A thioredoxin with antioxidant activity identified from Eriocheir sinensis

Thioredoxin, with a redox-active disulfide/dithiol in the active site, is the major ubiquitous disulfide reductase responsible for maintaining proteins in their reduced state. In the present study, the cDNA encoding thioredoxin-1 (designated EsTrx1) was cloned from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis by using rapid amplification of cDNA ends (RACE) approaches. The full-length cDNA of EsTrx1 was of 641 bp, containing a 51 untranslated region (UTR) of 17 bp, a 3' UTR of 306 bp with a poly (A) tail, and an open reading frame (ORF) of 318 bp encoding a polypeptide of 105 amino acids. The high similarity of EsTrx1 with Trx1s from other animals indicated that EsTrx1 should be a new member of the Trx1 sub-family. Quantitative real-time PCR analysis revealed the presence of EsTrx1 transcripts in gill, gonad, hepato-pancreas, muscle, heart and haemocytes. The expression of EsTrx1 mRNA in haemocytes was up-regulated after Listonella anguillarum challenge, reached the maximum level at 6 h post-stimulation, and then dropped back to the original level gradually. In order to elucidate its biological functions, EsTrx1 was recombined and expressed in E. coli BL21 (DE3). The rEsTrx1 was demonstrated to possess the expected redox activity in enzymatic analysis, and to be more potent than GSH in antioxidant capacity. These results together indicated that EsTrx1 could function as an important antioxidant in a physiological context, and perhaps is involved in the responses to bacterial challenge. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

织纹螺（Nassarius spp.）体内河豚毒素来源的研究

近几十年来，国内沿海地区频繁发生食用织纹螺中毒事件，并导致数十人死亡，这一问题得到了政府相关部门的高度重视。但是，由于织纹螺毒性变化很大，毒素来源不清楚，因此很难预测食用织纹螺中毒事件的发生，这在很大程度上限制了对食用织纹螺中毒事件的有效监测和管理。目前，对于中国沿海有毒织纹螺体内河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）的来源还未见过系统研究。本文选取中国沿海常见的半褶织纹螺（Nassarius semiplicatus）、纵肋织纹螺（N. variciferus）和拟半褶织纹螺（N. semiplicatoides sp. nov.）作为实验对象，从毒素的微生物来源与食物链来源这两个角度分别展开研究，以探讨织纹螺体内 TTX 的可能来源，为提出相应的预防管理措施提供科学依据。 首先，我们先后从曾发生过中毒事件的江苏盐城和连云港采集了织纹螺样品，通过小鼠生物测试法和液-质联用分析技术（LC-MS），对织纹螺的毒性和毒素组成进行了测试和分析，分离培养了织纹螺体内及其生活环境中的细菌，应用河豚毒素单克隆抗体酶联免疫检测方法（ELISA）对细菌的产毒情况进行了测试，并通过 16S 核糖体（rRNA）部分基因序列测定对细菌种类进行了初步的分析。研究发现，采自江苏盐城和连云港的半褶织纹螺的毒性分别约为 2 MU/g 和 200 MU/g 组织，体内的毒素成分是河豚毒素及其同系物。从盐城的半褶织纹螺及其生活环境分离的菌株中随机挑出 14 个菌株中，9 个菌株河豚毒素检测结果呈现阳性。从连云港高毒性半褶织纹螺消化腺中分离到的 45 个菌株中，阳性菌株有 21 个。但是，有毒菌株毒素含量较低，毒素含量范围是 15-184ng/g。通过 16S rDNA 部分序列的测序结果发现，大部分有毒菌株与弧菌属（Vibrio）的细菌在遗传序列信息上比较相近。其余有毒菌株分别与希瓦氏菌属（Shewanella）、海单胞菌属（Marinomonas）、黄杆菌属（Tenacibaculum）、动性菌属（Planococcus）、发光杆菌属 (Photobacterium)和气单胞菌属（Aeromonas）的遗传序列比较相近。其中与海单胞菌属、动性菌属和发光杆菌属亲缘关系较近的产毒细菌是首次报道。这一研究表明织纹螺体内及其生活环境中的存在产河豚毒素的细菌，但由于产毒素的量较低，因此可能在织纹螺体内河豚毒素的产生和累积过程并不发挥主要作用。 织纹螺作为一类腐食性的海洋动物，也有可能通过进食含有河豚毒素的生物而累积河豚毒素。对此，我们开展了高毒性半褶织纹螺的室内培养实验，以及河豚毒素在不同种类织纹螺体内的累积和排出的模拟实验，并定期采样，通过液相色谱与串联质谱联用技术（LC-MS/MS）对织纹螺体内河豚毒素及其同系物的含量变化情况进行了分析。室内培养实验发现，从连云港赣榆县采集的高毒性半褶织纹螺，在实验初期，体内毒素含量呈下降的趋势，但从 7月上旬开始，毒素含量突然快速上升，与连云港赣榆县野外采集的织纹螺的毒素含量表现出相似的变化趋势。河豚毒素在不同种织纹螺体内的累积和排出的模拟实验发现，通过投喂高毒性的河豚鱼肝脏（毒性为5×103 MU/g），纵肋织纹螺在一段时间内能够快速累积少量的河豚毒素。当停止投喂有毒河豚鱼肝脏后，毒素含量会快速下降。而在曾导致中毒事件的拟半褶织纹螺中，投喂有毒河豚鱼的肝脏后，其体内毒素含量只有缓慢增加。但在投喂无毒的河豚鱼肝脏后，其毒性却出现了快速增加的现象，这与该地区野外样品的毒性变动状况类似。这些发现显示高毒性半褶、拟半褶织纹螺体内的河豚毒素应当不是食物链累积的结果，而可能是由其自身产生。并且，毒素含量的变化具有一定的生物节律，有可能与产卵、繁殖等自然节律相关。 通过对半褶、纵肋和拟半褶织纹螺的研究工作可以认为，产河豚毒素的细菌不是织纹螺体内河豚毒素的主要来源，并且毒素也不是来自其摄食的食物，推测可能主要是由织纹螺自身产生。织纹螺所表现出的河豚毒素含量的季节性变化，极有可能与产卵、繁殖等自然节律相关，这些发现为预防和管理食用织纹螺中毒事件提供了科学依据。但是，本研究并未完全阐明织纹螺体内河豚毒素的来源，对于织纹螺体内河豚毒素的确切来源以及河豚毒素的代谢和转化机制，还有待于更加深入地研究工作。

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）Peroxiredoxin 6和Thioredoxin1基因的克隆及表达

中华绒螯蟹是我国重要的水产经济动物，近年来养殖规模不断扩大，产量持续增加。但是，伴随着养殖规模的扩大，养殖环境也日益恶化并导致了大量疾病的发生，严重制约了中华绒螯蟹养殖业的健康发展。因此，疾病预防和控制对中华绒螯蟹养殖业的可持续发展具有举足轻重的作用。与其他无脊椎动物一样，中华绒螯蟹的免疫系统没有免疫球蛋白和淋巴细胞，而是依靠由细胞免疫和体液免疫构成的固有免疫系统来对病原进行识别和清除。中华绒螯蟹的固有免疫机制的研究有助于推动中华绒螯蟹病害防治工作的开展。 本研究采用大规模EST测序方法，结合末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技术从中华绒螯蟹血淋巴中克隆到了过氧化物还原酶（peroxiredoxin，EsPrx6）和硫氧还蛋白（thioredoxin，EsTrx1）基因的cDNA 全长序列；采用实时荧光定量PCR 技术检测了这两个基因在健康个体中表达的组织分布情况以及鳗弧菌刺激后血淋巴细胞中的时序表达规律；同时，将这两个基因的编码区克隆到pET 系列载体，并在大肠杆菌中实现了重组表达，并进行了体外活性检测。 过氧化物还原酶是一个抗氧化蛋白超家族，在保护机体免受活性氧（reactive oxygen species，ROS）的伤害中发挥着重要作用。中华绒螯蟹Prx6（EsPrx6） 基因的cDNA 全长为1076 bp，5` UTR（untranslated region，UTR） 为69 bp，3` UTR 为347 bp，开放阅读框（open reading frame，ORF）为660 bp，编码219 个氨基酸的蛋白。mRNA 3`-端具有多聚腺苷酸加尾信号（polyadenylation signal）AATAAA 和polyA 尾巴。EsPrx6 的预测分子量为 24 kDa，理论等电点为6.21，具有一个保守的Prx 结构域、一个AhpC 结构域和过氧化物酶催化活性中心PVCTTE，表明EsPrx6 属于1-Cys 型Prx。在所检测的组织中均有EsPrx6 的表达，其中以肝胰腺表达量最高，为血淋巴细胞中表达量的17.4 倍。鳗弧菌刺激后，血淋巴细胞中EsPrx6 的表达下降，到12 h 时，实验组显著低于对照组（P<0.05）；随时间推移，表达水平逐渐回升，但在整个实验期间，都没有恢复到起始水平。将EsPrx6 进行体外重组并在大肠杆菌E. coli BL21（DE3）中实现表达，重组EsPrx6 具有预期的抗氧化活性和过氧化物酶活性，其中抗氧化活力为14.69 U/mg 蛋白，高于相同条件下GSH 的抗氧化力（P<0.05），过氧化物酶活力为23.46 U/mg 蛋白。结果表明，EsPrx6 作为一种重要的抗氧化剂，在中华绒螯蟹抵御ROS 可能引起的氧化损伤方面具有重要作用。 硫氧还蛋白是广泛存在于生物体内的一种具有硫醇依赖性的具有还原活性的蛋白。中华绒螯蟹Trx1（EsTrx1）基因的cDNA 全长为641 bp，5` UTR 为17 bp，3` UTR 为306 bp，开放阅读框为318 bp，编码105 个氨基酸。EsTrx1 的预测分子量为12.2 kDa，理论等电点为4.8。EsTrx1 不含信号肽，其氨基酸序列与其他动物的Trx1s 具有高度相似性，如与地中海黄蝎的Trx1 相似度达到73%；而与其他物种Trx2 的同源性很低，相似度仅为14.3-22.8%，表明EsTrx1 属于Trx1 亚族。实时荧光定量PCR 检测发现，EsTrx1 在鳃、性腺、肝胰腺、肌肉、心脏和血淋巴细胞中都有表达。血淋巴细胞中EsTrx1 mRNA 的表达量在菌刺激后上升，刺激后6 h，实验组表达量显著高于对照组和空白组（P<0.05），然后逐渐恢复到刺激前水平。为进一步探讨其生物学功能，将EsTrx1 进行体外重组并在大肠杆菌E. coli BL21（DE3）得到表达，重组EsTrx1 具有预期的氧化还原调节活性，抗氧化活力为3.06 U/mg，且抗氧化活力高于GSH（P<0.05）。rEsTrx1 的二硫键还原活力为5.03，低于凡纳滨对虾的二硫键还原活力（10.44），接近于大肠杆菌（4.93），小牛胸腺（6.50）和小牛肝脏（5.09），而高于鲍鱼Trx2（1.83）活力。结果表明，EsTrx1 在生理条件下能够作为一种重要的抗氧化剂，参与对细菌感染的免疫应答反应。

皱纹盘鲍的遗传育种与养殖技术研究

优良的种质是产业发展的重要保证，品种更新和养殖技术的发展已经给世界农业带来了令人瞩目的成就，然而我国水产生物的育种工作刚处于起步阶段，而育种技术的研究则更是滞后。借鉴陆生生物中发展起来的相对成熟的研究方法，可以帮助加快海洋生物遗传育种相关研究的进度。本研究以我国北方海区重要的海洋经济动物－皱纹盘鲍为研究对象，从表型遗传、数量性状遗传等2个方面开展了皱纹盘鲍的遗传育种研究，同时从幼鲍培育密度与分选效应等方面研究了皱纹盘鲍的中间培育技术。 主要结果如下： 1. 皱纹盘鲍的贝壳颜色遗传、食物对贝壳颜色表现型的影响，贝壳颜色与生长速度间的关系 将贝壳颜色为橘红色（O表型）的突变型皱纹盘鲍与贝壳颜色为绿色（G表型）的野生型皱纹盘鲍进行了连续2代的交配实验。结果表明：皱纹盘鲍橘红色的贝壳颜色相对于绿色的贝壳颜色为隐性性状，皱纹盘鲍的贝壳颜色表型受单位点、2个等位基因遗传控制，其中基因型为oo的个体，贝壳颜色的表现型为橘红色（O表型），而基因型为GG或Go的个体，贝壳颜色的表现型为野生型（G表型）。 为探讨食物类型对不同基因型皱纹盘鲍贝壳颜色表现型的影响，对不同贝壳颜色表型的个体投喂不同种类的食物，结果表明，除遗传因素外，皱纹盘鲍的贝壳颜色表现型显著地受食物类型的调控。其中oo基因型的个体，在摄食底栖硅藻（Navicula sp.）和红藻时，贝壳颜色的表型为橘红色；而在摄食褐藻、绿藻和以海带粉为唯一海藻源的人工配合饵料时，贝壳颜色的表型为黄色。GG和Go基因型的个体，在摄食底栖硅藻、红藻时，贝壳颜色的表型为褐红色；在摄食褐藻、绿藻和以海带粉为唯一海藻源的人工配合饵料时，贝壳颜色的表型为绿色。该结果表明，相同基因型的皱纹盘鲍在摄食不同类型的食物时，贝壳表现型不同，即不同类型的食物可以导致2种基因型皱纹盘鲍的贝壳颜色表现型在一定范围内发生转换：oo基因型的个体，贝壳的颜色可以表现为橘红色或者黄色，不会出现野生型皱纹盘鲍的褐红色或绿色；而GG与Go基因型的个体，相应的贝壳颜色表型只能是褐红色或者绿色，不会出现oo基因型可能表现的橘红色或黄色。特定基因型的皱纹盘鲍，在摄食特定类型的食物时贝壳的相应部位可表现出特定的颜色。皱纹盘鲍的这种“食物－贝壳颜色”的相关性可作为一种形态标记，用于标识皱纹盘鲍的个体和群体，该标记技术可用于皱纹盘鲍的养殖技术和遗传学研究。 此外，选用了贝壳颜色遗传学实验中建立的贝壳颜色发生分离的家系为实验材料，以壳长为指标，分析比较了来自相同家系的O表型与G表型个体之间的生长速度。结果表明，在幼鲍发育至412天止的3-5个统计时段内，没有在同一家系来源的2种贝壳颜色表型个体之间检验到生长速度的显著差异。 2. 皱纹盘鲍不同选育群体及杂交群体的贝壳形态参数分析 在皱纹盘鲍的7个群体中（包括已经对生长速度为指标进行了多代人工选育的群体4个、野生群体之间直接杂交繁育的杂交F1群体3个），测量了4-6龄成体样本的壳长（L）、壳宽（W）、壳高（H）和壳重（Sw），并计算了L/（L+W+H）、W/（L+W+H）、H/（L+W+H）和Sw/（L×W×H）等4个壳形态学参数。用方差分析方法（MANOVA、ANOVA）统计并比较了这些壳形态参数在皱纹盘鲍群体间的遗传变异。结果表明，4个壳形态参数在不同群体间变异系数分别为0.34、0.74、2.62和6.54，其中，H/（L+W+H）与Sw/（L×W×H）在各供试群体间均具有较高的多态性且差异达显著水平，表明这2个参数在不同群体间存在较高的遗传变异。由于在活体情况下无法测量壳重（Sw）性状，建议以参数H/（L+W+H）为指标对皱纹盘鲍贝壳形态（如壳型）等进行人工选择。 3. 皱纹盘鲍成体阶段生长性状的遗传参数估计 采用巢式设计，分析了成体阶段不同发育期皱纹盘鲍的壳长与生长速率的遗传力、不同发育期的壳长性状之间的遗传相关、以及不同发育期的生长速率之间的遗传相关，结果表明：（1）壳长遗传力在受精后第70 、130、320、320、380、490与550天的雄性组分估计值分别为0.161 ± 0.075、0.312 ± 0.131、0.326 ± 0.331、0.135 ± 0.228、0.153 ± 0.185和0.180 ± 0.106；雌亲组分估计分别为0.312 ± 0.172、0.699 ± 0.168、0.695 ± 0.168、0.977 ± 0.407、0.427 ± 0.195和0.449 ± 0.027。（2）生长速率遗传力在受精后第320~380天、490 ~ 550天，雄、雌组分估计值分别为0.080 ± 0.120（雄）、 0.210 ± 0.191（雌）以及0.299 ± 0.146（雄）、0.306± 0.148（雌）。雌亲组分的壳长遗传力和生长速率遗传力估计值较大且均达显著水平，表明皱纹盘鲍在成体阶段依然受母性效应的影响。成体阶段生长性状遗传力水平的估计对制定科学的皱纹盘鲍育种方案有指导意义。（3）雄亲组分估计的不同发育期（第390 ~ 550天）壳长间遗传相关为0.597 ~ 1.000，雌亲组分估计为0.589 ~ 1.177。由雄亲、雌亲组分估计，受精后第320~380天与第490 ~ 550天两个发育阶段生长速率间遗传相关均接近于0。雌亲组分估计不同发育期壳长间遗传相关均达显著水平（t0.05, d.f.=13 = 4.33 ~ 11.69，P<0.01），表明壳长性状早期选择有效，即在皱纹盘鲍早期阶段依据壳长性状对个体进行择优或去劣可在后期阶段获得壳长较大的个体。由于使用的雄亲数目少（8个父系半同胞），实验中以雄亲组分估计的遗传参数误差较大。 4. 皱纹盘鲍选育系间的群体杂交 进行了皱纹盘鲍4个人工选育系之间的完全双列杂交实验，以群体交配的方式共建立了16个组合；此外，以大连“98”选群与汕头“S”选群为亲本，以群体交配的方式建立了4个交配组合。对不同方向的杂交组合进行了中亲杂种优势、超亲杂种优势以及配合力等方面的评价。 （1）测量了4个选育群体（R、97、S和J）及其各杂交组合在受精后第9、20和30天时的壳长，统计分析了不同选育系间壳长性状的差异、评价了不同方向杂交组合的中亲与超亲杂种优势、以及配合力。结果如下： 选育系群体内交配繁育的4个组合，在受精后第9、20和30天的壳长均有显著差异，其中，97  97组合在早期发育各阶段均为最小，分别为0.462 ± 0.023mm、0.698 ± 0.057mm和1.476 ± 0.234mm；S  S组合的3次测量值均为最大，分别为0.522 ± 0.023mm、0.824 ± 0.084mm和1.798 ± 0.229mm。 两个方向杂交组合与选育系亲本群体内交配组合的平均值和高亲值比较，得到如下结果：（A）受精后第9天壳长表现正向中亲杂种优势的组合有6个、表现负向中亲杂种优势的组合6个，其中J  97组合的中亲优势率最高，为9.05%；R  S组合最低，为-6.61%。正向高亲杂种优势组合有4个、负向高亲杂种优势组合有8个，其中S  J组合的高亲优势率最高，为5.77%；R  S组合最低，为-7.96%。（B）受精后第20天壳长表现正向中亲杂种优势的组合有7个、表现负向中亲杂种优势的组合5个，其中J  97组合的中亲优势率最高，为12.60%；J  R组合最低，为-8.72%。正向高亲杂种优势组合有3个、负向高亲杂种优势组合有11个，其中J  97组合的高亲优势率最高，为12.20%；J  R组合最低，为-12.67%。（C）受精后第30天壳长表现正向中亲杂种优势的组合有7个、负向中亲杂种优势的组合5个，其中97  S组合的中亲优势率最高，为24.08%；S  97组合最低，为-12.69%。正向高亲杂种优势组合有6个、负向高亲杂种优势组合有6个，其中97  S组合的高亲优势率最高，为15.95%；S  J组合最低，为-19.44%。上述结果表明，皱纹盘鲍不同选育系之间的交配组合，杂种优势率差异很大，因此，通过组配实验，将杂种优势率高的交配组合选择出来应用于生产，可望显著提高目标性状的产量。 对早期发育阶段各生长期壳长性状，亲本一般配合力（GCA）、各杂交组合间特殊配合力（SCA）以及正反交（REC）效应值进行方差分析，结果表明：各亲本GCA差异显著，说明各选育群体存在显著的遗传差异，其中汕头选群“S”在测量的各个生长期均为正值且显著大于其它各亲本；特殊配合力（SCA）以及正反交（REC）效应值较大在各杂交组合间存在显著差异，说明在早期生长发育阶段非加性遗传效应（显性和上位效应）占主导地位。综合各个生长期亲本GCA和杂交组特殊配合力（SCA）以及正反交（REC）效应值，杂交组合97×S在早期生长阶段不仅有较高SCA值而且两个亲本也具有较大的GCA值，表明选育系97和S较适宜作为杂交亲本使用。 （2）大连“98”选群与汕头“S”选群进行2×2因子设计的群体杂交实验，比较了各交配组合早期存活相关性状如受精率、孵化率、变态率以及壳长性状，评价了两个方向杂交组合平均以及不同方向杂交组合的中亲杂种优势率。结果表明早期发育阶段各组合间的受精率无显著差异，而孵化率、变态率等两个杂交方向平均的中亲杂种优势率为5.49%与12.53%，高于壳长性状的优势率（0.936-1.534%）。方差分析结果表明不同方向的杂交组合在早期发育阶段存活相关性状以及壳长性状存在显著差异。孵化率、变态率性状，S×98的中亲杂种优势率分别为13.21%与21.10%，均高于98×S的-3.84%与3.85%；而第10和25d壳长性状，S×98的中亲杂种优势率为1.14%与-2.52%，低于98×S的1.93%与4.41%。 为进一步评价“98”选群与“S”选群不同交配组合在不同温度条件下的生长，进行了基因型与环境的互作研究。从“98”选群与“S”选群的4个交配组合中分别取5月龄幼鲍100头，各组合随机分成3组，每组1个重复，分别于12°C、16°C和 22°C温度条件下进行培育，比较各交配组合基因型与温度对幼鲍生长的影响。不同温度条件下，各组合壳长生长的方差分析结果表明，基因型和温度都能够对幼鲍生长以及最终壳长产生极显著的影响（P < 0. 01），它们的交互作用也达到显著水平（P < 0.05）。杂交子代的幼鲍壳长在12°C、16°C和 22°C温度条件下均表现出杂种优势，双向杂交的中亲杂种优势率分别为5.32%、5.55%和0.03%，表明低温条件（12°C），比高温条件（22°C）下有更强的杂种优势。汕头“S”选群的早期孵化率、变态率、生长性状以及低温条件下幼鲍生长性状的单亲杂种优势率分别为16.64%、42.49%、3.42~5.79%和5.73~9.15%，单亲杂种优势率较大，表明可通过杂交手段，显著地改良汕头“S”选群在早期发育阶段的生长速度、存活率以及幼鲍期的生长性状。本研究的结果支持了Lerner（1954）杂种优势的基因与环境互作学说。 5. 皱纹盘鲍幼鲍的中间培育技术研究 （1）对南方越冬方式的评价 目前，每年的11月前后，将6-7月龄幼鲍运往南方的闽东、闽中、闽南沿海越冬，翌年4月至6月再运回到北方（大连、山东半岛）的养殖模式已经普遍应用于皱纹盘鲍的实际生产，为评价南方越冬的幼鲍培育方式，本研究分别以不同幼鲍材料在闽东三都海湾进行了越冬培育实验。 选择生产上壳长分别为18.37 ± 1.28 mm、15.89 ± 1.10 mm、14.55 ± 1.10 mm与10.59 ± 0.84 mm的幼鲍进行了为期6.5个月的越冬培育，实验结束时，存活率分别为95.56 ± 2.21%、90.55 ± 1.96%、83.97 ± 1.63%与63.30 ± 2.79%。回归分析表明，供试幼鲍在实验起始时的壳长与越冬阶段的存活率成正相关（P = 0.018 < 0.05）。该结果表明，提高幼鲍的规格可显著提高皱纹盘鲍的越冬成活率，因此对于实际生产而言，采取适当措施提高皱纹盘鲍越冬苗种的规格将大幅增加生产的收益，而采用生长速率快的品种、品系或提早采苗均可实现该目标。综合各规格组幼鲍，幼鲍在南方开放性水域进行越冬培育的平均存活率较高，可达到91.38±0.01%，从幼鲍南方越冬的存活曲线可以看出，幼鲍的死亡主要集中在从大连运至福建某地后的15天内，出现死亡高峰的原因可能是由于运输过程的胁迫。此外，2月及4月中下旬水温出现显著降低或回升时也有较明显的死亡出现。该部分结果，对皱纹盘鲍幼鲍的养成管理有指导意义，可以通过合理安排越冬时间、避开死亡的敏感期等措施减少苗种越冬阶段的死亡量。 以中国大连野生群体繁育的子一代为亲本（10♀，10♂），以群体交配的方式繁育F2代个体为实验材料，分别于南方海区以及北方室内升温水方式下进行生长、存活比较，结果表明南方越冬培育方式下，幼鲍壳长的日增长率为81.37-108.89 µm•day-1，与北方室内升温培育条件相比，壳长生长提高了1.08 ~ 1.68倍；而存活率无显著差异。皱纹盘鲍幼鲍南方越冬方式的优势主要体现在鲍鱼幼鲍的生长速度加快，同时节约养殖场的能耗 （2）幼鲍培育过程中的养殖密度与分选效应评价 以3种规格皱纹盘鲍幼鲍为材料比较幼鲍在4个培育密度以及分选或混养条件下壳长的平均日生长及特定生长率。在南方越冬培育方式下实验进行106天，多因素方差分析结果表明实验初始幼鲍的壳长以及培育密度对壳长的生长有显著影响，而且密度效应在不同幼鲍起始规格组中有不同表现；分选没有能够提高不同规格组的生长。本研究的结果对皱纹盘鲍幼鲍的越冬培育有一定的指导作用。

南黄海浮游植物的固碳强度与污染物胁迫下海水碳源/汇格局的变化

本论文在解析了南黄海生态环境的基础上，首次研究揭示了浮游植物固碳强度的年际变化及生态反馈机制，获得了东中国近海浮游植物固碳强度及对海域源/汇格局的影响程度；同时，用室内模拟实验探讨了重金属和有机污染物胁迫下海水无机碳体系和源汇格局的变化过程，获得了一些新的认识。主要结论如下： 1. 南黄海浮游植物固碳强度具有明显的时空变化特征，与海域光照、流系和水团变化、海水磷的浓度等因素密切相关，并在一定程度上决定海区碳源/汇的性质。2005年秋季浮游植物日固碳量达9.5万吨，1983-2005年间，南黄海浮游植物固碳强度有降低的趋势，与海水关键营养盐－磷的限制有关。东中国近海浮游植物年总固碳量约为2.2亿吨，约占全球近海浮游植物的年固碳量的2.0%。 在综合分析秋季南黄海水文、化学、生物背景的基础上，系统阐明了海域浮游植物固碳体系的生物地球化学机制。结果表明，2005年秋季南黄海浮游植物固碳强度，即初级生产力变化在 97−701 mgC m-2 d-1之间，平均为307 mg C m-2 d-1；与其关系比较密切的环境因子为海水透明度、盐度、pH、氨氮 (NH4-N)、磷酸盐 (PO4-P) 以及Chl a。在这些因素中，PO4-P对初级生产力的影响最大，显然11月份南黄海的磷是浮游植物生长的限制因子，次之的影响因素是Chl a和NH4-N。 对南黄海源汇格局的研究发现，如果除去涌升流较为活跃的站位（A9、B7、B8、B9、C8、C9、 D9和A1），2005年秋季表层海水pCO2与浮游植物固碳强度明显负相关（r=-0.8，n=23, p<0.001）。在南黄海东部浮游植物固碳强度较高，pCO2值较低；而在西部海区浮游植物固碳强度较低的区域，其pCO2值较高。碳源/汇转折点浮游植物固碳强度为230 mgC m-2 d-1，即小于此值，海区为大气二氧化碳的源，反之为汇，并且CO2汇区浮游植物固碳强度平均值约是CO2源区的2倍多；浮游植物固碳作用，在某一时间和空间尺度内，基本决定了海区的源汇格局。估算结果显示，东中国近海浮游植物固碳量约为222×106t a-1，约为东中国近海通过海－气界面总表观碳汇强度每年1369万吨的16.2倍，仅就浮游植物的年固碳量而言，东中国近海约占全球近海浮游植物的年固碳量的2.0%。 研究揭示了近年来南黄海浮游植物固碳强度具有区域与年际变化明显这一显著特点。一般，近岸区（由黄海沿岸水和表层水控制）内，光照是浮游植物固碳的主要限制因子；从2001年后的大多数年份中，中央区（黄海冷水团控制）的浮游植物固碳强度均与磷酸盐浓度显著正相关，但与氮浓度的相关性不大，说明南黄海生态系统普遍存在着磷限制而非氮限制；混合区终年受黄、东海混合水控制，受到光照条件和营养盐浓度同时影响。根据本次观测所获数据，结合以前研究者的调查资料，我们发现从1983年到2005年，南黄海浮游植物优势种由Bacillariophyta变为Pyrrophyta，浮游植物细胞丰度和Chl a明显下降，浮游植物固碳强度几乎下降了二分之一 （由569.50 mgC m-2 d-1下降至306.83 mgC m-2 d-1），说明南黄海在世界边缘海固碳过程中的作用在降低。经过相关水质参数及生态环境变化的分析，以上现象是对关键营养盐磷的限制以及光限制响应的缘故。此外，研究还发现，由于南黄海初级生产者产量下降所引起的一些生态反馈信息，如浮游动物固碳量的下降和鱼类产量的锐减。 2. 室内模拟实验显示，重金属（铅、铜、镉和锌）及有机污染物（乙醇、丙酮、尿素和多灭磷）对水体生物固碳体系有重要影响，较低浓度时可提高水体的固碳能力，相应水体中的DIC、HCO3-和 Pco2 与对照组相比都明显下降 (P<0.01)；当污染物达到一定浓度后，水体生物的固碳能力明显下降，其有机碳可降解转化为无机碳。当污染物小于转折浓度水体为大气二氧化碳的汇，反之为源。 水体固碳体系对于不同种类、不同浓度的污染物质所表现的受胁迫情况不同，低浓度各污染物（包括重金属和有机污染物）添加组中（对于重金属为0.1和1µmol•L-1，醇和酮分别为<0.5 mol L-1和<0.75 mol L-1），藻干重及固碳量均要大于初始值，说明适量的外源污染可能会促进藻类生长，提高水体的固碳能力，相应水体中的DIC、HCO3- 和PCO2与对照组相比都明显下降 (P<0.01)。当污染物达到一定浓度后，由于其毒害作用，使得水体内生物的固碳能力下降，甚至分解并转化为无机碳，从会引起DIC、HCO3- 和PCO2含量的升高，其含量上升幅度会因固碳体系对不同种类污染物耐受程度的差异而不同。对于尿素和多灭磷，二者浓度分别达到80和20mgL-1时，水体中二氧化碳各参数仍呈现下降趋势，说明在该浓度范围内，大型藻类（如石莼）仍可利用添加物中的氮和磷，将其做为氮源或磷源，促进水体总固碳量的增加。 污染物胁迫对水体碳源汇能力及格局可起到一定的调控作用，与污染物的浓度密切相关，污染物存在着一转折浓度，分别为5µmol L-1（铜）、20µmol L-1（镉） 0.75mol L-1（酮），当污染物添加小于转折浓度并排除其他影响因素时，水体表现为大气CO2的汇，并且适量的增加污染物浓度会使海洋碳汇能力有所增强；而当污染物超出转折浓度时，水体成为CO2的源，其CO2的释放量是随着污染物浓度的增加而增大。对与研究中其他种类的污染物，在实验室设计范围内，水体始终表现为大气CO2的汇。

Effects of salinity on energy budget in pond-cultured sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) (Echinodermata: Holothuroidea)

Pond farming for sea cucumber has developed rapidly along the northern coast of China in the recent years. Holothurians inhabiting ponds undergo seasonal fluctuations of salinity. This study deals with the bioenergetic responses of pond-cultured sea cucumbers Apostichopus japonicus (wet weight of 37.5 +/- 1.8 g) to different water salinities [22, 27, 31.5, and 36 practical salinity units (psu)] at 15 degrees C in the laboratory to determine the influence of water salinity on growth and energy allocation in this species. Results show that ingested energy and scope for growth (SFG) were highest at 31.5 psu and then decreased when water salinity was below or above this point. Although energy ingested was lowest at 36 psu, the lowest SFG occurred at 22 psu (only 102.68 +/- 14.26 J g(-1) d(-1)) because animals reared at 22 psu spent much more consumed energy on feces (72.19%), respiration (21.70%), and excretion (2.59%), leaving less energy for growth (3.52%). Results suggest that pond-cultured sea cucumbers could tolerate chronic salinity fluctuations at a range of 22 to 36 psu and grew better between 27 and 31.5 psu, but decreased at salinities above and below the mentioned salinity range. Crown Copyright (C) 2010 Published by Elsevier B.V. All rights reserved.

Analysis for Flavonoids in Bee Pollens by Capillary Electrophoresis

A capillary electrophoresis (CE) method has been developed for the determination of six bioactive flavonoids that are commonly found in health foods: hesperidin, hyperin, isorhamnetin, kaempferol, quercetin and rutin. The effects of several parameters, such as pH, buffer concentration, separation voltage and UV detector wavelength, were investigated to find the optimal conditions. Using a HbBCh-NaiB-iO? buffer (pH 9.2), the analytes can be separated within 8 min. The relative standard deviations of migration times in eight injections were between 0.77% and 0.93%, and those of the peak areas ranged from 3.8% to 8.6%. A high reproducibility and excellent linearity was observed over two orders of magnitude, with detection limits (S/N = 3) ranging from 0.34ug ml to 2.9ug ml for all the six analytes. Recoveries ranged from 80.4 % to 113.9 %. The new method is simple, reproducible and sensitive. No solid phase extraction for sample pretreatment is necessary. Analysis results are accurate in application to bee pollens.

IL15／PAP融合蛋白基因克隆及其原核与植物表达载体的构建

将IL15和PAP基因通过一甘氨酸接头（Gly4Ser）3连接在一起，构建原核和植物表达载体，以期表达具有导向杀伤活性的融合蛋白．在引物设计中，通过引物在IL15基因下游引入（Gly4Ser）3的编码序列和Bam HI位点，然后采取分步克隆及PCR、酶切、连接等一系列分子克隆方法，将IL15和PAP基因融合在一起，构建融合蛋白的原核与植物表达载体．经PCR和Nco Ⅰ／Sal Ⅰ双酶切鉴定及测序，证实原核表达载体pET32a-IL15／PAP及植物表达载体pB-ⅠP中均插入了正确的融合基因序列．

稳定性同位素技术在生态学上的应用

稳定性同位素技术早在20世纪70年代末期就被引入到生态学领域.最初是利用植物稳定性碳同位素的差异,开展了许多有关营养流动方面的研究;到90年代,稳定性碳和氮同位素被用来分析动物的食性、营养级位置关系以及食物链结构;本世纪初,由于技术的进步,稳定性同位素(特别是氢同位素)被用来开展动物迁徙习性方面的研究.到目前为止,国内有关这方面的研究还鲜有报道,而且对自然界存在的稳定性同位素的理解还存在一定偏差.本文主要介绍了稳定性同位素效应及其分馏原理、稳定性同位素在示踪动物食性信息、确定营养级位置关系、分析食物网结构以及研究动物迁徙生态学中的作用等方面的内容.

论无心菜属的地理分布

全世界无心菜属植物有306种,隶属10亚属24组,主要分布于欧、亚、美三洲和北非,基本上是北温带分布属。文章分析了亚属的系统位置及其分布式样。地中海区到西亚亚区和中亚亚区的西北部是其分布区中心,也可能是它的起源地,中国横断山脉到青藏高原是其次生分布中心。起源时间至少应该追溯到白垩纪中期。最后,讨论了它的散布途径和现代分布式样的形成及其原因。

螺纹拧紧机机轴控制器的设计与实现

在现代工业生产过程中，螺纹联接由于稳定可靠、拆卸方便，而广泛应用于众多的机构装配当中。目前在中国，由于传统工艺和技术水平的原因，广泛应用在装配线上的是气动与液压扳手，其存在操作不方便、工人劳动强度大、效率低、角度和扭矩控制精度差，无法实现集中式管理等缺点。这也逐渐成为制约我国装备制造业发展的重要瓶颈。随着近几年装备制造业的飞速发展，对螺纹装配的效率和质量提出了更高的要求，自动螺纹拧紧机由于其装配效率高、控制精确、能够实现网络化等优点，逐渐应用于发动机、制冷压缩机、变速箱、机床、仪表等对螺纹拧紧的角度和位置精度要求很高的场合。但目前，我国所使用的自动螺纹拧紧机还完全依赖于国外，国内在自动螺纹拧紧机的研制和设计上才刚刚起步，同国外相比还存在着较大的差距。 本论文适应装备制造业的发展和自动螺纹拧紧设备市场的需要，根据现代螺纹拧紧理论与技术的发展情况，对自动螺纹拧紧机进行了深入研究。本论文结合嵌入式技术，设计出了基于嵌入式微控制器的螺纹拧紧机机轴控制器。 论文的第一部分介绍了自动螺纹拧紧机国内外发展现状，在此基础上，提出了本课题的研究目标与研究内容。 第二部分详细分析了现代螺纹拧紧理论。在此基础上，给出了在机轴控制器上实现精确预紧力控制的控制算法、包括紧固扭矩的计算、转角的计算、屈服点的计算等问题。同时，在扭矩控制中采用角度监视；在转角控制中采用扭矩监视；在屈服极限控制中采用扭矩监视和角度监视。可以自动对最终拧紧结果的有效性进行判断，从而实现有效、准确的螺纹多目标控制方式。本论文实现了扭矩控制/角度监视、转角控制/扭矩监视、屈服极限控制/扭矩、角度监视。 第三部分介绍了机轴控制器的硬件结构。本文采用美国Silicon Lab公司的C8051F040微控制器，使得成本大大降低。在硬件设计中采用大量可靠性设计，保证了螺纹拧紧机在复杂的工业环境下能够稳定工作。 第四部分介绍了机轴控制器的软件设计。在机轴控制软件的实现中，引入了嵌入式实时操作系统 C/OS-II。这部分首先将 C/OS-II移植到单片机C8051F040上，接着在 C/OS-II上完成整个机轴控制软件的编写。 C/OS-II的使用使得上层应用程序容易设计和扩展，提高了机轴控制软件的实时性。 实验证明，本文设计的基于嵌入式微控制器的螺纹拧紧机机轴控制器，控制精度较高、性能稳定、质量可靠、操作简便。在扭矩控制模式下，误差可以控制在5%以内；在屈服极限控制模式下，误差可以控制在15%以内。同时，由于在控制软件的设计中引入了嵌入式实时操作系统 C/OS-II, 使得该控制系统具有较好的扩展性和实时性。本设计进一步缩小了我国与国外同类产品的差距，因此，具有很好的市场发展前景。

高温高压下辉石岩的电导率实验研究

使用YJ-3000t紧装式六面顶高压设备和1260阻抗／增益-相位分析仪，在1．0～4．0GPa和773～1134K下用阻抗谱法就位测定了辉石岩的电导率。实验结果表明，电导率对频率具有很强的依赖性；温度是决定辉石岩电导率的一个重要物理参数，电导率随着温度升高而增大，lgσ与I／T之间符合Arrenhius关系式；随着压力升高。电导率降低，活化焓和独立于温度的指前因子亦降低。

喀斯特石漠化研究存在的问题与发展趋势

喀斯特石漠化代表了世界上一个比较独特的荒漠类型,即湿润区石质荒漠化。目前石漠化面积快速扩展的总体趋势并没有得到有效遏止,因对石漠化发生机制与喀斯特生态系统稳定性机制还不清楚,同时缺乏比较完善的石漠化防治理论和技术体系也是重要的原因之一。较为详细地介绍了目前西南喀斯特山区石漠化过程和适应性生态修复研究方面存在的基础理论问题,包括喀斯特石漠化的时空格局变化与驱动力、喀斯特山地的侵蚀过程、驱动力与危险性、以水为纽带的喀斯特生态系统退化和石漠化过程中的生物地球化学过程、喀斯特受损生态系统的适应性修复、喀斯特生态系统的服务功能优化和综合调控等方面,阐述了上述几个研究领域的研究现状与可能的发展方向;强调喀斯特石漠化是一个非地带性问题,不是纯自然过程,而是与自然、社会与经济紧密相关,需要以喀斯特科学为主的多学科交叉与综合集成研究。