (resistência no intercepto), Rm (resistência média) e S (inclinação da reta de resistência) e propriedades reativas: Cdin,sr (complacência dinâmica do sistema respiratório), Xm (reatância média), frequência de ressonância (fr); e o módulo da impedância em 4 Hz (׀Zrs4Hz׀). Na espirometria o distúrbio ventilatório obstrutivo (DVO) com CVF reduzida foi predominante, com marcante redução do FEF25%-75% no grupo FC (p<0,0001) em relação ao controle. Na pletismografia: destacou-se a elevação de VR, na presença de CPT normal e elevação da Rva e redução da SGva no grupo FC. Alterações da TOF ocorridas no grupo FC em relação ao controle: aumento de R0 e Rm (p<0,0001) e fr (p<0,0002), relacionados à obstrução das vias aéreas; redução de S (p<0,0006), Xm (p<0,0001) associadas à não-homogeneidade do sistema respiratório e Cdin,sr (p<0,0001), relacionada à redução da complacência pulmonar; aumento do módulo da impedância em 4 Hz (׀Zrs4Hz׀) (representando a carga mecânica total do sistema respiratório) resultante da interação das demais alterações da TOF citadas. Os parâmetros da TOF apresentaram correlações muito boas com a espirometria e moderadas com a pletismografia. Rm foi o único parâmetro que não se relacionou com nenhuma destas técnicas. A sensibilidade e especificidade da TOF em adultos com FC apresentaram valores elevados, sobretudo nos parâmetros reativos, em especial, Xm (85,2% e 73,9% respectivamente e área sob a curva de 0,86).

From lakes to lungs : assessing microbial activity in diverse environments

All major geochemical cycles on the Earth’s surface are mediated by microorganisms. Our understanding of how these microbes have interacted with their environments (and vice versa) throughout Earth's history, and how they will respond to changes in the future, is primarily based on studying their activity in different environments today. The overarching questions that motivate the research presented in the two parts of this thesis -- how do microorganisms shape their environment (and vice versa)? and how can we best study microbial activity in situ? -- have arisen from the ultimate goal of being able to predict microbial activity in response to changes within their environments both past and future.

Part one focuses on work related to microbial processes in iron-rich Lake Matano and, more broadly, microbial interactions with the biogeochemical cycling of iron. Primarily, we find that the chelation of ferrous iron by organic ligands can affect the role of iron in anoxic environmental systems, enabling photomixotrophic growth of anoxygenic microorganisms with ferrous iron, as well as catalyzing the oxidation of ferrous iron by denitrification intermediates. These results imply that the ability to grow photomixotrophically on ferrous iron might be more widespread than previously assumed, and that the co-occurrence of chemical and biological processes involved in the coupled biogeochemical cycling of iron and nitrogen likely dominate organic-rich environmental systems.

Part two switches focus to in situ measurements of growth activity and comprises work related to microbial processes in the Cystic Fibrosis lung, and more broadly, the physiology of slow growth. We introduce stable isotope labeling of microbial membrane fatty acids and whole cells with heavy water as a new technique to measure microbial activity in a wide range of environments, demonstrate its application in continuous culture in the laboratory at the population and single cell level, and apply the tool to measure the in situ activity of the opportunistic pathogen Staphylococcus aureus within the environment of expectorated mucus from cystic fibrosis patients. We find that the average in situ growth rates of S. aureus fall into a range of generation times between ~12 hours and ~4 days, with substantial heterogeneity at the single-cell level. These data illustrate the use of heavy water as a universal environmental tracer for microbial activity, and highlight the crucial importance of studying the physiology of slow growth in representative laboratory systems in order to understand the role of these microorganisms in their native environments.

Diagnóstico sorológico da infecção pulmonar por Pseudomonas aeruginosa em crianças com Fibrose Cística

A Fibrose Cística (FC) é uma doença letal, de caráter autossômico recessivo, que acomete populações de diferentes etnias. A doença caracteriza-se pelo comprometimento sistêmico das glândulas exócrinas e, na maioria dos pacientes, a doença pulmonar acaba tornando-se a patologia predominante. A infecção por P. aeruginosa é a principal causa de mortalidade dos pacientes com FC. O Sistema de Secreção Tipo III da bactéria é expresso na fase aguda da doença e é responsável por injetar proteínas citotóxicas no interior da célula eucariótica. Há um grande interesse em se investigar a resposta de anticorpos anti P. aeruginosa em pacientes com FC a fim de diagnosticar a colonização e ou infecção pulmonar antes da cultura, permitindo a antibioticoterapia preventiva, a fim de se evitar a infecção pulmonar crônica. Nesta tese, investigamos a resposta de anticorpos (IgG+IgM+IgA) contra as proteínas do SSTT de P. aeruginosa, através do Western-Blot. Participaram do estudo 51 pacientes com FC, de 1.1 a 16.8 anos acompanhados no Departamento de Pneumologia do Instituto Fernandes Figueira - FioCruz, durante um período aproximado de 2 anos. De cada paciente foram coletadas de 1 a 4 amostras de sangue, com intervalo médio de 6 meses entre as coletas. O grupo controle negativo consistiu de 28 indivíduos não fibrocísticos, de 2 a 17 anos, atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto - HUPE UERJ. As proteínas do SSTT foram extraídas das cepas PAO1 e PAOΔExsA (regulador da expressão do SSTT) de P. aeruginosa. Controles positivos e negativos foram utilizados em todas as reações. Para a identificação das proteínas do SSTT na reação utilizou-se antisoro de camundongos imunizados com a proteína recombinante PcrV. Doze (75%) dos 16 pacientes fibrocísticos considerados não infectados por P. aeruginosa tiveram a primeira sorologia positiva para PopB e 15 (93,75%) para ExoS/ExoT, indicando a colonização ou infecção por P. aeruginosa. Aproximadamente 25% e 35,7% dos soros do grupo controle mostraram reatividade fraca com PopB ou ExoS/ExoT, respectivamente. O tempo decorrido entre a primeira sorologia positiva e o primeiro isolamento de P. aeruginosa nestes pacientes variou de 18 a 30 meses. Concluindo, é possível fazer o diagnóstico sorológico da infecção pulmonar por P. aeruginosa antes do isolamento da bactéria pela cultura.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA): tipificação do cassete cromossômico SCCmec e resistência a antimicrobianos em pacientes com fibrose cística assistidos em dois centros no Rio de Janeiro

A infecção pulmonar de etiologia bacteriana é um dos principais problemas que levam a morbi-mortalidade na fibrose cística (FC). Staphylococcus aureus se destaca como um dos micro-organismos mais frequentes e com um agravante para a terapêutica quando se apresentam resistentes à oxacilina (MRSA). Amostras MRSA podem ser classificadas tanto genotipicamente quanto fenotipicamente em MRSA adquiridas na comunidade (CA-MRSA) ou adquiridas no hospital (HA-MRSA). Fenotipicamente, essa classificação é muito controversa, podendo se basear em critérios epidemiológicos ou ainda pelo perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Por outro lado, a classificação genotípica consiste na determinação dos cassetes cromossômicos (SCCmec), local de inserção do gene mecA (que confere resistência a meticilina). Atualmente são reconhecidos 11 tipos de SCCmec, sendo os de tipo I ao III e VIII relacionados ao genótipo HA-MRSA e IV ao XI ao genótipo CA-MRSA. Classicamente CA-MRSA é capaz de produzir a toxina Panton-Valentine leukocidin (PVL), codificada pelos genes luk-S e luk-F que está associada à pneumonia necrotizante e infecções de tecidos moles em pacientes com FC com quadros de exacerbação pulmonar. No Brasil, raros são os trabalhos envolvendo caracterização de SCCmec em amostras de pacientes com FC. Diante disso, este estudo teve como objetivo principal a caracterização dos tipos de SCCmec e ainda a determinação do perfil de susceptibilidade a antimicrobianos em uma população de MRSA recuperada de pacientes com FC assistidos em dois centros de tratamento no Rio de Janeiro, Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) e Instituto Fernandes Figueira (IFF). Foram estudadas 108 amostras de MRSA isoladas do período de 2008 a 2010, sendo 94 oriundas de 28 pacientes adultos atendidos no IFF e 14 de 2 pacientes adultos atendidos no HUPE. Foram encontradas altas taxas de resistência para os antimicrobianos oxacilina, cefoxitina e eritromicina. Todas as amostras foram sensíveis à vancomicina e a linezolida quando determinada as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM). Através da técnica de PCR foi possível a tipificação dos SCCmec em 82,4% das amostras, sendo 64% destas compatíveis ao genótipo CA-MRSA. Não houve diferença estatística nas taxas de susceptibilidade aos antimicrobianos entre as amostras CA-MRSA e HA-MRSA. Foram encontrados os SCCmec dos tipos I, III, IV e V, sendo os tipos I e IV os mais frequentes. O gene que codifica a toxina PVL foi encontrado em 34,2% das amostras e foi observado em amostras CA-MRSA e HA-MRSA. Nosso estudo se destaca por apresentar um alto percentual de amostras CA-MRSA e ainda por ser o primeiro do país a detectar a presença do gene que codifica a toxina PVL em pacientes com FC. Além disso, de forma inédita na literatura, encontramos o gene luk-S, em amostras classificadas como HA-MRSA em pacientes com FC. Os poucos estudos nacionais, bem como as diferenças encontradas entre trabalhos, refletem a necessidade de conhecimento mais aprimorado do MRSA envolvido nas infecções pulmonares dos pacientes com FC.

Epidemiologia molecular de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) isolados de pacientes com Fibrose Cística

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um importante patógeno pulmonar em pacientes com fibrose cística (FC). Caracteriza-se pela resistência a todos os β-lactâmicos, devido a presença do elemento genético móvel SCCmec o qual abriga o gene mecA. Além disso, é reconhecido por vários fatores de virulência o qual destacamos a toxina Panton-Valentine Leukocidin (PVL), uma citolisina formadora de poros na célula hospedeira, e por apresentar diversos clones epidêmicos envolvidos em surtos hospitalares. O objetivo desse estudo foi caracterizar a epidemiologia de MRSA, isolados de pacientes com FC referente a dois centros de referência no Rio de Janeiro a partir da aplicação de técnicas fenotípicas e genotípicas. Um total de 57 amostras de MRSA foi submetido ao teste de difusão em ágar para 11 antimicrobianos a fim de avaliar perfil de resistência, com aplicação da técnica da PCR foi tipificado o SCCmec e investigado a presença do gene LukS-PV responsável pela codificação da toxina PVL com intuito de estabelecer uma melhor caracterização epidemiológica dos clones identificados pela técnica do MLST (Multilocus Sequence Typing). Os antimicrobianos não β-lactâmicos apresentaram um percentual de resistência abaixo de 50%, em que destacamos a eritromicina com o maior percentual 45,6% e quanto ao perfil de resistência 24,6% foram multirresistentes. Com exceção do SCCmec II, os outros tipos foram encontrados (I, III, IV e V) com os respectivos percentuais de 22,8% (n=13), 7,1% (n=4), 61,4% (n=35) e 3,5% (n=2) e apenas 5,3% (n=3) das amostras não foram caracterizadas, não há dados da prevalência do SCCmec IV. Vinte (35,1%) amostras apresentaram produtos de amplificação compatível com a presença do gene lukS, aproximadamente metade dessas amostras (55%) estava correlacionada ao SCCmec IV. Com a análise do MLST, obtivemos os STs 1 (n=1, 1,7%), 5 (n=28, 49,1%), 30 (n=11, 19,3%), 72 (n=1, 1,7%), 398 (n=1, 1,7%), 1635 (n=7, 12,3%), 1661 (n=2, 3,5%), 239 (n=5, 8,8%), e ainda identificamos um novo ST (2732) presente em 1 amostra. A partir de uma análise associativa entre o MLST e o SCCmec foi possível observar a presença de linhagens características de clones epidêmicos, como o UK-EMRSA-3 (ST5, SCCmec I), USA 800/pediátrico (ST5, SCCmec IV), Oceania Southwest Pacific Clone - OSPC (ST30, SCCmec IV) e Brazilian Epidemic Clone - BEC (ST239, SCCmec III). Em conclusão este estudo é o primeiro a caracterizar linhagens epidêmicas de MRSA nos centros de atendimento a pacientes com FC no Rio de Janeiro, sendo necessário um monitoramento constante a fim de evitar a disseminação desses clones.

Complexo Burkholderia cepacia em pacientes com fibrose cística: caracterização das espécies, avaliação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos e da diversidade genética

O Complexo Burkholderia cepacia (CBc) é um grupo de 17 espécies intimamente relacionadas que estão associadas à deterioração pulmonar e aumento da mortalidade em pacientes com Fibrose Cística (FC). Essas espécies variam entre si em relação à prevalência, quadros clínicos e virulência. Pouco é conhecido em relação ao perfil de resistência aos antimicrobianos. Uma vez estabelecida a infecção, a abordagem terapêutica e as medidas de controle atualmente adotadas são baseadas no CBc, sem considerar cada espécie em particular. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência das espécies do CBc em pacientes atendidos em dois centros de referência no Rio de Janeiro, bem como estabelecer perfis de resistência a antimicrobianos e avaliar a diversidade molecular entre as espécies. Cem amostras do CBc isoladas de 38 pacientes com FC no período de janeiro de 2010 a fevereiro de 2012 foram identificadas por métodos fenotípicos e pelo sequenciamento do gene recA. As CIMs para amicacina, aztreonam, ceftazidima, trimetoprim/sulfametoxazol e tobramicina foram determinadas por microdiluição e a genotipagem das espécies foi realizada por PFGE com a enzima SpeI. B. vietnamiensis (44%) foi a espécie mais prevalente, seguida de B. cenocepacia IIIA (36%), B. multivorans (10%), B. cenocepacia IIIB (1%) e B. stabilis (1%). Cinco por cento das amostras não foram identificadas. B. vietnamiensis foi identificada em mais da metade dos pacientes (58,3%). Foram observadas diferenças no perfil de susceptibilidade entre as espécies do CBc. B. cenocepacia IIIA foi a espécie que apresentou as maiores taxas de resistência aos antimicrobianos, sobretudo para trimetoprim/ sulfametoxazol (80,5%), principal antimicrobiano utilizado no tratamento de infecções causadas pelo CBc. Amostras com perfis MDR ocorreram em todas as espécies, destacando-se o perfil A, resistente simultaneamente aos cinco antimicrobianos, observado em 58,8% das amostras de B.cenocepacia IIIA. A análise do polimorfismo genético mostrou que, apesar de B. vietnamiensis ter sido a espécie mais prevalente, a ocorrência de nove grupos clonais sugere que a aquisição dessas cepas tenha se dado a partir de uma fonte ambiental comum. Para B. cenocepacia IIIA, 52,9% das amostras foram atribuídas a um mesmo grupo clonal (BcA), compartilhado entre nove pacientes atendidos em um mesmo centro de referência. Oitenta por cento dessas amostras apresentaram ainda resistência a todos os antimicrobianos testados. Os dados mostram que, mesmo com o emprego de técnicas moleculares, é difícil a identificação do CBc em nível de espécie; que B. cenocepacia IIIA é caracterizada por índices de resistência superiores às outras espécies e que a transmissão cruzada entre os indivíduos aponta para a necessidade do estabelecimento de medidas de vigilância do CBc nos centros de referência.

Achromobacter xylosoxidans na fibrose cística: infecção crônica e disseminação clonal

A mortalidade na Fibrose Cística (FC) é decorrente de infecções pulmonares causadas comumente por: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e espécies do Complexo Burkholderia cepacia (CBc). Mais recentemente, tem sido observada a emergência de BGN-NF raros, como Achromobacter xylosoxidans, porém, sua prevalência, potencial de transmissão e significado clínico são desconhecidos. O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrência de colonização crônica por A. xylosoxidans e avaliar a possibilidade de transmissão cruzada entre os pacientes acompanhados em dois centros de referência na cidade do Rio de Janeiro. Foram incluídos 39 pacientes com FC, com pelo menos uma cultura positiva para o gênero Achromobacter spp., em um total de 897 analisadas, do período de janeiro de 2003 a dezembro de 2008. A frequência de isolamento de Achromobacter spp. nas culturas analisadas foi de 14,5% (130 em 897 culturas). A maioria (n=122; 93,8%) foi identificada como A. xylosoxidans por testes fenotípicos e pelo sequenciamento do gene rrs que codifica o 16S rRNA. A análise do polimorfismo genético dos isolados de A. xylosoxidans pela técnica de PFGE, mostrou 22 grupos clonais. Destes, sete foram compartilhados entre pacientes distintos sugerindo transmissão cruzada. Apenas o clone G foi amplamente disseminado entre 56,4% dos pacientes estudados, sugerindo a possibilidade de um surto. Os 15 clones restantes constituíram-se em clones exclusivos por pacientes. Os cinco pacientes colonizados cronicamente por A. xylosoxidans mostraram a prevalência de clones únicos. Até o momento, este é o primeiro caso da ocorrência de surto por A. xylosoxidans em pacientes com Fibrose Cística. A. xylosoxidans é um microrganismo que vem se destacando em frequência e como um possível patógeno pulmonar nesses pacientes. Entretanto, até o momento os dados são insuficientes para avaliar a sua contribuição para a evolução da doença pulmonar. Estudos que busquem elucidar as características de A. xylosoxidans que o permitem colonizar persistentemente o pulmão dos pacientes com FC, bem como seu potencial de virulência, são necessários.

Avaliação do custo-efetividade da incorporação do Espectômetro de Massa em Tandem no Programa Nacional de Triagem Neonatal no Brasil para diagnóstico da Fenilcetonúria e MCAD.

A Espectrometria de Massa em Tandem (MS/MS) é mundialmente considerada padrão ouro para a Triagem Neonatal (TN) de Erros Inatos do Metabolismo (IEM). Além de apresentar melhor sensibilidade e especificidade possibilita rastrear uma vasta gama de IEM usando um único teste. Atualmente o Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN) rastreia cinco doenças (Fenilcetonúria, Hipotiroidismo Congênito, Fibrose Cística, Hemoglobinopatias e Deficiência da Biotinidase). Uma das metas do PNTN é o aprimoramento e a incorporação de novas doenças e/ou tecnologias. Com a recente recomendação da CONITEC (Comissão Nacional de Incorporação de Tecnologias) para aquisição do MS/MS para diagnóstico de doenças raras, vislumbra-se o incremento desta tecnologia para ampliação de doenças triadas, melhora da qualidade do teste diagnóstico, corroborando para melhorar qualidade de vida das crianças acometidas pelos EIM. Este trabalho teve como objetivo realizar uma análise de custo efetividade, para incorporação da tecnologia de tandem MS/MS na triagem neonatal, sob a perspectiva do SUS. Desta maneira buscou-se comparar diferentes cenários da TN com a tecnologia atualmente utilizada (Fluorimetria) somente para Fenilcetonúria (PKU), e com MS/MS para rastreio da PKU e da Deficiência de Cadeia Média Acyl-Coenzima Desidrogenase (MCAD). Para tanto construiu-se um modelo matemático de decisão baseados em cadeias de Markov que simulou a TN da PKU e da MCAD, bem como a história natural da MCAD. Foi acompanhada uma coorte hipotética de cem mil recém-nascidos. O horizonte temporal adotado foi a expectativa de vida da população brasileira de 78 anos de acordo com IBGE. Utilizou-se uma taxa de desconto de 5% para os custos e consequências clínicas para ambos os cenários propostos. Quando incorporado o MS/MS para triagem da PKU os ganhos em saúde continuaram os mesmos, pois o desempenho do MS/MS e da Fluorimetria foram praticamente iguais (efetividade), porém o custo incremental foi quatro vezes maior para a mesma efetividade, o que torna o MS/MS somente para PKU não custo efetiva (dominada). No entanto, quando analisado o cenário do MS/MS para triagem da PKU e da MCAD o custo incremental do MS/MS no PNTN foi menor por causa da economia feita uma vez que é possível realizar ambos os testes no mesmo o teste do pezinho atual.

软电离质谱在蛋白质组分析和生物活性分子表征中的应用

随着软电离技术的发展，特别是基质辅助激光解析（MALDI）和电喷雾（ESI）两种软电离技术的出现，使质谱分析生物大分子成为可能，将质谱的应用范围迅速扩展到生命科学的诸多研究领域，特别是成为了蛋白质组分析，医学诊断，药物分析等领域不可替代的新工具。首先，采用凝胶电泳与傅立叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）的高分辨率和高质量精确度性能相结合的新方法，对不同肺病患者的支气管肺泡灌洗液进行了快速直接的蛋白质组分析，为肺疾病诊断学、肺病相关机理的研究以及高分辨质谱在蛋白质组分析中的应用奠定了基础。一维（1-D）和二维（2-D）凝胶电泳与高分辨FT-ICR MS相结合，对慢性支气管炎（cblonic broncnitis，CB）和囊泡纤维化（cystic fibrosis，CF）患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）中表面蛋白A和D进行了鉴定；并对表面蛋白的翻译后修饰（hydroxy-prollne）进行了直接的确定；对来自于不同肺泡蛋白沉积症（PAP）患者的BALF中的特异性蛋白进行了鉴定，鉴定出表面蛋白A的两个降解片段，为研究与肺病相关的SP-A降解产物的可能降解途径提供了初步的信息。证实了FT-ICR MS的高分辨率和高质量精确度在蛋白质的鉴定过程中的突出作用：（i）利用单个多肤的精确质量，可以避免依赖离子的串联质谱数据进行蛋白质鉴定，即无需对谱图中的离子进行串联质谱分析，就可实现蛋白质或蛋白质混合物的快速、确切的鉴定；（ii）在数据库检索中应用很小的误差范围可以大大提高蛋白质鉴定时的选择性；（iii）通过来自于微量蛋白质的少量肤峰就可以进行蛋白质的准确鉴定。通过MALDI/EST FT-ICR MS、园二色谱（CD）和H／D交换实验（hydrogedeuteriuln exchange）对一系列人SP-C及其类似物进行了表征。证实了溶液相中FFI-SP-C和rh-SP-C的非共价二聚体的存在；研究了人SP-C在有机溶剂中的构象变化和聚集行为，为探讨肺病相关机理奠定了基础。其次，以电喷雾多级串联质谱为研究手段，对部分生物类黄酮及其络合物进行系统的质谱研究，发现二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物在电喷雾条件负离子模式下具有不同的特征质谱行为，为质谱区分这两类化合物提供了重要的依据；黄酮金属络合物的研究中，四种二价过渡金属（Cu（II），Zn，Mn（II）和Fe（II））与芸香普均可以形成络合物，探讨了芸香普一铜络合物软电离条件下的碎裂机理，并利用多级串联质谱数据探讨了络合物C和D的结构，为质谱方法探讨金属清除疾病相关自由基的机理以及提高金属的生物利用度奠定了基础。