Entwicklung und Anwendung molekularbiologischer Methoden zur Art- und Stamm-Identifizierung pro- und eukaryotischer Organismen

Das Wachstum von Milchsäurebakterien-Arten der Gattungen Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc während der Weinfermentation kann durch die Bildung verschiedener Stoffwechselprodukte zu Weinfehlern führen. Um rechtzeitig Gegenmaßnahmen ergreifen zu können und einem Weinverderb vorzubeugen, bedarf es geeigneter Identifizierungsmethoden. Klassische mikrobiologische Methoden reichen oft nicht aus, um Mikroorganismen auf Art- und Stammniveau gezielt zu identifizieren. Wegen ihrer schnellen Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit sind molekularbiologische Identifizierungsmethoden zur Kontrolle der mikrobiellen Flora während der Lebensmittelfermentierung in der heutigen Zeit unabdingbar. In der vorliegenden Forschungsarbeit wurden die 23S rRNA-Gensequenzen von neun Pediococcus-Typstämmen sequenziert, analysiert und phylogenetische Analysen durchgeführt. Zur Art-Identifizierung der Pediokokken wurden PCR-Primer generiert und ein Multiplex PCR System entwickelt, mit dem alle typischen Arten simultan in einer Reaktion nachgewiesen werden konnten. Die Ergebnisse der Multiplex PCR-Identifizierung von 62 Pediococcus-Stämmen aus Kulturensammlungen und 47 neu isolierten Stämmen aus Wein zeigten, dass einige Stämme unter falschen Artnamen hinterlegt waren, und dass P. parvulus im Weinanbaugebiet Rheinhessen weit verbreitet war. Die Fähigkeit der Pediococcus-Stämme zur Exopolysaccharid-Synthese wurde durch den Nachweis zweier Gene überprüft. Auf Basis der 23S rDNA-Sequenzen wurden rRNA-Sekundärstrukturen mit der neu entwickelten Software Structure Star generiert, die zum Auffinden von Zielbereichen für fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden geeignet waren. Die Sequenzunterschiede zwischen den Pediococcus-Arten reichten aus, um zwei Gruppen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung differenzieren zu können. Die Verwendung unmarkierter Helfer-sonden verbesserte die Zugänglichkeit der Sonden an die rRNA, wodurch das Fluoreszenz-Signal verstärkt wurde. Um Milchsäurebakterien durch Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese differenzieren zu können, wurden Primer entwickelt, mit denen ein hochvariabler 23S rDNA-Bereich amplifiziert werden konnte. Die Nested Specifically Amplified Polymorphic DNA (nSAPD)-PCR wurde in der vorliegenden Arbeit zur Art- und Stamm-Differenzierung pro- und eukaryotischer Organismen angewandt. Es wurden vor allem weinrelevante Milchsäurebakterien der Gattungen Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc und Hefen der Gattungen Dekkera / Brettanomyces und Saccharomyces untersucht. Die Cluster-Analyse der Pediococcus-Typstämme führte zu einer unterschiedlichen Baum-Topologie im Vergleich zum phylogenetischen 23S rDNA-Stammbaum. Die Verwandtschaftsverhältnisse der untersuchten O. oeni-Stämme aus Starterkulturen konnten in Bezug auf eine frühere Cluster-Analyse reproduziert werden. Die Untersuchung von 40 B. bruxellensis-Stämmen aus rheinhessischen Weinproben zeigte eine Gruppierung der Stämme gemäß dem Ort der Probennahme. Beim Vergleich der Verwandtschaftsverhältnisse von Stämmen der Arten P. parvulus und B. bruxellensis, die aus denselben Weinproben isoliert wurden, konnte eine hohe Übereinstimmung der beiden Baum-Topologien beobachtet werden. Anhand der SAPD-PCR Untersuchung von Sekthefen aus Starterkulturen konnten alle Stämme der Art S. cerevisiae zugeordnet werden. Die nSAPD-PCR war darüber hinaus geeignet, um höhere Eukaryoten wie Weinreben zu differenzieren und es konnten die Verwandtschaftsverhältnisse von Mäusen und menschlichen Individuen durch Cluster-Analysen nachvollzogen werden. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik wurden (n)SAPD-Marker in SCAR-Marker konvertiert. Die neu generierten SCAR-Primer konnten zur simultanen Art-Identifizierung von sieben weinschädlichen Milchsäurebakterien in einer Multiplex PCR erfolgreich eingesetzt werden. Die in dieser Arbeit entwickelten molekularbiologischen Identifizierungsmethoden können zum Beispiel in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle Anwendung finden.

Sintesi, modifica e caratterizzazione di polimeri da fonti rinnovabili

Gli argomenti trattati all’interno di questa tesi di dottorato riguardano la sintesi e la modifica di polimeri ottenuti a partire da fonti rinnovabili. L’acido polilattico (PLA) è stato modificato per ottenere film estensibili per uso alimentare. La scelta del materiale si è basata sull’analisi del suo ciclo di vita e perché è riconosciuto come sicuro per l’utilizzo nel campo alimentare. Le formulazioni testate, a base di PLA, sono state preparate con l’aggiunta di una serie di additivi utilizzati per migliorare le proprietà meccaniche del materiale. La lavorazione è stata eseguita mediante estrusione, ottenendo dei pellet a composizione omogenea successivamente lavorati nell’estrusore a bolla, modalità industriale di produzione dei film estensibili. È stata poi effettuata la sintesi diretta di nuovi poliesteri insaturi a base di dimetil succinato e 1,6-esandiolo. L’insaturazione della catena è stata ottenuta mediante l’uso, durante la sintesi, di derivati dell’olio di ricino, l’acido ricinoleico e il suo derivato insaturo metil undecenoato. Un’altra molecola insatura utilizzata è stata il citronellolo, scelto tra i terpeni. I polimeri così ottenuti sono stati modificati tramite reazioni radicaliche indotte con radiazioni UV utilizzando sostanze antibatteriche (sale 3-esadecil-1-vinilimidazolo bromuro) al fine di ottenere materiali con attività biocida a lungo termine e senza rilascio. Si è proceduto inoltre alla polimerizzazione reversibile di monomeri furanici con oli vegetali utilizzando una strategia di tipo double click. Si è partiti dalla sintesi di monomeri derivanti da oli vegetali contenenti eterocicli furanici attaccati mediante addizione tiol-enica (prima reazione click chemistry) e si è proseguito con la loro successiva polimerizzazione attraverso una reazione di tipo Diels-Alder con molecole con gruppi maleimmidici (seconda reazione click chemistry). I polimeri così ottenuti sono materiali potenzialmente auto-riparanti, grazie alla possibilità di spostare l’equilibrio verso i prodotti o i reagenti semplicemente variando le condizioni di temperatura.

Mucinartige Glycopeptide als Inhibitoren selektinvermittelter Zelladhäsionsprozesse

Es wurden Glycopeptide mit einer Partialsequenz aus der N-terminalen Domäne des natürlichen Selektinliganden PSGL-1 synthetisiert, welche prinzipiell als kompetitive Inhibitoren unerwünschter selektinvermittelter Zelladhäsionsphänomene fungieren könnten. Grundsätzlich könnte es möglich sein, auf diesem Wege entsprechende chronisch entzündliche Krankheiten wie rheumatoide Arthritis zu behandeln und bestimmte akut eintretende schwere Schädigungen von gesundem Gewebe sowie die Metastasenbildung maligner Tumore zu unterdrücken. Das tatsächliche Potential der hergestellten Glycopeptide als Liganden der Selektine kann nun in biologischen Tests geprüft werden. Der gewählte Ausschnitt aus dem P-Selektin-Glycoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) reicht von Tyr48 bis Pro59 und umfasst so sämtliche Aminosäurereste der Sequenz, die für das Auftreten einer hochaffinen Rezeptorbindung erforderlich sind. Dabei ist die Seitenkette von Thr57 mit einem O-Glycan modifiziert, welches das in natürlichen Selektinliganden häufig vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewisx bzw. ein Mimetikum desselben enthält und die für Mucine typische Form der Anbindung an das peptidische Rückgrat über eine N-Acetyl-α-D-galactosamineinheit aufweist. Zum Aufbau der komplexen Glycopeptidstrukturen wurde zunächst eine Strategie für die Synthese des an die Hydroxylaminosäure gebundenen Oligosaccharids im Gramm-Maßstab ausgearbeitet. Dabei kam der Wahl eines geeigneten Schutzgruppenmusters besondere Bedeutung zu. Das entwickelte Konzept basiert allein auf chemischen Methoden und ermöglicht die parallele Herstellung potentieller Mimetika. So wurde in dieser Arbeit L-Fucose durch D-Arabinose und N-Acetyl-D-neuraminsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die erhaltenen Glycosylaminosäure-Bausteine wurden schließlich in die Glycopeptid-synthesen an der festen Phase eingebracht, welche nach vollständiger Deblockierung die gewünschten Zielverbindungen lieferten.rn

Die Synthese eines Sialyl-Lewis X-Mimetikums als Baustein zur Herstellung von Glycopeptid-Zelladhäsionsinhibitoren für Selektine

Zelladhäsionsphänomene spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Vorgängen, wie z. B. in der Embryogenese, der Wundheilung, der Immunantwort und Entzündungsprozessen. So wird die inflammatorische Kaskade durch P- und E-Selektin vermittelte Adhäsion der im Blutstrom zirkulierenden Leukozyten an Endothelzellen eingeleitet. Übermäßige Zelladhäsion kann hingegen eine Vielzahl von Krankheiten bewirken. Nachgewiesen ist eine solche Beteiligung der Selektine u. a. bei rheumatoider Arthritis, Erkrankungen der Herzkranzgefäße und dem Reperfusionssyndrom. Ein Ansatz zur Therapie besteht in der Verabreichung löslicher Selektinliganden, die kompetitiv an die Selektine binden und deren Aktivität dadurch mindern. Die wichtigste Leitstruktur für pharmakologisch aktive Selektinliganden stellt hierbei das Tetrasaccharid-Epitop Sialyl-Lewisx (sLex) dar.rnrnIn dieser Arbeit wurde nach einer nicht enzymatischen Strategie ein auf der sLex Struktur basierender Baustein für die Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert. Aus diesem sollen nach Schutzgruppen-Manipulationen durch Einsatz in automatisierten Festphasen-Peptidsynthesen, verschiedene Glycopeptide als Zelladhäsionsinhibitoren für Selektine gewonnen werden. Der rasche Abbau der sLex-Struktur im Organismus schränkt die pharmakologische Nutzung von sLex-Derivaten jedoch stark ein. Das synthetisierte Kohlenhydrat Epitop weist daher gegenüber der natürlichen sLex-Struktur mehrere Modifikationen auf, die zu einer erhöhten metabolischen Stabilität führen sollen, ohne die für eine effektive Bindung zum Rezeptor nötigen Wechselwirkungen zu beeinträchtigen. rnrnAus diesem Grund wurde der synthetisch anspruchsvolle Sialinsäure-Baustein durch die L-Cyclohexylmilchsäure substituiert. Die Anbindung des Kohlenhydrat-Epitops an das Peptid wird im Gegensatz zur natürlichen N-glycosidischen Verknüpfung hier über eine zusätzliche Glucosamin-Einheit O-glycosidisch an die Aminosäure L-Threonin bewirkt. Außerdem wird der labile Fucose-Rest durch die D-Arabinose ersetzt, die nicht im menschlichen Organismus vorkommt, jedoch die drei essentiellen pharmakophoren Hydroxylfunktionen in der gleichen dreidimensionalen Orientierung präsentiert wie die L-Fucose.

Derivate des Ionentransporters Valinomycin

In der vorliegenden Arbeit wurden Derivate des Ionentransporters Valinomycin synthetisiert und als Sensorelemente in Modellmembransysteme inkorporiert. Als Modellmembranen wurden festkörpergestützte Lipiddoppelschichten (tBLMs, tethered bilayer lipid membranes) verwendet. rnValinomycin transportiert selektiv Kalium-Ionen durch Membranen, was durch einen Rückgang des Widerstandes über elektrochemische Messmethoden nachgewiesen werden kann. Es ist ein zyklisches Dodecadepsipeptid, das aus zwei verschiedenen Aminosäuren (L- und D-Valin) und  Hydroxysäuren (L Milchsäure und D Hydroxyisovaleriansäure) besteht. In dieser Arbeit wurde ein L Valin durch ein L-Lysin ausgetauscht, um eine freie Aminogruppe zum Anbinden verschiedenster Liganden zu erhalten. rnDie Synthese erfolgte in Lösung über einen linearen Decadepsipeptid-Precursor, hierbei wurde hauptsächlich mit Benzyl- und Boc-Schutzgruppen gearbeitet. An den Precursor wurden dann unterschiedlich modifizierte Lysin-Didepside gebunden und das daraus erhaltene lineare Dodecadepsipeptid zyklisiert.rnInsgesamt wurden sechs verschiedene Derivate synthetisiert, deren Ionentransportfähigkeit mit Hilfe eines angebundenen Liganden blockiert wurde. Diese Blockade kann entweder mechanisch durch Festhalten des Ionencarriers an der Oberfläche der Membran oder chemisch durch Einbringen einer Ladung erfolgen, da geladene Moleküle eine Membran nicht überwinden können. rnAcetyl-Lysin-Valinomycin wurde als Testsystem hergestellt, um zu zeigen, dass die Synthese einen funktionsfähigen Ionencarrier ergeben hatte. Im nächsten Schritt wurde Lysin-Valinomycin mit freier Aminogruppe synthetisiert, um es als pH-Sensor zu nutzen und damit zu überprüfen, ob das chemische Einbringen einer Ladung möglich ist. Es konnte ein pH abhängiger Kalium-Transport nachgewiesen werden, die Blockade der Ionentransportfähigkeit über eine eingebrachte Ladung ist somit möglich. rnAuf dem gleichen Konzept beruht Ferrocen-Valinomycin. Wird der Ferrocen-Ligand oxidiert, liegt eine positive Ladung vor und der Ionencarrier kann die Membran nicht mehr überwinden. Eine Reduktion macht diesen Prozess reversibel. Ferrocen-Valinomycin konnte innerhalb einer tBLM chemisch oxidiert und reduziert werden, dieses System kann somit als chemischer Redox-Sensor eingesetzt werden.rnEine mechanische Blockade liegt dem Biotin- und dem Sulfonamid-Valinomycin zugrunde. Dabei soll die Zugabe von Streptavidin bzw. BCA II (bovine Carboanhydrase) den Ionentransport durch die Membran stoppen. Beide Valinomycin-Derivate zeigten aber keine Ionentransportfähigkeit, eine Inkorporation in tBLMs konnte jedoch über SPR gezeigt werden. rnDie Synthese eines fluoreszenz-markierten (FITC) Valinomycins ergab zwar auch keinen transportfähigen Ionencarrier, aber mit diesem Derivat konnte der Diffusionskoeffizient von Valinomycin in sBLMs mit Hilfe von Fluorescence Recovery after photobleaching (FRAP) bestimmt werden.rn

Development of guidelines for microbiological control in microbrewery

Over the past 15 years the Italian brewing scene showed interesting changes, especially with regard to the creation of many breweries with an annual production of less than 10,000 hectoliters. The beers produced by microbreweries are very susceptible to attack by spoilage micro-organisms that cause the deterioration of beer quality characteristics. In addition, most of the microbreweries do not practice heat treatments of stabilization and do not carry out quality checks on the product. The high presence of beer spoilage bacteria is an economic problem for the brewing industry because it can damage the brand and it causes high costs of product retrieval. This thesis project was aimed to study the management of the production process in the Italian microbreweries within a production less than 10,000 hl. In particular, the annual production, type of plant, yeast management, process management, cleaning and sanitizing of a representative sample of microbreweries were investigated. Furthermore was made a collection of samples in order to identify, with simple methods, what are spoilage bacteria more present in the Italian craft beers. 21% of the beers analysed were positive at the presence of lactic acid bacteria. These analytical data show the importance of understanding what are the weak points of the production process that cause the development of spoilage bacteria. Finally, the thesis examined the actual production of two microbreweries in order to understand the process management that can promote the growth of spoilage bacteria in beer and production plant. The analysis of the data for the two case studies was helpful to understand what are the critical points where the microorganisms are most frequently in contact with the product. The hygiene practices are crucial to ensure the quality of the finished product, especially in the case of non-pasteurized beer.

Use of essential oils and biocontrol cultures for the improvement of shelf-life of fresh cut products

The demand of minimally processed fruits and vegetables has increased in the last years. However, their intrinsic characteristics may favor the growth of pathogens and spoilage microbiota. The negative effects on human health reported for some traditional chemical sanitizers have justified the search for substitutes to guarantee food safety and quality. In this work we have evaluate the potential of some essential oils and their components to improve the safety and the shelf life of Lamb’s lettuce (Valerianella locusta) and apples (Golden delicious). Moreover, the effects of selected lactic acid bacteria alone or in combination with essential oils or their components, on the shelf-life and safety as well as organoleptic properties of minimally processed products, were evaluated. Since the lack of knowledge of microbial cell targets of essential oils represent one of the most important limit to the use of these molecules at industrial level, another aim of this thesis was the study of the action mechanisms of essential oils and their components. The results obtained showed the beneficial effects of the natural antimicrobials as well as the selected lactic acid bacteria on minimally processed fruit and vegetable safety and shelf-life, without detrimental effects on the quality parameters. The beneficial effects obtained by the use of the selected biocontrol agents were further increased combining them with selected natural antimicrobials. The natural antimicrobial employed induced noticeable modifications of membrane fatty acid profiles and volatile compounds produced by microbial cells during the growth. The modification of the expression in genes involved in fatty acid biosynthesis suggesting that the cytoplasmic membrane of microbial cells is one of the major cellular target of essential oils and their components. The comprehension of microbial stress response mechanisms can contribute to the scaling up of natural antimicrobials and bio-control agents at industrial level.

Electrospun Polymeric Scaffolds with Enhanced Biomimetic Properties for Tissue Engineering Applications

This PhD Thesis is focused on the development of fibrous polymeric scaffolds for tissue engineering applications and on the improvement of scaffold biomimetic properties. Scaffolds were fabricated by electrospinning, which allows to obtain scaffolds made of polymeric micro or nanofibers. Biomimetism was enhanced by following two approaches: (1) the use of natural biopolymers, and (2) the modification of the fibers surface chemistry. Gelatin was chosen for its bioactive properties and cellular affinity, however it lacks in mechanical properties. This problem was overcome by adding poly(lactic acid) to the scaffold through co-electrospinning and mechanical properties of the composite constructs were assessed. Gelatin effectively improves cell growth and viability and worth noting, composite scaffolds of gelatin and poly(lactic acid) were more effective than a plain gelatin scaffold. Scaffolds made of pure collagen fibers were fabricated. Modification of collagen triple helix structure in electrospun collagen fibers was studied. Mechanical properties were evaluated before and after crosslinking. The crosslinking procedure was developed and optimized by using - for the first time on electrospun collagen fibers - the crosslinking reactant 1,4-butanediol diglycidyl ether, with good results in terms of fibers stabilization. Cell culture experiments showed good results in term of cell adhesion and morphology. The fiber surface chemistry of electrospun poly(lactic acid) scaffold was modified by plasma treatment. Plasma did not affect thermal and mechanical properties of the scaffold, while it greatly increased its hydrophilicity by the introduction of carboxyl groups at the fiber surface. This fiber functionalization enhanced the fibroblast cell viability and spreading. Surface modifications by chemical reactions were conducted on electrospun scaffolds made of a polysophorolipid. The aim was to introduce a biomolecule at the fiber surface. By developing a series of chemical reactions, one oligopeptide every three repeating units of polysophorolipid was grafted at the surface of electrospun fibers.

Identifizierung biogene Amine bildender Bakterien und Einsatz von Enzymen zur Hemmung ihres Wachstums während der Weinbereitung

Mikroorganismen spielen eine wichtige Rolle in der Weinherstellung. Neben ihren positiven Stoffwechselaktivitäten wie die Bildung von Ethanol während der alkoholischen Gärung sind vor allem Bakterien in der Lage, Weinfehler zu verursachen. Einer dieser Weinfehler ist die Produktion von biogenen Aminen. Diese niedermolekularen Stickstoffverbindungen können zu verschiedenen Gesundheitsproblemen wie Bluthochdruck und Migräne führen. Aufgrund von hohen Ethanolgehalten und dem Vorkommen verschiedener biogener Amine kommt es im Wein zu einer Verstärkung dieser physiologischen Effekte. Um die Bildung dieser Verbindungen zu verhindern, ist es von speziellem Interesse, die verantwortlichen Mikroorganismen zu identifizieren und sie in ihrem Wachstum zu hemmen.In einem Teil der Dissertation stand die Isolierung und Identifizierung biogener Amine produzierender Bakterien aus deutschen Jungweinen und Mosten im Vordergrund. Es konnte gezeigt werden, dass hauptsächlich Milchsäurebakterien als potenzielle Produzenten in Frage kommen. Diese Bakteriengruppe war in hohen Titern in nahezu allen Proben vorhanden und stellt somit eine potentielle Gefahr für die Weinbereitung dar. Zur Identifizierung der Isolate wurden verschiedene molekularbiologische Methoden wie specifically amplified DNA polymorphic-PCR (Fingerprintmethode), Multiplex-PCR oder 16S rDNA-Sequenzierung angewandt. Das Screening bezüglich der Bildung von biogenen Aminen erfolgte mit Hilfe einer im Rahmen dieser Arbeit entwickelten hochauflösenden Dünnschichtchromatographie gefolgt von der Quantifizierung mittels HPLC.Zur Wachstumshemmung dieser Schadbakterien wurden zwei Exoenzyme aus Streptomyces albidoflavus B578 isolieren. Diese Enzyme wurden gereinigt und als eine Muramidase und eine Protease identifiziert. Aktivitätstests konnten zeigen, dass diese Enzyme eine hohe lytische Wirkung gegen weinrelevante Mikroorganismen aufweisen. Ebenso war die Aktivität der Enzyme unter Weinbedingungen sehr stabil. Aufgrund dieser Ergebnisse könnten diese Enzyme eine mögliche Alternative zur Zugabe von Lysozym oder Schwefeldioxid sein, welche konventionell in der Weinbereitung ihren Einsatz finden.

Synthese von optisch aktiven Chinolizidinen als Vorstufen einer Clavepictin-Totalsynthese : erste Untersuchungen zu einer neuen kationischen Umlagerung

Die aus Clavelina picta isolierten Clavepictine A und B, sowie das verwandte Pictamin, sind Alkaloide, die sich lediglich in der Länge der Seitenkette an C-6 und der Veresterung der Alkoholfunktion an C-3 des gemeinsamen Chinolizidingerüsts unterscheiden. Alle drei Verbindungen zeichnen sich durch antimikrobielle Wirkung und hohe Zytotoxizität aus, und sind daher Naturstoffe, die für die Entwicklung neuer Arznei- oder Pflanzenschutzmittel von Interesse sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine kurze, substratkontrollierte Chinolizidinsynthese entwickelt, mit der das den Naturstoffen gemeinsame Grundgerüst selektiv aufgebaut werden kann. Ausgehend von käuflichen Milchsäureestern wurden zunächst optisch aktive 1-Aryl-1-amino-2-propanole dargestellt, aus denen nach Katritzky in zwei Stufen mit guten Ausbeuten 2,6-disubstituierte Piperidine mit N-(1-Aryl-2-propanol)-Substituent erhalten wurden, die zu Acetaten verestert wurden. Als Schlüsselschritt der Synthese wurde eine neue kationische Umlagerung dieser Acetate unter Einwirkung einer geeigneten Lewis-Säure untersucht, die es ermöglicht, das Chinolizidingerüst aufzubauen. Die Umlagerung erwies sich als hochselektiv, da aus einem optisch aktiven Edukt nur ein (optisch aktives) Chinolizidingerüst erhalten wurde. Aus den Umlagerungsprodukten konnte in einer Stufe der C-1-Substituent Chlorid reduktiv entfernt und gleichzeitig der Aromat an C-3 in ein 1,4-Dien überführt werden, wodurch der Umbau des Aromaten in die gewünschte Alkoholfunktion eingeleitet wurde.

Biomedical and industrial applications of atmospheric pressure non-equilibrium plasmas

This dissertation will be focused on the characterization of an atmospheric pressure plasma jet source with an application oriented diagnostic approach and the description of processes supported by this plasma source. The plasma source investigated is a single electrode plasma jet. Schlieren images, optical emission spectra, temperature and heat flux profiles are analyzed to deeply investigate the fluid dynamic, the chemical composition and the thermal output of the plasma generated with a nanosecond-pulsed high voltage generator. The maximum temperature measured is about 45 °C and values close to the room temperature are reached 10 mm down the source outlet, ensuring the possibility to use the plasma jet for the treatment of thermosensitive materials, such as, for example, biological substrate or polymers. Electrospinning of polymeric solution allows the production of nanofibrous non-woven mats and the plasma pre-treatment of the solutions leads to the realization of defect free nanofibers. The use of the plasma jet allows the electrospinnability of a non-spinnable poly(L-lactic acid) (PLLA) solution, suitable for the production of biological scaffold for the wound dressing.

Definition of Food Safety Criteria for Bacteria Food-Borne Pathogens in Ready to Eat products

The aims of this research study is to explore the opportunity to set up Performance Objectives (POs) parameters for specific risks in RTE products to propose for food industries and food authorities. In fact, even if microbiological criteria for Salmonella and Listeria monocytogenes Ready-to-Eat (RTE) products are included in the European Regulation, these parameters are not risk based and no microbiological criteria for Bacillus cereus in RTE products is present. For these reasons the behaviour of Salmonella enterica in RTE mixed salad, the microbiological characteristics in RTE spelt salad, and the definition of POs for Bacillus cereus and Listeria monocytogenes in RTE spelt salad has been assessed. Based on the data produced can be drawn the following conclusions: 1. A rapid growth of Salmonella enterica may occurr in mixed ingredient salads, and strict temperature control during the production chain of the product is critical. 2. Spelt salad is characterized by the presence of high number of Lactic Acid Bacteria. Listeria spp. and Enterobacteriaceae, on the contrary, did not grow during the shlef life, probably due to the relevant metabolic activity of LAB. 3. The use of spelt and cheese compliant with the suggested POs might significantly reduce the incidence of foodborne intoxications due to Bacillus cereus and Listeria monocytogenes and the proportions of recalls, causing huge economic losses for food companies commercializing RTE products. 4. The approach to calculate the POs values and reported in my work can be easily adapted to different food/risk combination as well as to any changes in the formulation of the same food products. 5. The optimized sampling plans in term of number of samples to collect can be derive in order to verify the compliance to POs values selected.

Entwicklung und Evaluierung von Methoden zur zeitnahen Identifizierung weinrelevanter Mikroorganismen

Hefen der Gattung Saccharomyces und Milchsäurebakterien sind bei der Weinbereitung von besonderer Bedeutung. Neben der alkoholischen Gärung sind Hefen an der Ausbildung von Aromastoffen beteiligt. Milchsäurebakterien spielen eine Rolle beim biologischen Säureabbau (malolaktische Fermentation), können jedoch aufgrund ihrer Stoffwechseleigenschaft weitere Aromamodifikationen bewirken. Die Zusammensetzung der mikrobiellen Flora zu verschiedenen Zeitpunkten der Weinbereitung hat einen direkten Einfluss auf die Qualität der Weine, welche sich sowohl positiv als auch negativ verändern kann. Daher ist die zuverlässige Identifizierung und Differenzierung verschiedener Mikroorganismen auf Art- aber auch Stamm-Ebene während der Vinifikation von Bedeutung.rnDer erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Differenzierung von Hefearten der Gattung Saccharomyces, welche mit Hilfe konventioneller Methoden nicht eindeutig identifiziert werden können. Unter Verwendung des DNA-Fingerprintverfahrens Specifically Amplified Polymorphic DNA (SAPD)-PCR sowie der Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization-Time-Of-Flight-Mass-Spectrometry (MALDI-TOF-MS) war eine Differenzierung dieser taxonomisch sehr nah verwandten Arten möglich. Weiterhin konnten interspezifische Hybridstämme detektiert werden. In diesem Zusammenhang wurde der Hybridcharakter des Stammes NCYC 3739 (S. cerevisiae x kudriavzevii) entdeckt. Um die Elternspezies eines Hybridstamms zuverlässig zu bestimmen, sind weiterführende Genanalysen notwendig. Hierzu konnte eine Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse verschiedener genetischer Marker erfolgreich herangezogen werden.rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde weiterhin ein Schnellidentifizierungssystem zum Nachweis weinrelevanter Milchsäurebakterien entwickelt. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik konnten artspezifische Primer generiert werden, welche auf der Grundlage charakteristischer Fragmente der SAPD-PCR abgeleitet wurden. Durch die Anwendung dieser Primer in einer Multiplex-PCR-Reaktion war die Detektion verschiedener, einerseits häufig in Wein vorkommender und andererseits potentiell an der Ausbildung von Weinfehlern beteiligter Milchsäurebakterien-Arten möglich. Die ermittelte Nachweisgrenze dieser Methode lag mit 10^4 - 10^5 Zellen/ml im Bereich der Zelltiter, die in Most und Wein anzutreffen sind. Anhand der Untersuchung verschiedener Weinproben von Winzern in Rheinhessen wurde die Praxistauglichkeit dieser Methode demonstriert. rnUm die gesamten Milchsäurebakterien-Population im Verlauf der Weinbereitung zu kontrollieren, kann die Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese herangezogen werden. Hierzu wurden in dieser Arbeit Primer zur Amplifikation eines Teilbereichs des rpoB-Gens abgeleitet, da dieses Gen eine Alternative zur 16S rDNA darstellt. Die DNA-Region erwies sich als geeignet, um zahlreiche weinrelevante Milchsäurebakterien-Arten zu differenzieren. In einigen ersten Versuchen konnte gezeigt werden, dass diese Methode für eine praktische Anwendung in Frage kommt.rnOenococcus oeni ist das wichtigste Milchsäurebakterien während der malolaktischen Fermentation und wird häufig in Form kommerzieller Starterkulturen eingesetzt. Da verschiedene Stämme unterschiedliche Eigenschaften aufweisen können, ist es von Bedeutung, die Identität eines bestimmten Stammes zweifelsfrei feststellen zu können. Anhand der Analyse verschiedener O. oeni-Stämme aus unterschiedlichen Weinbaugebieten konnte gezeigt werden, dass sowohl die nested SAPD-PCR als auch die MALDI-TOF-MS genügend Sensitivität aufweisen, um eine Unterscheidung auf Stamm-Ebene zu ermöglichen, wobei die mittels nSAPD-PCR ermittelten Distanzen der Stämme zueinander mit deren geographischer Herkunft korrelierte.rnDie in der vorliegenden Arbeit entwickelten Methoden können dazu beitragen, den Prozess der Weinherstellung besser zu kontrollieren und so eine hohe Qualität des Endproduktes zu gewährleisten.rn

Synthesen von C-glycosylierten Aminosäuren und Peptiden unter Einsatz speziell konstruierter Mikroreaktoren

Die chemische Synthese definierter Glycopeptidstrukturen bildet die Basis einiger vielversprechender Ansätze zur Therapie verschiedener Krankheiten. Die Entwicklung hochaffiner Selektininhibitoren könnte der Behandlung chronischer Entzündungen und zur Unterdrückung der Metastasierung von Tumoren dienen. Vollsynthetische Vakzine auf Basis glycosylierter MUC1-Partialstrukturen sollen das Immunsystem zur Bekämpfung von krankem Gewebe anregen und so perspektivisch eine Impfung gegen Krebs ermöglichen. Da die natürlich vorkommenden O-Glycoside in vivo eine begrenzte Stabilität besitzen, wurde eine Methode entwickelt, welche die modulare Herstellung von stabilen rnC-Glycosylaminosäuren als Mimetika der natürlichen Serin-, Threonin- und Tyrosin-Glycoside ermöglicht. Dazu wurden passend geschützte Kohlenhydrat-Lactone synthetisiert, die in einer mikrowellengestützten Petasis-Olefinierung unter Durchflussbedingungen in die entsprechenden exo-Glycale überführt wurden. Die Reaktionszeit konnte durch diese spezielle Reaktionsführung auf weniger als drei Minuten verringert werden, während konventionell mehrere Stunden benötigt werden. Die C-glycosidische Verknüpfung mit den entsprechenden Aminosäurebausteinen gelang durch eine Hydroborierungs-Suzuki-Kupplungs-Kaskade. Nach umfangreicher Optimierung der Reaktionsparameter ließ sich neben mehreren Monosacchariden auch ein exo-Glycal der Lactose erfolgreich in der Kupplung einsetzen. Nach verschiedenen Schutzgruppenmanipulationen wurden einige der synthetisierten Bausteine zur Synthese C-glycosylierter Partialstrukturen des Mucins MUC1 an der festen Phase herangezogen. In ELISA-Experimenten wurden die C-Glycosylpeptide von an Brustkrebsgewebe bindenden Antikörpern erkannt, die durch Vakzinierung mit ähnlichen Strukturen erhalten worden waren. Zur Synthese zweier Bausteine potenzieller Selektin-Inhibitoren wurde ein Mimetikum des in natürlichen Liganden vorkommenden Tetrasaccharides Sialyl-Lewisx synthetisiert. Bei diesem wurde die terminale Sialinsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die bei der gewählten Syntheseroute notwendige regioselektive Öffnung eines Benzylidenacetals wurde in einem Mikroreaktor durchgeführt, wodurch eine einfache Reaktionsoptimierung mit geringen Substanzmengen möglich war. Die Reaktionszeit liegt mit unter 4 Minuten deutlich unter den üblichen Werten von einer bis mehreren Stunden. In einer Block-Glycosylierung konnte das Pseudotetrasaccharid sowohl an einen C-Lactosyl-Tyrosin-, als auch an einen C-Lactosyl-Serin-Akzeptor angefügt und somit die Synthese der Zielverbindungen abgeschlossen werden. Diese Bausteine können in Zukunft als Bestandteile synthetischer Glycopeptide zum Einsatz kommen, welche Mimetika der natürlichen Selektin-Liganden darstellen sollen.rn

Mikrobielle Synthese von Biopolymeren aus der nachwachsenden Rohstoffquelle Weizenstroh

Weizenstroh als erneuerbare Ressource zur Produktion von Biopolymeren und wichtigen Grundchemikalien stellt eine ökologisch sinnvolle Alternative dar. Durch die vom PFI durchgeführte Thermodruckhydrolyse konnte das Weizenstroh und die darin enthaltenen Zucker fast vollständig mobilisiert werden. Ein umfangreiches Screening nach Organismen, welche die Zucker des Weizenstrohs verwerten konnten, ergab, dass einige wenige Stämme zur PHB-Bildung aus Xylose befähigt waren (10 %). Zur PHB-Synthese aus Glucose waren indes ca. doppelt so viele Organismen in der Lage (20 %). Zwei der insgesamt 118 untersuchten Organismen zeigten besonders gute PHB-Bildung sowohl mit Xylose als auch mit Glucose als Substrat. Dabei handelte es sich um die hauseigenen Stämme Bacillus licheniformis KHC 3 und Bacillus megaterium KNaC 2. Nach Enttoxifizierung der hemicellulosischen Fraktion konnte diese als C-Quelle im Mineral Medium eingesetzt werden. Burkholderia sacchari DSM 17165 und Hydrogenophaga pseudoflava DSM 1034, sowie die hauseigenen Isolate Bacillus licheniformis KHC 3 und Bacillus megaterium KNaC 2 wurden für die Synthese von PHB aus der hemicellulosischen Fraktion verwendet. Die Zucker der hemicellulosischen Fraktion (Xylose, Glucose, Arabinose) konnten durch diese Organismen zur PHB-Synthese genutzt werden. Hierbei stellte sich heraus, dass die beiden Bacillus-Stämme besser zur Produktion von PHB aus dem hemicellulosischen Hydrolysat geeignet waren als die Stämme der DSMZ. Die alternative Umsetzung der im hemicellulosischem Hydrolysat enthaltenen Zucker (Xylose, Glucose und Arabinose) in die wichtigen Grundchemikalien Lactat und Acetat konnte durch die Verwendung von heterofermentativen Milchsäurebakterien verwirklicht werden. Die Bildung dieser wichtigen Grundchemikalien stellt eine interessante Alternative zur PHB-Synthese dar. Die Menge an teuren Zusätzen wie Tomatensaft, welcher für das Wachstum der MSB essentiell war, konnte reduziert werden. Die Glucose der zweiten Fraktion des Weizenstrohs, der cellulosischen Fraktion, konnte ebenfalls durch den Einsatz von Mikroorganismen in PHB umgewandelt werden. Kommerzielle Cellulasen der Firma Novozymes konnten große Mengen an Glucose (≥10 g/l) aus der cellulosischen Fraktion freisetzen. Diese freie Glucose wurde mit Hilfe von Cupriavidus necator DSM 545, Cupriavidus necator NCIMB 11599, Bacillus licheniformis KHC 3 und Bacillus megaterium KNaC 2 zu PHB fermentiert. Wie auch beim hemicellulosischen Hydrolysat konnten hier die beiden Bacillus-Stämme die besten Ergebnisse erzielen. Bei ihnen machte die PHB mehr als die Hälfte der Trockenmasse aus. Die Abtrennung des Zielprodukts ohne die Verwendung von umweltschädlichen Lösungsmitteln wurde durch die Lyse der Zielzellen durch eigens isolierte Enzyme aus Streptomyceten verwirklicht. Die Zelllyse durch die Enzyme aus Streptomyces globisporus subsp. caucasius DSM 40814 und Streptomyces albidoflavus DSM 40233 war erfolgreich und zeigte vor allem bei den Bacillen hohe Wirkung (83 % und 99 % Zelllyse). Bei dem Gram-negativen Organismus Cupriavidus necator DSM 428 konnte die anfangs niedrige Zelllyse von 38 % durch Ultraschallbehandlung auf ca. 75 % erhöht werden.