Molekulare Mechanismen der Knochenmetastasierung des Nierenzellkarzinoms

Die schlechte Prognose des Nierenzellkarzinoms (NZK) kommt nicht durch den Primärtumor an sich zustande, sondern durch das Vorhandensein von Fernmetastasen. Obwohl bereits vieles über die Mechanismen der Metastasierung bekannt ist, sind die Hintergründe der Organspezifität metastasierender Tumorzellen weitgehend ungeklärt. In 30% der Fälle kommt es zur Entstehung von Knochenmetastasen. Diese hohe Frequenz deutet darauf hin, dass NZK-Zellen bevorzugt in dieses Organ metastasieren, da die Knochenmatrix ein günstiges Mikromilieu für ihr Wachstum bietet. Hierbei könnte extrazellulärem Calcium und dem für die Detektion zuständigen Calcium-sensitiven Rezeptor (CaSR) eine entscheidende Rolle zukommen, da sich Knochen durch ihren hohen Gehalt an Calcium auszeichnen und von anderen Organen unterscheiden. Das Ziel der vorliegenden Dissertation lag in der Aufklärung der Mechanismen, die zu einer Knochenmetastasierung des NZK führen.rnrnIn ersten Analysen konnte gezeigt werden, dass sich bereits der Primärtumor durch eine von Calcium unabhängige charakteristische Expression bestimmter Signalmediatoren auszeichnet, die Metastasierungspotenzial und –ort bestimmen. So wurden in Gewebeproben und primären Tumorzellen von NZK-Patienten, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie Knochenmetastasen entwickelten, in Westernblot-Analysen eine sehr hohe Expression der α5-Integrine, eine starke Aktivität von Akt, FAK und eine Reduktion der PTEN-Expression detektiert. Diese Veränderungen begünstigten die chemotaktische Migration in Richtung Fibronektin (bestimmt in einer Boyden-Kammer) und die Adhäsion dieser NZK-Zellen an Komponenten der Extrazellularmatrix (Fibronektin und Kollagen I – beides ist Bestandteil der Knochenmatrix). Migration und Adhäsion sind essentielle Schritte beim Austreten der Tumorzellen aus dem Primärtumor und Infiltration des Knochens. In NZK-Zellen von Patienten, die keine Metastasen oder Lungenmetastasen entwickelten, waren diese Charakteristika nicht oder deutlich schwächer ausgeprägt. Bestimmte Primärtumore sind somit prädestiniert Knochenmetastasen auszubilden.rnrnUm die Bedeutung von extrazellulärem Calcium und dem CaSR darzustellen, wurde die Expression des CaSR mittels Real-Time PCR, Westernblot-Analysen und durchflusszytometrisch in NZK-Gewebeproben und –Zellen von Patienten untersucht, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie keine bzw. Lungen- oder Knochenmetastasen ausbildeten. Proben von Patienten mit Knochenmetastasen zeigten die stärkste Expression von CaSR-mRNA und CaSR-Protein. Durch eine Behandlung der NZK-Zellen mit Calcium in physiologischen Konzentrationen, konnte Calcium als möglicher Regulator der CaSR-Expression ausgeschlossen werden. Der Einfluss von Calcium auf die Metastasierungsfähigkeit der primären NZK-Zellen wurde anhand eines weiteren chemotaktischen Migrationsversuchs mit Calcium als Chemotaxin analysiert. Die Zellproliferationsrate konnte nach Behandlung der Zellen mit Calcium mittels BrdU-Inkorporation gemessen werden. NZK-Zellen, die aus dem Primärtumor von Patienten mit Knochenmetastasen kultiviert wurden, konnten durch eine erhöhte extrazelluläre Calcium-Konzentration verstärkt zu Migration und Proliferation (Konzentrations-abhängige Steigerung) angeregt werden. Diese stellen weitere essentielle Schritte bei der Infiltration und Vermehrung der NZK-Zellen in den Knochen dar. Die Effekte traten bei NZK-Zellen aus Patienten, die keine oder Lungenmetastasen ausbildeten, nicht auf. Die Identifizierung der beteiligten Signalwege erfolgte in Westernblot-Analysen und einem Phospho-Kinase Array. Hierdurch konnten eine verstärkte Aktivierung des Akt-, JNK-, p38α- und PLCγ-1-Signalwegs und eine beinahe vollständige Reduktion der PTEN-Expression nach Calcium-Behandlung in Knochen-metastasierenden NZK-Zellen aufgedeckt werden. Durch Blockierung des CaSR mittels des Inhibitors NPS 2143 konnte bestätigt werden, dass die metastasierungs-fördernde Wirkung von Calcium über den CaSR zustande kommt. rnrnNZK-Zellen zeichnen sich somit bereits im Primärtumor durch eine charakteristische Expression verschiedener Signalmediatoren aus, die ihr Metastasierungspotenzial und die mögliche Lokalisation der Metastase bestimmen. Gelangen metastasierende NZK-Zellen auf ihrem Weg durch den Blutkreislauf in das Knochenmilieu, verhilft ihnen hier eine hohe Expression des CaSR zu einem wichtigen Überlebensvorteil. Extrazelluläres Calcium wirkt über den CaSR, verstärkt ihre metastatischen Eigenschaften und fördert schließlich die Ausbildung einer Knochenmetastase. Aus diesem Grund kommt dem CaSR eine Rolle als möglicher prognostischer Marker hinsichtlich der Knochenmetastasierung beim NZK zu. Die Charakteristika des Primärtumors sollten daher die Auswahl des adjuvanten Therapeutikums und die Nachsorgeuntersuchungen beeinflussen. um die Medizin dem Ziel einer individualisierten Therapie näher zu bringen.rn

Langzeitergebnisse nach Trabekulektomie bei Glaukompatienten

Hintergrund: Die antimetabolitgestützte Trabekulektomie stellt seit längeren denrnGoldstandard bei medikamentös nicht ausreichend therapierbaren Glaukomen dar. Kurz- und mittelfristige Erfolge wurden durch viele Studien bestätigt. Allerdings unterliegen diese sehr unterschiedlichen Erfolgsdefinitionen. Eine strikte Druckkontrolle ≤ 15 mm Hg ohne zusätzliche medikamentöse Therapie erscheint sinnvoll einen risikofreien Therapieerfolg zu bewerten. Es existieren nur wenige Langzeitstudien mit diesem Erfolgskriterium. Die durchgeführte Studie soll einen Eindruck der ophthalmologischen Versorgung trabekulektomierter Patienten an der Universitätsaugenklinik Mainz über einen bewusst langen Zeitraum bieten. Patienten und Methoden: In diese retrospektiven Studie wurden alle Patienten, die aufgrund einer fortgeschrittenen Glaukomerkrankung in den Jahren 1996, 2001 oder 2006 eine Trabekulektomie erhielten, aufgenommen. Von den 723 Augen der 664 Patienten dieser Jahrgänge konnten 447 (61,8%) nachverfolgt werden. Die Zusammensetzung der Patienten war mit anderen Studien vergleichbar. 28% konnten mindestens 7 Jahre, 10% sogar 10 Jahre nachverfolgt werden. Esrnwurde untersucht, ob ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem ophthalomologisch-internistischem Entlassstatus (Visus, Tensio, Gesichtsfeld,rnGlaukomtyp, Voroperationen, Medikation, Vorerkrankungen, Art der Operation) undrnder erstrebten Kontrolle des Intraokulardruckes besteht. Ergebnisse: Die mittlere Nachbeobachtungszeit betrug 4,3 ± 3,4 Jahre. Nach 1, 3,rn5, 7 und 10 Jahren wiesen 217 (82,1%) (p < 0,001), 133 (67,7%) (p < 0,001), 70rn(50%) (p < 0,001), 59 (47,7%) (p = 0,056) und 16 (38,1%) (p = 0,06) Augen Intraokulardrücke ≤ 15 mm Hg ohne zusätzliche Antiglaukomatosa auf. Nichtrnstatistisch signifikant waren die 7- und 10-Jahresergebnisse. Mit Hilfe von Antiglaukomatosa waren es insgesamt, 225 (85,1%), 156 (79,7%), 87 (62,5%), 93 (75%) und 23 (54,7%) (alle p < 0,001). Die mediane Überlebenszeit für IOD ≤ 15 mm Hg ohne Medikation betrug 7,4 Jahre ± 5 Monate. Druckobergrenzen von ≤ 18 bzw. 21 mm Hg erfüllten bis zu 20% mehr Patienten. Der mittlere Visus von 0,32 ± 6 Stufen blieb nach einem mittleren postoperativen Abfall auf 0,25 ± 5 Stufen in den Folgeuntersuchungen stabil. Er zeigte ab dem 3-Jahresintervall keine statistisch signifikante Verschlechterung zum präoperativen Visus. 5,8 Jahre ± 80 Tage betrug die mediane Überlebenszeit für ein stabiles Gesichtsfeld. Gesichtsfelddaten, MD und PSD zeigten keine statistisch signifikante Verschlechterung (p > 0,05). Risikofaktoren für ein Scheitern der Operation waren Patientenalter (RR = 1,01, KI: 0,95 - 1,34, p = 0,043), arterielle Hypertonie (RR = 1,87, KI: 1,21-2,9, p = 0,005) und männliches Geschlecht (RR = 1,24; KI: 1,07 – 1,43; p = 0,004). Komplikationen waren passagere okuläre Hypotonien an 85 (19%), Fistulation an 46(10,2%), Aderhautschwellung an 29 (6,4%) –abhebung an 14 (3,1%), retinale Amotio an 9 (2%), hypotone Makulopathie an 5 (1,1%) und Hypertonien an 70 (15,6%) Augen. 150 (33,5%) Augen erhielten einen Folgeeingriff, 117 (26%) eine Phakoemulsifikation, 149 (33%) eine Fadenlockerung, 122 (27%) 5-FU-Injektionen, 42 (9,4%) eine Fadennachlegung, 33 (7,4%) ein Needling, 26 (5,8%) eine Zyklophotokoagulation, 19 (4,3%) eine Re-TE und 9 (2%) sonstige chirurgische Revisionen. Schlussfolgerung: Die Kontrolle des Augeninnendruckes ≤ 15 mm Hg ohne zusätzliche Medikation erreichten viele Patienten über einen langen Nachbeobachtungszeitraum. Die Häufigkeit der Komplikationen oder nötiger Folgeeingriffe war meist niedriger als in vergleichbaren Studien. Selbst Patienten mit hohem Risikoprofil hatten gute Ergebnisse. Aufgrund mangelnder Gesichtsfelddaten fanden sich keine Hinweise auf statistisch relevantes Fortschreiten des Glaukoms zur angestrebten medikationsfreien Druckkontrolle. Weitere Studien für einen Untersuchungszeitraum von 10 Jahren mit gleichen Erfolgskriterien wie in der vorliegenden Arbeit mit genauer Analyse der Gesichtsfelddaten wären wünschenswert, um zu belegen, dass die guten Langzeitergebnisse nach Trabekulektomie an der Universitätsaugenklinik Mainz auch eine Glaukomprogredienz dauerhaft verhindern. Damit stellt die an der Universitätsaugenklinik Mainz durchgeführte antimetabolitgestützte Trabekulektomie und deren postoperative Nachbetreuung an einer repräsentativen Population eine sichere und komplikationsarme Methode dar.

Vergleich der retinalen und dermalen mikrovaskulären endothelialen Funktion bei Gesunden, Insulinresistenten und Typ-2-Diabetikern

Die vorliegende klinische Studie hatte zum Ziel, die mikrovaskuläre Endothelfunktion retinaler und dermaler Gefäße von Insulinresistenten und Typ 2- Diabetikern ohne Zeichen einer diabetischen Retinopathie mit einer gesunden insulinsensitiven nicht-diabetischen Kontrollgruppe hinsichtlich früher morphologischer und funktioneller Veränderungen zu vergleichen.rnrnMethode:rnEs wurden 54 Patienten ohne Nachweis einer diabetischen Retinopathie eingeschlossen und in 3 Gruppen entsprechend ihren metabolischen Ergebnissen eingeteilt: 1.) Gruppe K (Kontrollgruppe) setzte sich aus gesunden, nicht-diabetischen, insulin-sensitiven rn(HOMA ≤ 2) Probanden mit einem BMI ≤ 28 kg/m2 zusammen; 2.) Gruppe IR bestand aus den nicht-diabetischen, insulin-resistenten (HOMAs > 2), übergewichtigen Patienten mit einem BMI > 28 kg/m2 und 3.) Gruppe DM war definiert als Patienten mit einem manifesten Typ 2-Diabetes mellitus.rnrnDie mikrovaskuläre Funktion der Retina wurde mittels eines Laserdoppler-Verfahrens (Heidelberg Retina Flowmeter) untersucht und hierbei der retinale Blutfluss und das Verhältnis der Gefäßwand zum Lumen (WLR, wall-to-lumen-ratio) basal und nach Flickerlicht-Stimulation (10 Hz, Photo Stimulator 750) gemessen. Letzterer gilt als Marker für vaskuläre Schädigung. rnZusätzlich wurde die dermale Mikrozirkulation (Blutfluss, O2-Sättigung) als weiterer Faktor der mikrovaskulären Endothelfunktion in den 3 Studiengruppen untersucht und miteinander verglichen.rnErgebnisse:rnEs zeigte sich kein signifikanter Unterschied des retinalen Blutflusses zwischen den 3 Gruppen weder basal noch nach Flickerlicht-Stimulation. Es zeigte sich keine Korrelation zwischen der mikrovaskulären Funktion der Haut und der Retina. rnDie arterielle WLR zeigte nur geringe Unterscheide zwischen den 3 Gruppen.rnrnMit zunehmendem Grad der Insulinresistenz wurde jedoch eine Reduktion des basalen als auch des flickerlicht-stimulierten retinalen Blutflusses deutlich, dabei zeigte sich unerwarteter Weise eine Abnahme der WLR.rnrnDer (prä-ischämische) muskuläre Blutfluss war in der IR-Gruppe signifikant geringer als in der K-Gruppe. Auch war die postischämische dermale O2-Sättigung in der DM und IR-Gruppe signifikant niedriger im Vergleich zur K-Gruppe. Jedoch war die postischämische hyperämische dermale Reaktion in der IR und DM-Gruppe nur geringgradig weniger als in der K-Gruppe. rnrnSchlussfolgerung:rnEine Korrelation zwischen der Entwicklung der Insulinresistenz und retinaler sowie dermaler mikrovaskulärer endothelialer Funktion wurde bei der Studie deutlich. Mithilfe des neuen Verfahrens der Laser Scanner Flowmeter zur Messung der retinalen Endothelfunktion lassen sich sehr frühe morphologische Veränderungen des mikrovaskulären Blutflusses erfassen. rnDie fehlende Korrelation zwischen retinaler und dermaler mikrovaskulärer Funktion als auch die geringen Unterschiede der WLR sollte Gegenstand weiterer Studien seinrn

Proton magnetic resonance with parahydrogen induced polarization : Imaging strategies and continuous generation

A major challenge in imaging is the detection of small amounts of molecules of interest. In the case of magnetic resonance imaging (MRI) their signals are typically concealed by the large background signal of e.g. the tissue of the body. This problem can be tackled by hyperpolarization which increases the NMR signals up to several orders of magnitude. However, this strategy is limited for 1H, the most widely used nucleus in NMR andrnMRI, because the enormous number of protons in the body screen the small amount of hyperpolarized ones.Here, I describe a method giving rise to high 1H MRI contrast for hyperpolarized molecules against a large background signal. The contrast is based on the J-coupling induced rephasing of the NMR signal of molecules hyperpolarized via parahydrogen induce polarization (PHIP) and it can easily be implemented in common pulse sequences.rnrnHyperpolarization methods typically require expensive technical equipment (e.g. lasers or microwaves) and most techniques work only in batch mode, thus the limited lifetime of the hyperpolarization is limiting its applications. Therefore, the second part of my thesis deals with the simple and efficient generation of an hyperpolarization.These two achievements open up alternative opportunities to use the standard MRI nucleus 1H for e.g. metabolic imaging in the future.

Das Phosphoproteom von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs nach Bestrahlung und Applikation des Cyclooxygenase-Inhibitors Flurbiprofen

Ziel: Die Radiotherapie hat in der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf- und Halsbereichs nach wie vor einen hohen Stellenwert. Der Erfolg eines Therapieregimes, das die Behandlung mit ionisierenden Strahlen einschließt, ist jedoch häufig limitiert durch die Entwicklung radioresistenter Tumorzellpopulationen, die nicht selten durch die Bestrahlung selbst induziert wird. Die Mechanismen, die zu einer solchen bestrahlungsinduzierten Radioresistenz führen sind bisher nur unvollständig verstanden und Methoden, durch die die Entwicklung von Radioresistenz verhindert werden könnte, wie beispielsweise der präventive Einsatz von Pharmazeutika, sind bislang nicht systematisch untersucht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu überprüfen, ob der Cyclooxygenase-Inhibitor Flurbiprofen durch Bestrahlung induzierte Veränderungen der Phosphoprotein-Expression verstärken oder abschwächen kann und ob sich aus solchen Modifikationen des Bestrahlungsergebnisses ein radioprotektiver Effekt der Flurbiprofenapplikation ableiten lässt. Methoden: Es wurde ein experimenteller Ansatz gewählt, der mittels 2D PAGE und anschließender MALDI-TOF Massenspektrometrie das Phosphoproteom einer HNSCC-Zelllinie unter verschiedenen Bedingungen untersuchte. Die Zellen wurden entweder mit einer Energiedosis von 8 Gy bestrahlt, mit einer 200 μM Flurbiprofen enthaltenden Lösung inkubiert oder sie wurden mit einer Kombination aus Flurbiprofenapplikation und Bestrahlung behandelt. Vor der 2D PAGE wurden die Phosphoproteine durch IMAC angereichert. Zur Verbesserung der Gel-Analytik wurde die Software Delta 2D angewendet, die zum Ausgleich von Laufweitenunterschieden zwischen den Gelen ein Warping vorsieht. Ergebnisse und Diskussion: Bei der Analyse, der unter den verschiedenen experimentellen Bedingungen differentiell exprimierten Phosphoproteinen mittels bioinformatischer Hilfsprogramme wie z.B. WEBGestalt und STRING, wurden sieben Proteine mit Bedeutung für das Wachstum und die Entdifferenzierung von Tumoren identifiziert und einer ausführlichen Literaturrecherche unterzogen. Auf diese Weise konnten die Ergebnisse der für die vorliegende Arbeit durchgeführten Experimente in den systembiologischen Kontext eingeordnet werden. Besonders hervorzuheben ist die Herabregulierung der möglicherweise Radioresistenz vermittelnden Proteine GRP-75, 14-3-3 sigma und CRT sowie die Herabregulierung des anti-apoptotischen und tumor-begünstigenden Hsp60 durch Flurbiprofen. Die Verminderung der Expression unterstreicht das Potential dieses Pharmakons sowie der Klasse der COX-Inhibitoren als mögliche radiosensitivierende und tumorsuppressive Substanzen.

Volatile anesthetics influence blood-brain barrier integrity by modulation of tight junction protein expression in traumatic brain injury

Disruption of the blood-brain barrier (BBB) results in cerebral edema formation, which is a major cause for high mortalityrnafter traumatic brain injury (TBI). As anesthetic care is mandatory in patients suffering from severe TBI it may be importantrnto elucidate the effect of different anesthetics on cerebral edema formation. Tight junction proteins (TJ) such as zonularnoccludens-1 (ZO-1) and claudin-5 (cl5) play a central role for BBB stability. First, the influence of the volatile anestheticsrnsevoflurane and isoflurane on in-vitro BBB integrity was investigated by quantification of the electrical resistance (TEER) inrnmurine brain endothelial monolayers and neurovascular co-cultures of the BBB. Secondly brain edema and TJ expression ofrnZO-1 and cl5 were measured in-vivo after exposure towards volatile anesthetics in native mice and after controlled corticalrnimpact (CCI). In in-vitro endothelial monocultures, both anesthetics significantly reduced TEER within 24 hours afterrnexposure. In BBB co-cultures mimicking the neurovascular unit (NVU) volatile anesthetics had no impact on TEER. In healthyrnmice, anesthesia did not influence brain water content and TJ expression, while 24 hours after CCI brain water contentrnincreased significantly stronger with isoflurane compared to sevoflurane. In line with the brain edema data, ZO-1 expressionrnwas significantly higher in sevoflurane compared to isoflurane exposed CCI animals. Immunohistochemical analysesrnrevealed disruption of ZO-1 at the cerebrovascular level, while cl5 was less affected in the pericontusional area. The studyrndemonstrates that anesthetics influence brain edema formation after experimental TBI. This effect may be attributed tornmodulation of BBB permeability by differential TJ protein expression. Therefore, selection of anesthetics may influence thernbarrier function and introduce a strong bias in experimental research on pathophysiology of BBB dysfunction. Futurernresearch is required to investigate adverse or beneficial effects of volatile anesthetics on patients at risk for cerebral edema.

Software zur automatischen Tumordiagnose in der funktionalen MRT der weiblichen Brust

In den westlichen Industrieländern ist das Mammakarzinom der häufigste bösartige Tumor der Frau. Sein weltweiter Anteil an allen Krebserkrankungen der Frau beläuft sich auf etwa 21 %. Inzwischen ist jede neunte Frau bedroht, während ihres Lebens an Brustkrebs zu erkranken. Die alterstandardisierte Mortalitätrate liegt derzeit bei knapp 27 %.rnrnDas Mammakarzinom hat eine relative geringe Wachstumsrate. Die Existenz eines diagnostischen Verfahrens, mit dem alle Mammakarzinome unter 10 mm Durchmesser erkannt und entfernt werden, würden den Tod durch Brustkrebs praktisch beseitigen. Denn die 20-Jahres-Überlebungsrate bei Erkrankung durch initiale Karzinome der Größe 5 bis 10 mm liegt mit über 95 % sehr hoch.rnrnMit der Kontrastmittel gestützten Bildgebung durch die MRT steht eine relativ junge Untersuchungsmethode zur Verfügung, die sensitiv genug zur Erkennung von Karzinomen ab einer Größe von 3 mm Durchmesser ist. Die diagnostische Methodik ist jedoch komplex, fehleranfällig, erfordert eine lange Einarbeitungszeit und somit viel Erfahrung des Radiologen.rnrnEine Computer unterstützte Diagnosesoftware kann die Qualität einer solch komplexen Diagnose erhöhen oder zumindest den Prozess beschleunigen. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung einer vollautomatischen Diagnose Software, die als Zweitmeinungssystem eingesetzt werden kann. Meines Wissens existiert eine solche komplette Software bis heute nicht.rnrnDie Software führt eine Kette von verschiedenen Bildverarbeitungsschritten aus, die dem Vorgehen des Radiologen nachgeahmt wurden. Als Ergebnis wird eine selbstständige Diagnose für jede gefundene Läsion erstellt: Zuerst eleminiert eine 3d Bildregistrierung Bewegungsartefakte als Vorverarbeitungsschritt, um die Bildqualität der nachfolgenden Verarbeitungsschritte zu verbessern. Jedes kontrastanreichernde Objekt wird durch eine regelbasierte Segmentierung mit adaptiven Schwellwerten detektiert. Durch die Berechnung kinetischer und morphologischer Merkmale werden die Eigenschaften der Kontrastmittelaufnahme, Form-, Rand- und Textureeigenschaften für jedes Objekt beschrieben. Abschließend werden basierend auf den erhobenen Featurevektor durch zwei trainierte neuronale Netze jedes Objekt in zusätzliche Funde oder in gut- oder bösartige Läsionen klassifiziert.rnrnDie Leistungsfähigkeit der Software wurde auf Bilddaten von 101 weiblichen Patientinnen getested, die 141 histologisch gesicherte Läsionen enthielten. Die Vorhersage der Gesundheit dieser Läsionen ergab eine Sensitivität von 88 % bei einer Spezifität von 72 %. Diese Werte sind den in der Literatur bekannten Vorhersagen von Expertenradiologen ähnlich. Die Vorhersagen enthielten durchschnittlich 2,5 zusätzliche bösartige Funde pro Patientin, die sich als falsch klassifizierte Artefakte herausstellten.rn

Minimalinvasive Osteosynthese der distalen extraartikulären Radiusfraktur : XSCREW und DorsalNailPlate im biomechanischen Vergleich

Gegenstand der Arbeit: Die distale Radiusfraktur ist der häufigste Bruch des Menschen. Neben etablierten Verfahren wie der dorsalen und palmaren Plattenosteosynthese gibt es seit Kurzem neuartige minimalinvasive Osteosynthesesysteme. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der biomechanischen Stabilität von zwei neuartigen Implantaten für die distale extraartikuläre Radiusfraktur. rnMethodik: Es handelt sich einerseits um das System XSCREW (Zimmer, Freiburg i. Br., Deutschland), eine kanülierte Schraube, die über den Processus styloideus eingeführt wird und mit bis zu neun Bohrdrähten im Knochen fixiert werden kann. Das Vergleichsimplantat DorsalNailPlate (HandInnovations, Miami, Florida, USA) ist ein Hybrid aus einer dorsalen Platte und einem Marknagel. Beide Systeme wurden an 8 paarigen frischen unfixierten Leichenradii unter Axialbelastung bis 100 N und Torsionsbelastung bis 1,5 Nm getestet. Die A3-Fraktur wurde durch eine standardisierte Keilosteotomie simuliert. Das Biomaterial wurde prä- und postinterventionell sowie nach einem Dauerbelastungstest unter 1000 Zyklen in Rotation mit 0,5 Hz untersucht. Ein Versagenstest mit steigendem Drehmoment beendete das Experiment. rnErgebnisse: Die XSCREW erreichte eine Axialsteifigkeit von 136 N/mm und eine Torsionssteifigkeit von 0,16 Nm/°. Die DNP erzielte hingegen axial 70 N/mm und torsional 0,06 Nm/°. Der Unterschied zwischen beiden Verfahren war nur für die Torsion eindeutig statistisch auffällig (p=0,012), jedoch nicht für die Axialsteifigkeit (p=0,054). Die ursprüngliche Axial- und Torsionssteifigkeit wurde durch die XSCREW signifikant besser wiederhergestellt als durch die DNP (p=0,012). Beide Verfahren erzielten nach der Intervention signifikant niedrigere Steifigkeiten als die intakten Knochen (p=0,012). Ein Präparat der DNP-Gruppe und vier Präparate der XSCREW-Gruppe überstanden den Dauerbelastungstest. Das Drehmoment bei Versagen war mit der XSCREW höher als mit der DNP, der Unterschied zwischen den Verfahren war signifikant (p=0,043). Die Schwachstellen beider Systeme lagen vorwiegend in der proximalen Verankerung im Knochen. Kirschner-Drähte bzw. Verriegelungsschrauben führten unter andauernder Belastung zu einer Spaltung der Kortikalis im Schaftbereich. Bedingt durch die Ausrichtung der distalen Verriegelungen können mit beiden Implantaten Schäden an der radiocarpalen bzw. radioulnaren Gelenkfläche entstehen. rnZusammenfassung: Die XSCREW ermöglicht insgesamt eine höhere mechanische Stabilität als die DNP. Beide Verfahren sind jedoch einer winkelstabilen palmaren Plattenosteosynthese insbesondere unter rotatorischer Dauerbelastung unterlegen und erreichen nicht die Stabilität eines anderen neuartigen minimalinvasiven Systems.

Untersuchungen zur Plasmapheresetherapie bei Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura

Die thrombotische thrombozytopenische Purpura (TTP) ist charakterisiert durch eine Triade aus Thrombozytopenie, hämolytischer Anämie und Mikrothromben. Ursächlich für diese Mikroangiopathie ist ein Mangel der Von Willebrand Faktor (VWF)-spaltenden Protease, ADAMTS13, der durch Autoantikörper oder eine genetische Mutation bedingt sein kann. In der Folge treten hochmolekulare, prothrombotische VWF Multimere im Blut auf, die eine Plättchenadhäsion und -aggregation initiieren, die zu mikrovaskulären Thromben in den Arteriolen und Kapillaren zahlreicher Organe insbesondere im zentralen Nervensystem führt. rnMomentan ist der Goldstandard der Therapie dieser ansonsten tödlich verlaufenden Erkrankung, die Plasmapherese (PEX). Hierfür stehen mit Fresh Frozen Plasma (FFP) und solvent/detergent (s/d) Plasma zwei Präparate zur Verfügung. Die Effizienz der Therapie bei der TTP konnte in den letzten Jahrzehnten im klinischen Alltag belegt werden, dennoch geht die intensive und invasive Therapie mit vielen Risiken und Nebenwirkungen für die Patienten einher, die in dieser Arbeit herausgearbeitet werden sollten. rnIn einer deutschlandweiten Patientenstudie wurde retrospektiv, mittels Fragebögen, ein Nebenwirkungsprofil der Plasmapherese erstellt, sowie mögliche Prädispositionen für die TTP untersucht. Zudem wurden mögliche Auslöser für das Auftreten einer klinisch manifesten TTP analysiert. Die Auswertung zeigte, dass Parästhesien (64,4 %) und Schüttelfrost (61,2 %) als häufigste Nebenwirkungen der PEX bei den Patienten auftraten. Weitere Symptome waren vermehrte Kopfschmerzen (50,6 %) und Tachykardien (36,8 %). Nebenwirkungen wie schwerer Kollaps (9 %) traten selten auf. Patienten mit Allergien in der Anamnese reagierten nicht empfindlicher auf die PEX, als andere. Ein Unterschied in der Häufigkeit der Nebenwirkungen hinsichtlich der verschiedenen Plasmapräparate konnte nicht gezeigt werden, relativiert wird dies durch den sehr geringen Einsatz von Octaplas® bei der untersuchten Patientenkohorte.rnEs konnte eine deutliche Verbindung zwischen dem Auftreten der TTP und anderen Autoimmunerkrankungen gezeigt werden. Von insgesamt 87 Patienten leiden 20,8 % an einer weiteren Autoimmunerkrankung. Insbesondere die Hashimoto Thyreoiditis liegt bei den Befragten als häufige Begleiterkrankung vor. Die genetische Prädisposition hat sich in den vergangen Jahren als ein primärer Risikofaktor für die TTP herausgestellt.rnAls mögliche Trigger eines TTP Schubes konnten Infektionen (38,7 %), Medikamente (u.a. Kontrazeptiva, Chinolone, Clarithromycin) (24,3 %), und Schwangerschaft (5,4 %) ausgemacht werden.rnEin weiterer Untersuchungspunkt der Dissertation war die Beurteilung der ADAMTS13-Aktivität in den Plasmapräparaten. Hierfür wurden drei verschieden Methoden, zwei auf Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer beruhende Assays und eine turbidimetrische Messung, verwendet. In allen Methoden konnte eine physiologische ADAMTS13-Aktivität, 646 ng/ml für FFP und 634 ng/ml für Octaplas®, gemessen werden, die sich für beide Präparate nicht signifikant unterschied. Auffällig waren jedoch die höheren Schwankungen der Aktivität bei den verschiedenen Chargen bei FFP gegenüber Octaplas®. rnAufgrund des Herstellungsverfahrens bietet Octaplas® einen sichereren Schutz vor Virusübertragungen und dem Auftreten von TRALI als FFP. Jedoch kann es aufgrund der niedrigen Konzentration an Protein S prothrombotisch wirken. FFP enthält dagegen einen höheren Gehalt an Gerinnungsfaktoren. rnAbschließend ist festzuhalten, dass beide Präparate für die Therapie der TTP geeignet sind. Welches Präparat gewählt wird, sollte individuell für den zu behandelnden Patienten entschieden werden. Bei TTP-Patienten, die in der Vergangenheit bereits sensibel auf FFP reagierten, bietet sich eine Therapie mit Octaplas® an. Die schnelle Bereitstellung einer adäquaten Therapie spielt bei der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura die entscheidende Rolle.

Lokalisation und Quantifizierung von 4-Hydroxynonenal in der Kochlea des Meerschweinchens nach Applikation von Gentamicin

Einleitung und Literaturdiskussion: Gentamicin ist ein aus Bakterien gewonnenes Aminoglykosid-Antibiotikum, das seit vielen Jahren im klinischen Alltag zur Therapie von bakteriellen Infektionen und zur Behandlung des Morbus Ménière eingesetzt wird. Ein bedeutender, jedoch noch nicht vollständig verstandener, Pathomechanismus ist dabei die Entstehung von 4-HNE durch Lipid Peroxidation und die konsekutive Schädigung durch das gebildete Aldehyd. Ziel dieser Arbeit war es, die Beeinflussung der Expression von 4-HNE in sieben verschiedenen Regionen der Kochlea (SV, SL, CO, NF, LF, IDZ und SGZ) durch Gentamicin zu beschreiben und quantitativ zu ermitteln.rnMaterial und Methoden: Die Meerschweinchen wurden in vier Gruppen unterteilt: eine unbehandelte Kontrollgruppe und je eine Gruppe 1, 2 und 7 Tage nach Gentamicin-Applikation. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Kochleae den Tieren entnommen, das Gewebe fixiert, geschnitten und auf Objektträgern aufgebracht. Die Schnitte wurden mit 4-HNE-Antikörpern behandelt und die Immunreaktion mikroskopisch lokalisiert und zelluläre quantitative Unterschiede am Computer berechnet.rnErgebnisse: Die Auswertung der Daten ergab signifikante Anstiege der Immunreaktion auf 4-HNE von der Kontrollgruppe zu allen drei Behandlungsgruppen in vier der sieben untersuchten Regionen (Stria vascularis, Spirales Ligament, Cortisches Organ und Nervenfasern). In zwei Bereichen (Fibrozyten im Limbus und Interdentalzellen) kam es zwischen Kontrollgruppe und nur einer Behandlungsgruppe D (7d) zu einer signifikanten Erhöhung. Lediglich die Spiralganglionzellen erbrachten keine signifikanten Differenzen. Der Vergleich der Einzelwindungen erbrachte für die Stria vascularis, das Spirale Ligament, das Cortische Organ und die Nervenfasern signifikante Anstiege innerhalb der drei Windungen von der Kontrollgruppe zu den drei Behandlungsgruppen. Bei der Stria vascularis zeigte sich als einzige Region eine signifikant erhöhte Immunfärbung in allen drei Einzelwindungen von der Kontrollgruppe zu allen Behandlungsgruppen. Beim Vergleich der Gesamtwindungen ließ sich ausschließlich für die Region der Stria vascularis von der ersten zur dritten Windung ein Anstieg der Braunfärbung feststellen. Zudem konnten Korrelationen der Färbeintensitäten einerseits zwischen den beiden Regionen der Lateralen Wand und andererseits zwischen zwei Zelltypen im Limbus aufgezeigt werden.rnDiskussion: Die durch Gentamicin-gesteigerte 4-HNE-Expression kann durch genomische und nicht-genomische Prozesse hervorgerufen werden.

Expressionsunterschiede verschiedener miRNAs bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen

Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen konfrontieren unsere heutige Gesellschaft mit hohen Inzidenzraten in der westlichen Welt und zunehmend steigenden Inzidenzraten im asiatischen Raum. Die Folgen für die Patienten sind eine starke Beeinträchtigung der Lebensqualität, mit sozialen und wirtschaftlichen Folgen sowie ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung kolorektaler Karzinome. Durch die Entdeckung von 22 nt langen, regulierenden RNAs, auch genannt miRNAs, wurde ein neuer Baustein im Verständnis zellulärer Regelprozesse und der Differenzierung und Aktivierung von Antworten etwa des Immunsystems entdeckt. Somit stellt sich die Frage nach der Bedeutung von miRNAs im Rahmen von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen. Hierzu wurden in dieser Arbeit über ein miRNA-Array System 12 miRNAs als potentiell relevante Ziele identifiziert und an einem Kollektiv aus insgesamt 131 Patienten und 163 Biopsien aus dem Bereich des Darmes überprüft. Es zeigte sich hierbei, dass im Rahmen eines Morbus Crohn mit Befall des Dickdarms die miRNAs let-7d und miR-22 in gesteigerter Expression vorlagen. Da im terminalen Ileum eine gesonderte Immunsituation vorliegt, wurde dieser Bereich zusätzlich bei der Erkrankung Morbus Crohn untersucht. Es zeigten sich Expressionsveränderungen für die miRNAs miR-30e, miR-185, miR-374b und miR-424. Bei Patienten mit einer Colitis ulcerosa waren die miRNAs let-7d, miR-185 und miR-424 in ihrem Expressionsverhalten verändert. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit vom Entzündungsgrad bei bestehender Colitis ulcerosa eine zunehmenden Überexpression der miRNAs let-7d, miR-185 und miR-424 erfolgte. Die miRNAs miR-18a und miR-185 wiesen unter Remissionsbedingungen Expressionsveränderungen auf und lassen somit den Verdacht eines protektiven Effektes aufkommen. Mit Hilfe von computerbasierten Datenbankanalysen konnten gemeinsam regulierenden miRNAs Proteine und Pathways zugeordnet werden, welche einen Zusammenhang mit bereits pathogenetisch bestätigten Signalwegen wie etwa dem nF-ĸB und MAPK-Signalweg nahelegen. Auch konnte herausgearbeitet werden, dass einige, der von diesen miRNAs regulierten Proteine, bereits in veröffentlichten Arbeiten als fehlreguliert festgestellt wurden, jedoch blieb die Ursache dieser Fehlregulation gänzlich unbekannt. Mit den in dieser Arbeit erhobenen Daten konnte gezeigt werden, dass eine Kongruenz der Befunde vorliegt, welche einen Zusammenhang der miRNA-Expression mit der Fehlregulation bestimmter Proteine nicht nur nahelegt, sondern darüber hinaus auch noch einige weitere potentielle Proteinziele für weitere Untersuchungen aufführt. Dazu ist es jedoch notwendig, die Relevanz der hier entdeckten, computerbasierten Proteine in zukünftigen Untersuchungen einer genauen Prüfung zu unterziehen.

Parahydrogen induced polarization on a clinical MRI system : polarization transfer of two spin order

Hyperpolarization techniques enhance the nuclear spin polarization and thus allow for new nuclear magnetic resonance applications like in vivo metabolic imaging. One of these techniques is Parahydrogen Induced Polarization (PHIP). It leads to a hyperpolarized 1H spin state which can be transferred to a heteronucleus like 13C by a radiofrequency (RF) pulse sequence. In this work, timing of such a sequence was analyzed and optimized for the molecule hydroxyethyl propionate. The pulse sequence was adapted for the work on a clinical magnetic resonance imaging (MRI) system which is usually equipped only with a single RF transmit channel. Optimal control theory optimizations were performed to achieve an optimized polarization transfer. A drawback of hyperpolarization is its limited lifetime due to relaxation processes. The lifetime can be increased by storing the hyperpolarization in a spin singlet state. The second part of this work therefore addresses the spin singlet state of the Cs-symmetric molecule dimethyl maleate which needs to be converted to the spin triplet state to be detectable. This conversion was realized on a clinical MRI system, both by field cycling and by two RF pulse sequences which were adapted and optimized for this purpose. Using multiple conversions enables the determination of the lifetime of the singlet state as well as the conversion efficiency of the RF pulse sequence. Both, the hyperpolarized 13C spin state and the converted singlet state were utilized for MR imaging. Careful choice of the echo time was shown to be crucial for both molecules.

Untersuchungen zur autoimmunen Genese der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura

Untersuchungen zur autoimmunen Genese der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura. rnEinführung: Die idiopathische thrombotisch thrombozytopenische Purpura (TTP) ist eine lebensbedrohliche Mikroangiopathie und wird durch ein Autoantikörper-induziertes Defizit der ADAMTS13-Protease ausgelöst. Eine Assoziation zwischen Krankheitsprädisposition und Vorliegen bestimmter humaner Leukozytenantigene (HLA) wird vermutet. Untersuchungen zu diesem Zusammenhang stellen einen Teil dieser Arbeit dar. rnAutoimmunkrankheiten tendieren zum gemeinsamen Auftreten innerhalb eines Individuums. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird untersucht, ob eine solche Kookkurrenz verschiedener Autoimmunkrankheiten auch bei Patienten mit idiopathischer TTP beobachtet werden kann.rnMethodik: Zur Untersuchung der ersten Fragestellung werden die HLA-Klasse I und II-Merkmale von 54 deutschen TTP-Patienten bestimmt. Alle Patienten weisen Autoantikörper gegen ADAMTS13 und eine Protease-Aktivität <5% vor. Die Blutproben werden mittels Sequence Specific Primer-Polymerase Chain Reaction (PCR) und Sequence Specific Oligonucleotid-PCR auf HLA-DRB1, -DRB3-5 und –DQB1 untersucht. Als Referenz dienen die Werte deutscher Knochenmark- und Blutspender, erhalten über www.allelefrequencies.net. Die statistische Auswertung erfolgt mittels zweiseitigem Binomialtest und die resultierenden p-Werte werden nach Benjamini-Hochberg korrigiert.rnZur Beantwortung der zweiten Fragestellung werden 76 deutsche TTP-Patienten anhand eines standardisierten Fragebogens nach Begleiterkrankungen befragt. Als Vergleichswerte dient die Prävalenz der jeweiligen Erkrankung in der Allgemeinbevölkerung. Die statistische Auswertung erfolgt mittels zweiseitigem Binomialtest. Da die p-Werte nicht korrigiert werden, sind die Ergebnisse nur deskriptiv zu verstehen.rnErgebnis: Der Vergleich der HLA-Frequenzen ergibt ein signifikant gehäuftes Vorkommen von HLA-DQB1*02:02 (p<0,001) und -DRB1*11 (p=0,003) innerhalb des Patientenkollektivs. 20% (DQB1*02:02) bzw. 48,1% (DRB1*11) der TTP-Patienten sind im Gegensatz zu nur 1,2% (DQB1*02:02) bzw. 23,5% (DRB1*11) innerhalb der Vergleichsgruppe für das jeweilige HLA-Merkmal positiv.rnDie Befragung der TTP-Patienten bezüglich weiterer Erkrankungen ergab im Vergleich mit der Allgemeinbevölkerung fünf auffällig häufig im Patientenkollektiv vorkommende Autoimmunkrankheiten: Hashimoto Thyreoiditis (23,5% in der Patientengruppe zu 0,7% in der Allgemeinbevölkerung; p<0,001), systemischer Lupus erythematodes (6,5% der Patienten im Gegensatz zu 0,025% in der Allgemeinbevölkerung, p<0,001), Immunthrombozytopenie (6,3% der Patienten zu 0,02% in der Allgemeinbevölkerung; p<0,001), Psoriasis (9,4% der Patienten zu 2,5% in der Allgemeinbevölkerung; p=0,005) und glutensensitive Enteropathie (3,1% der Patienten zu 0,2% in der Allgemeinbevölkerung; p=0,007). rnSchlussfolgerung: Das vermehrte Vorkommen bestimmter HLA-Merkmale im Patientenkollektiv spricht für eine prädisponierende Wirkung dieser Antigene im Krankheitsgeschehen. Eine mögliche HLA-vermittelte Assoziation zwischen TTP und den genannten Autoimmunkrankheiten wird vermutet, kann jedoch nicht in allen Fällen die beobachtete Kookkurrenz ausreichend erklären. Insgesamt bestätigt die vorliegende Arbeit die Assoziation verschiedener Autoimmunkrankheiten untereinander und spricht für eine genetische Prädisposition zur Ausbildung autoimmuner Störungen. rn

Design of cell adhesive and angiogenic titanium surfaces for cellular stimulation

Die Förderung der Zelladhäsion durch sogenannte biomimetische Oberflächen wird in der Medizin als vielversprechender Ansatz gesehen, um Komplikationen wie z. B. Fremdkörperreaktionen nach der Implantation entgegenzuwirken. Neben der Immobilisierung einzelner Biomoleküle wie z. B. dem RGD-Peptid, Proteinen und Wachstumsfaktoren auf verschiedenen Materialien, konzentriert man sich derzeit in der Forschung auf die Co-Immobilisierung zweier Moleküle gleichzeitig. Hierbei werden die funktionellen Gruppen z. B. von Kollagen unter Verwendung von nur einer Kopplungschemie verwendet, wodurch die Kopplungseffizienz der einzelnen Komponenten nur begrenzt kontrollierbar ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Immobilisierungsverfahrens, welches die unabhängige Kopplung zweier Faktoren kontrolliert ermöglicht. Dabei sollten exemplarisch das adhäsionsfördernde RGD-Peptid (Arginin-Glycin-Asparaginsäure) zusammen mit dem Wachstumsfaktor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) auf Titan gebunden werden. In weiteren Experimenten sollten dann die pro-adhäsiven Faktoren Fibronektin, Kollagen, Laminin und Osteopontin immobilisiert und untersucht werden. rnDie Aminofunktionalisierung von Titan durch plasma polymerisierte Allylaminschichten wurde als Grundlage für die Entwicklung des nasschemischen Co-immobilisierungsverfahren verwendet. Für eine unabhängige und getrennte Anbindung der verschiedenen Biomoleküle stand in diesem Zusammenhang die Entwicklung eines geeigneten Crosslinker Systems im Vordergrund. Die Oberflächencharakterisierung der entwickelten Oberflächen erfolgte mittels Infrarot Spektroskopie, Surface Plasmon Resonance Spektroskopie (SPR), Kontaktwinkelmessungen, Step Profiling und X-Ray Photoelectron Spektroskopie (XPS). Zur Analyse der Anbindungsprozesse in Echtzeit wurden SPR-Kinetik Messungen durchgeführt. Die biologische Funktionalität der modifizierten Oberflächen wurde in vitro an Endothelzellen (HUVECs) und Osteoblasten (HOBs) und in vivo in einem Tiermodell-System an der Tibia von Kaninchen untersucht.rnDie Ergebnisse zeigen, dass alle genannten Biomoleküle sowohl einzeln auf Titan kovalent gekoppelt als auch am Bespiel von RGD und VEGF in einem getrennten Zwei-Schritt-Verfahren co-immobilisiert werden können. Des Weiteren wurde die biologische Funktionalität der gebundenen Faktoren nachgewiesen. Im Falle der RGD modifizierten Oberflächen wurde nach 7 Tagen eine geförderte Zelladhäsion von HUVECs mit einer signifikant erhöhten Zellbesiedlungsdichte von 28,5 % (p<0,05) gezeigt, wohingegen auf reinem Titan Werte von nur 13 % beobachtet wurden. Sowohl VEGF als auch RGD/VEGF modifizierte Proben wiesen im Vergleich zu Titan schon nach 24 Stunden eine geförderte Zelladhäsion und eine signifikant erhöhte Zellbesiedlungsdichte auf. Bei einer Besiedlung von 7,4 % auf Titan, zeigten VEGF modifizierte Proben mit 32,3 % (p<0,001) eine deutlichere Wirkung auf HUVECs als RGD/VEGF modifizierte Proben mit 13,2 % (p<0,01). Die pro-adhäsiven Faktoren zeigten eine deutliche Stimulation der Zelladhäsion von HUVECs und HOBs im Vergleich zu reinem Titan. Die deutlich höchsten Besiedlungsdichten von HUVECs konnten auf Fibronektin mit 44,6 % (p<0,001) und Kollagen mit 39,9 % (p<0,001) nach 24 Stunden beobachtet werden. Laminin zeigte keine und Osteopontin nur eine sehr geringe Wirkung auf HUVECs. Bei Osteoblasten konnten signifikant erhöhte Besiedlungsdichten im Falle aller pro-adhäsiven Faktoren beobachtet werden, jedoch wurden die höchsten Werte nach 7 Tagen auf Kollagen mit 90,6 % (p<0,001) und Laminin mit 86,5 % (p<0,001) im Vergleich zu Titan mit 32,3 % beobachtet. Die Auswertung der Tierexperimente ergab, dass die VEGF modifizierten Osteosyntheseplatten, im Vergleich zu den reinen Titankontrollen, eine gesteigerte Knochenneubildung auslösten. Eine solche Wirkung konnte für RGD/VEGF modifizierte Implantate nicht beobachtet werden. rnInsgesamt konnte gezeigt werden, dass mittels plasmapolymerisierten Allylamin Schichten die genannten Biomoleküle sowohl einzeln gebunden als auch getrennt und kontrolliert co-immobilisiert werden können. Des Weiteren konnte eine biologische Funktionalität für alle Faktoren nach erfolgter Kopplung in vitro gezeigt werden. Wider Erwarten konnte jedoch kein zusätzlicher biologischer Effekt durch die Co-immobilisierung von RGD und VEGF im Vergleich zu den einzeln immobilisierten Faktoren gezeigt werden. Um zu einer klinischen Anwendung zu gelangen, ist es nun notwendig, das entwickelte Verfahren in Bezug auf die immobilisierten Mengen der verschiedenen Faktoren hin zu optimieren. rn

Generation of FLT3-ITD-reactive T-cell populations from different sources

Approximately 25% of acute myeloid leukemias (AMLs) carry internal tandem duplications (ITD) of various lengths within the gene encoding the FMS-like tyrosine kinase receptor 3 (FLT3). Although varying duplication sites exist, most of these length mutations affect the protein´s juxtamembrane domain. FLT3-ITDs support leukemic transformation by constitutive phosphorylation resulting in uncontrolled activation, and their presence is associated with worse prognosis. As known form previous work, they represent leukemia- and patient-specific neoantigens that can be recognized by autologous AML-reactive CD8+ T cells (Graf et al., 2007; Graf et al., unpublished). Herein, in patient FL, diagnosed with FLT3-ITD+ AML and in first complete remission after induction chemotherapy, T cells against her leukemia´s individual FLT3-ITD were detected at a frequency up to 1.7x10-3 among peripheral blood CD8+ T lymphocytes. This rather high frequency suggested, that FLT3-ITD-reactive T cells had been expanded in vivo due to the induction of an anti-leukemia response.rnrnCell material from AML patients is limited, and the patients´ anti-leukemia T-cell repertoire might be skewed, e.g. due to complex previous leukemia-host interactions and chemotherapy. Therefore, allogeneic sources, i.e. buffy coats (BCs) from health donors and umbilical cord blood (UCB) donations, were exploited for the presence and the expansion of FLT3-ITD-reactive T-cell populations. BC- and UCB-derived CD8+ T cells, were distributed at 105 cells per well on microtiter plates and, were stimulated with antigen-presenting cells (APCs) transfected with in vitro-transcribed mRNA (IVT-mRNA) encoding selected FTL3-ITDs. APCs were autologous CD8- blood mononuclear cells, monocytes or FastDCs.rnrnBuffy coat lymphocytes from 19 healthy individuals were analyzed for CD8+ T-cell reactivity against three immunogenic FLT3-ITDs previously identified in patients VE, IN and QQ and designated as VE_, IN_ and QQ_FLT3-ITD, respectively. These healthy donors carried at least one of the HLA I alleles known to present an ITD-derived peptide from one of these FLT3-ITDs. Reactivities against single ITDs were observed in 8/19 donors. In 4 donors the frequencies of ITD-reactive T cells were determined and were estimated to be in the range of 1.25x10-6 to 2.83x10-7 CD8+ T cells. These frequencies were 1,000- to 10,000-fold lower than the frequency of autologous FLT3-ITD-reactive T cells observed in patient FL. Restricting HLA I molecules were identified in two donors. In one of them, the recognition of VE_FLT3-ITD was found to be restricted by HLA-C*07:02, which is different from the HLA allele restricting the anti-ITD T cells of patient VE. In another donor, the recognition of IN_FLT3-ITD was restricted by HLA-B*35:01, which also had been observed in patient IN (Graf et al., unpublished). By gradual 3´-fragmentation of the IN_FLT3-ITD cDNA, the 10-mer peptide CPSDNEYFYV was identified as the target of allogeneic T cells against IN_FLT3-ITD. rnLymphocytes in umbilical cord blood predominantly exhibit a naïve phenotype. Seven UCB donations were analyzed for T-cell responses against the FLT3-ITDs of patients VE, IN, QQ, JC and FL irrespective of their HLA phenotype. ITD-reactive responses against all stimulatory FLT3-ITDs were observed in 5/7 UCB donations. The frequencies of T cells against single FLT3-ITDs in CD8+ lymphocytes were estimated to be in the range of 1.8x10-5 to 3.6x10-6, which is nearly 15-fold higher than the frequencies observed in BCs. Restricting HLA I molecules were identified in 4 of these 5 positive UCB donations. They were mostly different from those observed in the respective patients. But in one UCB donation T cells against the JC_FLT3-ITD had exactly the same peptide specificity and HLA restriction as seen before in patient JC (Graf et al., 2007). Analyses of UCB responder lymphocytes led to the identification of the 10-mer peptide YESDNEYFYV, encoded by FL_FLT3-ITD, that was recognized in association with the frequent allele HLA-A*02:01. This peptide was able to stimulate and enrich ITD-reactive T cells from UCB lymphocytes in vitro. Peptide responders not only recognized the peptide, but also COS-7 cells co-transfected with FL_FLT3-ITD and HLA-A*02:01.rnrnIn conclusion, T cells against AML- and individual-specific FLT3-ITDs were successfully generated not only from patient-derived blood, but also from allogeneic sources. Thereby, ITD-reactive T cells were detected more readily and at higher frequencies in umbilical cord blood than in buffy coat lymphocytes. It occurred that peptide specificity and HLA restriction of allogeneic, ITD-reactive T cells were identical to autologous patient-derived T cells. As shown herein, allogeneic, FLT3-ITD-reactive T cells can be used for the identification of FLT3-ITD-encoded peptides, e.g. for future therapeutic vaccination studies. In addition, these T cells or their receptors can be applied to adoptive transfer.