Comparison of the organization and fine structure of a chicken and a Xenopus laevis vitellogenin gene.

The structural organization and the coding nucleotide sequence of the Xenopus laevis A2 and the chicken major vitellogenin genes have been compared. Both genes show the same exon-intron organization. However, the degree of homology between the nucleotide and derived amino acid sequences varies extensively along the genes. Several of the 35 exons are quite similar, and a unique cysteine motif in the lipovitellin II domain is conserved between the two genes. In contrast, one internal region is quite divergent. Part of this region encodes phosvitin, which appears to have evolved rapidly by both point mutations and duplications of serines or short other amino acid stretches. On the basis of these observations, we discuss the possible mechanism of evolution of phosvitin in vertebrates.

Fine structural variations of alphabeta TCRs selected by vaccination with natural versus altered self-antigen in melanoma patients

Immunotherapy of cancer is often performed with altered "analog" peptide Ags optimized for HLA class I binding, resulting in enhanced immunogenicity, but the induced T cell responses require further evaluation. Recently, we demonstrated fine specificity differences and enhanced recognition of naturally presented Ag by T cells after vaccination with natural Melan-A/MART-1 peptide, as compared with analog peptide. In this study, we compared the TCR primary structures of 1489 HLA-A*0201/Melan-A26-35-specific CD8 T cells derived from both cohorts of patients. Although a strong preference for TRAV12-2 segment usage was present in nearly all patients, usage of particular TRAJ gene segments and CDR3 composition differed slightly after vaccination with natural vs analog peptide. Moreover, TCR β-chain repertoires were broader after natural than analog peptide vaccination. In all patients, we observed a marked conservation of the CDR3β amino acid composition with recurrent sequences centered on a glycyl-leucyl/valyl/alanyl-glycyl motif. In contrast to viral-specific TCR repertoires, such "public" motifs were primarily expressed by nondominant T cell clonotypes, which contrasted with "private" CDR3β signatures frequently found in T cell clonotypes that dominated repertoires of individual patients. Interestingly, no differences in functional avidity were observed between public and private T cell clonotypes. Collectively, our data indicate that T cell repertoires generated against natural or analog Melan-A peptide exhibited slightly distinct but otherwise overlapping and structurally conserved TCR features, suggesting that the differences in binding affinity/avidity of TCRs toward pMHC observed in the two cohorts of patients are caused by subtle structural TCR variations.

Proteomic and transcriptomic profiling of Staphylococcus aureus surface LPXTG-proteins: correlation with agr genotypes and adherence phenotypes.

Staphylococcus aureus infections involve numerous adhesins and toxins, which expression depends on complex regulatory networks. Adhesins include a family of surface proteins covalently attached to the peptidoglycan via a conserved LPXTG motif. Here we determined the protein and mRNA expression of LPXTG-proteins of S. aureus Newman in time-course experiments, and their relation to fibrinogen adherence in vitro. Experiments were performed with mutants in the global accessory-gene regulator (agr), surface protein A (Spa), and fibrinogen-binding protein A (ClfA), as well as during growth in iron-rich or iron-poor media. Surface proteins were recovered by trypsin-shaving of live bacteria. Released peptides were analyzed by liquid chromatography coupled to tandem mass-spectrometry. To unambiguously identify peptides unique to LPXTG-proteins, the analytical conditions were refined using a reference library of S. aureus LPXTG-proteins heterogeneously expressed in surrogate Lactococcus lactis. Transcriptomes were determined by microarrays. Sixteen of the 18 LPXTG-proteins present in S. aureus Newman were detected by proteomics. Nine LPXTG-proteins showed a bell-shape agr-like expression that was abrogated in agr-negative mutants including Spa, fibronectin-binding protein A (FnBPA), ClfA, iron-binding IsdA, and IsdB, immunomodulator SasH, functionally uncharacterized SasD, biofilm-related SasG and methicillin resistance-related FmtB. However, only Spa and SasH modified their proteomic and mRNA profiles in parallel in the parent and its agr- mutant, whereas all other LPXTG-proteins modified their proteomic profiles independently of their mRNA. Moreover, ClfA became highly transcribed and active in fibrinogen-adherence tests during late growth (24 h), whereas it remained poorly detected by proteomics. On the other hand, iron-regulated IsdA-B-C increased their protein expression by >10-times in iron-poor conditions. Thus, proteomic, transcriptomic, and adherence-phenotype demonstrated differential profiles in S. aureus. Moreover, trypsin peptide signatures suggested differential protein domain exposures in various environments, which might be relevant for anti-adhesin vaccines. A comprehensive understanding of the S. aureus physiology should integrate all three approaches.

GLUT8 subcellular localization and absence of translocation to the plasma membrane in PC12 cells and hippocampal neurons.

GLUT8 is a high-affinity glucose transporter present mostly in testes and a subset of brain neurons. At the cellular level, it is found in a poorly defined intracellular compartment in which it is retained by an N-terminal dileucine motif. Here we assessed GLUT8 colocalization with markers for different cellular compartments and searched for signals, which could trigger its cell surface expression. We showed that when expressed in PC12 cells, GLUT8 was located in a perinuclear compartment in which it showed partial colocalization with markers for the endoplasmic reticulum but not with markers for the trans-Golgi network, early endosomes, lysosomes, and synaptic-like vesicles. To evaluate its presence at the plasma membrane, we generated a recombinant adenovirus for the expression of GLUT8 containing an extracellular myc epitope. Cell surface expression was evaluated by immunofluorescence microscopy of transduced PC12 cells or primary hippocampal neurons exposed to different stimuli. Those included substances inducing depolarization, activation of protein kinase A and C, activation or inhibition of tyrosine kinase-linked signaling pathways, glucose deprivation, AMP-activated protein kinase stimulation, and osmotic shock. None of these stimuli-induced GLUT8 cell surface translocation. Furthermore, when GLUT8myc was cotransduced with a dominant-negative form of dynamin or GLUT8myc-expressing PC-12 cells or neurons were incubated with an anti-myc antibody, no evidence for constitutive recycling of the transporter through the cell surface could be obtained. Thus, in cells normally expressing it, GLUT8 was associated with a specific intracellular compartment in which it may play an as-yet-uncharacterized role.

Structure of the extracellular domains of human and Xenopus Fn14: implications in the evolution of TWEAK and Fn14 interactions.

TWEAK (TNF homologue with weak apoptosis-inducing activity) and Fn14 (fibroblast growth factor-inducible protein 14) are members of the tumor necrosis factor (TNF) ligand and receptor super-families. Having observed that Xenopus Fn14 cross-reacts with human TWEAK, despite its relatively low sequence homology to human Fn14, we examined the conservation in tertiary fold and binding interfaces between the two species. Our results, combining NMR solution structure determination, binding assays, extensive site-directed mutagenesis and molecular modeling, reveal that, in addition to the known and previously characterized β-hairpin motif, the helix-loop-helix motif makes an essential contribution to the receptor/ligand binding interface. We further discuss the insight provided by the structural analyses regarding how the cysteine-rich domains of the TNF receptor super-family may have evolved over time. DATABASE: Structural data are available in the Protein Data Bank/BioMagResBank databases under the accession codes 2KMZ, 2KN0 and 2KN1 and 17237, 17247 and 17252. STRUCTURED DIGITAL ABSTRACT: TWEAK binds to hFn14 by surface plasmon resonance (View interaction) xeFn14 binds to TWEAK by enzyme linked immunosorbent assay (View interaction) TWEAK binds to xeFn14 by surface plasmon resonance (View interaction) hFn14 binds to TWEAK by enzyme linked immunosorbent assay (View interaction).

კატეხიზმო

Contient : აღსარება მართლისა სარწმუნოებისა წმიდისა კათოლიკე და სამოციქულოისა ეკკლესიისა (!) მართლმადიდებელთა აღმოსავალისათა ; Aḡsareba mart'lisa sarcmunoebisa cmidisa katolike da samocʼik'uloisa eklesiisa mart'lmadidebelt'a aḡmosavalisat'a ; Confession de la vraie foi, de la Sainte Eglise, véritable et apostolique des orthodoxes de l'Orient ; Commentaires sur la liturgie

La lymphadénite à mycobactérie atypique [Lymphadenitis due to atypical mycobacteria]

La lymphadénite est une maladie courante dans l'enfance et un motif fréquent de consultation pédiatrique ou ORL. Elle est habituellement due à une infection des voies respiratoires hautes et est autolimitée. Chez l'enfant présentant une lymphadénite cervicale subaiguë ou chronique qui ne répond pas aux antibiotiques habituels, une infection à mycobactérie atypique doit être évoquée. L'infection touche surtout les enfants en bonne santé entre un et cinq ans. Le diagnostic précoce est essentiel car le traitement de choix est l'exérèse des ganglions atteints, avant l'apparition d'une nécrose cutanée et d'une fistulisation. Cet article revoit les présentations cliniques spécifiques, les méthodes diagnostiques et le traitement des lymphadénites à mycobactéries atypiques. Cervical lymphadenitis is common in childhood and is a frequent source of consultation at the pediatrician's or ENT's office. It is usually caused by a viral upper respiratory tract infection and is self limited. In children with subacute or chronic cervical lymphadenitis which fails to respond to conventional antibiotics, infection due to atypical mycobacteria should always be considered. Infections occur predominantly in an otherwise healthy child of 1 to 5 years of age. The early diagnosis is essential as the treatment of choice is early surgical excision before skin necrosis and fistula occur. This article reviews the specific clinical manifestations, diagnostic tools and treatment of lymphadenitis due to atypical mycobacteria.

Ornementation et discours architectural de la "villa" gallo-romaine d'Orbe-Boscéaz : l'apport des peintures

La présente thèse s'inscrit dans la continuité de la publication des fouilles menées de 1986 à 2002 sur le site de la villa gallo-romaine d'Orbe-Boscéaz/VD par l'Institut d'archéologie et des sciences de l'antiquité de l'Université de Lausanne (URBA I, à paraître dans les Cahiers d'archéologie romande). Elle constitue l'analyse approfondie du corpus des peintures murales fragmentaires -succinctement présentées dans URBA I - appartenant à la pars urbana qui succéda, entre 161 et 180 apr. J.-C, à un édifice plus petit du Ier s. de notre ère -dont les peintures sont publiées dans l'ouvrage sus-mentionné. N'ayant subi que de très rares modifications, cette pars urbana de caractère palatial forme un "ensemble clos" autorisant une analyse globale de la conception architecturale et décorative voulue par le bâtisseur ou son commanditaire. Le corpus pictural, composé d'un matériel assez ingrat remplissant quelque 600 cagettes de stockage, offre de ce fait l'intérêt d'une grande homogénéité chronologique et reflète la cohérence et l'unité de la décoration peinte d'origine. Le travail de discrimination et de remontage des ensembles a permet d'individualiser au moins 220 décors et revêtements muraux; l'ensemble des hypothèses de restitution des peintures donne ainsi une image minimale de l'environnement pictural de la pars urbana. Ce corpus pictural n'est toutefois que l'une des composantes du programme décoratif, aussi l'analyse de ses caractéristiques est-elle confrontée à celle des autres composantes ornementales (architecture, placages de marbres et surtout le remarquable ensemble des mosaïques qui fait la célébrité du site). La conjugaison des divers éléments et leur répartition au sein d'un plan bien connu et très symétrique orientent sur les choix décoratifs majeurs, et permettent sinon de reconstituer, tout au moins d'approcher la conception du programme architectural et décoratif voulu par le commanditaire ou son architecte; ce programme, comme fréquemment, reflète le statut du commanditaire, le met évidemment en scène et tient un discours sur la villa, adressé tant aux habitants qu'aux visiteurs. On trouvera dans le travail six chapitres formant l'essentiel de l'exploitation du corpus pictural urbigène. Le premier chapitre est introductif, et présente dans ses grandes lignes la pars urbana de Boscéaz comme cadre de référence. Il est suivi par un état des lieux des peintures murales retrouvées sur le site, abordant leur répartition, leur état de conservation et la méthodologie adoptée pour leur traitement comme leur étude (chapitre 2). Le chapitre 3 constitue l'étude technique des enduits peints. Il réunit toutes les observations que l'on peut faire sur les techniques de réalisation des peinture murales, de la préparation et la pose des mortiers de support aux tours de main des peintres pour le rendu d'un motif. Ce chapitre s'inscrit dans la perspective, appliquée à Boscéaz, d'études marquantes comme celles sur les techniques de préparation des parois (Allag /Barbet 1972, Barbet 1995) sur l'identification des pigments (PACT 17, 1985, Béarat 1997, Colloque de Fribourg 1997) et sur l'analyse des mortiers (Coutelas 2003). Suit le catalogue des peintures, basé sur une sélection de 3414 plaques remontées et fragments (chapitre 4) : il propose une description rigoureuse et systématique des motifs, ainsi que leur analyse stylistique qui apporte les éléments comparatifs permettant la compréhension du matériel, et justifiant son interprétation, voire sa restitution. Les décors y sont présentés par local de découverte; un paragraphe introductif réunit les données de fouille et des informations sur le local ou le prélèvement des enduits, et donne le nombre et la détermination des décors retrouvés. Chacun d'eux fait l'objet d'une notice regroupant: une détermination par le mortier de support (le tectorium); les observations techniques diverses; la description, la restitution le cas échéant, et l'analyse stylistique. Cette dernière privilégie les comparaisons locales, en Suisse d'abord puis dans les pays limitrophes de façon à mettre en évidence les liens plausibles entre certains sites et les éventuels indices d'une production régionale. La documentation graphique qui accompagne chaque décor dans le volume d'illustrations est constituée avant tout des planches photographiques des fragments à l'échelle 1:3, accompagnés le cas échéant de dessins au trait justifiant la lecture des motifs. Ceux-ci permettent la reconstitution idéale

The cAMP response element binding protein-2 (CREB-2) can interact with the C/EBP-homologous protein (CHOP).

cAMP response element binding protein-2 (CREB-2) is a basic leucine zipper (bZIP) factor that was originally described as a repressor of CRE-dependent transcription but that can also act as a transcriptional activator. Moreover, CREB-2 is able to function in association with the viral Tax protein as an activator of the human T-cell leukemia virus type I (HTLV-I) promoter. Here we show that CREB-2 is able to interact with C/EBP-homologous protein (CHOP), a bZIP transcription factor known to inhibit CAAT/enhancer-dependent transcription. Cotransfection of CHOP with CREB-2 results in decreased activation driven by the cellular CRE motif or the HTLV-I proximal Tax-responsive element, confirming that CREB-2 and CHOP can interact with each other in vivo.

A fluorescent hormone biosensor reveals the dynamics of jasmonate signalling in plants.

Activated forms of jasmonic acid (JA) are central signals coordinating plant responses to stresses, yet tools to analyse their spatial and temporal distribution are lacking. Here we describe a JA perception biosensor termed Jas9-VENUS that allows the quantification of dynamic changes in JA distribution in response to stress with high spatiotemporal sensitivity. We show that Jas9-VENUS abundance is dependent on bioactive JA isoforms, the COI1 co-receptor, a functional Jas motif and proteasome activity. We demonstrate the utility of Jas9-VENUS to analyse responses to JA in planta at a cellular scale, both quantitatively and dynamically. This included using Jas9-VENUS to determine the cotyledon-to-root JA signal velocities on wounding, revealing two distinct phases of JA activity in the root. Our results demonstrate the value of developing quantitative sensors such as Jas9-VENUS to provide high-resolution spatiotemporal data about hormone distribution in response to plant abiotic and biotic stresses.

Cerebral aneurysm exclusion by CT angiography based on subarachnoid hemorrhage pattern: a retrospective study

Contexte : Identifier les patients avec une hémorragie sous-arachnoïdienne spontanée chez qui l'angio-CT suffit pour exclure des anévrysmes rompus.Méthodes : Une étude rétrospective a été effectuée de tous les patients avec une hémorragie sous-arachnoïdienne qui ont eu un angio-CT ainsi qu'une angiographie par cathéter dans le but d'exclure un anévrysme. Les cas négatifs de l'angio-CT (sans anévrysmes) ont été classés d'après leur schéma hémorragique au CT dans les catégories suivantes : « anévrysmale », « périmésencéphalique » puis « sans hémorragie ».Résultats : Deux-cent-quarante-et-un patients ont été inclus. Une sensibilité de 96.4% et une spécificité de 96.0% ont été observée pour l'exclusion d'anévrysmes par l'angio-CT. Parmi les 78 cas négatifs de l'angio-CT, chacun des 35 cas avec un motif hémorragique périmésencéphalique ou sans hémorragie au CT n'ont pas eu d'anévrysmes démontrés à l'angiographie par cathéter.Conclusions: L'angio-CT est fiable pour exclure les anévrysmes rompus lorsqu'un motif hémorragique périmésencéphalique ou pas d'hémorragie sont visibles au CT à une semaine depuis le début des symptômes.

Pob1 participates in the Cdc42 regulation of fission yeast actin cytoskeleton.

Rho GTPases regulate the actin cytoskeleton in all eukaryotes. Fission yeast Cdc42 is involved in actin cable assembly and formin For3 regulation. We isolated cdc42-879 as a thermosensitive strain with actin cable and For3 localization defects. In a multicopy suppressor screening, we identified pob1(+) as suppressor of cdc42-879 thermosensitivity. Pob1 overexpression also partially restores actin cables and localization of For3 in the mutant strain. Pob1 interacts with Cdc42 and this GTPase regulates Pob1 localization and/or stability. The C-terminal pleckstrin homology (PH) domain of Pob1 is required for Cdc42 binding. Pob1 also binds to For3 through its N-terminal sterile alpha motif (SAM) domain and contributes to the formin localization at the cell tips. The previously described pob1-664 mutant strain (Mol. Biol. Cell. 10, 2745-2757, 1999), which carries a mutation in the PH domain, as well as pob1 mutant strains in which Pob1 lacks the N-terminal region (pob1DeltaN) or the SAM domain (pob1DeltaSAM), have cytoskeletal defects similar to that of cdc42-879 cells. Expression of constitutively active For3DAD* partially restores actin organization in cdc42-879, pob1-664, pob1DeltaN, and pob1DeltaSAM. Therefore, we propose that Pob1 is required for For3 localization to the tips and facilitates Cdc42-mediated relief of For3 autoinhibition to stimulate actin cable formation.

Structure, bioactivity and synthesis of natural products with hexahydropyrrolo[2,3-b]indole

Research on natural products containing hexahydropyrrolo[2,3-b]indole (HPI) has dramatically increased during the past few years. Newly discovered natural products with complex structures and important biological activities have recently been isolated and synthesized. This review summarizes the structures, biological activities, and synthetic routes for natural compounds containing HPI, emphasizing the different strategies for assembling this motif. It covers a broad gamut of molecules, from small alkaloids to complex peptides.

Translation of polarity cues into asymmetric spindle positioning in "Caenorhabditis elegans"

Abstract: Asymmetric cell division is important to generate tissue diversity. The Caenorhabditis elegans embryo is well suited to study the mechanisms of asymmetric cell division. In wild type one-cell stage embryos, the spindle sets up along the anterior-posterior axis (AP). During anaphase, the spindle elongates. While the anterior spindle pole is relatively immobile, the posterior spindle pole moves towards the posterior cortex during anaphase leading to an asymmetric spindle position. As a result, the first cleavage gives rise to a large anterior blastomere and a smaller posterior one, which differs also in cell fate determinants. This posterior spindle displacement occurs in response to polarity cues set up along the AP axis by the PAR proteins and is due to imbalanced pulling forces acting on the two spindle poles, with net forces acting on the posterior spindle pole being more extensive than those at the anterior one. The project of my thesis was to characterize the involvement of two new components, gpr-1 and gpr-2, in spindle positioning. These genes encode essentially identical proteins containing a GoLoco motif characteristic of proteins interacting with α subunits of heterotrimeric G protein (Gα). In gpr-1/2(RNAi) embryos and in embryos lacking simultaneously two α subunits, goa-1 and gpa-16, (Ga(RNAi) embryos), there is a minimal posterior displacement of the spindle during anaphase, and the first division is equal. I found that the pulling forces acting on the two spindle poles is weak and equal in gpr-1/2(RNAi) and Gα (RNAi) embryos. I found that GPR-1/2 acts downstream of polarity cues for generation of pulling forces. Furthermore, I showed that GPR-1/2 distribution was enriched at the posterior cortex during metaphase whereas GOA-1 and GPA-16 were uniformly distributed at the cell cortex throughout the cell cycle. Gα subunits oscillate between GDP- and GTP-bound forms. Gα signaling is turned on by GDP/GTP exchange catalyzed by guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and turned off by hydrolysis of GTP catalyzed by GTPase activating proteins (GAPs). A third class of proteins, the guanine dissociation inhibitors (GDIs), binds the GDP-bound form of Gα subunits and inhibits nucleotide exchange. I found that GPR-1/2 acts as a GDI for GOA-1. Taken together, my findings suggest a model in which differential activation of Gα subunits along the AP axis may translate into generation of differential pulling forces on the anterior and posterior spindle poles, and, thus, asymmetric cell division. Résumé L'embryon du nématode Caenorhabditis elegans est un modèle approprié pour étudier les mécanismes de la division asymétrique. Chez l'embryon précoce, le fuseau mitotique se forme le long de l'axe antéro-postérieur (A/P) et au centre de l'embryon, le pôle antérieur restant relativement immobile alors que le pôle postérieur du fuseau se déplace vers le cortex postérieur au cours de l'anaphase conduisant à une position excentrée du fuseau. 11 en résulte une première division qui génère un blastomère antérieur et postérieur de grande et petite taille respectivement et qui diffèrent en facteurs développementaux. Ce déplacement postérieur se produit en réponse de la polarité établie par la distribution polarisée des protéines PAR et est le résultat de la génération de forces inégales tirant sur les deux pôles du fuseau, les forces agissant sur le pôle postérieur du fuseau étant plus grandes. Le projet de ma thèse était d'identifier la fonction de deux nouveaux constituants, gpr-1 et gpr-2 dans le positionnement asymétrique du fuseau. Ces gènes codent essentiellement pour la même protéine qui contient un motif GoLoco, caractéristique des protéines interagissant avec la sous-unité alpha des protéines G hétérotrimériques. Chez l'embryon gpr-1/2(RNAi) et chez les embryons dépourvus d'activité de deux sous-unités alpha, goa-1 et gpa-16, (Gα(RNAi)), j'ai montré qu'il y avait un déplacement minimal du fuseau vers le pôle postérieur au cours de l'anaphase et la première division est symétrique en raison de forces faibles et égales agissant sur les deux pôles du fuseau. J'ai également montré que gpr-1/2 était requis en aval des signaux établissant la polarité pour générer les forces responsables du positionnement asymétrique du fuseau. De plus, j'ai montré que GPR-1/2 était enrichi au pôle postérieur lors de la métaphase alors que GOA-1 et GPA-16 étaient localisés de façon uniforme au cortex de l'embryon précoce. Gas oscillent entre une forme liée au GDP et une forme liée au GTP. La signalisation des Gas est activée par l'échange GDP/GTP qui est catalysé par des protéines GEFs. La signalisation des Gas est désactivée par l'hydrolyse du GTP qui est catalysée par des protéines GAPs. Une troisième classe de protéines, GDIs lie la forme GDP et inhibe l'échange de nucléotides. J'ai montré que GPR-1/2 agissait comme un GDI pour GOA-1. Mes résultats suggèrent un modèle dans lequel une activation différentielle des Gα le long de l'axe A/P pourrait générer des forces différentielles sur le pôle antérieur et postérieur du fuseau.

Characterization and functional identification of a novel plant extradiol 4,5-dioxygenase involved in betalain pigment biosynthesis in Portulaca Grandiflora

RESUME Les bétalaïnes sont des pigments chromo-alcaloïdes violets et jaunes présents dans les plantes appartenant à l'ordre des Caryophyllales et dans les champignons des genres Amanita et Hygrocybe. Leur courte voie de biosynthèse est élucidée chimiquement depuis de nombreuses années, mais les enzymes impliquées dans cette biosynthèse chez les plantes ne sont toujours pas caractérisées. L'enzyme de la DOPA-dioxygénase d' Amanita muscaria a été identifiée (Girod et Zryd, 1991a), mais de nombreuses tentatives d'isolation d'un homologue chez les plantes ont échoué. Afin d'isoler les gènes spécifiques des bétalaïnes chez les plantes, nous avons construit des banques soustraites d'ADNc à partir d'ARN total de pétales immatures de Portulaca grandiflora (Pg) de génotypes jaunes et blancs, respectivement violets et blancs. Les clones couleur- spécifiques ont été détectés en premier par analyse Northem du RNA de pétales blancs et colorés. Les candidats positifs ont alors été soumis à une analyse de transcription au niveau des tiges colorées, vertes et des feuilles, afin d'établir leur expression spécifique. Deux ARNs messagers complets ont une expression corrélée avec l'accumulation des bétalaïnes dans les tissus. Le premier de ces clones, A.16, code pour une oxydase de l'acyl-Coenzyme A (ACX) putative, mais le domaine de liaison du FAD essentiel pour l'activité d'ACX est absent. Toutes nos tentatives pour démontrer sa fonction ont échoué. Le rôle de cette protéine dans la voie de synthèse des bétalaïnes reste inconnu. Le deuxième de ces clones spécifique aux bétalaïnes, L.6 (isolé par Zaiko, 2000), a été renommé DODA en raison de son homologie avec le domaine LigB (pfam02900) d'une 4,5-dioxygénase extradiol bactérienne. DODA a été identifié in silico comme une dioxygénase extradiol en raison de la conservation stricte, au niveau de sa séquence peptidique, des résidus catalytiques de LigB et de ceux liant le cofacteur fer. Une analyse de transfert Southem a montré que ce gène est unique dans Pg. L'expression transitoire de DODA par transformation biolistique dans des pétales blancs de Pg a produit des taches violettes ou jaunes dans des cellules transformées. Une analyse HPLC de ces taches a démontré leur identité avec les bétalaïnes présentes naturellement dans les pétales violets et jaunes de Pg, confirmant ainsi la complémentation par le gène Pg DODA de l'allèle récessif cc présent dans les pétales blancs de Pg. Des homologues de DODA (DOPA-dioxygénase) ont été identifiés dans de nombreuses espèces de plantes, y compris dans celles sans bétalaïne. L'alignement de ces homologues a permis l'identification d'un motif spécifique aux bétalaïnes à côté d'une histidine catalytique conservée. Ce motif [H-P-(S,A)-(N,D)-x-T-P] remplace le motif [H-N-L-R] conservé dans les plantes sans bétalaïne et le motif [H-N-L-x] présent dans tous les homologues bactériens et archaebactériens. Une modélisation tridimensionnelle préliminaire du site actif de Pg DODA et de son homologue dans la mousse Physcomitrella patens a montré l'importance de ce motif spécifique aux bétalaïnes pour l'accessibilité du substrat au site actif. L'analyse phylogénétique de DODA a confirmé l'évolution séparée de cette protéine chez les plantes à bétalaïnes par comparaison avec celle des plantes sans bétalaïne. Nous avons donc conclu que les bétalaïnes sont apparues par modification de l'affinité pour un substrat d'enzymes similaires à DODA, chez un ancêtre unique des Caryophyllales qui a perdu toute capacité de biosynthèse des anthocyanes. Finalement, Pg DODA n'a aucune similarité avec la protéine DODA d' Amanita muscaria, bien que celle-ci complémente aussi la pigmentation des pétales blancs de Pg. La biosynthèse des bétalaïnes est un exemple remarquable de convergence évolutive biochimique indépendante entre espèces de règnes différents. ABSTRACT Betalains are violet and yellow chromo-alkaloid pigments present in plants belonging to the order Caryophyllales and also in the fungal genera Amanita and Hygrocybe. Their short biosynthetic pathway is chemically well understood since many years, but enzymes involved in the plant pathway are still uncharacterized. The DOPA-dioxygenase from Amanita muscaria was identified (Girod and Zryd, 1991a), but numerous attempts to identify a plant homologue to the corresponding gene, failed. In order to isolate betalain-specific genes in plants, subtractive cDNA libraries were built with total RNA from white and yellow and respectively, violet immature petals from Portulaca grandiflora (Pg) genotypes. Colour-specific clones were first detected by Northern blot analysis using RNA from white and coloured petals. Positive candidates were submitted to further transcription analysis in coloured, green stems and leaves in order to assess their specific expression. Two full-length mRNAs showed a correlated expression with betalain accumulation in tissues. One of them, A.16, encodes a putative acyl-Coenzyme A oxidase (ACX), but missing the FAD binding domain essential for the ACX activity. Thus, all attempts to demonstrate its function failed. The role of this protein in the betalain biosynthesis pathway, if any, is still unknown. The second betalain-specific mRNA, L.6 (isolated by Zaiko, 2000) shows a homology with a LigB domain (pfam02900) from a bacterial extradiol 4,5-dioxygenase. It was then renamed DODA (DOPA-dioxygenase). DODA was identified in silico as a highly conserved extradiol dioxygenase due to the strict conservation of its peptidic sequence with LigB catalytic residues and iron-binding cofactor residues. Southern blot analysis showed that this gene is a single copy-gene in Pg. Transient expression of DODA protein through biolistic transformation of Pg white petals produced violet or yellow spots in individual cells. HPLC analysis of these spots showed an identity with betalain pigments present naturally in yellow and violet Pg petals, thus confirming the complementation of the recessive cc allele present in Pg white petals by Pg DODA gene. DODA homologues were identified in numerous plant species including those without betalain. Alignment of these homologues allowed the identification of a betalain-specific pattern beside a highly conserved catalytic histidine. This [H-P-(S,A)-(N,D)-x-T-P] pattern replaces a [H-N-L-R] pattern strictly conserved in non-betalain plants and a [H-N-L-x] pattern present in all bacterial and archaebacterial homologues. Preliminary three-dimensional modeling of the active site of Pg DODA and its Physcomitrella patens moss homologue revealed the importance of this betalain-specific pattern for the substrate accessibility to the DODA active site. DODA phylogenetic analysis confirmed the separate evolution of this protein in betalain-producing plants. We conclude that betalain pigments appeared in a unique ancestor of the Caryophyllales order in which anthocyanin biosynthetic pathway was impaired, by a modification of enzymes of the DODA family for substrate affinity. The Pg DODA protein has no sequence similarity with Amanita muscaria DODA, despite the fact that they both complement Pg white petals for their pigmentation. Betalain biosynthesis is an interesting example of independent biochemical evolutionary convergence between species from different kingdoms.