Genetic vaccine for tuberculosis (pVAXhsp65) primes neonate mice for a strong immune response at the adult stage

Abstract Background Vaccination of neonates is generally difficult due to the immaturity of the immune system and consequent higher susceptibility to tolerance induction. Genetic immunization has been described as an alternative to trigger a stronger immune response in neonates, including significant Th1 polarization. In this investigation we analysed the potential use of a genetic vaccine containing the heat shock protein (hsp65) from Mycobacterium leprae (pVAXhsp65) against tuberculosis (TB) in neonate mice. Aspects as antigen production, genomic integration and immunogenicity were evaluated. Methods Hsp65 message and genomic integration were evaluated by RT-PCR and Southern blot, respectively. Immunogenicity of pVAXhsp65 alone or combined with BCG was analysed by specific induction of antibodies and cytokines, both quantified by ELISA. Results This DNA vaccine was transcribed by muscular cells of neonate mice without integration into the cellular genome. Even though this vaccine was not strongly immunogenic when entirely administered (three doses) during early animal's life, it was not tolerogenic. In addition, pVAXhsp65 and BCG were equally able to prime newborn mice for a strong and mixed immune response (Th1 + Th2) to pVAXhsp65 boosters administered later, at the adult life. Conclusion These results suggest that pVAXhsp65 can be safely used as a priming stimulus in neonate animals in prime-boost similar strategies to control TB. However, priming with BCG or pVAXhsp65, directed the ensuing immune response triggered by an heterologous or homologous booster, to a mixed Th1/Th2 pattern of response. Measures as introduction of IL-12 or GM-CSF genes in the vaccine construct or even IL-4 neutralization, are probably required to increase the priming towards Th1 polarization to ensure control of tuberculosis infection.

The effects of long-term endurance training on the immune and endocrine systems of elderly men: the role of cytokines and anabolic hormones

Abstract Background a decline in immune and endocrine function occurs with aging. The main purpose of this study was to investigate the impact of long-term endurance training on the immune and endocrine system of elderly men. The possible interaction between these systems was also analysed. Results elderly runners showed a significantly higher T cell proliferative response and IL-2 production than sedentary elderly controls. IL-2 production was similar to that in young adults. Their serum IL-6 levels were significantly lower than their sedentary peers. They also showed significantly lower IL-3 production in comparison to sedentary elderly subjects but similar to the youngs. Anabolic hormone levels did not differ between elderly groups and no clear correlation was found between hormones and cytokine levels. Conclusion highly conditioned elderly men seem to have relatively better preserved immune system than the sedentary elderly men. Long-term endurance training has the potential to decelerate the age-related decline in immune function but not the deterioration in endocrine function.

Inflammatory and Immunological parameters in adults with Down syndrome

Abstract Background The increase in life expectancy within the general population has resulted in an increasing number of elderly adults, including patients with Down syndrome (DS), with a current life expectancy of about 50 years. We evaluate the parameters of humoral and cellular immune response, the quantitative expression of the regulator of calcineurin1 gene (RCAN1) and the production of cytokines. The study group consisted of adults DS (n = 24) and a control group with intellectual disability without Down syndrome (ID) (n = 21) and living in a similar environmental background. It was evaluated serology, immunophenotyping, the quantitative gene expression of RCAN1 and the production of cytokines. Results In the DS group, the results showed an increase in NK cells, CD8, decreased CD19 (p < 0.05) and an increase spontaneous production of IFNgamma, TNFalpha and IL-10 (p < 0.05). There was not any difference in RCAN1 gene expression between the groups. Conclusions These data suggest a similar humoral response in the two groups. The immunophenotyping suggests sign of premature aging of the immune system and the cytokine production show a proinflammatory profile.

SAG2A protein from Toxoplasma gondii interacts with both innate and adaptive immune compartments of infected hosts

Abstract Background Toxoplasma gondii is an intracellular parasite that causes relevant clinical disease in humans and animals. Several studies have been performed in order to understand the interactions between proteins of the parasite and host cells. SAG2A is a 22���kDa protein that is mainly found in the surface of tachyzoites. In the present work, our aim was to correlate the predicted three-dimensional structure of this protein with the immune system of infected hosts. Methods To accomplish our goals, we performed in silico analysis of the amino acid sequence of SAG2A, correlating the predictions with in vitro stimulation of antigen presenting cells and serological assays. Results Structure modeling predicts that SAG2A protein possesses an unfolded C-terminal end, which varies its conformation within distinct strain types of T. gondii. This structure within the protein shelters a known B-cell immunodominant epitope, which presents low identity with its closest phyllogenetically related protein, an orthologue predicted in Neospora caninum. In agreement with the in silico observations, sera of known T. gondii infected mice and goats recognized recombinant SAG2A, whereas no serological cross-reactivity was observed with samples from N. caninum animals. Additionally, the C-terminal end of the protein was able to down-modulate pro-inflammatory responses of activated macrophages and dendritic cells. Conclusions Altogether, we demonstrate herein that recombinant SAG2A protein from T. gondii is immunologically relevant in the host-parasite interface and may be targeted in therapeutic and diagnostic procedures designed against the infection.

The immunomodulatory role of carbon monoxide during transplantation

The number of organ and tissue transplants has increased worldwide in recent decades. However, graft rejection, infections due to the use of immunosuppressive drugs and a shortage of graft donors remain major concerns. Carbon monoxide (CO) had long been regarded solely as a poisonous gas. Ultimately, physiological studies unveiled the endogenous production of CO, particularly by the heme oxygenase (HO)-1 enzyme, recognizing CO as a beneficial gas when used at therapeutic doses. The protective properties of CO led researchers to develop uses for it, resulting in devices and molecules that can deliver CO in vitro and in vivo. The resulting interest in clinical investigations was immediate. Studies regarding the CO/HO-1 modulation of immune responses and their effects on various immune disorders gave rise to transplantation research, where CO was shown to be essential in the protection against organ rejection in animal models. This review provides a perspective of how CO modulates the immune system to improve transplantation and suggests its use as a therapy in the field.

Role of SP-A gene polymorphism in lung transplantation

Lung transplantation is a widely accepted therapeutic option for end stage lung disease. Clinical outcome is yet challenged by primary graft failure responsible for the majority of the early mortality, by chronic allograft dysfunction and chronic rejection accounting for more than 30% of deaths after the third postoperative year. Pulmonary surfactant proteins (SP) A, B, C and D are one of the first host defense mechanisms the lung can mount. SP-A in particular, produced by the type II pneumocytes, is active in the innate and adaptive immune system being an opsonin, but also regulating the macrophage and lymphocyte response. The main hypothesis for this project is that pulmonary surfactant protein A polymorphism may determine the early and long term lung allograft survival. Of note SP-A biologic activity seems to be genetically determined and SP-A polymorphisms have been associated to various lung disease. The two SP-A genes SP-A1 and SP-A2 have several polymorphisms within the coding region, SP-A1 (6A, 6A2-20), and SP-A2(1A, 1A0-13). The SP-A gene expression is regulated by cAMP, TTF-1 and glucocorticoids. In vitro studies have indicated that SP-A1 and SP-A2 gene variants may have a variable response to glucocorticoids. We proposed to determine if SP-A gene polymorphism predicts primary graft dysfunction and/or chronic lung allograft dysfunction and if SP-A may serve as a biomarker of lung allograft dysfunction. We also proposed to study the interaction between immunosuppressive drugs and SP-A expression and determine whether this is dependent on SP-A polymorphisms. This study will generate novel information improving our understanding of lung allograft dysfunction. It is conceivable that the information will stimulate the interest for a multi centre study to investigate if SP-A polymorphism may be integrated in the donor lung selection criteria and/or to implement post transplant tailored immunosuppression.

Modulation of apoptosis by endogenously produced nitric oxide

Untersuchungen zur Expression der induzierbaren NO-Synthetase (NOS2) belegen eine h��ufige Expression dieses Enzyms in Tumoren unterschiedlicher Gewebe. Bislang ist jedoch ungekl��rt, ob die Expression der NOS2 in Tumorzellen die apoptotische Eliminierung durch zytotoxische T-Zellen beeinflussen kann. In der vorliegenden Arbeit wurden die Folgen einer endogenen NO-Synthese auf die Apoptosesensitivit��t von HEK293-Zellen untersucht. Um prim��re NO-Wirkungen von NO-induzierten, sekund��ren (kompensatorischen) Ver��nderungen zu trennen, wurde mit einem induzierbaren Vektorsystem gearbeitet. Die NOS2 wurde zun��chst unter der Kontrolle eines Ecdyson-sensitiven Promoters in HEK293-Zellen kloniert. Es konnten regulierbare NOS2-Klone selektiert werden, die nach Ponasteronbehandlung dosisabh��ngig die NOS2 exprimieren und NO synthetisieren. Die NOS2-Expression wurde durch Western Blot Analyse und Immunfluoreszenzf��rbung dargestellt und die NO-Produktion mit Hilfe der Griess-Reaktion gemessen. An den NOS2-induzierten Zellen wurde dann der Einfluss von NO auf die CD95-vermittelte Apoptose analysiert. Es zeigte sich nach Stimulation des CD95-Rezeptors eine deutliche Korrelation der Apoptoserate mit der NOS2-Expression. In Kokulturexperimenten mit Peptid-spezifischen zytotoxischen T-Zellen zeigte sich, dass NO-produzierende Zielzellen effektiver eliminiert werden konnten. Auch nach Behandlung der Zellen mit TRAIL ergab sich eine h��here Apoptoserate in NO-produzierenden Zellen. Die weitere Analyse der durch NO beeinflussten Signalwege ergab eine Beteiligung von ER-Stress-vermittelten Apoptosewegen. Dies zeigte sich an der Hochregulation des ER-Stress-Proteins Grp78 (BiP) nach NOS2-Expression und der Spaltung der am ER-lokalisierten Caspase-4. Dar��ber hinaus konnte der schnellere Verlust des mitochondrialen Membranpotentials in Abh��ngigkeit von der NOS2-Expression nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die Wirkung einer dauerhaften NO-Exposition auf die Apoptosesensitivit��t der Zellen untersucht. Auch ohne zus��tzliche CD95-Stimulation induzierte eine kontinuierliche NOS2-Expression nach wenigen Tagen in den EcR293-NOS2-Zellen Apoptose. Diese Dauerbehandlung f��hrte zum nahezu vollst��ndigen Absterben der Kulturen. Einige Zellen ��berlebten jedoch diese Behandlung und wuchsen zu Zellklonen. Diese NO-resistenten Klone konnten isoliert werden. Sie zeigten eine zus��tzliche Resistenz f��r CD95-vermittelte Apoptosesignale und waren besser vor dem Angriff Peptid-spezifischer CTLs gesch��tzt. Die Apoptoseresistenz blieb auch nach l��ngerer Kultur erhalten und scheint auf NO-induzierter Genotoxizit��t zu beruhen. Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass allein durch chronische NO-Behandlung eine Selektion apoptoseresistenter Zellen stattfinden kann.

Die Bedeutung von NFAT-Transkriptionsfaktoren f��r die Expression von Mastzell-Cytokinen

Zusammenfassung Die Rolle verschiedener Mitglieder der NFAT- Familie in der Entwicklung von T- Zellen und deren Funktion wird intensiv untersucht, wohingegen vergleichbare Untersuchungen in Mastzellen rar sind. Mastzellen exprimieren eine Vielzahl biologisch hochaktiver Mediatoren und sind auf diese Weise sowohl in angeborenen als auch adaptiven Immunantworten beteiligt. Die von Mastzellen produzierten Th2-Cytokine verst��rken lokal Th2- Reaktionen und TNF-alpha ist ein wichtiger Initiator antimikrobieller Antworten. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Transkriptionsfaktoren NFATc1 und NFATc2 eine bedeutende Rolle in der Regulation der Expression von TNF-alpha und IL-13 einnehmen, wohingegen NFATc3 hierbei keine Funktion zukommt. Murine ���Bone marrow derived mast cells��� (BMMC) aus NFATc2- defizienten M��usen, aktiviert entweder durch Kreuzvernetzung des IgE- Rezeptors oder Ionomycin, zeigen eine drastisch reduzierte Expression dieser Cytokine verglichen mit Mastzellen aus Wildtyp- M��usen. Genauere Untersuchungen zeigen, dass sowohl NFATc2 als auch NFATc1 an der Expression von IL-13 und TNF-alpha beteiligt sind, wohingegen sie auf die Degranulation und die Expression von IL-6 keinen Einfluss nehmen. Zusammenfassend scheint eine hohe Aktivit��t von NFAT- Faktoren f��r die Induktion des IL-13 und TNF-alpha Promoters in Mastzellen erforderlich zu sein, unabh��ngig davon, ob diese durch NFATc2 oder NFATc1 oder eine Kombination beider Transkriptionsfaktoren bewerkstelligt wird.

Charakterisierung der neuroprotektiven Eigenschaften des Corticotropin-Releasing-Hormons

Das Corticotropin Releasing Hormon (CRH) ist ein zentraler Mediator des neuroendokrinen Systems von S��ugetieren und kontrolliert die physiologische Stressreaktion des K��rpers. Zudem zeigten in vitro Daten, dass es Neuroprotektion gegen��ber oxidativem Stress induzieren kann. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals ein neuroprotektiver Effekt des CRH in vivo gezeigt werden. Die ��berexpression des CRH im ZNS von M��usen konnte Nervenzellen in vivo vor Exzitotoxizit��t sch��tzen; nach Injektion des Exzitotoxins Kainat verk��rzte die CRH-��berexpression die Dauer der epileptischen Anf��lle, sch��tzte die Neurone der betroffenen Hippocampusregion vor Zelltod und verhinderte die bei Exzitotoxizit��t und vielen neurodegenerativen Erkrankungen auftretende Neuroinflammation. Desweiteren konnten in CRH-��berexprimierenden Tieren erh��hte BDNF-Proteinspiegel nachgewiesen werden. BDNF, ein bedeutender neurotropher Faktor im ZNS, vermittelt daher teilweise die CRH-induzierte Neuroprotektion gegen��ber der Exzitotoxizit��t in vivo. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Connexin43, dem Haupt-Gap Junction-Protein der Astrozyten, ein neues CRH-Zielgen im ZNS identifiziert. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass CRH sowohl die Expression des Connexin43-Gens als auch den Connexin43-Proteinspiegel in vitro und in vivo erh��ht. Diese Effekte werden ��ber die Aktivierung des CRH-Rezeptor 1 und nachfolgend der PKA- und MAPK-Signalwege vermittelt. In ��bereinstimmung mit der Hochregulation des Connexin43-Proteinspiegels verst��rkte CRH auch die interzellul��re Kommunikation ��ber Gap Junctions. Physiologisch hat diese CRH-induzierte Verst��rkung der astrozyt��ren Gap Junction-Kommunikation eine gro��e Bedeutung f��r die Neuroprotektion, da eine Hochregulation der interzellul��ren Kommunikation schnell toxische Molek��le verd��nnt, Energiesubstrate und protektive Faktoren verteilt und Ionen abpuffert. Dadurch werden Sch��digungen durch oxidativen Stress in den Zellen reduziert, was ��ber die Analyse der Proteincarbonylierung gezeigt wurde. Die Relevanz der astrozyt��ren Gap Junction-Kommunikation f��r das ��berleben der Neurone konnte in organotypischen hippocampalen Schnitten und in Neuron-Astrozyten-Co-Kulturen deutlich gemacht werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten zeigen, dass die Stress-induzierte Sekretion von CRH im ZNS zur verst��rkten Expression neuroprotektiver Molek��le wie BDNF und Connexin43 beitr��gt. Diese verm��gen Neurone gegen��ber toxischen Einfl��ssen zu sch��tzen und zum Erhalt ihrer Funktion beizutragen. Die protektiven CRH-Effekte k��nnten speziell bei chronischen neurodegenerativen Krankheiten wie der Alzheimerschen Demenz und der Parkinsonschen Krankheit hilfreich sein.

Caratterizzazione clinica, eziopatogenetica e ricerca di marker diagnostici nella poliradicoloneurite acuta idiopatica del cane

La poliradicoloneurite acuta idiopatica (ACIP) �� una patologia infiammatoria che interessa le radici di pi�� nervi spinali, descritta soprattutto nel cane, pi�� raramente nel gatto, caratterizzata da insorgenza acuta di paresi/paralisi flaccida. L���ACIP mostra notevoli similitudini con la sindrome di Guillan-Barr�� dell���uomo (GBS), in cui la patogenesi �� su base autoimmunitaria ed �� stata correlata con la presenza di alcuni fattori scatenanti (trigger). Lo scopo di questo lavoro �� stato quello di caratterizzare l���ACIP in 26 cani, descrivendone la sintomatologia, l���evoluzione clinica, i risultati degli esami diagnostici. La diagnosi si �� basata sui riscontri dell���anamnesi, della visita neurologica e del decorso confermata, quando possibile, dai rilievi elettrodiagnostici. Su tutti i cani �� stata valutata l���esposizione a specifici agenti infettivi (Toxoplasma gondii, Neospora canunim, Ehrlichia canis, Leishmania infantum), o altri fattori (come vaccinazioni) che potrebbero aver agito da ���trigger��� per l���instaurarsi della patologia; sull���intera popolazione e su 19 cani non neurologici (gruppo di controllo), si �� proceduto alla ricerca degli anticorpi anti-gangliosidi. La sintomatologia di pi�� frequente riscontro (25/26) ha coinvolto la funzione motoria (paresi/plegia) con prevalente interessamento dei 4 arti (24/25) . Sei cani hanno ricevuto una terapia farmacologica, che non ne ha influenzato il decorso, favorevole in 24/26 casi. In 9 pazienti �� stata rilevata una precedente esposizione a potenziali trigger; in 10 casi si �� riscontrato un titolo anticorpale positivo ad almeno un agente infettivo testato. In 17/26 cani si �� ottenuto un titolo anticorpale anti-GM2 e anti-GA1; nella popolazione di controllo solo un caso �� risultato positivo. Questi risultati hanno contribuito a consolidare le conoscenze di questa patologia, validando l���utilit�� della ricerca anticorpale anti-gangliosidica per la diagnosi di ACIP e facendo intravedere la possibilit�� che l���ACIP possa essere assimilate alla GBS anche dal punto di vista patogenetico, per la quale potrebbe essere considerata come modello animale spontaneo.

Analyse immunologischer und proteomischer Aspekte im Rahmen der Glaukompathogenese

Das Glaukom stellt eine heterogene Gruppe von okularen Erkrankungen dar, deren Pathogenese sich durch einen langsamen, progradienten Untergang von retinalen Ganglienzellen und ihren Axonen auszeichnet. rnIn den letzten Jahren wurde im Kontext der Glaukompathogenese verst��rkt die Beteiligung autoreaktiver Antik��rper diskutiert. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit bestand in dem Vergleich solcher Autoantik��rper-Reaktionen in den Serum- und Kammerwasserproben einzelner Glaukompatienten. Hierdurch sollte gekl��rt werden, inwieweit die Immunreaktivit��ten dieser beiden K��rperfl��ssigkeiten miteinander ��bereinstimmen und ob sich Hinweise auf eine lokale Antik��rperproduktion im immunprivilegierten Auge finden lassen. Mittels eines etablierten Protein-Microarray-Verfahrens wurden die Immunreaktionen gegen 40 verschiedene Antigene, wie z.B. Hitzeschock-Proteine oder neuronale Strukturproteine, untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die detektierten Autoantik��rper-Reaktionen gegen mehr als 80% der untersuchten Antigene in beiden K��rperfl��ssigkeiten miteinander ��bereinstimmen. Verdeutlicht wird hierdurch, dass die Antik��rper-basierenden immunologischen Vorg��nge im Auge bzw. Kammerwasser, trotz dessen Abschottung vom Blutkreislauf durch die Blut-Retina-Schranke, denen des Serums stark ��hneln. Nur vereinzelt lassen sich Hinweise auf eine lokale Antik��rperproduktion im Auge finden, wodurch die Bedeutung der detektierten Serumantik��rper-Reaktionen f��r die Glaukomerkrankung belegt wird. rnEin weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Detektion m��glicher ver��nderter Proteinexpressionen in den Retinae und Serumproben von Glaukompatienten, die potentiell zu den neurodegenerativen Prozessen der Glaukompathogenese beitragen. Um die Analyse spezifischer Proteinexpressionen zu erm��glichen, wurde das Verfahren des Antik��rper-Microarrays etabliert und auf die Fragestellung angewendet. Untersucht wurden hierbei vor allem die Abundanzen von Komplementproteinen, Zytokinen und Hitzeschock-Proteinen, aber auch die von verschiedenen neuronalen Strukturproteinen. Als Probenmaterial dienten Serum- und Retinaproben von Glaukompatienten, die vergleichend denen von gesunden Probanden gegen��bergestellt wurden. Die Analyse erbrachte die Erkenntnis, dass neben der verst��rkten Expression von Komplementproteinen in der Retina (z.B. C3, C6) auch im Serum der Glaukompatienten eine erh��hte Konzentration dieser Proteine vorliegt, die im Rahmen der Glaukomerkrankung m��glicherweise ebenfalls eine Rolle spielen. ��hnliches konnte f��r verschiedene Zytokine, wie z.B. TNF-��, IFN-�� oder IL1-�� beobachtet werden, die in den untersuchten Retinae von Glaukomprobanden, teilweise auch in den Serumproben der Patienten, in verst��rktem Ma��e detektiert werden konnten. Die erh��hte Produktion von Zytokinen in der Retina ist wahrscheinlich auf die Aktivierung von Gliazellen zur��ckzuf��hren, ein Ereignis f��r das in dieser Arbeit zahlreiche Hinweise gefunden werden konnten. Die Gliaaktivierung wird vermutlich durch apoptotische Prozesse in der Retina ausgel��st, eventuell aber auch durch eine erfolgte Komplementaktivierung. Dar��ber hinaus konnten mittels eines massenspektrometrischen Verfahrens weitere Expressionsunterschiede verschiedener retinaler Proteine bei Glaukompatienten festgestellt werden. Diese Ver��nderungen, wie z.B. geminderte Mengen von ROS-eliminierenden Proteinen, wie der Superoxid Dismutase und Peroxiredoxin-2, beg��nstigen bzw. verst��rken sehr wahrscheinlich die neurodegenerativen Prozesse in der Retina von GlaukompatientenrnInwieweit die untersuchten Faktoren kausativ an den neurodegenerativen Prozessen beteiligt sind, bleibt ungekl��rt, jedoch untermauert deren Vielzahl die Notwendigkeit, die Ursache der Glaukomerkrankung als komplexe Interaktion und Wechselwirkung verschiedener Komponenten zu betrachten und nicht als einen einzelnen fehlgesteuerten Mechanismus.rn

An interferon regulatory factor element controls the major immune modulator of murine cytomegalovirus

Immune modulation by herpesviruses, such as cytomegalovirus, is critical for the establishment of acute and persistent infection confronting a vigorous antiviral immune response of the host. Therefore, the action of immune-modulatory proteins has long been the subject of research, with the final goal to identify new strategies for antiviral therapy.rnIn the case of murine cytomegalovirus (mCMV), the viral m152 protein has been identified to play a major role in targeting components of both the innate and the adaptive immune system in terms of infected host-cell recognition in the effector phase of the antiviral immune response. On the one hand, it inhibits cell surface expression of RAE-1 and thereby prevents ligation of the activating natural killer (NK)-cell receptor NKG2D. On the other hand, it decreases cell surface expression of peptide-loaded MHC class I molecules thereby preventing antigen presentation to CD8 T cells. Ultimately, the outcome of CMV infection is determined by the interplay between viral and cellular factors.rnIn this context, the work presented here has revealed a novel and intriguing connection between viral m152 and cellular interferon (IFN), a key cytokine of the immune system: rnthe m152 promoter region contains an interferon regulatory factor element (IRFE) perfectly matching the consensus sequence of cellular IRFEs.rnThe biological relevance of this regulatory element was first suggested by sequence comparisons revealing its evolutionary conservation among various established laboratory strains of mCMV and more recent low-passage wild-derived virus isolates. Moreover, search of the mCMV genome revealed only three IRFE sites in the complete sequence. Importantly, the functionality of the IRFE in the m152 promoter was confirmed with the use of a mutant virus, representing a functional deletion of the IRFE, and its corresponding revertant virus. In particular, m152 gene expression was found to be inhibited in an IRFE-dependent manner in infected cells. Essentially, this inhibition proved to have a severe impact on the immune-modulatory function of m152, first demonstrated by a restored direct antigen presentation on infected cells for CD8 T-cell activation. Even more importantly, this effect of IRFE-mediated IFN signaling was validated in vivo by showing that the protective antiviral capacity of adoptively-transferred, antigen-specific CD8 T cells is also significantly restored by the IRFE-dependent inhibition of m152. Somewhat curious and surprising, the decrease in m152 protein simultaneously prevented an enhanced activation of NK cells in acute-infected mice, apparently independent of the RAE-1/NKG2D ligand/receptor interaction but rather due to reduced ���missing-self��� recognition.rnTaken together, this work presents a so far unknown mechanism of IFN signaling to control mCMV immune modulation in acute infection.rnrn

Exploring host-pathogen interactions through protein microarray. Large-scale protein microarray analysis revealed novel human receptors for the staphylococcal immune evasion protein FLIPr and for the neisserial adhesin NadA

Adhesion, immune evasion and invasion are key determinants during bacterial pathogenesis. Pathogenic bacteria possess a wide variety of surface exposed and secreted proteins which allow them to adhere to tissues, escape the immune system and spread throughout the human body. Therefore, extensive contacts between the human and the bacterial extracellular proteomes take place at the host-pathogen interface at the protein level. Recent researches emphasized the importance of a global and deeper understanding of the molecular mechanisms which underlie bacterial immune evasion and pathogenesis. Through the use of a large-scale, unbiased, protein microarray-based approach and of wide libraries of human and bacterial purified proteins, novel host-pathogen interactions were identified. This approach was first applied to Staphylococcus aureus, cause of a wide variety of diseases ranging from skin infections to endocarditis and sepsis. The screening led to the identification of several novel interactions between the human and the S. aureus extracellular proteomes. The interaction between the S. aureus immune evasion protein FLIPr (formyl-peptide receptor like-1 inhibitory protein) and the human complement component C1q, key players of the offense-defense fighting, was characterized using label-free techniques and functional assays. The same approach was also applied to Neisseria meningitidis, major cause of bacterial meningitis and fulminant sepsis worldwide. The screening led to the identification of several potential human receptors for the neisserial adhesin A (NadA), an important adhesion protein and key determinant of meningococcal interactions with the human host at various stages. The interaction between NadA and human LOX-1 (low-density oxidized lipoprotein receptor) was confirmed using label-free technologies and cell binding experiments in vitro. Taken together, these two examples provided concrete insights into S. aureus and N. meningitidis pathogenesis, and identified protein microarray coupled with appropriate validation methodologies as a powerful large scale tool for host-pathogen interactions studies.

Analyse humaner regulatorischer T-Zellen im humanisierten Mausmodell

Regulatorische T-Zellen sind essentiell f��r die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz. Hierbei sorgen diese hocheffektiven Suppressorzellen f��r ein immunologisches Gleichgewicht, indem sie Immunantworten gegen Autoantigene sowie harmlose Nahrungs- und Umweltantigene verhindern. Andererseits k��nnen diese bei chronischen Infekten Immunantworten reduzieren sowie effektive Antitumor-Immunantworten hemmen. Aufgrund ethischer Erw��gungen ist die Erforschung regulatorischer T-Zellen und deren Rolle bei der Tumorentwicklung weitestgehend auf Mausmodelle oder humane in vitro oder ex vivo Analysen beschr��nkt. Um diese Limitationen zu ��berwinden und translationale immunologische Experimente zu erm��glichen, wurde hier ein humanisiertes Mausmodell verwendet. T- und B-Zell-defiziente NOD-scid IL2Rgammanull (NSG) M��use wurden mit humanen CD34+ h��matopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut rekonstituiert. Aus diesen Stammzellen entstanden in den Tieren vielf��ltige humane Immunzellen. Im murinen Thymus der NSG Tiere entwickelten sich CD4+ und CD8+ einzelpositive T-Zellen, welche als funktionelle Effektorpopulationen in die Peripherie auswanderten. Humane regulatorische T-Zellen (CD4+ CD25+ Foxp3+ CD127-) entwickelten sich ebenfalls im murinen Thymus der Tiere und machten ca. 10% der humanen peripheren CD4+ T-Zellen in den M��usen aus. Diese humanen regulatorischen T-Zellen zeigten vorwiegend einen HLA-DR+ Ph��notyp, welcher mit h��chster Suppressivit��t assoziiert ist. Weiter verhielten sich die regualtorischen T-Zellen anergisch und bewiesen ihre Funktionalit��t unter anderem durch die Inhibition der Proliferation von Effektor-T-Zellen in vitro. rnSubkutan injizierte Tumorzellen eines humanen undifferenzierten pleomorphen Sarkoms wurden in den humanisierten M��usen nicht abgesto��en und der Tumor konnte, trotz Infiltration humaner Immunzellen, ungehindert wachsen. Als m��gliche Ursache hierf��r zeigte sich die selektive Akkumulation regulatorischer T-Zellen im Tumor. Zusammen mit dem erh��hten Anteil humaner regulatorischer T-Zellen in der Peripherie, weisen diese Beobachtungen deutliche Parallelen mit Befunden aus humanen Patienten auf. Dies bietet somit erstmalig die Option in vivo die Rolle humaner regulatorischer T-Zellen im undifferenzierten pleomorphen Sarkom zu analysieren. Die hier gezeigten Daten machen deutlich, dass es das humanisierte Mausmodell erm��glicht, die Entstehung und Funktion humaner regulatorischer T-Zellen in vivo zu analysieren, deren Bedeutung in klinisch relevanten Modellen zu charakterisieren und somit innovative Therapien zu etablieren.

Synthesen von C-glycosylierten Aminos��uren und Peptiden unter Einsatz speziell konstruierter Mikroreaktoren

Die chemische Synthese definierter Glycopeptidstrukturen bildet die Basis einiger vielversprechender Ans��tze zur Therapie verschiedener Krankheiten. Die Entwicklung hochaffiner Selektininhibitoren k��nnte der Behandlung chronischer Entz��ndungen und zur Unterdr��ckung der Metastasierung von Tumoren dienen. Vollsynthetische Vakzine auf Basis glycosylierter MUC1-Partialstrukturen sollen das Immunsystem zur Bek��mpfung von krankem Gewebe anregen und so perspektivisch eine Impfung gegen Krebs erm��glichen. Da die nat��rlich vorkommenden O-Glycoside in vivo eine begrenzte Stabilit��t besitzen, wurde eine Methode entwickelt, welche die modulare Herstellung von stabilen rnC-Glycosylaminos��uren als Mimetika der nat��rlichen Serin-, Threonin- und Tyrosin-Glycoside erm��glicht. Dazu wurden passend gesch��tzte Kohlenhydrat-Lactone synthetisiert, die in einer mikrowellengest��tzten Petasis-Olefinierung unter Durchflussbedingungen in die entsprechenden exo-Glycale ��berf��hrt wurden. Die Reaktionszeit konnte durch diese spezielle Reaktionsf��hrung auf weniger als drei Minuten verringert werden, w��hrend konventionell mehrere Stunden ben��tigt werden. Die C-glycosidische Verkn��pfung mit den entsprechenden Aminos��urebausteinen gelang durch eine Hydroborierungs-Suzuki-Kupplungs-Kaskade. Nach umfangreicher Optimierung der Reaktionsparameter lie�� sich neben mehreren Monosacchariden auch ein exo-Glycal der Lactose erfolgreich in der Kupplung einsetzen. Nach verschiedenen Schutzgruppenmanipulationen wurden einige der synthetisierten Bausteine zur Synthese C-glycosylierter Partialstrukturen des Mucins MUC1 an der festen Phase herangezogen. In ELISA-Experimenten wurden die C-Glycosylpeptide von an Brustkrebsgewebe bindenden Antik��rpern erkannt, die durch Vakzinierung mit ��hnlichen Strukturen erhalten worden waren. Zur Synthese zweier Bausteine potenzieller Selektin-Inhibitoren wurde ein Mimetikum des in nat��rlichen Liganden vorkommenden Tetrasaccharides Sialyl-Lewisx synthetisiert. Bei diesem wurde die terminale Sialins��ure durch (S)-Cyclohexylmilchs��ure ersetzt. Die bei der gew��hlten Syntheseroute notwendige regioselektive ��ffnung eines Benzylidenacetals wurde in einem Mikroreaktor durchgef��hrt, wodurch eine einfache Reaktionsoptimierung mit geringen Substanzmengen m��glich war. Die Reaktionszeit liegt mit unter 4 Minuten deutlich unter den ��blichen Werten von einer bis mehreren Stunden. In einer Block-Glycosylierung konnte das Pseudotetrasaccharid sowohl an einen C-Lactosyl-Tyrosin-, als auch an einen C-Lactosyl-Serin-Akzeptor angef��gt und somit die Synthese der Zielverbindungen abgeschlossen werden. Diese Bausteine k��nnen in Zukunft als Bestandteile synthetischer Glycopeptide zum Einsatz kommen, welche Mimetika der nat��rlichen Selektin-Liganden darstellen sollen.rn