Características físico-químicas, propriedades funcionais e perfil de compostos fenólicos de 17 variedades de maçãs portuguesas

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Qualidade Alimentar

Estudos de nutrição para a produção de clamidósporos de Pochonia chlamydosporia em cultura líquida estacionária

O fungo nematófago Pochonia chlamydosporia, estirpe PcMR, tem a capacidade de produzir clamidósporos em cultura líquida. Neste estudo quantificou-se o efeito da adição de hidratos de carbono (glucose, sacarose ou amido) ao meio basal de produção de clamidósporos (ALMA), e o efeito da substituição da lecitina no meio ALMA por outro lípido (ácidos gordos ou triglicéridos). Determinou-se as curvas de crescimento de clamidósporos e peso seco para o meio basal e meios ALMA + glucose, sendo medido o consumo de albumina, lecitina e glucose. Foram obtidas produções elevadas de clamidósporos (superior a 5X105 clamidósporos/ml) nos meios com 0 a 5g/L de glucose ou sacarose. A adição de maiores quantidades de hidratos de carbono ao meio ALMA leva à diminuição da produção de clamidósporos e a um aumento proporcional do peso seco. Ácidos gordos insaturados no meio ALMA permitem obter produções de clamidósporos superiores às obtidas com ácidos gordos saturados ou triglicéridos mas inferiores às obtidas com lecitina. No entanto, o peso seco final é menor quando se utiliza meio ALMA contendo ácidos gordos insaturados do que com quando se utilizam os restantes lípidos mais complexos estudados. O fungo desenvolve-se mais rapidamente nos meios com glucose, embora nesses meios a produção de clamidósporos se inicie mais tarde. Com elevadas quantidades de glucose no meio, o consumo de albumina é limitado, e a produção de clamidósporos é reduzida. Estes resultados mostram que os meios líquidos podem ser utilizados para a produção de elevadas quantidades de clamidósporos, permitem estabelecer alguns dos componentes mais importantes no processo de optimização industrial, e estabelecem a lecitina como o lípido mais importante na produção de clamidósporos.

Lab on paper: biossensores colorimétricos de papel para a detecção de membros do complexo Mycobacterium tuberculosis

Este trabalho foi realizado no âmbito do projecto Lab on Paper, desenvolvido no Centro de Investigação de Materiais (CENIMAT) da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (FCT - UNL)

Estudo da extração e caracterização de compostos bioativos a partir de casca, farelo e arroz de variedades portuguesas

O arroz é o alimento básico para milhões de pessoas no Mundo inteiro. Como tal, o seu valor nutricional é algo de extrema importância. Contudo, ao seu processamento está associado um desperdício dos resíduos que advêm do seu descasque e branqueamento, o farelo e a casca. O principal objetivo deste trabalho consistiu no estudo do valor nutricional do grão de arroz e da valorização dos resíduos (farelo e casca) através da avaliação da atividade antioxidante. O estudo foi aplicado a três frações do bago de arroz: grão, farelo e casca, de três subvariedades diferentes: opale, ariete e ellebi. Foi avaliado o perfil de macronutrientes nas amostras de arroz, entre eles o teor de humidade, cinza, proteína e gordura. O grão foi a fração que apresentou maior teor de humidade, o farelo a que apresentou maior teor de gordura e proteína e a casca maior teor de cinza. Os compostos bioativos foram extraídos pelo método de extração sólido-liquido, usando como solvente uma mistura aquosa de metanol. A caracterização dos compostos antioxidantes dos extratos foi analisada através do teste da eliminação dos radicais livres de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) e pelo método de Folin-Ciocalteau. Para a identificação dos compostos bioativos foi utilizada a técnica de UPLC-PDA (Cromatografia líquida de ultra eficiência - Detetor de matriz de Fotodíodos). A casca foi o extrato que continha uma maior capacidade antioxidante e um maior conteúdo de fenólicos totais (TPC), e o extrato do grão o que apresentou menor valor. Identicamente, foi na casca onde se conseguiu identificar um maior número de compostos, entre os quais se destacam os ácidos gentísico, isoferúlico, vanílico, elágico, p-cumárico e levulínico. A extração de compostos antioxidantes de farelo e casca de arroz demonstrou ser uma via bastante promissora para a valorização destes resíduos.

Deteção de Neisseria gonorrhoeae em amostras de urina de utentes de uma consulta de venereologia

Introdução: A vigilância epidemiológica dos agentes infeciosos é fundamental como atividade de controlo das doenças sexualmente transmissíveis. A gonorreia é uma das infeções sexualmente transmissíveis (IST) mais comum e é causada pela bactéria Neisseria gonorrhoeae. Os dados sobre os diferentes microrganismos causadores de IST são escassos em Portugal e a vigilância tradicional não é suficiente. Em muitos casos de infeção por N. gonorrhoeae, os pacientes são tratados empiricamente através de uma abordagem sindromática por vezes sem recurso a análises laboratoriais que confirmem a infeção e, além disso, existem os casos assintomáticos que contribuem para a contínua propagação da infeção por N. gonorrhoeae. A gonorreia é tratável e curável mas não está disponível uma vacina. Consequentemente, o controlo desta doença depende da identificação e tratamento de indivíduos infetados e dos seus contactos na rede de transmissão. Por outro lado, quando é efetuada cultura os resultados apresentam ocasionalmente falsos negativos, devido às características exigentes de crescimento da N. gonorrhoeae in vitro ou à automedicação prévia do doente. Objetivos: Avaliar a ocorrência de infeções por Neisseria gonorrhoeae entre utentes de uma consulta de venereologia, nos primeiros seis meses de 2011. Métodos: Estudo transversal. Amostragem consecutiva, cálculo do número de amostras pela fórmula de Wald para um nível de confiança de 95% e um erro de previsão de 3,3%. Foram analisadas 145 amostras de urina utilizando técnicas de amplificação de ácidos nucleicos com alvos diferentes. A identificação de Neisseria gonorrhoeae foi efetuada pela deteção de uma sequência do pseudogene porA de N. gonorrhoeae por técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real e pela deteção de uma sequência do gene ccpB de N. gonorrhoeae por técnica de PCR. Critérios de exclusão: recusa em participar ou apresentar problemas para o entendimento do consentimento livre e informado. Resultados: Foi detetada Neisseria gonorrhoeae em 8 doentes – 5,5 % de prevalência global. A prevalência entre indivíduos com infeção sexualmente transmissível prévia (n = 35) foi significativamente mais elevada (p = 0,032). Neste grupo detetou-se N. gonorrhoeae em 4 doentes (11,43 %). Em doentes com queixas de exsudado uretral (n = 29), foi detetada N. gonorrhoeae em seis (20,69 %), demonstrando que a prevalência entre os indivíduos com este sintoma é, também, significativamente mais elevada (p = 0,001). A coinfecção com Clamydia trachomatis foi observada em 1,4 % dos casos (2/145). A percentagem de casos assintomáticos foi de 12,5 % (1/8). As técnicas de PCR utilizadas neste estudo demonstraram-se igualmente especificas para a deteção de N. gonorrhoeae e ambas mais sensíveis relativamente à cultura. Neste estudo as estirpes isoladas em cultura apresentaram resistência a penicilina em 25 % dos casos, 37,5 % a tetraciclinas e 12,5 % eram produtoras de β-lactamases. Conclusões: A prevalência determinada neste estudo encontra-se superior ao esperado. Os resultados deste estudo indicam a existência de um importante problema de saúde pública e a necessidade de considerar a implementação de rastreios em grupos específicos de população. Este estudo confirma que as técnicas de PCR com os alvos porA e ccpB são satisfatórias para a deteção de Neisseria gonorrhoeae em amostras de urina. Apesar da percentagem de estirpes resistentes a tetraciclinas e penicilina ser elevada não foram demonstradas resistências a fluoroquinolonas ou cefalosporinas nas estirpes estudadas.

Utilização de redes neuronais artificiais como ferramenta de gestão de processos de digestão anaeróbia. Caso de estudo – ETAR do Seixal

As redes neuronais artificiais (RNA) têm sido apontadas como uma boa ferramenta de gestão da digestão anaeróbia, e o presente trabalho procurou explorar as funcionalidades de um aplicativo informático de criação de RNA, analisando a sua capacidade para modelar e otimizar os processos anaeróbios. O trabalho inseriu-se num estudo mais amplo, desenvolvido pelo grupo Águas de Portugal, no qual se pretendeu obter uma visão mais alargada e robusta da aplicabilidade deste tipo de ferramentas em digestores anaeróbios de diferentes instalações. O caso de estudo foi a ETAR do Seixal, pertencente à SIMARSUL, e o software utilizado foi o NeuralTools®. O desenvolvimento do estudo iniciou-se com a preparação dos dados referentes à ETAR do Seixal, tendo-se considerado esta como sendo a etapa determinante. A partir da caracterização das variáveis e de uma análise de correlações entre elas, foi possível selecionar 20 variáveis a integrar nos ensaios de treino e de teste, cujos principais objetivos se prenderam com a identificação da RNA com maior capacidade para prever o biogás produzido e a seleção das variáveis mais adequadas para a modelação dos processos anaeróbios. O treino e teste de redes envolveu a realização de 266 ensaios, a partir dos quais se identificaram as cinco melhores redes para previsão. A melhor RNA foi criada a partir dos dados de tempo de retenção hidráulico, pH, temperatura, ácidos gordos voláteis e alcalinidade total do digestor, e permitiu obter boas previsões do biogás produzido. Os resultados alcançados com esta rede ficaram, contudo, aquém dos valores de referência de uma previsão considerada “muito boa” e o reduzido número de casos usados para treinar a rede afigura-se como a principal causa. A escassez de dados constituiu, de resto, a principal limitação ao longo do estudo, permitindo realçar a importância da monitorização na gestão da digestão anaeróbia.

Caracterização de propriedades nutricionais e antioxidantes de chás do Arquipélago dos Açores e valorização dos seus resíduos

Neste trabalho estudou-se a composição e actividade antioxidante de chás verdes e pretos (8 provenientes dos Açores, e 11 de outras origens), 4 chás vermelhos e 6 tisanas de ervas. A composição mineral das folhas de chá e das correspondentes infusões de 5 e 15 minutos foi avaliada no que se refere aos macroelementos (K, Ca, Mg e Na) com valor nutricional e ao alumínio (Al), tendo-se verificado que as suas concentrações dependem do tipo de chá e do tempo de infusão. A actividade antioxidante dos chás e tisanas foi avaliada pela reacção de Folin Ciocalteu, a actividade antiradicalar (DPPH) e actividade redutora férrica (FRAP). Estas actividades aumentaram ou diminuiram com o tempo de infusão e dependendo do tipo de chá e do teste específico o que indica diferentes cinéticas de extracção e degradação de compostos específicos. Os compostos fenólicos dos chás foram quantificados por HPLC-DAD e agrupados nas famílias de catequinas, metilxantinas, ácidos hidroxibenzóicos e hidroxicinâmicos, teoflavinas, flavonas, flavonóis, e seus derivados glicosilados e/ou acilados. A cinética de extracção destes compostos foi avaliada em dois chás dos Açores para tempos de infusão entre 5 min e 60 min. Testaram-se diferenças significativas na composição dos chás e correlações entre composição e actividade antioxidante. A valorização de resíduos dos chás Gorreana como matérias-primas para a produção de suplementos nutracêuticos foi estudada efectuando a extracção de dois chás dos Açores e de dois resíduos de chá utilizando água, etanol acetona e suas misturas. Os resultados mostraram que a polaridade do solvente afectou significativamente o teor de polifenóis, actividade antioxidante e actividade antimicrobiana dos extractos. Os extractos de chá verde inibiram o crescimento de bactérias gram-positivas (Staphylococcus aureus e Staphylococcus aureus resistentes à meticilina), e observou-se uma correlacção forte entre teor de polifenóis e as actividades antioxidante e antimicrobiana de extractos de chá.

Unravelling the role of alpha 2,6 sialic acid on mouse dentritic cells functions

RESUMO: As células dendríticas (CDs) são fundamentais na imunomodulação e iniciação de respostas imunes adaptativas, enquanto os ácidos siálicos (Sias) são potenciais imunomoduladores. Estas células expressam níveis elevados da sialiltransferase ST6Gal-1, que transfere Sias para a posição terminal de oligossacáridos. De facto, a maturação de CDs está associada a uma diminuição da sialilação na sua superfície celular. Apesar de ter função biológica desconhecida, a forma solúvel, extracelular de ST6Gal-1 aumenta em cancros e inflamação. Ainda assim, esta foi recentemente identificada como moduladora da hematopoiese. Considerando o importante papel das CDs na iniciação de respostas anticancerígenas, uma ligação entre a sialilação extrínseca induzida por ST6Gal-1 extracelular e o seu papel na modulação de CDs deve ser identificada. Neste trabalho hipotetizou-se que a sialilação α2,6 extrínseca de CDs diminui o seu perfil de maturação mediante ativação por lipopolissacarídeo (LPS). O objetivo principal foi sialilar extrinsecamente em α2,6 CDs da medula óssea de murganhos, avaliando os seus perfis de maturação e de libertação de citocinas, após estimulação com LPS (por Citometria de Fluxo e ELISA, respetivamente). Ao contrário da hipótese, o perfil celular não foi modulado, usando várias abordagens. Por outro lado, a consequência da falta de α2,6 Sias na maturação de CDs foi avaliada analisando: 1) CDs da medula óssea de murganhos tratadas com sialidase, 2) CDs da medula óssea e 3) CDs das vias aéreas, ambas de murganhos deficientes em ST6Gal-1, comparando com a estirpe selvagem. Estes resultados sugerem que a perta total de α2,6 Sias se relaciona com o aumento da expressão do complexo de histocompatibilidade principal de classe II. Apesar de controverso, é provável existirem mecanismos inerentes à ativação por LPS, reduzindo a eficácia de ST6Gal-1 extracelular. Por outro lado, a modificação no perfil de CDs de murganhos deficientes em ST6Gal-1 poderá relacionar-se com uma predisposição para um estado inflamatório severo. Com isto, o trabalho desenvolvido abriu futuras linhas de investigação, nomeadamente explorar outros fatores envolvidos na (de)sialilação α2,6 de CDs, podendo ter impacto em imunoterapia com uso de CDs.--------------------------ABSTRACT: Dendritic cells (DCs) are vital for immunomodulation and the initiation of adaptive immune responses, whereas sialic acids (Sias) are potential immunomodulators. These cells express high levels of sialyltransferase ST6Gal-1, responsible for transferring Sias to the terminal position of oligosaccharide chains. Indeed, DCs’ maturation is associated with decreased cell surface sialylation. Although its biological significance is unknown, the soluble, extracellular form of ST6Gal-1 increases in cancers and inflammation. However, extracellular ST6Gal-1 was recently identified as modulator of hematopoiesis. Considering that DCs play a crucial role in the initiation of a productive anti-cancer immune response, a link between extrinsic sialylation by the extracellular ST6Gal-1 on DC function needs to be investigated. We hypothesize that extrinsic α2,6 sialylation of DCs diminishes their maturation features upon lipopolysaccharide (LPS) stimulation. The main goal was to extrinsically α2,6 sialylate mice bone marrow derived DCs (BMDCs) and to evaluate their maturation and cytokine profiles upon LPS stimulation (by Flow Cytometry and ELISA, respectively). Unlike the hypothesis, we observed that BMDCs’ profile is not modulated, even using several approaches. In contrast, the consequence of lacking cell surface α2,6 Sias in DC maturation was assessed by analysing: 1) sialidase treated BMDCs, 2) BMDCs from mice lacking ST6Gal-1 and 3) DCs from mice airways, comparing wild type with ST6Gal-1 knockout mice. These results suggest that overall lack in α2,6 Sias is related with increased expression of major histocompatibility class II (MHC-II). Although appearing to be controversial findings, other intracellular mechanisms might be occurring upon LPS-induced BMDC activation, probably reducing extracellular ST6Gal-1 effect. In opposite, the modification observed in DC profile of ST6Gal-1 knockout mice might be related to its predisposition to a more severe inflammatory status. With this, the developed work opened future lines of investigation, namely exploring other factors involved in α2,6 (de)sialylation of DC, which might have influence in immunotherapy using DCs.

Desenvolvimento de soluções para aproveitamento de subproduto da produção de Biodiesel e outras matérias-primas com acidez livre

A presente dissertação tem como objectivo o estudo de soluções para o aproveitamento de um subproduto com elevado teor em ácidos gordos livres (FFA) produzido na Unidade de Produção de Biodiesel da IBEROL, bem como a incorporação de matérias-primas alternativas de segunda geração. Para tal, foi elaborado um estudo de viabilidade económica assente em 5 propostas, solicitadas a 5 fornecedores, correspondendo cada uma delas a uma diferente tecnologia de pré-tratamento de matérias-primas com elevada acidez (A a E). Estabeleceram-se, previamente, critérios técnicos e económicos que permitiram avaliar as propostas e efectuar a sua hierarquização. Em seguida, foi realizada uma análise de sensibilidade a alguns parâmetros da qual resultaram 23 cenários, que se revelaram pouco influentes para a selecção do pré-tratamento, devido aos resultados negativos que apresentaram. Como tal, passou-se à análise de cenários estratégicos, da qual se concluiu que a instalação de um pré-tratamento só compensa para valores de incorporação de MPRs elevados. Com base na avaliação dos diferentes cenários acima mencionados, foi possível afirmar que as tecnologias C e D são as que apresentariam melhores resultados em termos económicos para a empresa. Contudo, devido à proximidade dos valores de VAL e Payback time obtidos em ambos os casos, é importante salvaguardar que existem grandes diferenças entre as duas tecnologias, no que toca às condições operatórias. Assim, pelos critérios técnicos, conclui-se que a redução do elevado teor de ácidos gordos livres presentes em matérias-primas como as gorduras animais e os óleos vegetais usados pode ser eficientemente levada a cabo pela tecnologia D, sem limitações no que diz respeito à acidez à entrada do processo, como as que se verificam na tecnologia C. Foi também estudada, a possibilidade de um revamping à Unidade de Neutralização e Desgomagem química da IBEROL para um aumento de capacidade de produção de óleo neutro. Após a realização de várias experiências, concluiu-se que seriam necessárias algumas alterações à unidade actual, executáveis com um baixo investimento, nomeadamente, uma intervenção para aumento do número de placas dos permutadores. Para as condições habituais (acidez e incorporação) de operação da neutralização e desgomagem química, prevê-se um aumento de capacidade de, aproximadamente,11%.

Desenvolvimento de membranas catalíticas ácidas para a metanólise do ácido palmítico: estudo do efeito da reticulação

A produção de biodiesel tem sido afectada, ao nível dos custos de produção, pela falta de matérias-primas adequadas que não entrem em competição com a indústria alimentar. A matéria-prima original para a produção de biodiesel é o óleo de soja alimentar, porém a sua utilização origina problemas significativos a nível político e económico. Desta forma, a indústria do biodiesel encontra-se empenhada na modificação para matériasprimas alternativas e de baixo custo. Contudo, estas matérias-primas apresentam elevados níveis de ácidos gordos livres, sendo por isso necessária a eliminação dos ácidos gordos livres. Neste trabalho experimental é proposta a metanólise do ácido palmítico catalisada por membranas poliméricas catalíticas ácidas, utilizadas num reactor de membrana com pervaporação simultânea. Este processo é uma alternativa á destilação reactiva visto que permite a integração da reacção e da separação numa única operação, pelo que é possível a optimização energética, a maximização da conversão e a eliminação de solventes de extracção. Foi efectuado o estudo cinético da reacção de esterificação catalisada pelo catalisador KIT-6 sulfonado. Este catalisador foi caracterizado por titulação ácido-base. Prepararam-se membranas catalíticas compósitas por dispersão do KIT-6 sulfonado em matrizes de poli(álcool vinílico) reticulado com glutaraldeído ou hexametilenodiisocianato. As membranas foram caracterizadas por medição de ângulos de contacto, percentagem de inchamento e por FTIR. Os efeitos do tipo de reticulante e da percentagem de reticulação nas propriedades de transporte e de sorção das membranas, foram estudados em reactor bacth, com as membranas cortadas em pedaços. Os elevados períodos de indução apresentados pelas curvas cinéticas obtidas sugerem que a água formada na reacção afecta de forma pronunciada as propriedades de transporte das membranas. Esta hipótese foi suportada pelo bom ajuste dum modelo cinético-difusional aos pontos experimentais. Por fim, foi testada uma membrana em reactor de membrana com pervaporação simultânea, utilizando azoto seco como gás de varrimento.

Understanding how dentritic cell glycans affect antitumor immune responses

RESUMO: As células dendríticas (DCs) têm a capacidade única de induzir respostas imunitárias contra as células tumorais, fagocitando antigénios tumorais e apresentando-os às células T, provocando respostas imunitárias específicas que conduzem à eliminação de células de tumorais. Por induzirem memória imunológica de longa duração, as DCs são uma estratégia atrativa para o tratamento e/ou prevenção do cancro. No entanto, os resultados terapêuticos obtidos em ensaios clínicos com DCs são escassos e pouco eficientes. O nosso grupo demonstrou que ácidos siálicos que contêm glicanos desempenham um papel funcional importante em DCs geradas ex vivo. Com o objetivo de estabelecer um modelo in vitro para avaliar a resposta anti-tumoral específica realizou-se um tratamento enzimático a DCs derivadas de monócitos (moDCs) com sialidase, enzima que cliva ácidos siálicos na superfície celular. O perfil de maturação de moDCs foi caracterizado por citometria de fluxo e expressão de citocinas. Os resultados mostram que a sialidase pode regular positivamente a expressão de moléculas co-estimuladoras na superfície de moDCs estimuladas com agonistas de Toll like receptors (TLRs). Para percebermos se o tratamento com sialidase afeta a sinalização dos TLRs foram usadas células HEK transfectadas de forma estável com TLRs 2, 4 and 7/8. Os dados mostraram que a desialilação não afeta a sinalização através estes recetores. Para investigar o impacto funcional da sialidase na capacidade de moDCs em apresentar um antigénio e ativar células T, moDCs foram tratadas, ou não, com sialidase e cultivadas com clones de células T CD8+ específicas para os péptidos derivados do antigénio tumoral gp100. Os resultados mostram que DCs HLA*02:01+ desialiladas exibem maior cross-presentation do péptido gp100280-288 às células T CD8+ específicas. Além disso o tratamento com sialidase também aumenta a capacidade de DCs de induzir a proliferação de células T CD4+. Em conjunto, os resultados indicam que moDCs com menos ácidos siálicos na superfície, têm melhor potencial imuno-estimulador, com maior capacidade de induzir respostas imunes anti-tumorais.--------------------- ABSTRACT: Dendritic cells (DCs) have a unique capacity to induce immune responses against tumor cells. They can phagocyte tumor antigens, maturate and present them to T cells, triggering antigen-specific immune responses that may lead to the elimination of tumor cells. Since they induce long-lasting immunological memory, DCs become an attractive strategy as cellular targets for vaccines in the treatment and/or prevention of cancer. However, the therapeutic results obtained in clinical trials with DCs are scarce and only few patients effectively respond to the DC vaccines. Our group has shown that sialic acid containing glycans play an important functional role in ex vivo generated DC. Here we aimed to establish an in vitro model to assess specific antitumor responses. To achieve this, an enzymatic treatment of monocyte-derived DCs (moDCs) was performed using sialidase to cleave surface sialic acids. The maturation profile of the moDCs was characterized by flow cytometry and cytokine expression. The results show that sialidase treatment can upregulate co-stimulatory molecules on surface of moDCs stimulated with Toll like receptor (TLR) agonists. To understand whether sialidase treatment affected the TLR signaling, we have used HEK cells stably transfected with TLRs 2, 4 and 7/8. The data showed that desialylation of moDCs does not affect the signaling via these receptors. To investigate the functional impact of sialidase treatment in the capacity of moDCs to present antigen and to activate antigen specific T cells, sialidase treated and untreated moDCs were co-cultured with CD8+ T cell clones specific for peptides derived from the gp100 tumor antigen. Our results show that desialylated HLA02:01+ DCs are superior in cross-presentation of the peptide to gp100280–288 specific CD8+ T cells. In addition, sialidase treatment also increased the DC capacity to induce CD4+ T cells proliferation. Together, these data indicate that moDCs with altered cell surface sialic acids, through a sialidase treatment, have a better immunostimulatory potential which could improve anti-tumor immune responses.

Estudo químico das sementes de bacuri.

A análise comparativa das sementes de bacuri e baripari mostrou, com respeito à gordura, diferenças na composição quantitativa de seus ácidos graxos (ácidos palmítico 44,2: 42,3, palmitoleíco 13,2:1,0, estárico 2,3:4, 6, oleíco 37,8:39,9 e linoleíco 2,5:12,3; %:%, respectivamente), além da presença de tripalmitina nos extrativos graxos das sementes de bacuri, podem ser indicadas como fontes alternativas à indústria.

Estudo preliminar das sementes e do óleo de cinco espécies da amazônia.

Resultadospreliminares são apresentados sobre a composição das sementes e dos óleos das seguintes espécies da Amazônia: Couroupita guianensis, Pachira aquatica, Eglerodendron pariri, Parkia gigantocarpae Parkia opositifolta,o que representa parte de uma tentativa de se estabelecer, aditivamente, o potencial econômico daquela região. Enquanto as duas primeiras, pelo teor de óleo apresentado (29,4 e 44,1%, respectivamente) podem ser considerados como oleaginosas, as duas espécies de Parkiaapresentaram proteínas com altoteor de triptofano, merecendo ser estudadasmais detalhadamente. A espécie Eglerodendron pariri,ao contrário, não se revelou como fonte potencial,quantitativa ou qualitativa, quer de óleo, quer de proteína. Na espécie Couroupia guianensisencontrou-se predominância de ácido linoleico (>80%) enquanto que nas amostras de óleo de Parkia gigantocarpae P. opositifoliasobressai a presença de 12-15% de ácidos de peso molecular elevado (C20:0 e C22:00) e um teor de aproximadamente 40% de C18:2. 0 ácido palmítico é o principal componente dos Óleos de Pachira aquaticae Eglerodendron pariri.A separação e a identificação de ácidos responsáveis, no Óleo de P. aquatica,pela resposta positiva ao teste de Halphen, não foram definitivas. Nos cinco óleos o β-sitosterol foi o componente maior da fração esterólica, isoladaa partir do material insaponificável.

The role of α2,3- and α2,6-sialylation

RESUMO: Os glicoconjugados que decoram a superfície celular e os lípidos e proteínas secretados ocupam o ponto de encontro onde normalmente ocorrem interacções críticas homólogas (hospedeiro-hospedeiro) e heterólogas (hospedeiro-patogénio). Apesar de ser largamente aceite que os glicanos são parte integrante do processo de imunidade, continua a não ser claro qual o papel que os glicanos, em toda a sua diversidade, tomam no quadro geral da imunidade. Os glicanos, que são frequentemente terminados por resíduos de ácido siálico, podem ser alterados por factores externos, tais como patogénios, ou por acontecimentos fisiológicos celulares específicos. Normalmente em posição terminal, as glico-estruturas que contêm ácido siálico assumem um papel fundamental numa quantidade substancial de receptores imunes envolvidos na adesividade e tráfico celular, tal como as Selectinas e as Siglecs, das quais se sabe apresentarem uma relevante função imune. À altura do início desta tese, era sabido que os ácidos siálicos expressos à superfície das células poderiam modular mecanismos importantes nas respostas imunes adaptativas. Considerando a posição de charneira que as células dendríticas (DCs) ocupam na transição da resposta imune inata para a adaptativa, antecipámos que os ácidos siálicos poderiam também modular mecanismos relevantes nas DCs humanas. As DCs têm uma função muito relevante na verificação e captura antigénica, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica aos linfócitos, uma sequência de funções que conduz, em ultima instância, à indução da resposta inata adaptativa. Considerando estas premissas, a nossa hipótese principal foi que os ácidos siálicos podem influenciar funções relevantes das DCs, tais como captura de antigénios, maturação, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica às células Para testar esta hipótese, dividimos o trabalho em quatro partes: 1) Analisámos os glicanos sialilados de superfície, expressos durante a diferenciação de monócitos humanos em DCs (moDCs). Os nossos dados mostraram que a expressão dos glicanos com ligações em O (O-glicanos) e sialilados em α2,3, assim como glicanos com ligações em N (N-glicanos) sialilados em α2,6 e α2,3 aumentou durante o processo de diferenciação das moDCs. Contribuindo para esta nova configuração glicosídica, três sialiltransferases (STs) poderão estar envolvidas: a ST6Gal-1 correlaciona-se com a expressão aumentada de N-glicanos sialilados em α2,6; a ST3Gal-1 contribui para a sialilação em α2,3 de O-glicanos, em especial de antigénios T; e a ST3Gal-4 poderá ser responsável pelo aumento de N-glicanos sialilados em α2,3. Após estímulo e consequente maturação das moDCs, ambos os níveis de expressão génica de ST6Gal-1 e ST3Gal-4 são negativamente modificados sendo, também, que a expressão de ST3Gal-1 varia consoante o estímulo. 2) Estudámos posteriormente as consequências da modulação dos ácidos siálicos de superfície nas funções das DCs. Observámos que a remoção dos ácidos siálicos de superfície diminui significativamente a capacidade de macropinocitose e endocitose mediada por receptores nas moDCs. Em contrapartida, o tratamento com sialidase aumentou significativamente a capacidade das moDCs para fagocitar Escherichia coli. Determinou-se também que este mecanismo requer a existência de ácido siálico presente nas E. coli indicando um mecanismo de interacção hospedeiro-patogénio dependente de ácido siálico em ambas as partes envolvidas. As moDCs tratadas com sialidase também apresentam um nível superior de expressão de moléculas de MHC e moléculas co-estimulatórias, sugerindo um fenótipo celular mais maduro. Recorrendo ao modelo de ratinho, utilizaram-se DCs derivadas de células da medula (BMDCs) de ratinhos deficientes em ST3Gal-1 e ST6Gal-1. Estes ensaios revelaram que quer a endocitose quer a maturação são influenciadas por modificações 37 nos glicanos sialilados em α2,3 ou α2,6. A detecção e quantificação de proteínas Nglicosiladas e sialiladas em α2,6 apontou para um potencial envolvimento de integrinas β2 nestes mecanismos. 3) O efeito da sialilação em α2,6 na migração das DCs para os gânglios linfáticos foi também analisado. Observámos que BMDCs deficientes para ST6Gal-1 apresentam uma redução de cerca de 50% nos níveis de migração das DCs para os gânglios linfáticos, tal como aferido em ensaios de inflamação in situ e estudos de transferência adoptiva de células. Uma redução dos níveis deste tipo de migração foi também observada quando BMDCs nativas foram transferidas para ratinhos receptores deficientes em ST6Gal-1. São, contudo, necessários mais ensaios de forma a identificar as moléculas envolvidas neste processo. 4) Por último, analisámos o impacto da sialilação na estimulação antigénica das DCs às células T. Assim, concluiu-se que moDCs tratadas com sialidase apresentam um nível de expressão superior de IL-12, TNF-ɑ, IL-6 e IL-10, e activação do factor de transcrição nuclear kappa B (NF-κB). As DCs tratadas com sialidase induziram uma maior proliferação nas células T, com expressão correspondente de interferão-γ. Este dado sugere que a remoção de ácidos siálicos de superfície contribui para o desenvolvimento de uma resposta pro-inflamatória do tipo 1 por células T auxiliares (resposta Th1). Considerando estes dados no seu todo, concluímos que o ácido siálico tem um papel marcante nas funções imunes das DCs. Alterações à concentração de ácido siálico à superfície das células podem alterar a endocitose/fagocitose, maturação, migração para os tecidos e gânglios linfáticos e capacidade estimulatória para com as células T. Complementando estes dados, as ligações glicosídicas de ácidos siálicos criados por ST6Gal-1 e ST3Gal-1 são funcionalmente relevantes. A modulação programada da sialilação do glicocálice, mediada por sialidases individuais ou sialiltransferases é uma possibilidade aceitável para a melhoria da fagocitose por DCs e da sua potência imunológica. Este facto tem um significado particular para imunoterapias baseadas em DCs, podendo provar-se decisivo para a sua eficiência e aplicabilidade num futuro muito próximo.-------------------------------ABSTRACT: Glycans decorating cell surface and secreted proteins and lipids occupy the junction where critical host–host and host-pathogen interactions occur. In spite of the wide acceptance that glycans are centrally implicated in immunity, exactly how glycans and their variety and variability contribute to the overall immune response remains poorly defined. Glycans, frequently terminated by sialic acid residues, may be modified by external factors such as pathogens or upon specific physiological cellular events. The terminal, privileged positions of sialic acid-modified structures makes them key, fundamental determinants for a number of immune receptors with known involvement in cellular adhesiveness and cell trafficking, such as Selectins and Siglecs, with known relevant immune functions. At the time this thesis was initiated, it was established that sialic acids expressed at cell surface could modulate important mechanisms of the adaptive immune responses. Given the key role of dendritic cells (DCs) in the transition from innate to the adaptive immune responses, we anticipated that sialic acids could also modulate important mechanisms of human DCs. DCs have a relevant role in antigen screening and uptake, migration to lymph nodes and antigen presentation to lymphocytes, ultimately triggering the adaptive immune response. Therefore, our primary hypothesis was that sialic acids may modulate DC functions, such as antigen uptake, maturation, homing to lymph nodes and antigen presentation to T cells. To test this hypothesis, we divided our work in four parts. 1) Surface sialylated glycans expressed during differentiation from human monocytes to DCs (moDCs) were analyzed. Our data showed that α2,3-sialylated O-glycans and α2,6- and α2,3-sialylated N-glycans expression increased during moDC differentiation. Three main sialyltransferases (STs) are committed with this new glycan configuration: ST6Gal- 1 correlates with the increased expression of α2,6-sialylated N-glycans; ST3Gal-1 32 contributes for the α2,3-sialylation of O-glycans, especially T antigens; and ST3Gal-4 may contribute for the increased α2,3-sialylated N-glycans. Upon moDC maturation, ST6Gal-1 and ST3Gal-4 are downregulated and ST3Gal-1 is altered in a stimulus dependent manner. 2) We subsequently analyzed the consequences of the modulation of cell surface sialic acids in DC functions. We observed that removing surface sialic acid by sialidase significantly decreased the capacity of moDCs to micropinocytose and receptormediated endocytose. In contrast, treatment with a sialidase significantly improved the capacity of moDCs to phagocytose Escherichia coli. The improved phagocytosis mechanism required E. coli sialic acids, indicating a mechanism of host–pathogen interaction dependent on sialic acid moieties. Sialidase-treated moDCs have increased expression of MHC and co-stimulatory molecules, suggesting a more mature phenotype. Experiments using mouse bone marrow-derived DCs (BMDCs) from ST3Gal-1-/- and ST6Gal-1-/- strains indicated that endocytosis and maturation are influenced by changes in either α2,3 or α2,6-sialylated glycans. The analysis of α2,6-sialylated, N-glycosylated proteins, strongly suggested the potential involvement of β2 integrins, underlying these mechanisms. 3) The effect of α2,6-sialylation in DC homing to lymph nodes was also analyzed. We observed that BMDCs deficient for ST6Gal-1 have an almost 50% reduction in DC homing, as assayed by in situ inflammation and adoptive transfer studies. A reduction in DC homing was also observed when wild type BMDCs were transferred into ST6Gal-1-/- recipient mice. Further investigations are necessary to identify the molecules involved in this process. 4) Finally, we also analyzed the impact of sialylation on DCs ability to prime T cells. Sialidase-treated moDCs show increased gene expression of IL-12, TNF-α, IL-6 and IL- 10 cytokines, and activation of the transcription factor nuclear factor-κB. Sialidase33 treated DCs induced a higher proliferative response of T cells with concomitant higher expression of interferon-γ, suggesting that the clearance of cell surface sialic acids contributes to the development of a T helper type 1 proinflammatory response. Together, our data strongly support sialic acid’s relevance in DC immune functions. Alterations of cell surface sialic acid content can alter the endocytosis/phagocytosis, maturation, migration/homing and the ability for T cell priming in human DCs. Moreover, sialic acid linkages created by ST6Gal-1 and ST3Gal-1 are functionally relevant. The engineering of cell surface sialylation, mediated by individual sialidases or sialyltransferases is a likely possibility to fine tune DC phagocytosis and immunological potency, with particular significance to DC-based therapies.

Lignóides de plantas amazônicas: investigações biológicas e químicas

Lignóides, arilpropanóides aligoméricos, possuem atividade aleloquímica nas plantas nas quais ocorrem a ação farmacológica no homem, fato que já levou a aplicações terapêuticas importantes. Os grupos mais numerosos são constituídos pelas lignanas, derivadas pela condensação oxidativa de álcoois cinamílicos entre sí ou com ácidos cinâmicos, e pelas neolignanas, derivadas pela condensação oxidativa de alilfenóis e de propenilfenóis entre sí ou cruzada. A química das lignanas é conhecida desde longa data. A química das neolignanas começou a ficar conhecida em época recente, principalmente atráves de nossos trabalhos próprios com plantas da Amazônia.