Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Biossensores de pH, ureia e glicose utilizando a microeletrônica de filmes finos de AZO e TIO2

Este trabalho apresenta o desenvolvimento de biossensores de pH, ureia e glicose, utilizando óxidos como plataforma para a parte seletiva. Os filmes finos de óxidos condutores foram produzidos por diferentes técnicas de deposição, como spin-coat, dip-coat, spray-pyrolysis e casting. Os materiais fabricados foram AZO e TiO2, ambos depositados sobre substratos de FTO, ITO ou vidro hidroflilizado. O número de camadas foi variado para cada técnica e as caracterizações morfológicas e estruturais foram feitas por MEV, DRX e FTIR. As caracterizações elétricas foram feitas por EGFET e voltametria cíclica. Os filmes foram testados como sensores de pHs na faixa de 2 a 8. O filme depositado com AZO em substrato de FTO pela técnica de spray-pyrolysis apresentou melhor resposta, com sensibilidade de 31,7 mV/pH entre toda a faixa de pHs do 2 ao 8. Já para os filmes de TiO2, o filme produzido por dip-coat com 5 camadas em substrato de FTO apresentou sensibilidade de 37,8 mV/pH entre a faixa de pHs de 2 a 8. Paralelamente, os filmes tiveram suas superfícies funcionalizadas com proteínas como urease ou glicose oxidase. Neste caso, os dispositivos foram testados entre as concentrações de 5 a 200 mg/dL de ureia e glicose. Como biossensor de ureia, o filme de TiO2 depositado por spin-coat com 5 camadas em substrato de FTO apresentou a maior sensibilidade, com valor 3,32 mV/(mg/dL) entre as concentrações de 5 a 120 mg/dL. Para os filmes estudados como biossensores de glicose, o melhor resultado também foi obtido pelo filme de TiO2 depositado por spin-coat com 5 camadas em substrato de FTO, apresentando sensibilidade em torno de 6,18 mV/(mg/dL) entre as concentrações de 5 a 200 mg/dL. Alguns resultados encontrados foram iguais ou melhores aos encontrados na literatura vigente, mesmo que os dispositivos ainda são passíveis de otimização.

Transferência transplacentária de anticorpos em gestações gemelares

Há poucos dados na literatura sobre o transporte transplacentário de imunoglobulinas em gestações múltiplas. O objetivo deste estudo foi observar fatores que influenciam a concentração de imunoglobulina G (IgG) no cordão umbilical dos neonatos e a transferência transplacentária de IgG total e de IgG contra o Streptococcus grupo B (EGB), e lipopolissacarídeos (LPS) de Klebsiella spp. e Pseudomonas spp.. Métodos: estudo prospectivo realizado no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo no período de 2012 a 2013. Foram coletadas amostras de sangue materno e de cordão umbilical no momento do parto. Os critérios de inclusão foram gestações gemelares com ausência de sinais de infecção por HIV, citomegalovírus, Hepatites B e C, toxoplasmose e rubéola e ausência de doenças autoimunes, malformação fetal e síndromes genéticas. A análise multivariada foi realizada para avaliar a associação entre os níveis de IgG em cordão umbilical e as taxas de transferência de anticorpos com a concentração materna de IgG, a corionicidade da gestação, a presença de insuficiência placentária, a restrição de crescimento intrauterino, a idade gestacional de nascimento, o peso de nascimento, o tabagismo, a doença materna e a via de parto. Resultados: a concentração de IgG total em cordão umbilical apresentou correlação positiva com os níveis maternos séricos de IgG total e a idade gestacional do parto. Os níveis de IgG total em cordão umbilical foram significativamente menores em gestações monocoriônicas quando comparadas às dicoriônicas. A taxa de transferência de IgG total apresentou correlação positiva com a idade gestacional do parto, mas negativa com as concentrações maternas de IgG total. As concentrações de IgG contra EGB e LPS de Klebsiella spp. e Pseudomonas spp. apresentaram associação com os níveis maternos de IgG específicos contra esses antígenos e com o diabetes. Os níveis de IgG contra LPS de Klebsiella spp. também foram associados com o peso de nascimento e com hipertensão materna. As taxas de transferência de IgG contra EGB e LPS de Pseudomonas spp. apresentaram correlação com os níveis maternos de IgG específicos contra os antígenos referidos. A taxa de transferência de IgG contra EGB também esteve associada com a idade gestacional do parto, enquanto a taxa de transferência de IgG contra LPS de Pseudomonas spp. apresentou correlação com diabetes. Não houve correlação entre a taxa de transferência de IgG contra a LPS de Klebsiella spp. com nenhum fator analisado. Conclusão: em gestações gemelares, a concentração total de IgG em cordão umbilical foi influenciada pela concentração materna de IgG total, pela idade gestacional do parto e pela corionicidade placentária. As concentrações de IgG total foram significativamente menores em gestações monocoriônicas que em dicoriônicas. As concentrações séricas de IgG contra EGB e LPS de Klebsiella spp. e Pseudomonas spp. em cordão umbilical apresentaram associação com os níveis maternos de IgG específicos contra esses antígenos e com a presença de diabetes. Todos os outros parâmetros estudados apresentaram diferentes associações com as concentrações de IgG e com as taxas de transferências de IgG específicas contra cada antígeno investigado

Disponibilidade de níquel no sistema solo-planta: efeito de doses e saturações por bases

Por se tratar de um elemento essencial às plantas e um metal pesado ao mesmo tempo, o níquel requer atenção quanto aos aspectos da fisiologia de plantas e ambiental. Além disso, existe um intervalo estreito entre as exigências nutricionais e os teores tóxicos às plantas. Neste contexto, objetivou-se avaliar o efeito do Ni no sistema solo-planta, com foco no ciclo do N e a disponibilidade do elemento no solo, por meio de experimento em condições controladas, utilizando vasos distribuídos inteiramente ao acaso, utilizando-se esquema fatorial 2 x 5, com sete repetições cada tratamento. O primeiro fator foi constituído de duas saturações por base (50 e 70%) e o segundo de cinco doses de Ni (0; 0,1; 0,5; 1,0 e 10,0 mg dm-3 de solo). Os vasos foram preenchidos com 8 dm3 de terra e cultivados com soja [Glycine max (L.) Merrill] sucedida por girassol (Helianthus annuus L.). Os parâmetros qualitativos e quantitativos: altura de plantas (AP), diâmetro do caule (DC), número de nós (NN), estádio fenológico (EF), índice SPAD e, diâmetro do capítulo (DCap) (para girassol) foram avaliadas aos 30 e 60 dias após a emergência (d.a.e.) de cada cultivo. Plantas inteiras de soja, amostradas em quatro vasos de cada tratamento, foram coletadas no estádio R1. Na mesma ocasião foram coletadas amostras de solo da rizosfera. Em seguida, as plantas coletadas foram divididas em: folhas; raízes (nódulos na soja) e parte aérea. Foram determinados nas folhas utilizadas para diagnose em soja e girassol: os teores de macro e micronutrientes, as atividades da redutase do nitrato e da urease e as concentrações dos ácidos orgânicos: oxálico, malônico, succínico, málico, tartárico, fumárico, oxaloacético, cítrico e lático. Os mesmos ácidos orgânicos foram determinados em raízes secundárias de girassol e nódulos de soja. Foram realizadas avaliações ultraestruturais por meio de microscopia eletrônica de transmissão (MET) em raízes de girassol, e estruturais e de tonalidade em nódulos de soja, por meio de microscopia de luz. No solo, foram determinadas: atividade urease, desidrogenase, Ni total e fitodisponível pelos métodos: Mehlich-1, Mehlich-3 e DTPA. No período de maturidade fisiológica de cada cultura foi realizada a colheita das plantas dos vasos restantes para determinação de produção de grãos, teores de Ni na planta inteira e Ni e N nos grãos. Ao final dos dois experimentos foi realizada nova coleta de solo para extração sequencial de Ni. O índice SPAD em soja aos 60 d.a.e., a produção de massa seca da parte aérea da soja e da raiz de girassol foram influenciados pela saturação por bases, doses de níquel e pela a interação destes. Foram influenciados pelas saturações por base e doses de níquel (fatores isolados): para soja: AP aos 60 d.a.e., NN aos 30 e 60 d.a.e., SPAD aos 30 d.a.e.; para girassol: AP e NN aos 30 e 60 d.a.e., DC e SPAD aos 30 d.a.e. As demais variáveis avaliadas aos 30 e 60 d.a.e. foram influenciadas apenas pela saturação por bases, ou doses de Ni separadamente. As plantas de soja e girassol apresentaram maiores teores de Ni nos diferentes tecidos avaliados (exceto grãos) quando cultivadas sob V50%. A produção de grãos de soja e girassol não foi influenciada pelos tratamentos, porém o teor de N dos grãos de soja influenciado pelas doses de Ni na V70%. A atividade da enzima urease nas folhas de soja e girassol foi responsiva positivamente ao aumento das doses de Ni. Quatro dos ácidos orgânicos avaliados e o teor de N nas folhas e nos grãos foram maiores nas plantas cultivadas sob V70% com a dose de 0,5 mg dm-3 de Ni. As doses de Ni bem com as saturações por bases influenciaram diretamente o balanço de nutrientes das plantas. Os extratores Mehlich-1, Mehlich-3 e DTPA apresentaram elevado coefienciente de correlação entre a fração de Ni disponível no solo e a concentração do elemento nas plantas de soja e girassol, sendo o extrator DTPA o que apresentou maior coeficiente de correlação. O Ni apresentou distribuição variável entre as diferentes frações do solo em função dos tratamentos. Os solos dos tratamentos com saturação por bases de 70% apresentaram maior concentração de Ni ligado a carbonato, comparado aos tratamentos sob saturação por bases de 50%. A distribuição do Ni entre as frações do solo seguiu a seguinte orgem: ligado a carbonato < trocável < ligado a óxidos < matéria orgânica < residual. A saturação por bases exerceu efeito diferenciado para a atividade da urease no solo em função da cultura avaliada. Por sua vez, o Ni exerceu efeito diferenciado sobre a atividade de desidrogenase em função da cultura estudada

ESTUDIO INTEGRAL DE LA POBLACIÓN BACTERIANA EN EL AIRE DE UN CENTRO DE SALUD: IMPACTO EN LA TRANSMISIÓN DE PATÓGENOS INTRAHOSPITALARIOS

La transmisión de infecciones intrahospitalarias se ha convertido en un tema sanitario prioritario, dado el alto porcentaje de personas que se ven afectadas. Teniendo en cuenta que gran parte de estas infecciones son transmitidas a través del aire, se pretende realizar un muestreo de partículas en suspensión en diferentes áreas dentro del Hospital Regional Familiar Domingo Funes y en diferentes estaciones del año, a fin de evaluar tanto el tipo de microorganismo presente en el ambiente interno, asi como las posibles vías de propagación. Se seleccionaran cinco áreas diferentes para muestreo activo y siete zonas para muestreo pasivo dentro del hospital. Para ello se emplearan muestreadores activos de partículas en suspensión de 10 y 2,5 µm de diámetro y bioaerosoles, en las que se determinará presencia o ausencia de bacterias, mediante PCR con primers específicos para microorganismos de los géneros Acinetobacter, Staphilococcus, Klebsiella, Pseudomonas y Micobacterium, patógenos clínicos más frecuentemente aislados en el hospital seleccionado como área de estudio. Asimismo, se emplearan cápsulas de sedimentación con medios de cultivo específicos para colectar de manera pasiva partículas sedimentables. Se determinara también en cada área de muestreo dentro del hospital, la densidad ocupacional, temperatura y humedad ambiente a fin de evaluar la influencia de factores externos en la transmisión de microorganismos. Se pondrá especial atención en el estudio de M. tuberculosis por ser una de las infecciones cuya incidencia ha aumentado notablemente en los últimos años. De esta manera se intenta establecer una cooperación que aporte información útil para el establecimiento de medidas de prevención y control de patógenos hospitalarios. La realización de este proyecto implica un trabajo multidisciplinar, abordando esta problemática desde un ámbito académico científico en la Universidad Nacional de Córdoba y desde la práctica médica en el laboratorio de Bacteriología del Hospital Domingo Funes.

Atividade antibacteriana de sementes de açaí (Euterpe oleracea Mart.)

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antibacteriana de um extrato aquoso de sementes de açaí (Euterpe oleracea Mart.), proveniente do Brasil, em isolados clínicos. O extrato revelou atividade antibacteriana em todos os isolados clínicos testados com a exceção de Escherichia coli e de Klebsiella pneumoniae. Os melhores valores de CMIs (concentrações mínimas inibitórias) foram observados para Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) (0,25 mg/mL), Staphylococcus aureus sensível à meticilina (MSSA), Enterococcus faecalis e Streptococcus agalactiae com um valor de 0,5 mg/mL. O extrato testado parece ser uma opção a explorar no combate de bactérias resistentes.

Abcesso hepático piogénico criptogénico : caso clínico

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

Using new scanning electron microscopy (SEM) approaches to elucidate bacterial biofilm architecture

Healthcare-associated infections (HAI) are a major public health problem being Klebsiella pneumoniae and nontuberculous mycobacteria, both with high antibiotic resistance rates, among their etiological agent. Since biofilme assembly is pointed as one of the mechanisms involved in emergence of antibiotic resistance understanding bacteria organization within the biofilm and the identification of differences between planktonic and sessile forms of bacteria will be a step forward to fight HAI. In the present work we used SEM as a tool to characterize the internal structure of biofilm assembled on different surfaces. For SEM analysis, biofilms were allowed to form either on six-well cell culture plates, silicon or metallic disks placed inside the wells for different incubation periods at 37 °C. The biofilm assembled on the cell culture dish was for both secondary and backscattered electron analysis as described before. Biofilms assembled on silicon disks instead of being sectioned were prepared as metallographic samples, by grinding with grit SIC paper and polishing with diamond particles. Samples were cleaned (70% ethanol), dried with hot air, further coated and analysed. A preliminary study using FIB-SEM has been performed to access the ultrastructure of biofilms assembled on metallic surfaces. The results obtained showed that the same bacteria assembled biofilms with different ratios of biomass and extracellular matrix depending on the surface. SEM performed on thin sections of biofilms is a powerful tool to elucidate biofilm structure allowing the quantification of the major components. FIB-SEM is also a promising tool in this field.

Estudo comparativo da microflora bacteriana de doentes portadores de próteses totais acrílicas mucosuportadas e implantosuportadas

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz

Bioaumento aplicado ao controlo dos níveis de amoníaco em aviários

Este projecto teve como principal objectivo desenvolver um estudo à escala real e laboratorial com o intuito de testar a viabilidade da suspensão biológica comercial JASS para minorar o problema da ocorrência de elevadas concentrações de amoníaco atmosférico no interior dos aviários. Pretendeu-se, assim, estudar a vantagem da utilização de microrganismos com capacidade de degradar o amoníaco ou inibir a sua formação, fixando os compostos azotados na cama de aviário e reduzindo a sua emissão atmosférica. Para o efeito, realizaram-se diversos ensaios à escala laboratorial e real numa instalação industrial, de forma a testar a eficácia da suspensão biológica. Os ensaios laboratoriais consistiram na determinação da influência da aplicação da suspensão biológica na libertação de amoníaco em cama de aviário colocada em reactor fechado ou aberto e numa coluna que permitiu a quantificação do fluxo de amoníaco libertado a diferentes cotas. Noutro conjunto de experiências, procurou-se estudar a caracterização da suspensão biológica essencialmente por técnicas de coloração e de ensaios bioquímicos. Finalmente, avaliou-se a eficácia da suspensão na inibição da transformação da ureia pela enzima urease produzida pelo microrganismo Proteus vulgaris. Os ensaios à escala real decorreram nas instalações de Leiria da Ovopor - Agro-Pecuária dos Milagres, S.A., com uma área de 12500m2. Realizaram-se ensaios em dois ciclos de criação, um com 30970 pintos em que não foi aplicada a suspensão em estudo e outro com 28470 pintos onde foi feita a aplicação da suspensão, como forma de validar as vantagens de aplicação do produto desenvolvido. Durante estes ensaios foi feita a monitorização das condições ambientais, da concentração e do caudal mássico de amoníaco amostrado, bem como de alguns parâmetros caracterizadores da produtividade, como sejam o peso dos animais e a mortalidade. Apesar de não ter sido possível tirar conclusões esclarecedoras quanto à eficiência da suspensão nos estudos comparativos à escala laboratorial, quer nos ensaios em reactor fechado, quer com circulação de ar, observou-se uma redução da emissão de amoníaco de cerca de 13% no estudo da determinação do fluxo de amoníaco a diferentes cotas nas experiências em que se usou a mesma cama de aviário (redução do fluxo mássico total de 32,67 mgNH3/ (m2.h) para 30,68 mgNH3/ (m2.h). Relativamente ao ensaio de campo na recria da Ovopor verificou-se uma clara redução na emissão de amoníaco na segunda campanha, redução essa que foi particularmente relevante nas primeiras quatro semanas de criação, que correspondem ao período em que as condições de ambas as campanhas são praticamente iguais, uma vez que não se promove a ventilação da sala de recria. Constatou-se ainda que os valores mais elevados de amoníaco atmosférico registados foram de 8,2 e 4,8 ppm na 1ª e 2ª campanhas, respectivamente, que correspondem a valores claramente abaixo do valor máximo admissível previsto na legislação nacional (20ppm). Quanto à composição da suspensão biológica JASS verificou-se que é essencialmente composta por esporos de Bacillus sp. e que a germinação destes esporos é favorecida quando a suspensão é diluída. Por fim, através do estudo em meio de cultura com composição controlada, em que foi feita a avaliação da capacidade da suspensão biológica estudada inibir o processo de formação de amoníaco, confirmou-se que esta inibiu a actividade da enzima urease produzida pelo microorganismo Proteus vulgaris e, consequentemente, houve uma redução de cerca de 47% na capacidade de formação de amoníaco comparando o desempenho dos dois reactores aos quais foram adicionados este microrganismo. Em suma, pode-se pois concluir que, com excepção dos resultados dos estudos de determinação do amoníaco libertado realizados à escala laboratorial, todas as restantes experiências indiciam que a suspensão JASS estudada tem capacidade para inibir a formação de amoníaco e, consequentemente, a sua libertação, provando a utilidade do produto na melhoria das condições ambientais dos aviários.

Identification of the essential histidine residue for high-affinity binding of AlbA protein to albicidin antibiotics

The albA gene from Klebsiella oxytoca encodes a protein that binds albicidin phytotoxins and antibiotics with high affinity. Previously, it has been shown that shifting pH from 6 to 4 reduces binding activity of AlbA by about 30%, indicating that histidine residues might be involved in substrate binding. In this study, molecular analysis of the albA coding region revealed sequence discrepancies with the albA sequence reported previously, which were probably due to sequencing errors. The albA gene was subsequently cloned from K oxytoca ATCC 13182(T) to establish the revised sequence. Biochemical and molecular approaches were used to determine the functional role of four histidine residues (His(78), HiS(125), HiS(141) and His(189)) in the corrected sequence for AlbA. Treatment of AlbA with diethyl pyrocarbonate (DEPC), a histidine-specific alkylating reagent, reduced binding activity by about 95%. DEPC treatment increased absorbance at 240-244 nm by an amount indicating conversion to N-carbethoxyhistidine of a single histidine residue per AlbA molecule. Pretreatment with albicidin protected AlbA against modification by DEPC, with a 1 : 1 molar ratio of albicidin to the protected histidine residues. Based on protein secondary structure and amino acid surface probability indices, it is predicted that HiS125 might be the residue required for albicidin binding. Mutation of HiS125 to either alanine or leucine resulted in about 32% loss of binding activity, and deletion of HiS125 totally abolished binding activity. Mutation of HiS125 to arginine and tyrosine had no effect. These results indicate that HiS125 plays a key role either in an electrostatic interaction between AlbA and albicidin or in the conformational dynamics of the albicidin-binding site.

Characterization of Pantoea dispersa UQ68J: producer of a highly efficient sucrose isomerase for isomaltulose biosynthesis

Aims: Isolation, identification and characterization of a highly efficient isomaltulose producer. Methods and Results: After an enrichment procedure for bacteria likely to metabolize isomaltulose in sucrose-rich environments, 578 isolates were screened for efficient isomaltulose biosynthesis using an aniline/diphenylamine assay and capillary electrophoresis. An isolate designated UQ68J was exceptionally efficient in sucrose isomerase activity. Conversion of sucrose into isomaltulose by UQ68J (enzyme activity of 90-100 U mg(-1) DW) was much faster than the current industrial strain Protaminobacter rubrum CBS574.77 (41-66 U mg(-1) DW) or a reference strain of Erwinia rhapontici (0.3-0.9 U mg(-1) DW). Maximum yield of isomaltulose at 78-80% of supplied sucrose was achieved in less than half the reaction time needed by CBS574.77, and the amount of contaminating trehalulose (4%) was the lowest recorded from an isomaltulose-producing microbe. UQ68J is a Gram negative, facultatively anaerobic, motile, noncapsulate, straight rod-shaped bacterium producing acid but no gas from glucose. Based on 16S rDNA analysis UQ68J is closest to Klebsiella oxytoca, but it differs from Klebsiella in defining characteristics and most closely resembles Pantoea dispersa in phenotype. Significance and Impact of Study: This organism is likely to have substantial advantage over previously characterized sucrose isomerase producers for the industrial production of isomaltulose.

Enrichment, isolation and characterisation of ruminal bacteria that degrade non-protein amino acids from the tropical legume Acacia angustissima

Acacia angustissima has been proposed as a protein supplement in countries where low quality forages predominate. A number of non-protein amino acids have been identified in the leaves of A. angustissima and these have been linked to toxicity in ruminants. The non-protein amino acid 4-n-acetyl-2,4-diaminobutyric acid (ADAB) has been shown to be the major amino acid in the leaves of A. angustissima. The current study aimed to identify micro-organisms from the rumen environment capable of degrading ADAB by using a defined rumen-simulating media with an amino acid extract from A. angustissima. A mixed enrichment culture was obtained that exhibited substantial ADAB-degrading ability. Attempts to isolate an ADAB-degrading micro-organism were carried out, however no isolates were able to degrade ADAB in pure culture. This enrichment culture was also able to degrade the non-protein amino acids diaminobutyric acid (DABA) and diaminopropionic acid (DAPA) which have structural similarities to ADAB. Two isolates were obtained which could degrade DAPA. One isolate is a novel Grain-positive rod (strain LPLR3) which belongs to the Firmicutes and is not closely related to any previously isolated bacterium. The other isolate is strain LPSR1 which belongs to the Gammaproteobacteria and is closely related (99.93% similar) to Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae. The studies demonstrate that the rumen is a potential rich source of undiscovered micro-organisms which have novel capacities to degrade plant secondary compounds. (c) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

Characterization of the highly efficient sucrose isomerase from Pantoea dispersa UQ68J and cloning of the sucrose isomerase gene

Sucrose isomerase (SI) genes from Pantoea dispersa UQ68J, Klebsiella planticola UQ14S, and Erwinia rhapontici WAC2928 were cloned and expressed in Escherichia coli. The predicted products of the UQ14S and WAC2928 genes were similar to known SIs. The UQ68J SI differed substantially, and it showed the highest isomaltulose-producing efficiency in E. coli cells. The purified recombinant WAC2928 SI was unstable, whereas purified UQ68J and UQ14S SIs were very stable. UQ68J SI activity was optimal at pH 5 and 30 to 35 degrees C, and it produced a high ratio of isomaltulose to trehalulose (> 22:1) across its pH and temperature ranges for activity (pH 4 to 7 and 20 to 50 degrees C). In contrast, UQ14S SI showed optimal activity at pH 6 and 35 degrees C and produced a lower ratio of isomaltulose to trehalulose (< 8:1) across its pH and temperature ranges for activity. UQ68J SI had much higher catalytic efficiency; the K-m was 39.9 mM, the V-max was 638 U mg(-1), and the K-cat/K-m was 1.79 x 104 M-1 s(-1), compared to a K-m of 76.0 mM, a V-max. of 423 U mg(-1), and a K-cat/K-m of 0.62 x 104 M-1 s(-1) for UQ14S SI. UQ68J SI also showed no apparent reverse reaction producing glucose, fructose, or trehalulose from isomaltulose. These properties of the P. dispersa UQ68J enzyme are exceptional among purified SIs, and they indicate likely differences in the mechanism at the enzyme active site. They may favor the production of isomaltulose as an inhibitor of competing microbes in high-sucrose environments, and they are likely to be highly beneficial for industrial production of isomaltulose.

Phosphate forms an unusual tripodal complex with the Fe-Mn center of sweet potato purple acid phosphatase

Purple acid phosphatases (PAPs) are a family of binuclear metalloenzymes that catalyze the hydrolysis of phosphoric acid esters and anhydrides. A PAP in sweet potato has a unique, strongly antiferromagnetically coupled Fe(III)-Mn(II) center and is distinguished from other PAPs by its increased catalytic efficiency for a range of activated and unactivated phosphate esters, its strict requirement for Mn(II), and the presence of a mu-oxo bridge at pH 4.90. This enzyme displays maximum catalytic efficiency (k(cat)/K-m) at pH 4.5, whereas its catalytic rate constant (k(cat)) is maximal at near-neutral pH, and, in contrast to other PAPs, its catalytic parameters are not dependent on the pK(a) of the leaving group. The crystal structure of the phosphate-bound Fe(III)-Mn(II) PAP has been determined to 2.5-Angstrom resolution (final R-free value of 0.256). Structural comparisons of the active site of sweet potato, red kidney bean, and mammalian PAPs show several amino acid substitutions in the sweet potato enzyme that can account for its increased catalytic efficiency. The phosphate molecule binds in an unusual tripodal mode to the two metal ions, with two of the phosphate oxygen atoms binding to Fe(III) and Mn(II), a third oxygen atom bridging the two metal ions, and the fourth oxygen pointing toward the substrate binding pocket. This binding mode is unique among the known structures in this family but is reminiscent of phosphate binding to urease and of sulfate binding to A protein phosphatase. The structure and kinetics support the hypothesis that the bridging oxygen atom initiates hydrolysis.