Studio della trasduzione del Segnale Nucleare Inositide-Dipendente: identificazione di eEF1A2 come nuovo Fosfosubstrato di PKC βI

Introduction Phospholipase Cb1 (PLC-β1) is a key player in the regulation of nuclear inositol lipid signaling and of a wide range of cellular functions, such as proliferation and differentiation (1,2,3). PLCb1 signaling depends on the cleavage of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and the formation of the second messengers diacylglycerol and Inositol tris-phosphate which activate canonical protein kinase C (cPKC) isoforms. Here we describe a proteomic approach to find out a potential effector of nuclear PLC-b1 dependent signaling during insulin stimulated myogenic differentiation. Methods Nuclear lysates obtained from insulin induced C2C12 myoblasts were immunoprecipitated with anti-phospho-substrate cPKC antibody. Proteins, stained with Comassie blue, were excised, digested and subsequently analysed in LC-MS/MS. For peptide sequence searching, the mass spectra were processed and analyzed using the Mascot MS/MS ion search program with the NCBI database. Western blotting, GST-pull down and co-immunoprecipitation were performed to study the interaction between eEF1A2 and cPKCs. Site direct mutagenesis was performed to confirm the phosphorylated motif recognized by the antibody. Immunofluorescence analysis, GFP-tagged eEF1A2 vector and subcellular fractionation were performed to study nuclear localization and relative distribution of eEF1A2. Results We have previously shown that PLC-β1 is greatly increased at the nuclear level during insulin-induced myoblasts differentiation and that this nuclear localization is essential for induction of differentiation. Thus, nuclear proteins of insulin stimulated C2C12 myoblasts, were immunoprecipitated with an anti-phospho-substrate cPKC antibody. After Electrophoretic gel separation of proteins immunoprecipitated, several molecules were identified by LC-MS/MS. Among these most relevant and unexpected was eukaryotic elongation factor 1 alpha 2 (eEF1A2). We found that eEF1A2 is phosphorylated by PKCb1 and that these two molecules coimmunolocalized at the nucleolar level. eEF1A2 could be phosphorylated in many sites among which both threonine and serine residues. By site direct mutagenesis we demonstrated that it is the serine residue of the motif recognized by the antibody that is specifically phosphorylated by PKCb1. The silencing of PLCb1 gives rise to a reduction of expression and phosphorylation levels of eEF1A2 indicating this molecule as a target of nuclear PLCb1 regulatory network during myoblasts differentiation.

Un nuovo processo per la sintesi di acroleina e acido acrilico da glicerolo

La trasformazione di glicerolo ad acido acrilico può essere un fattore importante per la valorizzazione del processo di produzione di biodiesel, il quale prevede la coproduzione di enormi quantità di glicerolo. La sintesi di acido acrilico in un unico step è stata studiata attraverso vari catalizzatori solidi bifunzionali di diversa natura, contenenti proprietà acide e redox. I catalizzatori devono avere un’adeguata acidità di Brønsted per promuovere la trasformazione di glicerolo ad acroleina, mentre le proprietà ossidanti, necessarie per la sintesi di acido acrilico sono ottenute mediante l’inserimento di un metallo ossidante nella struttura. Si vuole quindi sintetizzare e testare una serie di catalizzatori che mostrino questa bifunzionalità in grado di soddisfare requisiti di attività e selettività nei confronti della reazioni . Per questo studio sono stati sintetizzati e caratterizzati ossidi misti di W/V, nella forma di aggregati dispersi sulla titania ed ossidi misti di Zr/Nb/V in struttura bulk. Sono stati quindi eseguiti dei test di reattività in fase gas ed in presenza di ossigeno utilizzando un reattore tubolare in quarzo a letto fisso.

DALLA TERRA DESOLATA ALLA MAPPA DEL NUOVO MONDO: percorso mitografico - letterario sull'influsso di T.S. Eliot nell'ambito della poesia di D. Walcott

Questo progetto intende indagare il rapporto privilegiato che Derek Walcott intesse con gli scrittori che lo hanno preceduto, e in particolare con T.S.Eliot. Attraverso l ‘analisi di un percorso mitografico letterario emerge la rilevanza che per entrambi i poeti assumono sia il paesaggio che il mito. La ricerca svolta si focalizza prevalentemente su The Waste Land di T.S.Eliot e Mappa del Nuovo Mondo di Derek Walcott.

Archeologia e storia del Fayyum durante il Nuovo Regno

La presente ricerca prende in esame le dinamiche archeologiche e storiche della regione egiziana del Fayyum durante il Nuovo Regno (1552 – 1069 a.C.). L’elaborato è suddiviso in quattro parti: la prima analizza tutti i contesti archeologici che hanno restituito materiale databile al Bronzo Tardo, la seconda riguarda, invece, la catalogazione di tutti i documenti iscritti provenienti dalla regione e databili al medesimo periodo. La terza parte rappresenta la sintesi dei dati acquisiti nelle due precedenti sezioni e descrive il divenire storico regionale tra XVIII, XIX e XX dinastia, mentre la quarta parte, un’appendice prosopografica, chiude l’intero studio. I contesti archeologici fayyumici che hanno restituito materiale databile al Bronzo Tardo sono solamente sette: Gurob, el-Lahun, Haraga, Hawara, Medinet Madi, Shedet e Tebtynis. La distribuzione della documentazione tende a concentrarsi, dal punto di vista territoriale nell’area d’ingresso della regione, mentre dal punto di vista cronologico sono molto ben attestate la seconda metà dell’epoca thutmoside, l’età amarniana e la prima parte dell’epoca ramesside. Per quanto la documentazione regionale pertinente al Nuovo Regno sia estremamente rarefatta, soprattutto se paragonata a quella contestualizzabile cronologicamente ad altri periodi storici, un’attenta analisi delle testimonianze porta a collocare il Fayyum in una fitta trama di rapporti politici, economici e militari non solo con il resto del Paese ma anche con altre aree geografiche, esterne all’Egitto.

Pondicherry, India: progetto per il nuovo waterfront

Il tema oggetto della tesi riguarda la riqualificazione del nuovo waterfront per la città di Pondicherry situata nell'India del sud. Dopo una attenta analisi sulla città, comprendente un'ampia analisi storica e cartografica, l'analisi del verde e dell'acqua, del tessuto edilizio e dell'emergenza abitativa che la città si trova ad affrontare, è stato scelto di progettare una nuova darsena come polo attrattivo al cui interno fossero previsti spazi per la comunità ed il turismo: un museo del mare, un hotel, un parco pubblico, un sistema di piazze e zone di sosta all'aperto, un complesso residenziale di espansione.

Studio Concettuale, Progettazione e Realizzazione di un Nuovo Rotatore Omerale per Protesi Mioelettriche di Arto Superiore

L’attività della tesi riguarda le protesi mioelettriche, gli arti protesici maggiormente diffusi, le quali sono descrivibili come arti robotici in cui i segmenti artificiali sono attuati da giunti elettromeccanici alimentati da batterie ricaricabili ed attivati mediante segnali elettromiografici (segnali elettrici generati dalla contrazione dei muscoli). Tali protesi di arto superiore attualmente disponibili in commercio potrebbero essere inadeguate per una riabilitazione soddisfacente di alcuni pazienti con una amputazione di alto livello che richiedono una elevata funzionalità nella vita quotidiana. In questo contesto si inserisce l’attività di ricerca del Centro Protesi INAIL di Budrio di Vigorso, Bologna, e dell’Università di Bologna i quali stanno sviluppando nuovi arti protesici con il progetto a lungo termine di rendere disponibili svariate soluzioni di protesi di arto superiore in grado di soddisfare la maggior parte delle richieste degli amputati. Lo scopo di questa tesi è l’introduzione di un nuovo rotatore omerale attivo da integrare alla protesi di arto superiore disponibile presso i nostri laboratori. Per ottenere questo risultato è stata utilizzata una procedura di progettazione già consolidata in attività precedenti per lo sviluppo di una protesi di spalla a due gradi di libertà. Differenti modelli cinematici sono stati studiati tramite analisi cinematiche per determinare l’incremento delle prestazioni a seguito dell’introduzione del nuovo rotatore omerale attivo. Sono state inoltre condotte analisi cinetostatiche per definire le specifiche tecniche di riferimento (in termini di carichi agenti sul rotatore omerale) e per guidare il dimensionamento della catena di trasmissione di potenza del nuovo dispositivo protesico. Ulteriori specifiche tecniche sono state considerate per garantire l’irreversibilità spontanea del moto sotto carichi esterni (quando i giunti attivi della protesi non sono alimentati), per salvaguardare l’incolumità del paziente in caso di caduta, per misurare la posizione angolare del rotatore omerale (in modo da implementare strategie di controllo in retroazione) e per limitare i consumi e la rumorosità del dispositivo. Uno studio di fattibilità ha permesso la selezione della architettura ottimale della catena di trasmissione di potenza per il nuovo rotatore omerale. I criteri di scelta sono stati principalmente la limitazione del peso e dell’ingombro del nuovo dispositivo protesico. Si è quindi proceduto con la progettazione di dettaglio alla quale è seguita la costruzione di un prototipo del nuovo rotatore omerale presso i nostri laboratori. La tesi tratta infine una attività preliminare di sperimentazione che ha permesso di fare considerazioni sulle prestazioni del prototipo ed osservazioni importanti per le successive attività di revisione ed ottimizzazione del progetto del rotatore omerale.

Un nuovo polo culturale per la città. Riqualificazione energetico-funzionale dell'ex deposito ATR a Forlì

Oggetto di questa tesi di laurea è la riqualificazione funzionale ed energetica di un'autorimessa per corriere costruita a Forlì nel 1935 dal geom. Alberto Flamigni e di proprietà dell' ATR, Agenzia per la Mobilità della provincia di Forlì-Cesena. Al deposito per corriere sono annessi dei piccoli capanni adibiti a magazzini ed una palazzina per uffici costruita negli anni '50, non facente parte del progetto originale. Oggi l'intero complesso risulta in disuso e la richiesta espressa dall'Amministrazione Comunale di Forlì è quella di adattare il comparto per ospitare funzioni musicali, d'intrattenimento e cultura, pensando anche ad un collegamento col manufatto storico dell'Arena Forlivese; quest'ultima, costruita negli anni '20, è situata ai margini del lotto in esame, risulta di proprietà privata ed oggi versa in condizioni di grave degrado. Uno dei fini del progetto, sul filo conduttore delle richieste dell'Amministrazione, è quello di mantenere l'involucro originale dell'edificio, su cui grava anche un vincolo storico, essendo stato progettato durante il periodo fascista ed avendo forti richiami alle soluzioni architettoniche adottate da Marcello Piacentini. Si è quindi deciso di lavorare al suo interno, al fine di creare dei nuclei indipendenti che ospitano le nuove funzioni di auditorium, mediateca, spazio espositivo, sale prova, camerini, mantenendo invece intatto il perimetro in mattoni facciavista con basamento in travertino. Il fronte esposto a sud, essendo stato originariamente pensato come mero elemento di chiusura, senza basamento e sistema di rivestimento ma semplicemente intonacato, si distacca dal resto dell'involucro ed è stato perciò oggetto di maggiori modifiche, in relazione anche al nuovo orientamento d'ingresso pensato per il comparto: l'Amministrazione Comunale ha infatti espresso il desiderio di modificare il percorso di accesso all'edificio, dal fronte nord su piazza Savonarola al fronte ovest su via Ugo Bassi. Il progetto ha adottato un approccio integrato dal punto di vista formale e costruttivo, ponendo particolare attenzione al rispetto e alla valorizzazione della struttura esistente: uno dei punti forti dell'ex deposito è infatti la sua copertura in travi reticolari in c.a. con shed vetrati orientati a nord. Tale sistema di copertura è stato mantenuto per favorire l'illuminazione degli spazi interni, isolato termicamente ed integrato con dei pannelli diffusori che garantiscono una luce uniforme e ben distribuita. Dal punto di vista funzionale e distributivo il progetto ha risposto a criteri di massima flessibilità e fruibilità degli ambienti interni, assecondando le esigenze dell'utenza. Mantenendo la finalità del minimo intervento sull'involucro esistente, nel piano terra si è adottata una tipologia di ambienti open space che delimitano il doppio volume dello spazio espositivo, pensato come un semplice e neutro contenitore, allestibile in base al tipo di mostra ed alla volontà degli organizzatori. Particolare attenzione è stata rivolta alla scelta della tipologia costruttiva per l'auditorium ed i volumi adibiti a sale prova, camerini e depositi, adottando elementi prefabbricati in legno assemblati a secco. Si sono studiati anche i sistemi impiantistici al fine di garantire un elevato livello di comfort interno e nel contempo un considerevole risparmio dal punto di vista energetico. Durante le varie fasi di avanzamento e messa a punto del progetto è stata posta grande attenzione all'aspetto acustico, dalla scelta della forma della sala al trattamento superficiale per garantire un'ottima resa prestazionale, parametro imprescindibile nella progettazione di un adeguato spazio musicale. Altro elemento preso in considerazione a scala locale e urbana è stato quello della sistemazione del cortile a sud, oggi asfaltato ed utilizzato come semplice parcheggio di autobus, al fine di trasformarlo in parco pubblico fruibile dagli utenti del complesso culturale e nel contempo elemento di connessione con l'Arena, tramite un nuovo sistema di orientamenti e percorsi.

Valutazione preclinica di oligonucleotidi antisenso come nuovo approccio terapeutico specifico per le leucemie acute con riarrangiamenti di MLL

Le Leucemie Acute Mieloidi di sottotipo FAB M4 e M5, le Leucemie Acute Linfoblastiche e le Leucemie Bifenotipiche sono frequentemente caratterizzate da traslocazioni del gene 11q23/MLL con formazione di oncogeni di fusione e produzione di oncoproteine che inducono la trasformazione neoplastica. Tali leucemie con riarrangiamenti di 11q23/MLL sono caratterizzate da prognosi infausta e scarsa responsività alle terapie convenzionali. Data la necessità di trovare terapie efficaci per le leucemie con traslocazione di MLL, in questo lavoro di ricerca sono stati progettati, caratterizzati e validati siRNA per il silenziamento genico degli oncogeni di fusione di MLL, con lo scopo di valutare il ripristino delle normali funzionalità di differenziamento cellulare e l’arresto della proliferazione neoplastica. Sono stati progettati siRNA specifici per gli oncogeni di fusione di MLL, sia per le regioni conservate nei diversi oncogeni di fusione, sia a livello del punto di fusione (breakpoint), sia per le regioni sui geni partner. I siRNA sono stati valutati su linee cellulari contenenti diverse traslocazioni del gene MLL. Il silenziamento è stato valutato sia a livello cellulare in termini di riduzione della capacità proliferativa e del numero delle cellule leucemiche, sia a livello molecolare tramite l’analisi della diminuzione dell’mRNA degli oncogeni di fusione di MLL. E’ stata valutata la diminuzione delle oncoproteine di fusione di MLL in seguito a trattamento con siRNA. E’ stata analizzata la variazione dell’espressione di geni dipendenti da MLL in seguito a trattamento con siRNA. Sono stati messi a punto modelli murini bioluminescenti di leucemie acute con traslocazioni di MLL innanzitutto per studiare il trafficking in vivo e la progressione leucemica delle leucemie acute con traslocazione di MLL. Successivamente sono stati utilizzati i modelli murini per lo studio in vivo dell’efficienza e della tossicità dei siRNA progettati e validati in vitro, valutando diversi sistemi di delivery per i siRNA in vivo.