Inactive endosialidase-based detection of bacterial and oncofetal polysialic acid

Polysialic acid is a carbohydrate polymer which consist of N-acetylneuraminic acid units joined by alpha2,8-linkages. It is developmentally regulated and has an important role during normal neuronal development. In adults, it participates in complex neurological processes, such as memory, neural plasticity, tumor cell growth and metastasis. Polysialic acid also constitutes the capsule of some meningitis and sepsis-causing bacteria, such as Escherichia coli K1, group B meningococci, Mannheimia haemolytica A2 and Moraxella nonliquefaciens. Polysialic acid is poorly immunogenic; therefore high affinity antibodies against it are difficult to prepare, thus specific and fast detection methods are needed. Endosialidase is an enzyme derived from the E. coli K1 bacteriophage, which specifically recognizes and degrades polysialic acid. In this study, a novel detection method for polysialic acid was developed based on a fusion protein of inactive endosialidase and the green fluorescent protein. It utilizes the ability of the mutant, inactive endosialidase to bind but not cleave polysialic acid. Sequencing of the endosialidase gene revealed that amino acid substitutions near the active site of the enzyme differentiate the active and inactive forms of the enzyme. The fusion protein was applied for the detection of polysialic acid in bacteria and neuroblastoma. The results indicate that the fusion protein is a fast, sensitive and specific reagent for the detection of polysialic acid. The use of an inactive enzyme as a specific molecular tool for the detection of its substrate represents an approach which could potentially find wide applicability in the specific detection of diverse macromolecules.

N-terminal amino acids of bovine alpha interferons are relevant for the neutralization of their antiviral activity

The structure-function relationship of interferons (IFNs) has been studied by epitope mapping. Epitopes of bovine IFNs, however, are practically unknown, despite their importance in virus infections and in the maternal recognition of pregnancy. It has been shown that recombinant bovine (rBo)IFN-alphaC and rBoIFN-alpha1 differ only in 12 amino acids and that the F12 monoclonal antibody (mAb) binds to a linear sequence of residues 10 to 34. We show here that the antiviral activities of these two IFNs were neutralized by the F12 mAb to different extents using two tests. In residual activity tests the antiviral activity dropped by more than 99% with rBoIFN-alphaC and by 84% with rBoIFN-alpha1. In checkerboard antibody titrations, the F12 mAb titer was 12,000 with rBoIFN-alphaC and only 600 with rBoIFN-alpha1. Since these IFNs differ in their amino acid sequence at positions 11, 16 and 19 of the amino terminus, only these amino acids could account for the different neutralization titers, and they should participate in antibody binding. According to the three-dimensional structure described for human and murine IFNs, these amino acids are located in the alpha helix A; amino acids 16 and 19 of the bovine IFNs would be expected to be exposed and could bind to the antibody directly. The amino acid at position 11 forms a hydrogen bond in human IFNs-alpha and it is possible that, in bovine IFNs-alpha, the F12 mAb, binding near position 11, would disturb this hydrogen bond, resulting in the difference in the extent of neutralization observed.

Characterization of ß-trypsin at acid pH by differential scanning calorimetry

Trypsin is a serino-protease with a polypeptide chain of 223 amino acid residues and contains six disulfide bridges. It is a globular protein with a predominance of antiparallel ß-sheet and helix in its secondary structure and has two domains with similar structures. We assessed the stability of ß-trypsin in the acid pH range using microcalorimetric (differential scanning calorimetry) techniques. Protein concentrations varied in the range of 0.05 to 2.30 mg/ml. Buffer solutions of 50.0 mM ß-alanine and 20.0 mM CaCl2 at different pH values (from 2.0 to 4.2) and concentrations of sorbitol (1.0 and 2.0 M), urea (0.5 M) or guanidinium hydrochloride (0.5 and 1.0 M) were used. The data suggest that we are studying the same conformational transition of the protein in all experimental situations using pH, sorbitol, urea and guanidinium hydrochloride as perturbing agents. The observed van't Hoff ratios (deltaHcal/deltaHvH) of 1.0 to 0.5 in the pH range of 3.2 to 4.2 suggest protein aggregation. In contrast, deltaHcal/deltaHvH ratios equal to one in the pH range of 2.0 to 3.2 suggest that the protein unfolds as a monomer. At pH 3.00, ß-trypsin unfolded with Tm = 54ºC and deltaH = 101.8 kcal/mol, and the change in heat capacity between the native and unfolded forms of the protein (deltaCp) was estimated to be 2.50 ± 0.07 kcal mol-1 K-1. The stability of ß-trypsin calculated at 298 K was deltaG D = 5.7 kcal/mol at pH 3.00 and deltaG D = 15.2 kcal/mol at pH 7.00, values in the range expected for a small globular protein.

Attraction to amino acids by Lymnaea acuminata, the snail host of Fasciola species

Adult Lymnaea acuminata (average length 20-22 mm) were collected locally from lakes and low-lying submerged fields from Gorakhpur. The chemoattraction studies were made in round glass aquaria measuring 30 cm in diameter and filled to a depth of 10 mm with 500 ml dechlorinated tap water. Each aquarium was divided into four concentric zones. At the starting time of the assay 10 snails were placed on the circumference of outermost zone 0. Snail attractant pellets (SAP) were added simultaneously in the center of central zone 3. SAP of different amino acids were prepared at concentrations of 10, 20, 50, 80 and 100 mM/2% agar solution and, subsequently, spread to a uniform thickness of 5 mm. After cooling, SAP were cut in small pieces of 5 mm in diameter. Lymnaea acuminata's attraction to amino acids was studied using different amino acid concentrations in SAP. Pellets containing amino acids with non-polar R groups (proline and tryptophan), a charged polar group (arginine) and uncharged polar R groups (serine, citrulline and asparagine) were tested. The snails were more attracted to the uncharged polar R group amino acid serine than to other groups of amino acids. The preferred amino acid concentration was 80 mM. The attraction of snails to different amino acids was concentration dependent. Snails could discriminate amongst the different amino acids at > or = 50 mM.

CYP1A1 and GSTP1 polymorphisms in an oral cancer case-control study

CYP1A1 and GSTP1 polymorphisms have been associated with a higher risk to develop several cancers, including oral squamous cell carcinoma (OSCC), which is closely related to tobacco and alcohol consumption. Both genes code for enzymes that have an important role in activating or detoxifying carcinogenic elements found in tobacco and other compounds, and polymorphic variants of these genes may result in alterations of the enzymatic activity. The CYP1A1 gene codes for the enzyme aryl hydrocarbon hydroxylase, which is responsible for the metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons. The investigated polymorphism, Ile/Val, seems to increase the activity of the enzyme in homozygous individuals, leading to an accumulation of carcinogens. The Ile/Val polymorphism occurs because of an A->G transition at exon 7, resulting in the CYP1A1*2B allele. The GSTP1*B variant shows an A->G transition at exon 5, changing the amino acid Ile to Val, with a reduced catalytic activity of the enzyme. Due to this reduction, the carriers of mutant alleles lost the capability to metabolize carcinogens, which could be responsible for a higher susceptibility to cancer. We conducted a case-control study in a group of 72 cases with newly diagnosed OSCC and 60 healthy controls matched for age, gender, smoking habits, and ethnicity. We used PCR methods to identify the allelic variants CYP1A1*2B and GSTP1*B. The data obtained showed no statistically significant association of allelic or genotypic variants of CYP1A1*2B (OR = 1.06; 95% CI = 0.49-2.29) and GSTP1*B (OR = 1.40; 95% CI = 0.70-2.79) with OSCC.

Plasma amino acids in pregnancy, placental intervillous space and preterm newborn infants

Plasma amino acid levels have never been studied in the placental intervillous space of preterm gestations. Our objective was to determine the possible relationship between plasma amino acids of maternal venous blood (M), of the placental intervillous space (PIVS) and of the umbilical vein (UV) of preterm newborn infants. Plasma amino acid levels were analyzed by ion-exchange chromatography in M from 14 parturients and in the PIVS and UV of their preterm newborn infants. Mean gestational age was 34 ± 2 weeks, weight = 1827 ± 510 g, and all newborns were considered adequate for gestational age. The mean Apgar score was 8 and 9 at the first and fifth minutes. Plasma amino acid values were significantly lower in M than in PIVS (166%), except for aminobutyric acid. On average, plasma amino acid levels were significantly higher in UV than in M (107%) and were closer to PIVS than to M values, except for cystine and aminobutyric acid (P < 0.05). Comparison of the mean plasma amino acid concentrations in the UV of preterm to those of term newborn infants previously studied by our group showed no significant difference, except for proline (P < 0.05), preterm > term. These data suggest that the mechanisms of active amino acid transport are centralized in the syncytiotrophoblast, with their passage to the fetus being an active bidirectional process with asymmetric efflux. PIVS could be a reserve amino acid space for the protection of the fetal compartment from inadequate maternal amino acid variations.

Peptide separation of commercial fermented milk during refrigerated storage

Milk is an important source of bioactive compounds. Many of these compounds are released during fermentation and refrigerated storage. The aim of this study was to determine the release of peptides by lactic acid bacteria in commercial fermented milk during refrigerated storage. The size and profile of peptides were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and sizeexclusion HPLC. During electrophoresis, it was observed that the peptides were released from caseins, whereas β-lactoglobulin was the whey protein with the highest degradation. HPLC analysis confirmed the pattern of peptide formation observed in electrophoresis. Two fractions lower than 2 kDa with aromatic amino acids in their structure were separated. These results were consistent with those reported for structures of peptides with antihypertensive activity. Therefore, the presence of aromatic amino acids in the peptide fractions obtained increases the likelihood of finding peptides with such activity in refrigerated commercial fermented milk. In conclusion, during cold storage, peptides with different molecular weights are released and accumulated. This could be due to the action of proteinases and peptidases of the proteolytic system in lactic acid bacteria.

Monooxygenase Diversity and Oxygen Activation within Polyketide Antibiotic Biosynthesis

Molecular oxygen (O2) is a key component in cellular respiration and aerobic life. Through the redox potential of O2, the amount of free energy available to organisms that utilize it is greatly increased. Yet, due to the nature of the O2 electron configuration, it is non-reactive to most organic molecules in the ground state. For O2 to react with most organic compounds it must be activated. By activating O2, oxygenases can catalyze reactions involving oxygen incorporation into organic compounds. The oxygen activation mechanisms employed by many oxygenases to have been studied, and they often include transition metals and selected organic compounds. Despite the diversity of mechanisms for O2 activation explored in this thesis, all of the monooxygenases studied in the experimental part activate O2 through a transient carbanion intermediate. One of these enzymes is the small cofactorless monooxygenase SnoaB. Cofactorless monooxygenases are unusual oxygenases that require neither transition metals nor cofactors to activate oxygen. Based on our biochemical characterization and the crystal structure of this enzyme, the mechanism most likely employed by SnoaB relies on a carbanion intermediate to activate oxygen, which is consistent with the proposed substrate-assisted mechanism for this family of enzymes. From the studies conducted on the two-component system AlnT and AlnH, both the functions of the NADH-dependent flavin reductase, AlnH, and the reduced flavin dependent monooxygenase, AlnT, were confirmed. The unusual regiochemistry proposed for AlnT was also confirmed on the basis of the structure of a reaction product. The mechanism of AlnT, as with other flavin-dependent monooxygenases, is likely to involve a caged radical pair consisting of a superoxide anion and a neutral flavin radical formed from an initial carbanion intermediate. In the studies concerning the engineering of the S-adenosyl-L-methionine (SAM) dependent 4-O-methylase DnrK and the homologous atypical 10-hydroxylase RdmB, our data suggest that an initial decarboxylation of the substrate is catalyzed by both of these enzymes, which results in the generation of a carbanion intermediate. This intermediate is not essential for the 4-O-methylation reaction, but it is important for the 10-hydroxylation reaction, since it enables substrate-assisted activation of molecular oxygen involving a single electron transfer to O2 from a carbanion intermediate. The only role for SAM in the hydroxylation reaction is likely to be stabilization of the carbanion through the positive charge of the cofactor. Based on the DnrK variant crystal structure and the characterizations of several DnrK variants, the insertion of a single amino acid in DnrK (S297) is sufficient for gaining a hydroxylation function, which is likely caused by carbanion stabilization through active site solvent restriction. Despite large differences in the three-dimensional structures of the oxygenases and the potential for multiple oxygen activation mechanisms, all the enzymes in my studies rely on carbanion intermediates to activate oxygen from either flavins or their substrates. This thesis provides interesting examples of divergent evolution and the prevalence of carbanion intermediates within polyketide biosynthesis. This mechanism appears to be recurrent in aromatic polyketide biosynthesis and may reflect the acidic nature of these compounds, propensity towards hydrogen bonding and their ability to delocalize π-electrons.

Does Gamma-aminobutyric acid function as a plant resistance mechanism against phytophagous insect activity? /

Gamma-aminobutyric acid (GAB A) is a ubiquitous non-protein amino acid synthesized via the decarboxylation of L-glutamate in a reaction catalyzed by the cytosolic enzyme L-glutamate decarboxylase (GAD). In animals it functions as an inhibitory neurotransmitter. In plants it accumulates rapidly in response to various stresses, but its function remains unclear. The hypothesis that GABA accumulation in leaf tissue may function as a plant resistance mechanism against phytophagous insect activity was investigated. GABA accumulation in response to mechanical stimulation, mechanical damage and insect activity was demonstrated. In wt tobacco (Nicotiana tabacum cv Samsun), mechanical stimulation or damage caused GABA to accumulate within 2 min from mean levels of 14 to 37 and 1~9 nmol g-l fresh weight (FW), respectively. In the transgenic tobacco strain CaMVGAD27c overexpressing Petunia GAD, the same treatments caused GABA to accumulate from 12 to 59 and 279 nmol g-l FW, respectively. In the transgenic tobacco strain CaMVGADilC 11 overexpressing Petunia GAD lacking an autoinhibitory domain, mechanical stimulation or damage caused GABA to accumulate from 180 to 309 and 630 nmol g-l FW, respectively. Ambulatory activity by tobacco budworm (TBW) larvae (Heliothis virescens) on leaves of CaMVGAD27c tobacco caused GABA to accumulate from 28 to 80 nmol g-l FW within 5 min. Ambulatory and leaf-rolling activity by oblique banded leaf roller (OBLR) larvae (Choristoneura rosaceana cv Harris) on wt soybean leaves (Glycine max cv Harovinton) caused GABA to accumulate from 60 to 1123 nmol g-l FW within 20 min. Increased GABA levels in leaf tissue were shown to affect phytophagous preference in TBW larvae presented with wt and transgenic tobacco leaves. When presented with leaves of Samsun wt and CaMVGAD27c plants, TBW larvae consumed more wt leaf tissue (640 ± 501 S.D. mm2 ) than transgenic leaf tissue (278 ± 338 S.D. mm2 ) nine times out of ten. When presented with leaves of Samsun wt and CaMVGAD~C11 plants, TBW larvae consumed more transgenic leaf tissue (1219 ± 1009 S.D. mm2 ) than wt leaf tissue (28 ± 31 S.D. mm2 ) ten times out of ten. These results indicate that: (1) ambulatory activity of insect larvae on leaves results in increased GABA levels, (2) transgenic tobacco leaves with increased capacity for GABA synthesis deter feeding, and (3) transgenic tobacco leaves with constitutively higher GABA levels stimulate feeding.

L-Glutamate uptake, decarboxylation to -aminobutyric acid and GABA efflux in isolated Asparagus sprengeri mesophyll cells

Addition of L-glutamate caused alkalinization of the medium surrounding Asparagus spreng.ri mesophyll cells. This suggests a H+/L-glutmate symport uptake system for L-glutamate. However stoichiometries of H+/L-glutamate symport into Asparagus cells were much higher than those in other plant systems. Medium alkalinization may also result from a metabolic decarboxylation process. Since L-glutmate is decarboxylated to r-amino butyric acid (SABA) in this system, the origin of medium alkalinization was reconsidered. Suspensions of mechanically isolated and photosyntheically competent Asparagus sprengeri mesophyll cells were used to investigate the H+/L-glutamate symport system, SABA production, GABA transport, and the origin of L-glutamate dependent medium alkalinization. The major results obtained are summarized as follows: 1. L-Glutamate and GABA were the second or third most abundant amino acids in these cells. Cellular concentrations of L-glutamate were 1.09 mM and 1.31 mM in the light and dark, respectively. Those of SABA were 1.23 mM and 1.17 mM in the light and dark, respectively. 2. Asparagine was the most abundant amino acid in xylem sap and comprised 54 to 68 1. of the amino acid pool on a molar basis. GABA was the second most abundant amino acid and represented 10 to 11 1. of the amino acid pool. L-Slutamate was a minor component. 3. A 10 minute incubation with 1 mM L-glutamate increased the production of GABA in the medium by 2,743 7. and 2,241 7. in the light and dark, respectively. 4. L-Glutamate entered the cells prior to decarboxylation. 5. There was no evidence for a H+/GABA symport process • 6. GABA was produced by loss of carbon-1 of L-glutamate. 7. The specific activity of newly synthesized labeled GABA suggests that it is not equilibrated with a storage pool of GABA. 8. The mechanism of GABA efflux appears to be a passive process. 9. The evidence indicates that the origin of L-glutamate dependent medium alkalinization is a H+/L-glutamate symport not an extracellular decarboxylation. The possible role of GABA production in regulating cytoplasmic pH and L-glutamate levels during rapid electrogenic H+/L-glutamate symport is discussed.

Méthodologie pour la synthèse combinatoire d’azapeptides: application à la synthèse d’analogues aza-GHRP-6 en tant que ligands du récepteur CD36

Les azapeptides sont des mimes peptidiques où le carbone alpha d’un ou de plusieurs acides aminés est remplacé par un atome d’azote. Cette modification tend à stabiliser une conformation en repliement beta en raison de la répulsion électronique entre les paires d’électrons libres des atomes d’azote adjacents et de la géométrie plane de l’urée. De plus, le résidu semicarbazide a une meilleure résistance face aux protéases en plus d’être chimiquement plus stable qu’une liaison amide. Bien que les propriétés des azapeptides en fassent des mimes peptidiques intéressants, leurs méthodes de synthèses font appel à la synthèse laborieuse d’hydrazines substituées en solution. Le peptide sécréteur d’hormone de croissance 6 (GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2) est un hexapeptide synthétique qui possède une affinité pour deux récepteurs distincts: les récepteurs GHS-R1a et CD36. Les travaux effectués au cours de mon doctorat qui seront détaillés dans cet ouvrage visent à atteindre deux objectifs: (1) le développement d’analogues du peptide GHRP-6 sélectif à un seul récepteur et (2) la mise au point d’une nouvelle méthodologie pour la synthèse combinatoire d’azapeptides. En réponse au premier objectif, la synthèse parallèle de 49 analogues aza-GHRP-6 a été effectuée et certains candidats sélectifs au récepteur CD36 ont été identifiés. L’étude de leurs propriétés anti-angiogéniques, effectuée par nos collaborateurs, a également permis d’identifier des candidats intéressants pour le traitement potentiel de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Une nouvelle approche pour la synthèse combinatoire d’azapeptides, faisant appel à l’alkylation et la déprotection chimiosélective d’une sous-unité semicarbazone ancrée sur support solide, a ensuite été développée. La portée de cette méthodologie a été augmentée par la découverte de conditions permettant l’arylation régiosélective de cette sous-unité semicarbazone, donnant accès à treize nouveaux dérivés aza-GHRP-6 possédant des résidus aza-arylglycines aux positions D-Trp2 et Trp4. L’élaboration de conditions propices à l’alkylation et la déprotection chimiosélective de la semicarbazone a donné accès à une variété de chaînes latérales sur l’acide aminé « aza » préalablement inaccessibles. Nous avons, entre autres, démontré qu’une chaîne latérale propargyl pouvait être incorporée sur l’acide aminé « aza ». Tenant compte de la réactivité des alcynes, nous avons ensuite élaboré des conditions réactionnelles permettant la formation in situ d’azotures aromatiques, suivie d’une réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire sur support solide, dans le but d’obtenir des mimes de tryptophane. Sept analogues du GHRP-6 ont été synthétisés et testés pour affinité au récepteur CD36 par nos collaborateurs. De plus, nous avons effectué une réaction de couplage en solution entre un dipeptide possédant un résidu aza-propargylglycine, du paraformaldehyde et une variété d’amines secondaires (couplage A3) afin d’accéder à des mimes rigides d’aza-lysine. Ces sous-unités ont ensuite été incorporées sur support solide afin de générer sept nouveaux azapeptides avec des dérivés aza-lysine à la position Trp4 du GHRP-6. Enfin, une réaction de cyclisation 5-exo-dig a été développée pour la synthèse de N-amino imidazolin-2-ones en tant que nouveaux mimes peptidiques. Leur fonctionnalisation par une série de groupements benzyliques à la position 4 de l’hétérocycle a été rendue possible grâce à un couplage Sonogashira précédant la réaction de cyclisation. Les propriétés conformationnelles de cette nouvelle famille de composés ont été étudiées par cristallographie aux rayons X et spectroscopie RMN d’un tétrapeptide modèle. L’activité biologique de deux mimes peptidiques, possédant un résidu N-amino-4-méthyl- et 4-benzyl-imidazolin-2-one à la position Trp4 du GHRP-6, a aussi été examinée. L’ensemble de ces travaux devrait contribuer à l’avancement des connaissances au niveau des facteurs structurels et conformationnels requis pour le développement d’azapeptides en tant que ligands du récepteur CD36. De plus, les résultats obtenus devraient encourager davantage l’utilisation d’azapeptides comme peptidomimétiques grâce à leur nouvelle facilité de synthèse et la diversité grandissante au niveau de la chaîne latérale des acides aminés « aza ».

The Role of Specific Amino Acids in the Formation of Ternary Complexes in Nitrogenase Regulation in the Photosynthetic Bacterium Rhodobacter capsulatus

L'azote est l'un des éléments les plus essentiels dans le monde pour les êtres vivants, car il est essentiel pour la production des éléments de base de la cellule, les acides aminés, les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires. L’atmosphère est composé de 78% d'azote gazeux, une source d'azote inutilisable par la plupart des organismes à l'exception de ceux qui possèdent l’enzyme nitrogénase, tels que les bactéries diazotrophique. Ces micro-organismes sont capables de convertir l'azote atmosphérique en ammoniac (NH3), qui est l'une des sources d'azote les plus préférables. Cette réaction exigeant l’ATP, appelée fixation de l'azote, est catalysée par une enzyme, nitrogénase, qui est l'enzyme la plus importante dans le cycle de l'azote. Certaines protéines sont des régulateurs potentiels de la synthèse de la nitrogénase et de son activité; AmtB, DraT, DraG, les protéines PII, etc.. Dans cette thèse, j'ai effectué diverses expériences afin de mieux comprendre leurs rôles détailés dans Rhodobacter capsulatus. La protéine membranaire AmtB, très répandue chez les archaea, les bactéries et les eucaryotes, est un membre de la famille MEP / Amt / Rh. Les protéines AmtB sont des transporteurs d'ammonium, importateurs d'ammonium externe, et ont également été suggéré d’agir comme des senseurs d'ammonium. Il a été montré que l’AmtB de Rhodobacter capsulatus fonctionne comme un capteur pour détecter la présence d'ammonium externe pour réguler la nitrogénase. La nitrogénase est constituée de deux métalloprotéines nommées MoFe-protéine et Fe-protéine. L'addition d'ammoniaque à une culture R. capsulatus conduit à une série de réactions qui mènent à la désactivation de la nitrogénase, appelé "nitrogénase switch-off". Une réaction critique dans ce processus est l’ajout d’un groupe ADP-ribose à la Fe-protéine par DraT. L'entrée de l'ammoniac dans la cellule à travers le pore AmtB est contrôlée par la séquestration de GlnK. GlnK est une protéine PII et les protéines PII sont des protéines centrales dans la régulation du métabolisme de l'azote. Non seulement la séquestration de GlnK par AmtB est importante dans la régulation nitrogénase, mais la liaison de l'ammonium par AmtB ou de son transport partiel est également nécessaire. Les complexes AmtB-GlnK sont supposés de lier DraG, l’enzyme responsable pour enlever l'ADP-ribose ajouté à la nitrogénase par DraT, ainsi formant un complexe ternaire. Dans cette thèse certains détails du mécanisme de transduction du signal et de transport d'ammonium ont été examinés par la génération et la caractérisation d’un mutant dirigé, RCZC, (D335A). La capacité de ce mutant, ainsi que des mutants construits précédemment, RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) et RCIA4 (W237A), d’effectuer le « switch-off » de la nitrogénase a été mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats ont révélé que tous les résidus d'acides aminés ci-dessus ont un rôle essentiel dans la régulation de la nitrogénase. L’immunobuvardage a également été effectués afin de vérifier la présence de la Fe-protéine l'ADP-ribosylée. D335, D388 et W237 semblent être cruciales pour l’ADP-ribosylation, puisque les mutants RCZC, RCIA1 et RCIA4 n'a pas montré de l’ADP-ribosylation de la Fe-protéine. En outre, même si une légère ADP-ribosylation a été observée pour RCIA2 (G344C), nous le considérons comme un résidu d'acide aminé important dans la régulation de la nitrogénase. D’un autre coté, le mutant RCIA3 (H193E) a montré une ADP-ribosylation de la Fe-protéine après un choc d'ammonium, par conséquent, il ne semble pas jouer un rôle important dans l’ADP-ribosylation. Par ailleurs R. capsulatus possède une deuxième Amt appelé AmtY, qui, contrairement à AmtB, ne semble pas avoir des rôles spécifiques. Afin de découvrir ses fonctionnalités, AmtY a été surexprimée dans une souche d’E. coli manquant l’AmtB (GT1001 pRSG1) (réalisée précédemment par d'autres membres du laboratoire) et la formation des complexes AmtY-GlnK en réponse à l'addition d’ammoniac a été examinée. Il a été montré que même si AmtY est en mesure de transporter l'ammoniac lorsqu'il est exprimé dans E. coli, elle ne peut pass’ associer à GlnK en réponse à NH4 +.

Caractérisation du rôle de l’amyline (IAPP) dans le diabète de type 2 : études de dérivés peptidiques et de composés inhibiteurs de la formation d’amyloïde

L’amyloïdose, une maladie progressive et incurable, implique une vaste panoplie de pathologies et de pathogénèses, qui est expliquée par la grande variabilité biologique et structurale des protéines responsables de la formation des dépôts d’amyloïde. L’amyline (polypeptide amyloïde des îlots pancréatiques, IAPP) est une protéine très susceptible de subir des changements de conformation impliquant les feuillets bêta et conférant aussi des propriétés physicochimiques distinctes. Cette protéine prend alors une forme fibrillaire et se dépose dans les îlots de Langerhans chez les humains atteints de diabète de type 2 ou d’insulinome. Ces dépôts d’amyloïde pancréatique (AIAPP) ont été décrits chez certaines espèces animales telles que les félins domestiques, les grands félins, le raton laveur et les primates non humains. La formation de dépôts d’amyloïde contribue à la pathogénèse du diabète de type 2, mais les mécanismes qui induisent la conversion de l’amyline (IAPP) en amyloïde (AIAPP) ne sont pas complètement compris. Les hypothèses du projet sont que certaines variations présentes dans les séquences peptidiques de l’IAPP provenant de différentes espèces animales jouent un rôle critique pour la formation de fibrilles et que plusieurs composés chimiques aromatiques/phénoliques sont capables d’abroger la formation de dépôts d’amyloïde. Le projet de recherche consiste donc à caractériser la propension des différentes isoformes animales d’IAPP à former de l’amyloïde in vitro afin d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans cette transformation structurale et ultimement d’inhiber la formation d’amyloïde pancréatique. Le projet se divise en deux volets principaux. Le premier consiste à identifier les différentes séquences peptidiques de l’IAPP retrouvées chez les espèces animales. L’objectif est d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans la formation d’amyloïde. Le gène de l’IAPP a été séquencé chez plus d’une quarantaine d’espèces. Le potentiel d’agrégation des séquences obtenues a été simulé à l’aide d’outils bioinformatique. Une librairie de 23 peptides a été commandée afin de procéder à des analyses physicochimiques in vitro permettant d’évaluer le potentiel amyloïdogénique (test fluorimétrique à la thioflavine T, essai de liaison au rouge Congo, dichroïsme circulaire, microscopie électronique à transmission) et cytotoxique (sur une lignée cellulaire provenant d’insulinome : INS-1). Les analyses effectuées à partir de la librairie constituée de 23 peptides ont permis d’identifier trois séquences ne formant pas d’amyloïde et qui proviennent des espèces animales suivantes : le tamarin lion doré (Leontopithecus rosalia), le grand dauphin (Tursiops truncatus) et l’alpaga (Vicugna pacos). Un site potentiellement critique est le segment 8-20 présentant le motif NFLVH qui ne forme plus d’amyloïde lorsqu’il est remplacé par le motif DFLGR ou KFLIR. Les acides aminés 29P, 14K et 18R sont également impliqués dans l’inhibition de la transformation structurale en fibrille. La dernière partie du projet consiste à inhiber la formation de l’amyloïde en utilisant des composés chimiques commercialisés (hypoglycémiants, anti-inflammatoires non stéroïdiens) ou nouvellement synthétisés dans notre laboratoire (les aryles éthyles urées). Un criblage d’une soixantaine de composés chimiques a été conduit dans cette étude. Leur efficacité a été testée sur l’IAPP humaine, qui possède un fort potentiel amyloïdogénique. Les techniques utilisées sont les mêmes que celles exploitées précédemment. L’essai de liaison croisée photo-induite ("photo-induced cross-linking of unmodified proteins", PICUP) a été réalisé afin d’étudier les formes intermédiaires (monomères, oligomères). Un total de 11 composés chimiques a démontré un potentiel à inhiber l’agrégation des fibrilles. Pour la classe des hypoglycémiants, le glyburide, le répaglinide et la troglitazone ont montré l’activité thérapeutique la plus élevée pour retarder et réduire la formation de fibrilles. Les anti-inflammatoires antiamyloïdogènes actifs incluaient le diclofenac, le méloxicam, le phénylbutazone, le sulindac et le ténoxicam. Les aryles étyles urées les plus intéressantes étaient la EU-362 et la EU-418. Tous ces composés ont conféré une protection cellulaire contre l’activité cytotoxique des fibrilles. Les molécules actives possèdent des éléments structuraux communs tels des substituants donneurs d’électrons (alcool, amine, halogène) sur un noyau benzène. En conclusion, ce projet de recherche a permis de caractériser l’IAPP chez diverses espèces animales, dont plusieurs chez lesquelles elle n’avait pas encore été décrite, de déterminer les sites jouant un rôle clé dans sa transformation en amyloïde et, ultimement, de tester le potentiel thérapeutique de nouveaux agents antiamyloïdogènes dans le diabète de type 2. Nous espérons que ce projet ouvrira ainsi la porte à de nouvelles stratégies de traitement.

Acid activated montmorillonite: an efficient immobilization support for improving reusability, storage stability and operational stability of enzymes

Three enzymes, α-amylase, glucoamylase and invertase, were immobilized on acid activated montmorillonite K 10 via two independent techniques, adsorption and covalent binding. The immobilized enzymes were characterized by XRD, N2 adsorption measurements and 27Al MAS-NMR spectroscopy. The XRD patterns showed that all enzymes were intercalated into the clay inter-layer space. The entire protein backbone was situated at the periphery of the clay matrix. Intercalation occurred through the side chains of the amino acid residues. A decrease in surface area and pore volume upon immobilization supported this observation. The extent of intercalation was greater for the covalently bound systems. NMR data showed that tetrahedral Al species were involved during enzyme adsorption whereas octahedral Al was involved during covalent binding. The immobilized enzymes demonstrated enhanced storage stability. While the free enzymes lost all activity within a period of 10 days, the immobilized forms retained appreciable activity even after 30 days of storage. Reusability also improved upon immobilization. Here again, covalently bound enzymes exhibited better characteristics than their adsorbed counterparts. The immobilized enzymes could be successfully used continuously in the packed bed reactor for about 96 hours without much loss in activity. Immobilized glucoamylase demonstrated the best results.

Characterisation and Distribution of Amino Acids in the Mangrove Sediments of Kochi

Mangrove swamps are unique inter-tidal wetland ecosystems found in sheltered tropical and subtropical shores.Mangrove sediments can be considered as large reservoirs of amino acids,which exist in several different forms,like free amino acids in the sediment micropores,as amino acids,peptides or proteins bound to clay minerals or as amino acids,peptides or proteins bound to humic colloids.Inorder to assess survival conditions of organisms of mangroves,it is important to understand stability of amino acids in the sediments.The amounts of amino acids present in sediment represent a balance between its synthesis and destruction by microorganisms.Thus amino acid analysis offers more insight into the processes of diagenesis,which changes the nature and characteristics of organic matter deposition and decomposition.