Mente sana en cuerpo sano.

Incluye el material utilizado, los cuestionarios y los resultados de la evaluación

La ESO de adultos : trayectorias de abandono escolar temprano entre estudiantes con experiencia laboral

Resumen basado en el de la publicaci??n

Caracterització de metabòlits produïts per soques de "Pseudomonas fluorescens" efectives en el control biològic de fongs fitopatògens

El principal objectiu d'aquest treball ha estat estudiar la producció de metabòlits amb activitat antibiòtica per soques de l'espècie Pseudomonas fluorescens de la col·lecció EPS, i també avaluar la seva potencialitat com a agents de biocontrol. Es va disposar també de diverses soques de P. fluorescens, cedides per altres investigadors, que van utilitzar-se com a referència perquè algunes són actives en control biològic i produeixen metabòlits secundaris d'interès en el biocontrol de malalties de plantes. La present memòria s'estructura en cinc capítols, que són, introducció al control biològic, descripció de l'etapa de selecció de soques i cerca dels metabòlits produïts, estudi de la producció d'HCN per la soca EPS288, estudi de la producció de l'antibiòtic 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG), i finalment, el darrer capítol, on s'ha estudiat la producció de DAPG sobre material vegetal i la capacitat de colonitzar arrels per diverses soques d'interès. En l'etapa de prospecció, va demostrar-se que un 37% del total de les soques de la col·lecció EPS produïen HCN, totes de l'espècie P. fluorescens, i un 90% d'aquestes provenien de les arrels de plantes. Es va confirmar la producció dels metabòlits secundaris 2,4-diacetilfloroglucinol, àcid fenazina-1-carboxílic, i pirrolnitrina, per diverses soques de la col·lecció EPS seleccionades mitjançant tècniques moleculars. Així, de la col·lecció EPS, les soques EPS317 i EPS808 produeixen DAPG, la EPS263 àcid fenazina-1-carboxílic i pirrolnitrina i, EPS894, EPS895, EPS945 produeixen àcid fenazina-1-carboxílic. La producció d'HCN es va estudiar més exhaustivament en la soca EPS288, seleccionada per la seva activitat antifúngica i candidata a agent de biocontrol contra Stemphylium vesicarium, causant de la estemfiliosi de la perera, i contra Penicillium expansum, causant de la podridura blava en conservació de fruita a postcollita. Per aquest estudi, es va dissenyar i validar un sistema per recollir l'HCN a partir de cultius en medi líquid. S'ha demostrat que la temperatura d'incubació, la concentració cel·lular de sembra i la composició del medi de cultiu afectaven a la producció d'HCN. Els medis complexos i la glicina n'afavorien la síntesi i la font de carboni no afectava. La soca EPS288 va produir més HCN que P. fluorescens CHA0, soca de referència productora d'HCN i descrita com a activa en processos de biocontrol de fongs fitopatògens. En l'estudi de la producció de DAPG, les soques de la col·lecció EPS i de referència, es van comparar en diversos medis de cultiu estudiant l'efecte de la complexitat i consistència del medi, i l'addició de ferro o de glucosa. Va demostrar-se que la producció de DAPG depèn principalment de la soca i de les característiques del medi de cultiu. La glucosa estimula la producció, mentre que el ferro pràcticament no afecta, i en general, el medi sòlid i complex estimula la producció de DAPG. Tanmateix, aquests efectes varien en alguna de les soques assajades donant lloc a comportaments singulars. En el seguiment del creixement amb un sistema automàtic es va comprovar que la velocitat específica de creixement i la concentració cel·lular assolida al final del cultiu, estaven condicionades per la composició del medi de cultiu. En les proves d'antagonisme vers fitopatògens que foren seleccionats com a indicadors, va observar-se que tant l'antagonisme in vitro com la inhibició d'infeccions sobre material vegetal estaven parcialment relacionades amb la producció dels metabòlits secundaris estudiats. La promoció del creixement de portaempelts per aquestes soques depenia de la soca i de l'hoste, però no es pogué establir una relació causa-efecte amb el metabòlits produïts. També es va comprovar que algunes de les soques podien sobreviure en ferides de pomes i de peres, on produïren DAPG. Mutants resistents a rifampicina de diverses soques de la col·lecció EPS i de referència es van inocular en llavors de pomera i de tomatera que es van sembrar i incubar en condicions controlades. Es va fer el seguiment de la població bacteriana total i resistent a rifampicina present a les arrels durant 72 dies. Totes les soques van colonitzar les arrels de les plantes, mantenint una elevada població durant 37 dies, cap d'elles va estimular el creixement ni mostrar efectes fitotòxics, no afectant tampoc signicativament a la població bacteriana espontània de les arrels. La soca EPS808, una de les seleccionades pel treball, va aconseguir uns nivells de producció de DAPG, una velocitat de creixement i una supervivència relativa a les arrels similar a altres soques de referència descrites com a bons agents de biocontrol. En conseqüència, se la considera una candidata a agent de biocontrol que hauria de ser objecte de futurs estudis d'eficàcia.

Estudio de las comunidades microbianas de embutidos fermentados ligeramente acidificados mediante técnicas moleculares. Estandarización, seguridad y mejora tecnológica.

Los embutidos fermentados ligeramente acidificados son un grupo de productos tradicionales mediterráneos, caracterizados por un pH superior a 5,3. Para un control eficiente de la seguridad microbiológica de los embutidos se necesitan técnicas rápidas para la identificación y recuento de los microorganismos patógenos a estudiar. En el presente trabajo, se desarrolló una técnica para la enumeración de L. monocytogenes que combinó el método del número más probable y la identificación mediante PCR específica. Para la detección de Salmonella spp. y L. monocytogenes se desarrolló un sistema de PCR-multiplex que permitió la identificación de ambos patógenos de forma simultánea en una sola reacción. El estudio de la calidad microbiológica de los embutidos fermentados ligeramente acidificados se completó con la caracterización de las comunidades microbianas más importantes en estos productos. Se identificaron a nivel de especie los aislados de bacterias del ácido láctico (BAL), de enterococos y de cocos gram-positivos catalasa-positivos (CGC+). Posteriormente se realizó una tipificación molecular de los mismos mediante RAPD y análisis del perfil plasmídico y se estudiaron las principales características de interés higiénico-sanitario y tecnológico de las cepas. Mediante PCR se identificó Lactobacillus sakei como la especie predominante (74%), seguida por Lactobacillus curvatus (21,2%). La actividad aminoácido-descarboxilasa se asoció a la especie L. curvatus (el 66% de los aislados presentaron esta actividad). La identificación de los enterococos se realizó mediante PCR-multiplex y por secuenciación del gen sodA. Enterococcus faecium fue la especie de enterococos predominante (51,9%) seguida por Enterococcus faecalis (14,2%). Todas las cepas de E. faecalis presentaron genes asociados a factores de virulencia. E. faecalis presentó mayor resistencia a antibióticos que el resto de las especies de enterococos estudiadas. Tan sólo una cepa de E. faecium presentó el genotipo vanA (que confiere resistencia de alto nivel a la vancomicina). La identificación de los aislados de CGC+ (mediante PCR específica y amplificación de la región intergénica 16S-23S ARNr) demostró que Staphylococcus xylosus es la especie predominante en los embutidos fermentados ligeramente acidificados (80,8%). La amina biógena más común en los CGC+ fue la feniletilamina, producida por un 10,8% de aislados. Un pequeño porcentaje de aislados fueron mecA+ (4,6%), presentando además resistencia a múltiples antibióticos. El potencial enterotoxigénico de las cepas de CGC+ fue muy reducido (3,3% de los aislados), detectándose únicamente el gen entC. El estudio pormenorizado de las comunidades bacterianas de interés permitió la selección de 2 cepas de L. sakei y 2 cepas de S. xylosus con características tecnológicas e higiénico-sanitarias óptimas. Para evaluar su efectividad como cultivos iniciadores se elaboraron dos tipos de embutidos ligeramente ácidos, chorizo y fuet, inoculados con microorganismos patógenos (Salmonella spp., L. monocytogenes y S. aureus). El uso de cultivos iniciadores permitió el control de L. monocytogenes, Enterobacteriaceae y Enterococcus así como del contenido en aminas biógenas. Los recuentos de Salmonella spp. disminuyeron de forma significante durante la maduración de los embutidos, independientemente del uso de cultivos iniciadores. El uso del tratamiento de alta presión (400 MPa) en los embutidos madurados consiguió la ausencia de Salmonella spp. en los lotes tratados.

Estudi dels carotenoides en espècies marrons de bacteris verds del sofre: diversitat, eco-fisiologia i regulació

El present treball es centra en l'estudi a diferents nivells dels carotenoides de les espècies marrons de Bacteris Verds del Sofre (GSB, de l'anglès Green Sulfur Bacteria). L'objectiu global ha estat el d'esbrinar quina és la funció d'aquests pigments dins l'aparell fotosintètic d'aquests microorganismes i aprofundir en el coneixement de la seva estructura i interaccions amb els altres pigments de l'aparell fotosintètic. En primer lloc es va dissenyar un nou mètode de cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) per analitzar de manera més ràpida i precisa els carotenoides de diferents soques de GSB (Capítol 3). Aquest mètode es basa en una purificació prèvia dels extractes pigmentaris amb columnes d'alúmina per eliminar les bacterioclorofil·les (BCls). Això va permetre analitzar amb una elevada resolució i en tan sols 45 min de carrera cromatogràfica els diferents carotenoides i els seus precursors, així com les configuracions trans i cis dels seus isòmers. El segon mètode utilitzat va consistir en una modificació del mètode de Borrego i Garcia-Gil (1994) i va permetre la separació precisa de tot tipus de pigments, procedents tant de cultius purs com de mostres de caràcter complex. Un exemple concret foren uns paleosediments de la zona lacustre de Banyoles. En aquests sediments (0,7-1,5 milions d'anys d'antiguitat) es van detectar, entre d'altres pigments, carotenoides específics de les espècies marrons de GSB, la qual cosa va permetre confirmar la presència d'aquests bacteris a la zona lacustre de Banyoles ja des del Pleistocè inferior. En aquest primer capítol també es van analitzar els carotenoides de Chlorobium (Chl.) phaeobacteroides CL1401 mitjançant cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (LC-MS/MS), amb l'objectiu de confirmar la seva identificació i el seu pes molecular. A més, també es va avaluar l'efecte de la temperatura, la llum i diferents agents oxidants i reductors en la composició quantitativa i qualitativa dels carotenoides i les BCls d'aquesta espècie. Això va permetre confirmar el caràcter fotosensible de les BCls i que els isòmers trans/cis dels diferents carotenoides no són artefactes produïts durant la manipulació de les mostres, sinó que són constitutius de l'aparell fotosintètic d'aquests microorganismes. El Capítol 4 inclou els experiments de fisiologia duts a terme amb algunes espècies de GSB, a partir dels quals es va intentar esbrinar la dinàmica de síntesi dels diferents pigments de l'aparell fotosintètic (BCl antena, BCl a i carotenoides) durant el creixement d'aquestes espècies. Aquestes investigacions van permetre monitoritzar també els canvis en el nombre de centres de reacció (CR) durant el procés d'adaptació lumínica. La determinació experimental del nombre de CR es va realitzar a partir de la quantificació de la BCl663, l'acceptor primari en la cadena de transport d'electrons dels GSB. L'estimació del nombre de CR/clorosoma es va realitzar tant a partir de dades estequiomètriques i biomètriques presents a la bibliografia, com a partir de les dades experimentals obtingudes en el present treball. El bon ajust obtingut entre les diferents estimacions va donar solidesa al valor estequiomètric calculat, que fou, com a promig, d'uns 70 CR per clorosoma. En aquest capítol de fisiologia també es van estudiar les variacions en les relacions trans/cis pels principals carotenoides de les espècies marrons de GSB. Aquestes es van determinar a partir de cultius purs de laboratori i de poblacions naturals de GSB. Pel que fa als valors trobats en cultius de laboratori no es van observar diferències destacades entre el valor calculat a alta intensitat de llum i el calculat a baixa intensitat, essent en ambdós casos proper a 2. En els clorosomes aïllats de diferents soques marrons aquest quocient prengué un valor similar tant pels isòmers de l'isorenieratè (Isr) com pels del -isorenieratè (-Isr). En poblacions naturals de Chl. phaeobacteroides aquesta relació va ser també de 2 isòmers trans per cada isòmer cis, mantenint-se constant tant en fondària com al llarg del temps. Finalment, en el Capítol 5 es presenta un marcador molecular que permet la identificació específica d'espècies marrons de GSB. Malgrat que inicialment aquest marcador fou dissenyat a partir d'un gen implicat en la síntesi de carotenoides (crtY, el qual codifica per a una licopè ciclasa) la seqüència final a partir de la qual s'han aconseguit els encebadors selectius està relacionada amb la família de proteïnes de les Policètid-ceto-sintases (PKT). Tot i així, l'eina dissenyada pot ser de gran utilitat per a la discriminació d'espècies marrons de GSB respecte les verdes en poblacions mixtes com les que es troben en ambients naturals i obre la porta a futurs experiments d'ecologia microbiana utilitzant tècniques com la PCR en temps real, que permetria la monitorització selectiva de les poblacions d'espècies marrons de GSB en ecosistemes naturals.

Aislamiento, identificación y conservación de cultivos de bacterias lácticas antagonistas de microbiota contaminante de sangre de matadero

La sangre obtenida en el matadero es un producto altamente contaminado que requiere un procesamiento inmediato si se pretende utilizarla como insumo alimentario en la fabricación de productos destinados al consumo humano. Si bien es cierto que los sistemas de higienización podrían ser muy eficientes desde el punto de vista de calidad microbiológica, su instalación en la línea de sacrificio comportaría muchas dificultades desde el punto de vista técnico y en algún caso sería muy costoso. La bioconservación podría ser una alternativa para mejorar la calidad microbiológica de la sangre, alargar su vida útil y reducir las posibilidades de procesamiento inmediato. El presente estudio nos permitiría formular la posibilidad de aplicar la bioconservación en sangre de cerdo procedente de matadero industrial, utilizando bacterias ácido lácticas (BAL) como cultivo bioprotector, para lo cual se aislaron cepas de BAL autóctonas y se confeccionaron dos colecciones una de BAL mesófilas y otra de psicrótrofas. Se evaluó el potencial antagonista de la colección de BAL mesófilas y psicrótrofas a 30ºC y a 15ºC respectivamente frente a bacterias contaminantes habituales de este subproducto. Las BAL que demostraron antagonismo en placa (7,1% a 30ºC y 11% a 15ºC) fueron seleccionadas para evaluar el potencial antagonista en sangre, donde el efecto inhibitorio se vio favorecido por la adición de un 2% glucosa. S.aureus y P. fluorescens fueron los indicadores más inhibidos por las cepas mesófilas, en algunos casos con reducciones superiores a 7 unidades logarítmicas. En condiciones psicrótrofas la bacteria más sensible a la presencia de BAL fue Bacillus sp., donde 8 de las 11 BAL ensayadas permitieron reducciones superiores a 4 logs y 1cepa incluso superiores a 7 logs; se obtuvieron reducciones máximas de 3 logs de E.coli y Pseudomonas fue inhibida por todas las BAL ensayadas, en algún caso con reducciones superiores a 5 logs. Las 5 que cepas que presentaron el espectro de inhibición más amplio en condiciones mesófilas y 7 en condiciones psicrótrofas frente a los microorganismos indicadores contaminantes de sangre de matadero se identificaron mediante técnicas moleculares por comparación de la secuencias correspondientes al gen que codifica la síntesis de 16S ARNr (16S ADNr) con las secuencias publicadas en las bases de datos. De las 7 cepas antagonistas en condiciones psicrótrofas 5 se identificaron como Lactococcus garvieae y 2 como Enterococcus malodoratus/gilvius raffinosus. Todas las BAL con potencial antagonista en condiciones mesófilas pertenecían al género Lactobacillus, 3 de elllas se identificaron como Lactobacillus murinus/animalis y una se identificó como Lactobacillus reuteri. TA20 que tuvo un gran espectro de inhibición a ambas temperaturas se identificó como Lactococcus garvieae. En este estudio se evaluaron tres métodos de conservación a largo plazo de las cepas que mostraron potencial antagonista. Se comparó la liofilización, la atomización frente a la congelación a -80ºC que era método que se había utilizado hasta el momento para conservar ambas colecciones de BAL. En general, los métodos de deshidratación (atomización y liofilización) y mantenimiento en refrigeración a 5ºC de los cultivos deshidratados se han mostrado más eficaces que la congelación.

Avaliação da patogenicidade de amostras de Brachyspira pilosicoli através de técnicas histopatológicas convencionais e por imunohistoquímica.

O presente trabalho objetivou avaliar diferenças na patogenicidade de 19 cepas de B. pilosicoli isoladas de casos de diarréia em suínos no Estado do Rio Grande do Sul. Foi utiliza o modelo experimental em pintos de um dia, que possui boa eficiência quando usado para a infecção oral com a B. pilosicoli, pois permite a consistente colonização cecal dos animais inoculados. Através dessa infecção experimental, buscou-se estabelecer diferenças de patogenicidade entre cepas de referência da B. pilosicoli e cepas dessa espécie isoladas previamente de casos de diarréia em leitões no Rio Grande do Sul. Foram inoculadas 21 cepas de origem suína e duas cepas controle (uma a referência da espécie, P43/6/78 e um isolado humano, P16). Os animais foram inoculados por via oral com uma suspensão de bactérias vivas multiplicadas em meio líquido, num inóculo de 0,8 mL contendo 1x106 espiroquetas na fase logarítmica de crescimento. Decorridos 21 dias após a infecção experimental, os animais foram sacrificados e os cecos fixados em formalina 10% tamponada, processados para exame histológico e os cortes examinados através da coloração pela prata e com uma técnica imunohistoquímica. Com o uso da coloração pela prata, 65% dos animais mostraram colonização pela B. pilosicoli do epitélio do cecal. Houve diferenças no tipo de colonização, consistindo de aderência contínua, aderência focal ou presença de bactérias livres na luz intestinal. Com a técnica de imunohistoquímica, 76,2% das cepas mostraram colonização. Dessa forma, concluiu-se que a imunohistoquímica foi superior à coloração pela prata para a avaliação da colonização intestinal dos pintos, pois foi capaz de detectar 11,2% de cepas colonizadoras a mais do que a coloração pela prata Um segundo experimento visou avaliar a transmissão horizontal da infecção por B. pilosicoli. Para tal, foram mantidos em contato na mesma gaiola, pintos inoculados com a bactéria e animais chamados “contatos”, não inoculados. Com o uso da coloração pela prata, 23,8 % apresentaram-se positivos e, pela imunohistoquímica, 54,2 % foram positivos. Aqui também a imunohistoquímica revelou-se mais eficiente do que a coloração pela prata. Como conclusão desse experimento, as cepas de campo analisadas mostraram alta capacidade de difusão horizontal. Um achado inesperado foi a presença de figuras elongadas dentro do citoplasma das células epiteliais cecais entre alguns animais inoculados. Essas estavam presentes em 33,3 % das cepas, quando analisadas através da coloração pela prata. Pelos dados obtidos, não foi possível concluir que as figuras fossem Brachyspira pilosicoli, pois poderia tratar-se de outra bactéria intracelular ou artefato. Entretanto, como recentemente (no ano de 2003) foi realizado o primeiro registro por microscopia eletrônica de um achado de Brachyspira spp. intracelular, esse achado poderia significar uma alta capacidade invasiva entre as cepas analisadas. Novos estudos serão realizados e, caso comprovado, esse fato poderia auxiliar em muito o entendimento da patogenia da infecção pela B. pilosicoli, pouco clara até o momento.

Identificação e avaliação do potencial biotecnológico de leveduras e fungos semelhantes a leveduras isolados de filoplano do Hibiscus rosa-sinensis

O filoplano do Hibiscus rosa-sinensis abriga uma enorme biodiversidade de leveduras e fungos semelhantes a leveduras cujo potencial biotecnológico ainda é desconhecido. Foram isoladas 84 cepas de leveduras de filoplano desta planta, sendo identificadas pela metodologia clássica. Do total de isolados 37% são de afinidade ascomicética, 36% de afinidade basidiomicética e 27% de fungos semelhantes a leveduras.

Tipificação molecular de amostras de Brucella spp. utilização a técnica de BOX-PCR

O gênero Brucella é formado por coco-bacilos Gram negativos patogênicos ao homem e animais, sendo classificado como patógeno de grupo de risco III. A identificação dessas bactérias apresenta várias limitações como: exigência de inoculação em vários meios, tempo de incubação longo e necessidade de soros imunes e bacteriófagos. Devido à sua alta patogenicidade e ao longo tempo de exposição dos laboratoristas à bactéria, a brucelose é uma das infecções mais freqüentemente adquiridas em laboratório. Além da contaminação em laboratório, a transmissão ao homem pode ocorrer através de animais infectados e ingestão de produtos derivados, como o leite cru. A procura de métodos rápidos de identificação das espécies e biovares pode ser útil para diminuir os riscos do manuseio desta bactéria e na tomada de medidas de controle epidemiológico. O principal objetivo deste trabalho foi facilitar a classificação de cepas de referência de Brucella spp. e isoladas no Brasil utilizando a técnica de rep-PCR com oligonucleotídeos do elemento BOX, uma seqüência repetida presente no genoma de várias bactérias. Foram analisados 38 isolados representando diferentes espécies e biovares de Brucella sp. e 13 isolados de gêneros relacionados como controle da especificidade da reação. Foi realizada uma confirmação prévia dos isolados de brucela por testes bioquímicos e PCR gênero-específica. A técnica de BOX-PCR agrupou todas as espécies e biovares de Brucella em um único grupo com nível de similaridade entre 100 e 74%. Diferenças entre os isolados, quanto a presença ou ausência de bandas, puderam ser observadas. Entretanto, essas divergências não caracterizam uma espécie ou biovar. Bandas comuns a todos os isolados de Brucella sp. podem caracterizar o gênero.

Estudo da resistência do streptococcus pneumoniae à penicilina em pneumopatias infecciosas nas cidades de Porto Alegre e Caxias do Sul (RS - Brasil)

A resistência aos antibióticos dos patógenos mais comuns do trato respiratório está aumentando mundialmente. Recentemente, Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina tem sido isolado em diversos países, e a freqüência dessas cepas tem elevado de modo alarmante. O aumento da resistência, com conseqüentes implicações terapêuticas, tem levado a uma reavaliação do uso dos antibióticos ß-lactâmicos para o tratamento de infecções pneumocócicas. No presente trabalho, um total de 107 amostras de Streptococcus pneumoniae, obtidas de materiais provenientes de pacientes adultos ambulatoriais e hospitalizados, em dois centros médicos de duas cidades do Rio Grande do Sul (Porto Alegre e Caxias do Sul), os quais apresentavam quadro clínico-radiológico de infecção pulmonar, foram analisadas com o objetivo de estudar-se a resistência do germe à penicilina. As amostras constituídas de escarro (80,4%), lavado brônquico (13,5%) e aspirado traqueal (6,6%) foram coletadas no período compreendido entre Julho de 1998 e Julho de 1999. O material foi semeado em meio de Agar sangue e as colônias suspeitas de Streptococcus pneumoniae foram transferidas para meio de Mueller-Hinton para teste de optoquina e de sensibilidade à penicilina com discos de oxacilina. Um halo de inibição da oxacilina menor do que 20 mm indicava a realização de teste para determinação da concentração inibitória mínima (MIC) com E-test. Um total de nove cepas foi identificado como tendo resistência intermediária à penicilina (MIC 0,1-1,0μg/ml) e nenhuma cepa resistente (resistência elevada: MIC > 2,0 μg/ml) foi identificada. Uma monitorização local das cepas quanto à resistência antimicrobiana é de grande importância para os clínicos no manejo de infecções pneumocócicas.

Estudo de bacteriocinas produzidas por espécies de Enterococcus

As enterocinas são compostos de natureza protéica que apresentam atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas e deteriorantes de alimentos. Por esta razão, nos últimos anos, o interesse por estas substâncias tem aumentado devido ao seu uso potencial como biopreservante de alimentos. Realizando uma triagem com 352 cepas de Enterococcus spp para detectar atividade antimicrobiana, foram encontradas 18 cepas (5%) produtoras de enterocinas, pertencentes às espécies E. faecalis, E. faecium e E. mundtii todas provenientes de amostras de fezes de humanos. Destas cepas foram produzidos sobrenadantes livres de células e realizados testes para caracterização das enterocinas produzidas. As enterocinas produzidas pelas 18 cepas apresentaram o mesmo espectro de atividade antimicrobiana, inibindo 4 espécies do gênero Listeria, Lactobacillus plantarum e Salmonella Enteritidis. Todas foram parcialmente estáveis ao aquecimento (121ºC por 10 minutos), a variações de pH de 2 a 10 e a estocagem por 60 dias a 4ºC e a -20ºC. A sensibilidade a proteases confirmou a natureza protéica destas substâncias antimicrobianas. Com cinco sobrenadantes livres de células foram realizadas curvas de produção de enterocinas e todas iniciaram a produção na fase logarítmica de crescimento, indicando cinética de metabólito primário. Com estes sobrenadantes foi determinado o peso molecular aproximado de 3 KDa, utilizando a técnica de SDS-PAGE. As cepas com atividade antimicrobiana no sobrenadante livre de células não apresentaram os genes para produção das enterocinas A e B, mas 14 cepas de E. faecium apresentaram o gene para enterocina A e 9 para enterocina B, sendo que apenas uma cepa apresentou ambos os genes. Nenhuma das 18 cepas produtoras de enterocinas apresentou atividade hemolítica e presença de adesinas, todas apresentaram cápsula. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que estas enterocinas demonstram um potencial aplicabilidade em novos estudos relacionados aos biopreservantes.

Ocorrência, contagem e resistência antimicrobiana de Salmonella isoladas de carcaças de frangos resfriadas e pesquisa de Salmonella em galpões de frangos de corte.

A Salmonella permanece um importante problema na avicultura mundial e considerando os patógenos transmitidos por alimentos, a Salmonella aparece como um dos agentes principais em surtos de toxinfecções alimentares. Existem vários relatos de isolamento de Salmonella em frangos vivos e surtos alimentares, porém em carcaças de frangos e cortes a disponibilidade de dados é menor, assim como estudos de determinação do número de Salmonella presentes nas amostras, também são poucos. No presente estudo, foram analisadas 180 carcaças de frangos resfriadas, adquiridas em varejos, para determinação da ocorrência de contaminação por Salmonella pelo método de microbiologia convencional, ensaio imunoenzimático (ELISA) e determinação do número de células da bactéria pelo método do número mais provável (NMP) nos ágares para isolamento verde brilhante com novobiocina (BGN) e xilose-lisina tergitol 4 (XLT4). Neste mesmo estudo, foi determinado o perfil de resistência a antimicrobianos de 13 amostras de Salmonella isoladas das carcaças de frangos, e analisados 101 suabes de arrasto de camas aviárias, pelo método microbiológico convencional, para a presença do agente. Os resultados mostraram 15,8% de ocorrência de Salmonella nos suabes de arrasto e 12,2% de ocorrência nas carcaças de frangos resfriadas, pelo método de microbiologia convencional. O teste de ELISA detectou 11,3% de positividade para Salmonella nas carcaças de frangos resfriadas. A média de NMP de Salmonella por mL, na leitura pelo ágar XLT4 foi de 2,674 células e BGN foi de 1,282 células. As cepas de Salmonella apresentaram resistência aos antimicrobianos lincomicina, penicilina e estreptomicina (100%), josamicina e enrofloxacina (69,23%), amoxicilina (30,76%), clortetraciclina (23,07%), estreptomicina e estreptomicina + penicilina (15,83%) e 7,69% de resistência a doxiciclina e polimixina B. Os sorovares de Salmonella isolados no estudo foram Enteritidis, Agona, Risssen, Heidelberg e Livingstone, nas carcaças de frangos, e, Enteritidis, Agona, Ohio, Rissen, Tennessee, entérica O: 3,10 e entérica O: 6,71 nos suabes de arrasto. A análise dos resultados apresentou contaminação por Salmonella nas camas aviárias e presença de cepas de Salmonella, isoladas das carcaças, multiresistentes a antimicrobianos. Também demonstrou existir um número variável de células de Salmonella contaminando as carcaças de frango resfriadas que estão à venda ao consumidor.

Biologia do gene pheA de Mycobacterium tuberculosis : clonagem, seqüenciamento e superexpressão do seu produto - a proteína prefenato desidratase

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Análise do polímero PHA em Saccharomyces cerevisiae recombinante : superexpressão de phaG, e a contribuição in vivo das enzimas auxiliares envolvidas na beta-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos

Os polímeros do tipo poli-hidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres bacterianos que apresentam as propriedades de termoplásticos e elastômeros biodegradáveis. A síntese deste polímero em plantas de interesse agroindustrial tem sido vista como uma área promissora dentro da biotecnologia de polímeros para a produção em grande escala com baixos custos. Contudo, esta tarefa requer o aprimoramento de diferentes metodologias bioquímicas e moleculares, além de maximizar os processos de extração destes polímeros biológicos. A produção de PHAs em peroxissomos ou no citoplasma de Saccharomyces cerevisiae, por meio da expressão de uma PHA-sintase bacteriana, pode servir como indicador e modulador do fluxo de carbonos que percorre vias biossintéticas como a síntese de novo de ácidos graxos e a β-oxidação. Esta levedura tem sido usada como eucarioto modelo para manipular as rotas envolvidas na síntese de PHAs do tipo MCL (PHA com um número médio de carbonos), um polímero menos cristalino e com menor ponto de fusão quando comparado ao PHA-SCL (PHA com um número pequeno de carbonos). A enzima PhaG (3-hidroxidecanoil-ACP-CoA transacilase) é responsável pela conexão entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em bactérias do gênero Pseudomonas, em meios de cultura contendo uma fonte de carbono nãorelacionada como gliconato, etanol ou acetato. Para tentar estabelecer esta rota metabólica em S. cerevisiae, o presente trabalho avaliou a coexpressão de PhaGPa e PhaC1Pa (PHA-sintase) de P. aeruginosa para a síntese de PHA-MCL a partir de uma fonte de carbono não-relacionada em leveduras. Contudo, a presença de PhaGPa não alterou a composição ou a quantidade de PHA-MCL em relação à cepa controle contendo apenas PhaC1Pa citoplasmática ou direcionada ao peroxissomo, independentemente da fonte de carbono utilizada (rafinose ou ácido oléico). Este resultado permite sugerir que a ligação entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em S. cerevisiae não foi estabelecida, provavelmente devido à ausência de algum passo enzimático que limita o desvio de substratos da síntese de ácidos graxos para a produção de PHA-MCL em organismos que não são capazes de acumular naturalmente este polímero quando cultivados em fontes de carbono não-relacionadas.A levedura S. cerevisiae tem sido usada como um sistema modelo para estudar a β-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos. A produção de PHA-MCL pela expressão de PhaC1Pa em peroxissomos de cepas selvagens e mutantes nulos de S. cerevisiae para as enzimas auxiliares da β-oxidação (Eci1p, Sps19p e Dci1p), multiplicadas em meio de cultivo contendo um ácido graxo insaturado como fonte de carbono, permitiu monitorar o fluxo de carbonos que percorre as vias dependente de isomerase, redutase e di-isomerase. Desta forma, o presente estudo permitiu avaliar a β- oxidação in vivo dos ácidos graxos linoléico conjugado, 9-cis,11-trans-CLA (ácido rumênico) ou 10-cis,13-cis-nonadecadienóico, para determinar a contribuição das vias alternativas na degradação destes substratos pela utilização de cepas selvagens, mutantes nulos e linhagens contendo um plasmídio multicópia para os genes ECI1 (Δ3- Δ2-enoil-CoA isomerase), SPS19 (2,4-dienoil-CoA redutase) e DCI1 (Δ3,5-Δ2,4-dienoil- CoA isomerase). As linhagens selvagens foram capazes de sintetizar PHA-MCL quando cultivadas em ácido rumênico, mas a atividade da enzima Eci1p foi essencial para a degradação deste CLA, indicando que a via dependente de isomerase é a única rota in vivo necessária para a β-oxidação do ácido rumênico em peroxissomos de S. cerevisiae. A contribuição da enzima di-isomerase (Dci1p) para a degradação do ácido 10- cis,13-cis-nonadecadienóico foi avaliada em cepas selvagens, mutantes nulos dci1Δ e linhagens de S. cerevisiae contendo os plasmídeos multicópia. De acordo com o conteúdo e a quantidade de PHA formado, a β-oxidação de ácidos graxos cisinsaturados em um carbono ímpar é, in vivo, independente da di-isomerase. Embora este resultado possa indicar o mesmo padrão de envolvimento de Dci1p na degradação de ácidos graxos cis-insaturados em um carbono ímpar em mitocôndrias de mamíferos, esta via alternativa deve ser mais bem investigada em eucariotos superiores.

Análise química e avaliação da atividade antiviral de hypericum connatum lam.

Plantas da família Guttiferae apresentam diversas atividades biológicas sendo Hypericum o gênero mais importante devido às atividades antidepressiva, antibacteriana e antiviral de algumas espécies. Hypericum connatum, utilizado no sul do Brasil para o tratamento de feridas de boca, demonstrou atividade contra o lentivírus, responsável pela imunodeficiência felina. Objetivo: isolar e identificar as substâncias majoritárias de H. connatum e testar a atividade de extratos obtidos das partes aéreas e raízes e das substâncias isoladas frente a duas cepas do herpesvírus simples tipo 1 (HSV-1). Método: foram obtidos frações nhexano, diclorometano e metanol e extratos bruto, aquosos a diferentes temperaturas e hidro-etanólico das partes aéreas e raízes. As frações n-hexano e metanólica das partes aéreas foram submetidas à coluna cromatográfica para o isolamento de substâncias. Os extratos e substâncias isoladas foram testados frente ao HSV-1, cepas KOS e ATCC-VR733. Determinou-se a concentração máxima não tóxica (CMNT) à célula e a concentração que provoca alteração morfológica em 50% das células (CC50) pela técnica da alteração morfológica celular, utilizando-se células VERO, linhagem ATCC CCL-81. A avaliação da atividade antiviral foi realizada em placas de microtitulação e medida pela inibição do efeito citopático (ECP) provocado pelo vírus. Resultados e Conclusões: da fração n-hexano foi isolado hiperbrasilol B, da fração metanólica foram isolados amentoflavona, hiperosídeo e guaijaveriana, além de um flavonol de estrutura ainda não definida (HCN3). A fração n-hexano e o extrato bruto das raízes inibiram o ECP das cepas KOS e ATCC-VR733. Os demais extratos testados não apresentaram atividade antiviral. Dentre as substâncias analisadas, hiperbrasilol B, amentoflavona e HCN3 foram ativos frente às duas cepas. Os flavonóides hiperosídeo e guaijaverina não apresentaram atividade anti-HSV-1.