Analyse humaner regulatorischer T-Zellen im humanisierten Mausmodell

Regulatorische T-Zellen sind essentiell f��r die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz. Hierbei sorgen diese hocheffektiven Suppressorzellen f��r ein immunologisches Gleichgewicht, indem sie Immunantworten gegen Autoantigene sowie harmlose Nahrungs- und Umweltantigene verhindern. Andererseits k��nnen diese bei chronischen Infekten Immunantworten reduzieren sowie effektive Antitumor-Immunantworten hemmen. Aufgrund ethischer Erw��gungen ist die Erforschung regulatorischer T-Zellen und deren Rolle bei der Tumorentwicklung weitestgehend auf Mausmodelle oder humane in vitro oder ex vivo Analysen beschr��nkt. Um diese Limitationen zu ��berwinden und translationale immunologische Experimente zu erm��glichen, wurde hier ein humanisiertes Mausmodell verwendet. T- und B-Zell-defiziente NOD-scid IL2Rgammanull (NSG) M��use wurden mit humanen CD34+ h��matopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut rekonstituiert. Aus diesen Stammzellen entstanden in den Tieren vielf��ltige humane Immunzellen. Im murinen Thymus der NSG Tiere entwickelten sich CD4+ und CD8+ einzelpositive T-Zellen, welche als funktionelle Effektorpopulationen in die Peripherie auswanderten. Humane regulatorische T-Zellen (CD4+ CD25+ Foxp3+ CD127-) entwickelten sich ebenfalls im murinen Thymus der Tiere und machten ca. 10% der humanen peripheren CD4+ T-Zellen in den M��usen aus. Diese humanen regulatorischen T-Zellen zeigten vorwiegend einen HLA-DR+ Ph��notyp, welcher mit h��chster Suppressivit��t assoziiert ist. Weiter verhielten sich die regualtorischen T-Zellen anergisch und bewiesen ihre Funktionalit��t unter anderem durch die Inhibition der Proliferation von Effektor-T-Zellen in vitro. rnSubkutan injizierte Tumorzellen eines humanen undifferenzierten pleomorphen Sarkoms wurden in den humanisierten M��usen nicht abgesto��en und der Tumor konnte, trotz Infiltration humaner Immunzellen, ungehindert wachsen. Als m��gliche Ursache hierf��r zeigte sich die selektive Akkumulation regulatorischer T-Zellen im Tumor. Zusammen mit dem erh��hten Anteil humaner regulatorischer T-Zellen in der Peripherie, weisen diese Beobachtungen deutliche Parallelen mit Befunden aus humanen Patienten auf. Dies bietet somit erstmalig die Option in vivo die Rolle humaner regulatorischer T-Zellen im undifferenzierten pleomorphen Sarkom zu analysieren. Die hier gezeigten Daten machen deutlich, dass es das humanisierte Mausmodell erm��glicht, die Entstehung und Funktion humaner regulatorischer T-Zellen in vivo zu analysieren, deren Bedeutung in klinisch relevanten Modellen zu charakterisieren und somit innovative Therapien zu etablieren.

Untersuchungen zur antitumoralen Wirkungsweise eines bispezifischen MCSP-CD3 Antik��rpers in vitro und im humanisierten Tumormausmodell

Humanes MCSP ist ein gut charakterisiertes Tumorantigen, das auf der Mehrzahl aller malignen Melanome hoch exprimiert wird, und stellt somit eine gute Zielstruktur f��r immuntherapeutische Ans��tze dar. rnInnerhalb der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkmechanismen eines neuen bispezifischen Antik��rpers, der gegen humanes MCSP und CD3 auf T-Zellen gerichtet ist, in vitro und im humanisierten Tumormausmodell in vivo untersucht. In humanen T Zellkokulturen induzierte der bispezifische MCSP-CD3 Antik��rper in Gegenwart MCSP-positiver Melanomzellen konzentrationsabh��ngige T-Zellaktivierung, Sekretion von Zytokinen und effiziente Tumorzelllyse durch CD4- und CD8-positive T-Zellen. Die induzierte Lyse war hierbei unabh��ngig von der T-Zellrezeptorspezifit��t sowie kostimulatorischen Molek��len und allein abh��ngig von der Expression des Tumorantigens sowie CD3 auf den T-Zellen. Wie hier diskutiert, liegt es nahe, dass die Freisetzung lytischer Molek��le (Perforin und Granzym-B) durch CD8- und auch CD4 positiver T-Zellen den Hauptmechanismus in der Lyse der Melanomzellen darstellt. rnUm die Wirksamkeit in vivo testen zu k��nnen, wurde ein humanisiertes Tumormausmodell etabliert. Die Injektion humaner h��matopoetischer Stammzellen in neugeborene Rag2-/-gc-/- M��use f��hrte zur Entwicklung funktioneller T-Zellen im murinen Thymus, welche lymphatische Organe besiedelten. In vitro induzierten die T-Zellen humanisierter M��use in Anwesenheit des bispezifischen MCSP-CD3 Antik��rpers ebenfalls konzentrationsabh��ngige Lyse der Melanomzellen. Wie hier gezeigt, induzierte die Injektion humaner Melanomzellen in humanisierte M��use keine messbare Absto��ungsreaktion. Unter Behandlung mit MCSP-CD3 wurde zwar eine erh��hte Anzahl humaner T-Zellen im Tumorgewebe nachgewiesen, jedoch verf��gte die verwendete Melanomzelllinie ��ber eine geringe basale T Zellinfiltration, geringe Vaskularisierung und ein nodul��res Wachstumsverhalten. Wie innerhalb dieser Arbeit diskutiert, kann durch die Kombination mit Therapien, die eine erh��hte T-Zellinfiltration in das Tumorgewebe erm��glichen, die Wirksamkeit von bispezifischen Antik��rpern m��glicherweise gesteigert werden. rn

Molekulare Charakterisierung der Il-9-Genexpression in T-Helfer-Typ-9-Zellen

CD4+ T-Zellen k��nnen in verschiedene T-Helferzellsubpopulationen differenzieren. Dabei h��ngt es von verschiedensten Milieubedingungen ab, welche Subpopulation sich auspr��gt, damit die CD4+ T-Zelle durch die Sekretion verschiedenster Zytokine ihre Funktion im Immunsystem wahrnehmen kann.rnBei der Th9-Subpopulation handelt es sich um einen IL-9-produzierenden Ph��notyp, welcher sich in der Anwesenheit von TGF-�� und IL-4 entwickelt39. Als treibender Transkriptionsfaktor f��r diese Subpopulation wurde das Protein IRF4 beschrieben45. Da dieser Transkriptionsfaktor auch f��r die Differenzierung weiterer Subpopulationen, wie Th2- und Th17-Zellen von Bedeutung ist30,121, stellte sich die Frage, welcher Interaktionspartner von IRF4 dar��ber entscheidet, welcher Subtyp sich entwickelt. Deshalb wurde in dieser Arbeit der Transkriptionsfaktor NFATc2 als m��glicher Interaktionspartner f��r IRF4 am murinen Il9 Promotor untersucht. Allerdings zeigten Reportergen��analysen, dass NFATc2 die IL-9-Produktion in Th9-Zellen inhibiert anstatt sie zu f��rdern. Th9-Zellen aus NFATc2-defizienten Tieren zeigen folglich im Vergleich zu wildtypischen Th9-Zellen sowohl nach Prim��r- als auch nach Restimulation eine verst��rkte IL-9-Produktion. Der Faktor NFATc2 kann somit als transkriptioneller Aktivator f��r die IL-9-Expression in Th9-Zellen ausgeschlossen werden. In vivo wurden diese Beobachtungen dadurch untermauert, dass NFATc2-defiziente Tiere im Rahmen des Asthma bronchiale zu einer verst��rkten pulmonalen Inflammation neigen und auch einen erh��hten Atemwegswiderstand nach Methacholin-Provokation aufweisen. Diese asthmatischen Symptome konnten durch Applikation eines neutralisierenden Antik��rpers f��r IL-9 wesentlich gemildert werden. In einem B16F10-Melanommodell konnten NFATc2-defiziente Tiere gegen��ber dem Wildtyp eine verbesserte anti-Tumorantwort auspr��gen. Nach Gabe eines IL-9-neutralisierenden Antik��rpers, wurde dieser Effekt wiederum gemildert.rnZusammenfassend l��sst sich sagen, dass IRF4 nicht mit NFATc2 am murinen Il9 Promotor interagiert, um die IL-9-Expression in Th9-Zellen zu f��rdern. Eine NFATc2-Defizienz resultiert sogar in einer gesteigerten IL-9-Produktion, womit ein inhibitorischer Einfluss von NFATc2 in Bezug auf die IL-9-Expression in Th9-Zellen nachgewiesen werden konnte.rn

Detrimental effects of exuberant and restrained immune responses against the central nervous system in the context of multiple sclerosis and glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most aggressive astrocytic tumor of the central nervous system (CNS) in adults. The standard treatment consisting of surgery, followed by a combinatorial radio- and chemotherapy, is only palliative and prolongs patient median survival to 12 to 15 months. The tumor subpopulation of stem cell-like glioma-initiating cells (GICs) shows resistance against radiation as well as chemotherapy, and has been suggested to be responsible for relapses of more aggressive tumors after therapy. The efficacy of immunotherapies, which exploit the immune system to specifically recognize and eliminate malignant cells, is limited due to strong immunosuppressive activities of the GICs and the generation of a specialized protective microenvironment. The molecular mechanisms underlying the therapy resistance of GICs are largely unknown. rnThe first aim of this study was to identify immune evasion mechanisms in GICs triggered by radiation. A model was used in which patient-derived GICs were treated in vitro with fractionated ionizing radiation (2.5 Gy in 7 consecutive passages) to select for a more radio-resistant phenotype. In the model cell line 1080, this selection process resulted in increased proliferative but diminished migratory capacities in comparison to untreated control GICs. Furthermore, radio-selected GICs downregulated various proteins involved in antigen processing and presentation, resulting in decreased expression of MHC class I molecules on the cellular surface and diminished recognition potential by cytotoxic CD8+ T cells. Thus, sub-lethal fractionated radiation can promote immune evasion and hamper the success of adjuvant immunotherapy. Among several immune-associated proteins, interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3) was found to be upregulated in radio-selected GICs. While high expression of IFITM3 was associated with a worse overall survival of GBM patients (TCGA database) and increased proliferation and migration of differentiated glioma cell lines, a strong contribution of IFITM3 to proliferation in vitro as well as tumor growth and invasiveness in a xenograft model could not be observed. rnMultiple sclerosis (MS) is the most common autoimmune disease of the CNS in young adults of the Western World, which leads to progressive disability in genetically susceptible individuals, possibly triggered by environmental factors. It is assumed that self-reactive, myelin-specific T helper cell 1 (Th1) and Th17 cells, which have escaped the control mechanisms of the immune system, are critical in the pathogenesis of the human disease and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). It was observed that in vitro differentiated interleukin 17 (IL-17) producing Th17 cells co-expressed the Th1-phenotypic cytokine Interferon-gamma (IFN-��) in combination with the two respective lineage-associated transcription factors ROR��t and T-bet after re-isolation from the CNS of diseased mice. Pathogenic molecular mechanisms that render a CD4+ T cell encephalitogenic have scarcely been investigated up to date. rnIn the second part of the thesis, whole transcriptional changes occurring in in vitro differentiated Th17 cells in the course of EAE were analyzed. Evaluation of signaling networks revealed an overrepresentation of genes involved in communication between the innate and adaptive immune system and metabolic alterations including cholesterol biosynthesis. The transcription factors Cebpa, Fos, Klf4, Nfatc1 and Spi1, associated with thymocyte development and na��ve T cells were upregulated in encephalitogenic CNS-isolated CD4+ T cells, proposing a contribution to T cell plasticity. Correlation of the murine T-cell gene expression dataset to putative MS risk genes, which were selected based on their proximity (�� 500 kb; ensembl database, release 75) to the MS risk single nucleotide polymorphisms (SNPs) proposed by the most recent multiple sclerosis GWAS in 2011, revealed that 67.3% of the MS risk genes were differentially expressed in EAE. Expression patterns of Bach2, Il2ra, Irf8, Mertk, Odf3b, Plek, Rgs1, Slc30a7, and Thada were confirmed in independent experiments, suggesting a contribution to T cell pathogenicity. Functional analysis of Nfatc1 revealed that Nfatc1-deficient CD4+ T cells were restrained in their ability to induce clinical signs of EAE. Nfatc1-deficiency allowed proper T cell activation, but diminished their potential to fully differentiate into Th17 cells and to express high amounts of lineage cytokines. As the inducible Nfatc1/��A transcript is distinct from the other family members, it could represent an interesting target for therapeutic intervention in MS.rn

Analyse der T-Zellkreuzreaktivit��t bei Birkenpollenallergikern mit assoziierter Nahrungsmittelallergie

Eine Pollenallergie geht h��ufig mit einer sekund��ren Nahrungsmittelallergie einher, die durch die Kreuzreaktivit��t zwischen dem Pollen- und dem Nahrungsmittelallergen verursacht wird. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Kohorte von 20 Allergikern mit einer Typ I-Allergie gegen Birkenpollen und einer assoziierten Nahrungsmittelallergie gegen Haseln��sse und/oder Karotten in Bezug auf eine allergenspezifische IgE-Antwort, T-Zellantwort und vor allen Dingen hinsichtlich der T-Zellkreuzreaktivit��t zwischen den rekombinanten Allergenen Bet v 1, Cor a 1 und Dau c 1 charakterisiert. Verwendet wurde hierzu ein Zellkultursystem mit prim��ren CD4+ T-Zellen ohne die Zugabe von exogenem IL-2 oder wiederholten Stimulationen. Zur Analyse der T-Zellkreuzreaktivit��t kamen zwei unterschiedliche Analyseverfahren zum Einsatz: zum einen der bew��hrte 3H-Thymidinassay und zum anderen eine neue durchflusszytometrische Methode, die auf der Verwendung von zwei unterschiedlichen Proliferationsfarbstoffen basiert.rnBei der Charakterisierung der T-Zellantwort konnte festgestellt werden, dass eine robuste Th2-Antwort vorliegt, die stark von dem Zytokin IL-5 dominiert wird, begleitet von einer signifikanten Produktion von IL-9 und IL-13, allerdings ohne die Beteiligung von IL-4.rnDes Weiteren konnte zum ersten Mal mit Hilfe eines dosisabh��ngigen Inhibitions-ELISA eine B-Zellkreuzreaktivit��t zwischen Bet v 1 und Cor a 1 gezeigt werden, wobei das Cor a 1-reaktive IgE pr��dominant ist und eine Subpopulation des Bet v 1-reaktiven IgE darstellt.rnMittels 3H-Thymidinassay konnte eine T-Zellkreuzreaktivit��t zwischen Bet v 1, Cor a 1 und in einem geringeren Ma��e zu Dau c 1 bei prim��ren T-Zellen von Allergikern gezeigt werden. Ebenso konnte die Kreuzreaktivit��t zwischen Bet v 1 und Cor a 1 durch die neue durchflusszytometrische Methode bewiesen werden. Zus��tzlich ist es mit Hilfe dieser neuen Methode nun m��glich, zwischen den einzelnen T-Zellsubpopulationen zu unterscheiden, die sowohl nach prim��rer und sekund��rer oder ausschlie��lich nach sekund��rer Stimulation proliferieren. Es konnte festgestellt werden, dass die kreuzreaktiven T-Zellen aus der T-Zellsubpopulation hervorgehen, die bereits nach der prim��ren Stimulations stark proliferiert haben. Somit kann also innerhalb des T-Zellrepertoires der allergischen Spender eine Pr��dominanz der kreuzreaktiven T-Zellsubpopulationen festgestellt werden. Eine monospezifische T-Zellsubpopulation konnte unter Verwendung der neuen Methode nicht detektiert werden.rnDas Ausma�� von Qualit��t und Quantit��t einer Kreuzreaktivit��t kann nun visualisiert werden, was dazu beitragen kann, das Protokoll einer SIT zu verbessern und optimal an den individuellen Patienten anzupassen, um m��glicherweise eine gr����ere Chance auf eine erfolgreiche Therapie in Aussicht zu stellen.

Einfluss des Treg-Aktivierungsmarkers GARP auf die Differenzierung und Funktion von T-Zellen

CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine essentielle Rolle bei der Unterdr��ckung von sch��dlichen Immunreaktionen. Da aktivierte CD4+ T-Helferzellen auch CD25 und FoxP3 exprimieren, k��nnen diese nicht als spezifische Marker zur Identifikation von Treg verwendet werden. Die Analyse der Membranproteinexpression beider Populationen f��hrte zur Identifikation von GARP (glycoprotein A repetitions predominant) als spezifischer Marker auf aktivierten Treg. GARP bindet LAP und TGF-beta, welches f��r die Unterdr��ckung von entz��ndlichen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Um die Funktion von GARP unabh��ngig von Treg zu untersuchen, wurde ein l��sliches GARP Protein (sGARP) synthetisiert und sein Effekt auf die Aktivierung und Differenzierung von humanen T-Zellen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass sGARP die Proliferation von naiven CD4+ T-Zellen supprimiert und zu einer Phosphorylierung von SMAD2/3 sowie zu der Induktion von FoxP3 f��hrt. Zus��tzlich inhibiert sGARP die Produktion von Effektorzytokinen wie IL-2 und IFN-gamma. Die Stimulation von naiven CD4+ T-Zellen mit sGARP induziert die Differenzierung zu Treg, welche in Kokultur die Aktivierung von T-Effektorzellen supprimieren. Die Wirkung war vergleichbar in naiven CD4+ und ruhenden CD4+CD45RA+ T-Zellen, konnte aber in differenzierten CD4+CD45RO+ T-Zellen nicht nachgewiesen werden. Die Induktion von FoxP3 und die Phosphorylierung von SMAD2/3 konnte durch eine Blockade des TGF-beta-Signalweges inhibiert werden. Dies l��sst vermuten, dass die Funktion von sGARP zumindest teilweise von TGF-beta abh��ngig ist. Zus��tzlich zu seiner passiven Rolle als TGF-beta-Transporter, induzierte sGARP die TGF-beta-Produktion in naiven T-Zellen und tr��gt so zum Mechanismus der infekti��sen Toleranz bei. Des Weiteren f��rdert die Stimulation von sGARP in Anwesenheit von IL-6 und IL-23 die Differenzierung zu Th17 Zellen. rnNeben dem Einfluss von sGARP auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, supprimiert sGARP die Proliferation und Granzyme B-Expression in CD8+ T-Zellen. rnF��r die Analyse der immunmodulatorischen Funktion von sGARP in vivo wurde ein Modell einer xenogenen GvHD (graft-versus-host disease) verwendet. Der Transfer von humanen PBMC in neugeborene, immundefiziente Rag2-/-gamma-chain-/--M��use f��hrt zu einer letalen GvHD, welche durch die Applikation von humanen Treg dosisabh��ngig unterdr��ckt werden kann. In diesem Modell konnte die repetitive Gabe von sGARP, ohne zus��tzliche Zugabe von Treg, ebenfalls die GvHD unterdr��cken. Dies l��sst auf einen synergistischen Effekt von sGARP und Treg bei der Suppression inflammatorischer T-Zellantworten schlie��en. rnZusammengefasst lassen die Ergebnisse auf eine entscheidende Rolle von GARP in der Modulation der peripheren Toleranz folgern und zeigen sGARP als potentes Biological f��r die Behandlung von unerw��nschten inflammatorischen Immunantworten.

Induktion tolerogener dendritischer Zellen zur Suppression von experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis und Kontaktallergie

Dendritische Zellen (DC) spielen als professionelle antigenpr��sentierende Zellen (APC) eine zentrale Rolle in der Aktivierung und Regulierung antigenspezifischer Immunantworten. Aus diesem Grund wird der therapeutische Einsatz von DC zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien sowie zur Tumorbek��mpfung erforscht. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit untersuchten wir das Potenzial einer biolistischen DNA-Vakzinierung zur Induktion tolerogener DC in vivo. Im Tiermodell der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein Peptid 35-55 (MOGp35-55) induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) sollte mittels pr��ventiver biolistischer Kovakzinierung von Plasmid-DNA kodierend f��r MOG und die immunregulatorischen Zytokine TGF�� oder IL-10 eine protektive Immunit��t induziert werden. Die MOG-Expression stand dabei entweder unter der Kontrolle des ubiquit��r aktiven CMV-Promotors oder des murinen Fascin-Promotors, um eine ektopische MOG-Expression spezifisch in dermalen DC und Langerhanszellen zu erreichen. Dass MOGp35-55-pr��sentierende DC nach biolistischer DNA-Vakzinierung von der Haut in die drainierenden Lymphknoten migrieren und dort T-Zellen aktivieren, konnte im Vorfeld anhand einer substanziellen Proliferation von MOGp35-55-reaktiven 2D2 T-Zellen nachgewiesen werden. Im pr��ventiven Ansatz der MOGp35-55-induzierten EAE zeigten M��use, die mit MOG-kodierenden Plasmiden biolistisch transfiziert wurden, eine leicht reduzierte EAE-Symptomatik. Die Kotransfektion von MOG und TGF�� f��hrte zu einer Verst��rkung der EAE-Suppression ��� unabh��ngig davon, ob die MOG-Expression unter der Kontrolle des CMV- oder des Fascin-Promotors stand. Interessanterweise resultierte die Koapplikation von MOG- und IL-10-kodierender Plasmid-DNA nur bei DC-fokussierter MOG-Expression zu reduzierter EAE-Symptomatik. F��r biolistische DNA-Vakzinierungen stellt somit der Fascin-Promotor eine potente Alternative zu viralen Promotoren dar. Entsprechend der milderen EAE-Symptome beobachteten wir bei behandelten EAE-M��usen einen geringeren Grad an Demyelinisierung sowie eine reduzierte Infiltration des ZNS mit IFN��-produzierenden CD4+ Th1- und IL-17-produzierenden CD4+ Th17-Zellen. Desweiteren zeigten Milzzellen ex vivo nach MOGp35-55-Restimulation eine inhibierte Proliferation und eine signifikant reduzierte IFN��- und IL-17-Zytokinproduktion. ��berraschenderweise ging die antigenspezifische Immunsuppression nicht mit der Expansion von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen einher. Da die Milzen aber erh��hte Mengen an CD8+IFN��+ T-Zellen aufweisen, k��nnte ein zytotoxisch-suppressiver Mechanismus f��r die Inhibition der Th1- und Th17-Immunantwort verantwortlich sein. Nachfolgende Untersuchungen sind notwendig, um die induzierten immunologischen Mechansimen mittels biolistischer DNA-Vakzinierung aufzukl��ren. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Generierung von tolerogenen DC in vitro. Daf��r wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen in Gegenwart des synthetischen Glucocorticoids Dexamethason (DEX) kultiviert. Die DEX-Zugabe f��hrte zur Differenzierung von APC mit geringer CD11c-Expression. DEX-APC waren in vitro weitestgehend gegen LPS stimulierungsresistent und zeigten eine reduzierte Expression von MHC-II und den kostimulatorischen Molek��len CD80, CD86 und CD40. Ihrem tolerogenen Ph��notyp entsprechend besa��en DEX-APC ein geringeres syngenes T-Zellstimulierungspotenzial als unbehandelte BM-DC. Anhand der erh��hten Oberfl��chenexpression von CD11b, GR1 und F4/80 besteht eine ph��notypische ��hnlichkeit zu myeloiden Suppressorzellen. Die F��higkeit von DEX-APC in vivo antigenspezifische Toleranz zu induzieren, wurde durch einen therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie ��berpr��ft. Die therapeutische Applikation von DEX-APC f��hrte hierbei im Vergleich zur Applikation von PBS oder unbehandelten BM-DC zu einer signifikant reduzierten Ohrschwellungsreaktion. Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Arbeit, dass potente tolerogene DC sowohl in vivo als auch in vitro induziert werden k��nnen. Dass diese Zellpopulation effektiv antigenspezifische Immunreaktionen supprimieren kann, macht sie zu einem vielversprechenden Werkzeug in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien.rn

Erkennung der alpha-Kette des GM-CSF-Rezeptors (CSF2RA) durch einen HLA-unabh��ngigen alpha:beta-T-Zellrezeptor

Aus dem tumorreaktiven T-Zellrepertoire der Melanompatientin Ma-Mel-86/INTH, bei der im Verlauf Lymphknotenmetastasen HLA-Klasse I-negativer Tumorzellen auftraten, wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen CD8+ T-Zellklone isoliert und expandiert, die auf Melanomzellen der Patientin CSF2RA (engl. GM-CSF receptor alpha chain) in HLA-unabh��ngiger Weise erkannten. Aus einem der T-Zellklone wurde ein CSF2RA-reaktiver ��:��-T-Zellrezeptor (TCR, engl. T-cell receptor) kloniert (Bezeichnung: TCR-1A.3/46). Die ��-Kette des TCR enthielt die Dom��nen TRAV14/DV4*01, TRAJ48*01 und TRAC*01, die ��-Kette die Dom��nen TRBV10-3*01, TRBD2*01, TRBJ2-7*01 und TRBC2*01. Durch Austausch der humanen konstanten gegen die homologen murinen Dom��nen wurde der TCR optimiert (Bezeichnung: cTCR-1A.3/46) und hinsichtlich seiner Expression und Funktionalit��t nach retroviralem Transfer in humane PBMC (engl. peripheral blood mononuclear cells) im 51Chromfreisetzungstest, im IFN-��-ELISpot-Assay und in einem Degranulations-Assay validiert. TCR-transgene T-Zellen lysierten nicht nur spezifisch die HLA-defizienten, CSF2RA+ Melanomlinien des Modells Ma-Mel-86, sondern erkannten auch Zelllinien verschiedener Spezies nach Transfektion von CSF2RA sowie Monozyten, Granulozyten, dendritische Zellen und ein breites Spektrum h��matologischer Malignome myeloiden Ursprungs ungeachtet deren HLA-Ph��notypen. Lymphatische Zellen sowie CD34+ Blutstammzellen wurden in In vitro-Untersuchungen nicht erkannt. Der Zusatz von GM-CSF zu Zellen, die CSF2RA und CSF2RB exprimierten, inhibierte die Erkennung durch TCR-transgene PBMC, w��hrend die Koexpression der ��- und der ��-Kette des GM-CSF-Rezeptors alleine keinen negativen Effekt auf die Erkennung hatte. Daraus war zu schlie��en, dass CSF2RA pr��ferentiell freistehend und weniger nach Integration in den heteromultimerischen GM-CSF-Rezeptor-Komplex erkannt wurde. In der zweidimensionalen Collier-de-Perles-Visualisierung der IMGT-Datenbank (engl. International immunogenetics information system) wies der CSF2RA-reaktive TCR-1A.3/46 im Vergleich zu TCR von konventionellen, HLA-restringierten T-Zellen keine Besonderheiten auf. Dar��ber hinaus waren auch die von den HLA-unabh��ngigen T-Zellen exprimierten CD8-Molek��le identisch zu den CD8-Molek��len HLA-abh��ngiger CTL (engl. cytotoxic T lymphocytes). Die Pr��senz von CD8-Molek��len f��rderte die HLA-unabh��ngige Erkennung von CSF2RA, schien aber daf��r nicht zwingend erforderlich zu sein, da Antik��rper gegen CD8 die Erkennung zu ca. 65 % blockierten und TCR-transgene CD4+ T-Zellen im Vergleich zu TCR-transduzierten CD8+ T-Zellen eine deutlich verringerte, aber noch erhaltene Funktionalit��t aufwiesen. Es ist derzeit nicht klar, ob HLA-unabh��ngige T-Zellen gegen CSF2RA im peripheren Blut der Patientin vorkamen, weil sie der im Tiermodell postulierten Thymusselektion MHC-unabh��ngiger TCR (Tikhonova et al., Immunity 36:79, 2012) entkommen waren, oder weil ein urspr��nglich gegen einen HLA-Peptid-Komplex gerichteter TCR eine HLA-unabh��ngige Kreuzreaktivit��t aufwies. CSF2RA verbessert die Glucoseutilisation in malignen Zellen, und es wurden ihm embryotrophe Eigenschaften zugeschrieben (Spielholz et al., Blood 85:973, 1995; Sj��blom et al., Biol. Reprod. 67:1817, 2002). Damit kann CSF2RA malignes Wachstum f��rdern und ist somit ein potentielles Zielmolek��l f��r die Immuntherapie. Seine HLA-unabh��ngige Erkennung w��rde sowohl die HLA-Vielfalt als auch den HLA-Verlust als typische Limitationen der T-Zellimmuntherapie umgehen. Zur ��berpr��fung der In vivo-Spezifit��t des HLA-unabh��ngigen TCR gegen CSF2RA und damit zum Ausschluss relevanter off-tumor-/on-target- bzw. off-tumor-/off-target-Effekte ist jedoch eine Testung in einem pr��klinischen Tiermodell erforderlich.

Improving adoptive T cell therapies of cancer by ectopic expression of miR181a to repress inhibitory phosphatases

Adoptive T cell therapy using antigen-specific T lymphocytes is a powerful immunotherapeutic approach against cancer. Nevertheless, many T cells against tumor-antigens exhibit only weak anti-tumoral response. To overcome this barrier it is necessary to improve the potency and anti-tumoral efficacy of these T cells. Activation and activity of T cells are tightly controlled to inhibit unwanted T cell responses and to reduce the risk of autoimmunity. Both are regulated by extrinsic signals and intrinsic mechanisms which suppress T cell activation. The intrinsic mechanisms include the expression of phosphatases that counteract the activation-inducing kinases. Modifying the expression of these phosphatases allows the targeted modulation of T cell reactivity. MicroRNAs (miRNAs) are regulatory small noncoding RNA molecules that control gene expression by targeting messenger RNAs in a sequence specific manner. Gene-specific silencing plays a key role in diverse biological processes, such as development, differentiation, and functionality. miR181a has been shown to be highly expressed in immature T cells that recognize low-affinity antigens.rnThe present study successfully shows that ectopic expression of miR181a is able to enhance the sensitivity of both murine and human T cells. In CD4+ T helper cells as well as in CD8+ cytotoxic T cells the overexpression of miR181a leads to downregulation of multiple phosphatases involved in the T cell receptor signaling pathway. Overexpression of miR181a in human T cells achieves a co-stimulatory independent activation and has an anti-apoptotic effect on CD4+ T helper cells. Additionally, increasing the amount of miR181a enhances the cytolytic activity of murine CD8+ TCRtg T cells in an antigen-specific manner.rnTo test miR181a overexpressing T cells in vivo, a mouse tumor model using a B cell lymphoma cell line (A20-HA) expressing the Influenza hemagglutinin (Infl.-HA) antigen was established. The expression of model antigens in tumor cell lines enables targeted elimination of tumors using TCRtg T cells. The transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells alone has no positive effect neither on tumor control nor on survival of A20-HA tumor-bearing mice. In contrast, the co-transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ and CD4+ T cells leads to improved tumor control and prolongs survival of A20-HA tumor-bearing mice. This effect is characterized by higher amounts of effector T cells and the expansion of Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells.rnAll effects were achieved by changes in expression of several genes including molecules involved in T cell differentiation, activation, and regulation, cytotoxic effector molecules, and receptors important for the homing process of T cells in miR181a overexpressing T cells. The present study demonstrates that miR181a is able to enhance the anti-tumoral response of antigen-specific T cells and is a promising candidate for improving adoptive cell therapy.

Individualisierte Krebstherapie : pr��klinischer ���proof of concept��� einer mutationsspezifischen Immuntherapie

Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das ver��nderte Proteinprodukt vom Immunsystem als ���fremd��� erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen f��r die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore k��nnen individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu kl��ren, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenit��t zu testen. F��r diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer L��nge von 27 Aminos��uren genutzt, in denen die mutierte Aminos��ure zentral positioniert war. Durch die L��nge der Peptide k��nnen prinzipiell alle m��glichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver M��use sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabh��ngigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgef��hrt. Die Immunph��notypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivit��t induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien best��tigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen k��nnen. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 best��tigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rn��beraschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabh��ngigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop f��r das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt n��her zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erh��hte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der fr��hen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien best��tigt. Daran anschlie��end wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-�� ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-�� sekretieren. Dass diese spezifische IFN-�� Aussch��ttung f��r den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-�� -/- K.O. M��usen best��tigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von ���escape���-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die f��r ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren k��nnen. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivit��ten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es m��glich ist, unabh��ngig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit pr��klinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen f��r die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. ��berraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabsto��ungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn

Cellular immune responses to HCV core increase and HCV RNA levels decrease during successful antiretroviral therapy

Background Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of morbidity in HIV infected individuals. Coinfection with HIV is associated with diminished HCV-specific immune responses and higher HCV RNA levels. Aims To investigate whether long-term combination antiretroviral therapy (cART) restores HCV-specific T cell responses and improves the control of HCV replication. Methods T cell responses were evaluated longitudinally in 80 HIV/HCV coinfected individuals by ex vivo interferon-��-ELISpot responses to HCV core peptides, that predominantly stimulate CD4+ T cells. HCV RNA levels were assessed by real-time PCR in 114 individuals. Results The proportion of individuals with detectable T cell responses to HCV core peptides was 19% before starting cART, 24% in the first year on cART and increased significantly to 45% and 49% after 33 and 70���months on cART (p=0.001). HCV-specific immune responses increased in individuals with chronic (+31%) and spontaneously cleared HCV infection (+30%). Median HCV RNA levels before starting cART were 6.5 log10 IU/ml. During long-term cART, median HCV-RNA levels slightly decreased compared to pre-cART levels (���0.3 log10 IU/ml, p=0.02). Conclusions Successful cART is associated with increasing cellular immune responses to HCV core peptides and with a slight long-term decrease in HCV RNA levels. These findings are in line with the favourable clinical effects of cART on the natural history of hepatitis C and with the current recommendation to start cART earlier in HCV/HIV coinfected individuals.

Narcolepsy: autoimmunity, effector T cell activation due to infection, or T cell independent, major histocompatibility complex class II induced neuronal loss?

Human narcolepsy with cataplexy is a neurological disorder, which develops due to a deficiency in hypocretin producing neurons in the hypothalamus. There is a strong association with human leucocyte antigens HLA-DR2 and HLA-DQB1*0602. The disease typically starts in adolescence. Recent developments in narcolepsy research support the hypothesis of narcolepsy being an immune-mediated disease. Narcolepsy is associated with polymorphisms of the genes encoding T cell receptor alpha chain, tumour necrosis factor alpha and tumour necrosis factor receptor II. Moreover the rate of streptococcal infection is increased at onset of narcolepsy. The hallmarks of anti-self reactions in the tissue--namely upregulation of major histocompatibility antigens and lymphocyte infiltrates--are missing in the hypothalamus. These findings are questionable because they were obtained by analyses performed many years after onset of disease. In some patients with narcolepsy autoantibodies to Tribbles homolog 2, which is expressed by hypocretin neurons, have been detected recently. Immune-mediated destruction of hypocretin producing neurons may be mediated by microglia/macrophages that become activated either by autoantigen specific CD4(+) T cells or superantigen stimulated CD8(+) T cells, or independent of T cells by activation of DQB1*0602 signalling. Activation of microglia and macrophages may lead to the release of neurotoxic molecules such as quinolinic acid, which has been shown to cause selective destruction of hypocretin neurons in the hypothalamus.

Comparative analysis of four lipoproteins from Mycoplasma mycoides subsp. mycoides Small Colony identifies LppA as a major T-cell antigen

Control of contagious bovine pleuropneumonia (CBPP), caused by Mycoplasma mycoides subsp. mycoides Small Colony (MmmSC), remains an important goal in Africa. Subunit vaccines triggering B and T-cell responses could represent a promising approach. To this aim, the T-cell immunogenicity of four MmmSC lipoproteins (LppA, LppB, LppC and LppQ), present in African strains and able to elicit humoral response, was evaluated. In vitro assays revealed that only LppA was recognized by lymph node lymphocytes taken from three cattle, 3 weeks after MmmSC exposure. Maintenance of the LppA-specific response, relying on CD4 T-cells and IFN gamma production, was then demonstrated 1 year after infection. LppA is thus an important target for the CD4 T-cells generated early after MmmSC infection and persisting in the lymph nodes of recovered cattle. Its role as a protective antigen and ability to in vivo trigger both arms of the host immune response remain to be evaluated.

Low levels of mannan-binding lectin or ficolins are not associated with an increased risk of cytomegalovirus disease in HIV-infected patients

Background In HIV-infected patients, prediction of Cytomegalovirus (CMV) disease remains difficult. A protective role of mannan-binding lectin (MBL) and ficolins against CMV disease has been reported after transplantation, but the impact in HIV-infected patients is unclear. Methods In a case-control study nested within the Swiss HIV Cohort Study, we investigated associations between plasma levels of MBL/ficolins and CMV disease. We compared HIV-infected patients with CMV disease (cases) to CMV-seropositive patients without CMV disease (controls) matched for CD4 T-cells, sampling time, and use of combination antiretroviral therapy. MBL and M-ficolin, L-ficolin, and H-ficolin were quantified using ELISA. Results We analysed 105 cases and 105 matched controls. CMV disease was neither associated with MBL (odds ratio [OR] 1.03 per log10 ng/mL increase (95% CI 0.73���1.45)) nor with ficolins (OR per log10 ng/mL increase 0.66 (95% CI 0.28���1.52), 2.34 (95% CI 0.44���12.36), and 0.89 (95% CI 0.26���3.03) for M-ficolin, L-ficolin, and H-ficolin, respectively). We found no evidence of a greater association between MBL and CMV disease in patients with low CD4 counts; however in the multivariable analysis, CMV disease was more likely in patients with an increased HIV RNA (OR 1.53 per log10 copies/mL; 95% CI 1.08���2.16), or a shorter duration of HIV-infection (OR 0.91 per year; 95% CI 0.84���0.98). Conclusions CMV disease is not associated with low levels of MBL/ficolins, suggesting a lack of a protective role in HIV-infected patients.

Role of retroviral restriction factors in the interferon-��-mediated suppression of HIV-1 in vivo

The antiviral potency of the cytokine IFN-�� has been long appreciated but remains poorly understood. A number of studies have suggested that induction of the apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide 3 (APOBEC3) and bone marrow stromal cell antigen 2 (BST-2/tetherin/CD317) retroviral restriction factors underlies the IFN-��-mediated suppression of HIV-1 replication in vitro. We sought to characterize the as-yet-undefined relationship between IFN-�� treatment, retroviral restriction factors, and HIV-1 in vivo. APOBEC3G, APOBEC3F, and BST-2 expression levels were measured in HIV/hepatitis C virus (HCV)-coinfected, antiretroviral therapy-na��ve individuals before, during, and after pegylated IFN-��/ribavirin (IFN-��/riba) combination therapy. IFN-��/riba therapy decreased HIV-1 viral load by -0.921 (��0.858) log(10) copies/mL in HIV/HCV-coinfected patients. APOBEC3G/3F and BST-2 mRNA expression was significantly elevated during IFN-��/riba treatment in patient-derived CD4+ T cells (P < 0.04 and P < 0.008, paired Wilcoxon), and extent of BST-2 induction was correlated with reduction in HIV-1 viral load during treatment (P < 0.05, Pearson's r). APOBEC3 induction during treatment was correlated with degree of viral hypermutation (P < 0.03, Spearman's ��), and evolution of the HIV-1 accessory protein viral protein U (Vpu) during IFN-��/riba treatment was suggestive of increased BST-2-mediated selection pressure. These data suggest that host restriction factors play a critical role in the antiretroviral capacity of IFN-�� in vivo, and warrant investigation into therapeutic strategies that specifically enhance the expression of these intrinsic immune factors in HIV-1-infected individuals.