Antimicrobial effect of polymeric biomaterials for bone infection treatment

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, 2016.

Isolamento de uma quitinase extraída do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti (BURKENROAD, 1936) : avaliação de suas atividades antimicrobiana e larvicida

Chitinases are enzymes involved in degradation of chitin and are present in a range of organisms, including those that do not contain chitin, such as bacteria, viruses, plants and animals, and play important physiological and ecological roles. Chitin is hydrolyzed by a chitinolytic system classified as: endo-chitinases, exo-chitinases and N-acetyl-b-D-glucosaminidases. In this study a Litochitinase1 extracted from the cephalotorax of the shrimp Litopenaeus Schmitt was purified 987.32 times using ionexchange chromatography DEAE-Biogel and molecular exclusion Sephacryl S-200. These enzyme presented a molecular mass of about 28.5 kDa. The results, after kinetic assay with the Litochitinase1 using as substrate p-nitrophenyl-N-acetyl-b-Dglucosaminideo, showed apparent Km of 0.51 mM, optimal activity at pH ranging from 5.0 to 6.0, optimum temperature at 55°C and stability when pre-incubated at temperatures of 25, 37, 45, 50 and 55°C. The enzyme showed a range of stability at pH 4.0 to 5.5. HgCl2 inhibited Litochitinase1 while MgCl2 enhances its activity. Antimicrobial tests showed that Litochitinase1 present activity against gram-negative bacterium Escherichia coli in the 800 μg/mL concentration. The larvicidal activity against Aedes aegypti was investigated using crude extracts, F-III (50-80%) and Litochitinase1 at 24 and 48 hours. The results showed larvicidal activity in all these samples with EC50 values of 6.59 mg/mL for crude extract, 5.36 mg/mL for F-III and 0.71 mg/mL for Litochitinase1 at 24 hours and 3.22 and 0.49 mg/mL for the F-III and Litochitinase1 at 48 hours, respectively. Other experiments confirmed the presence of chitin in the midgut of Aedes aegypti larvae, which may be suffering the action of Litochitinase1 killing the larvae, but also the absence of contaminating proteins as serine proteinase inhibitors and lectins in the crude extract, F-III and Litochitinase1, indicating that the death of the larvae is by action of the Litochitinase1. We also observed that the enzymes extracted from intestinal homogenate of the larvae no have activity on Litochitinase1. These results indicate that the enzyme can be used as an alternative to control of infections caused by Escherichia coli and reducing the infestation of the mosquito vector of dengue.

Análise do transcriptoma das glândulas venenosas do escorpião Tityus stigmurus

In Brazil, accidents with scorpions are considered of medical importance, not only by the high incidence, but also for the potentiality of the venom from some species in determining severe clinical conditions. Tityus stigmurus is a widely distributed scorpion species in Northeastern Brazil and known to cause severe human envenomations, inducing pain, hyposthesia, edema, erythema, paresthesia, headaches and vomiting. The present study uses a transcriptomic approach to characterize the molecular repertoire from the non-stimulated venom gland of Tityus stigmurus scorpion. A cDNA library was constructed and 540 clones were sequenced and grouped into 37 clusters, with more than one EST (expressed sequence tag) and 116 singlets. Forty-one percent of ESTs belong to recognized toxin-coding sequences, with antimicrobial toxins (AMP-like) the most abundant transcripts, followed by alfa KTx- like, beta KTx-like, beta NaTx-like and alfa NaTx-like. Our analysis indicated that 34% include other possible venom molecules , whose transcripts correspond to anionic peptides, hypothetical secreted peptides, metalloproteinases, cystein-rich peptides and lectins. Fifteen percent of ESTs are similar to cellular transcripts. Sequences without good matches corresponded to 11%. This investigation provides the first global view of cDNAs from Tityus stigmurus. This approach enables characterization of a large number of venom gland component molecules, which belong either to known or atypical types of venom peptides and proteins from the Buthidae family

Evaluación fitoquímica y microbiológica de extractos naturales y su incorporación en nanopartículas poliméricas para su aplicación odontológica

La caries dental es la principal enfermedad oral que padece la población a nivel mundial. Su prevención se basa en educación sobre higiene oral, además del uso complementario de agentes antimicrobianos. Entre las alternativas de prevención una área prometedora incluye el empleo de extractos de plantas como agentes antimicrobianos incorporados en nanopartículas poliméricas (NP), las cuales, puedan funcionar como vehículos de liberación de extractos, mejorando el desempeño de estos agentes activos naturales. El objetivo de este trabajo fue obtener extractos de plantas de Ocimum basilicum (Albahaca) Calendula officinalis (Cálendula) y aceites esenciales de Syzigium aromaticum (Clavo) y Thymus vulgaris (Tomillo). Se realizó su caracterización fitoquímica y se evaluó su actividad antimicrobiana mediante dilución en tubo contra células plantónicas de Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans y Candida albicans (ATCC), determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI). El extracto con mayor actividad fue incorporado en NP mediante el método de nanoprecipitación (NP) y las nanopartículas se caracterizaron en base a su tamaño e índice de polidispersidad por espectroscopia de relación fotónica; el porcentaje y la eficiencia de encapsulación y mecanismo de liberación del eugenol contenido en el aceite encapsulado, se realizó mediante cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GSMC). En la presente investigación, se determinó que el aceite esencial de clavo mostró la mayor actividad antimicrobiana con respecto a los demás extractos evaluados. Por medio de GSMC se identificó al eugenol como el componente principal del aceite esencial obtenido por hidrodestilación. Se obtuvieron NP esféricas con tamaño alrededor de 157 nm, el porcentaje y la eficiencia de encapsulación de eugenol presente en el aceite encapsulado fue de 73.16 % y 47 % respectivamente; además de mostrar una liberación in vitro de eugenol del 50 % a las 24 horas. Finalmente, la CMI del aceite de clavo sin encapsular e incorporado en NP, correspondió a 125 y 75 μg/mL respectivamente. En base a los resultados obtenidos, es factible incorporar extractos vegetales en NP para su liberación sostenida, siendo una terapia antimicrobiana prometedora dentro del área odontológica.

Actividad bactericida, antifúngica y antiviral de nanopartículas de bismuto contra patógenos orales

De acuerdo con un anuncio publicado por el NIH (National Institute of Health, EUA), los biofilms o biocapas son un problema de salud pública muy importante en el área médica, ya que representan más del 80% de las infecciones microbianas en el cuerpo humano. Los tratamientos antimicrobianos estándar, típicamente fallan para erradicarlos. Por tanto, existe una creciente necesidad de desarrollo de nuevos fármacos con nuevas y mejores capacidades que puedan controlar a los biofilms. Hoy en día, la nanoterapeútica ofrece opciones innovadoras para controlar enfermedades infecciosas incluyendo la cavidad oral, contrarrestando el crecimiento de microorganismos patógenos tales como, Streptococcus mutans, Candida albicans y herpesvirus. En el área médica, algunos derivados del bismuto, como el subsalicilato, han sido empleados en el área médica para contrarrestar el vómito, náuseas, diarrea y dolor de estómago. En esta investigación determinamos la actividad antimicrobiana de nanopartículas de bismuto (BiNPs) contra patógenos orales. La actividad antibacteriana y antifúngica lo evaluamos por el ensayo de MTT y microscopía de fluorescencia. Demostramos que las BiNPs inhibieron el crecimiento de Streptococcus mutans con un 69% de efectividad así mismo obtuvimos un 85% de inhibición con Candida albicans, además fueron capaces de inhibir la formación del biofilm de ambas cepas. Por otra parte, determinamos la actividad antiviral en un modelo de rotavirus mediante el ensayo de inmunoperoxidasa presentando 90% de control de infección con el tratamiento de BiNPs. Finalmente, se evaluó la posible citotoxicidad de BiNPs en células epiteliales de riñón de mono mediante microscopía de fluorescencia y no mostró evidencias de citotoxicidad a 24 horas de exposición.

Descrição do resistoma de solo de Cerrado stricto sensu e o potencial de dioxigenases metagenômicas na resistência antimicrobiana e em processos de biorremediação

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016.

Epidemiología, diagnóstico y tratamiento de la sepsis severa en Uruguay: un estudio multicéntrico prospectivo

Objetivo: conocer las características epidemiológicas de pacientes que ingresan por sepsis severa (SS) y shock séptico (ShS); valorar la implementación de recomendaciones de la campaña Sobrevivir a las Sepsis (CSS) y determinar variables asociadas con mal pronóstico vital. Diseño: estudio prospectivo, observacional, cohorte única, multicéntrico, durante un año (setiembre 2011 - agosto 2012). Ámbito: cinco centros de Montevideo, del subsector público y privado con cobertura de 800.000 habitantes. Pacientes y métodos: 153 pacientes que ingresaron con diagnóstico de SS y ShS a las unidades de cuidados intensivos (UCI) de forma consecutiva. Variables de interés principales: aquellas relacionadas con características del paciente y episodio de sepsis, medidas diagnósticas y terapéuticas según la CSS en las primeras 48 horas, y pronósticas en UCI, hospital y a los seis meses. Resultados: se incluyeron 153 pacientes, la mediana de edad fue 68 años, la de Acute Physiology and Chronic Health Evaluation (APACHE II) fue de 24; 73,9% recibieron asistencia respiratoria mecánica (ARM), con una mediana de 8 días. La mediana de estadía en CTI fue de 12 y la de estadía hospitalaria fue de 19 días. De los episodios de SS, ShS, 69,3% de los casos fue comunitario; 77,8% presentó shock, y 37,9% inmunodebilidad-inmunocompromiso. Predominó la sepsis de origen respiratorio en 30,1%, se aisló microorganismos en 64,1%, siendo bacterianas 95,9%. La mortalidad en CTI fue 49,7%, hospitalaria 54,9% y a seis meses 58,8%. Se asociaron a mayor mortalidad hospitalaria: edad, APACHE II, inmunodebilidad-compromiso, demoras de ingreso a UCI e inicio de antimicrobianos y balance positivo. Conclusiones: los pacientes ingresan a UCI con formas severas o estado biológico comprometido. Existen demoras y limitaciones en el diagnóstico y terapéutica inicial, situaciones que se asocian a mayor mortalidad hospitalaria.

Utilidad de los criterios de predicción clínica y del test rápido antigénico para el manejo de la faringitis aguda en un servicio de urgencias

Objetivo: Validar los criterios de CENTOR modificados (CENTOR-m) y los tests rápidos de detección del antígeno de Estreptococo del Grupo A (SGA) en la faringitis aguda. Diseño: Estudio de validación de pruebas diagnósticas. Emplazamiento y participantes: Ciento un pacientes elegibles, que consultaron al departamento de urgencias de un hospital de tercer nivel con cuadro clínico compatible con faringitis aguda. Mediciones Principales: Se obtuvieron muestras de hisopados faríngeos para la realización del test rápido antigénico para SGA (FAMR) y para cultivo, respectivamente. Se calculó en cada caso los criterios de CENTOR-m. Resultados: La edad media de los pacientes incluidos en el estudio fue de 22,6 años (DE:13,8). El 48,5 % eran varones. El SGA fue el patógeno aislado en el 20,79 % de los casos. El CENTOR-m presentó una sensibilidad del 83,3 % (50,9 %-97,1 %), especificidad del 45,5 % (30,7 %-61,0 %) valor predictivo positivo (VPP) del 29,4 % (15,7 %-47,7 %) y valor predictivo negativo (VPN) del 90,9 % (69,4 %-98,4 %). El FAMR presento una sensibilidad del 81,5 % (61,3 %-93,0 %) especificidad del 98,6 % (91,4 %-99,9 %), VPP del 95,7 % (76,0 %-99,8 %) y VPN del 93,3 % (84,5 %-97,5 %). El 49,5 % de los pacientes recibieron antibióticos basándose en el juicio médico, lo que resultó en una proporción de sobreindicación de antimicrobianos del 62 %. Conclusiones: Los criterios de CENTOR-m demostraron adecuado valor pronóstico negativo y el FAMR buena sensibilidad, especificidad y valor pronóstico positivo para faringitis por SGA. La utilización de ambos métodos en la atención urgente podría optimizar el manejo de la patología y la adecuación antibiótica.

Sistemas de vigilância das resistências aos antibióticos

Dissertação de Mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Impacto da utilização de ácido gálhico, ácido ferúlico e eugenol em modo contínuo na suscetibilidade de Pseudomonas aeruginosa

Dissertação de Mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016

Características genotípicas de Staphylococcus coagulase-negativos e taxas de cura da mastite ovina.

A mastite em ovelhas de dupla aptidão é reconhecida por afetar a qualidade do leite. Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são os principais micro-organismos responsáveis pela doença, e o tratamento ao final da lactação, pode contribuir para a cura e prevenção de casos subclínicos na lactação consecutiva. Entretanto, fatores de virulência e mecanismos de resistência apresentados por SCN podem reduzir as taxas de cura. Os objetivos deste trabalho foram identificar no leite de ovelhas tratadas e não tratadas à secagem com antimicrobianos, as espécies de SCN antes e após o tratamento e identificar nesses micro-organismos a presença dos genes mecA, icaA, icaC, icaD, bap, bhp, sea, seb, sec, sed e tsst-1, determinar o perfil clonal das principais espécies identificadas e relacionar os casos de cura após o tratamento com a presença/ausência dos respectivos genes. Sessenta ovelhas foram divididas em três grupos experimentais: G1, controle, metades mamárias que não receberam antimicrobiano; G2, metades mamárias em que foram administrados 10 mL de cloxacilina-benzatina 100 mg via intramamária / estrutura convencional; G3, metades mamárias em que foram administrados 86 mL de cloxacilina-benzatina 50 mg via intramamária / estrutura nanoencapsulada. As amostras de leite foram coletadas à secagem e aos 15 e 30 dias pós-parto da lactação seguinte. As análises para identificação das espécies de SCN foram realizadas por meio de testes bioquímicos e Internal Transcribe Spacer (ITS-PCR), e a pesquisa dos genes responsáveis pelos fatores de virulência e pela resistência à oxacilina foram realizados por meio da técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). Dentre as espécies identificadas S. warneri prevaleceram nos três grupos experimentais. Nenhuma amostra foi positiva para o gene mecA. O único gene relacionado com a produção de enterotoxinas encontrado foi o sec. Dentre os genes relacionados com a produção de biofilme, icaD foi o único identificado nos três grupos experimentais. Staphylococcus warneri, S. simulans e S. epidermidis apresentaram clones na mesma metade mamária no pré e pós-parto das ovelhas. A cloxacilina benzatina nanoparticulada 50mg / 86 mL foi eficiente para reduzir a mastite subclínica no pós-parto de ovelhas (P= 0,0192). Staphylococcus warneri, S. simulans, S. epidermidis e S. xylosus foram as espécies de maior ocorrência. Os genes icaA, icaC, icaD e bap foram encontrados no momento da desmama e no pós-parto, os genes sec e icaD estão associados à ausência de cura da mastite subclínica no pós-parto. Ovelhas em que foram isolados SCN portadores de genes responsáveis pela formação de biofilme não apresentaram resultados satisfatórios quando submetidas a esquemas de controle e ao tratamento da mastite subclínica. Os genes sec e icaD, estão associadas à ausência de cura microbiológica da mastite subclínica no pós-parto. Staphylococcus epidermidis e S. xylosus portador do gene bap estão associados à reinfecção.

Caracterização química e biológica de peptídeos com propriedades antiproliferativas isolados da secreção cutânea do anuro Hypsiboas raniceps (Cope, 1862)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016.

Detecção de genes de enterotoxinas e da toxina-1 da Síndrome do Choque Tóxico de Staphylococcus aureus isolados de mastites no Distrito Federal e Entorno

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2016.

Avaliação do potencial de formigas (Hymenoptera: formicidae) como vetores mecânicos de bactérias do gêneroSstaphylococcus no ambiente hospitalar.

In a hospital environment, these bacteria can be spread by insects such as ants, which are characterized by high adaptability to the urban environment. Staphylococcus is a leading cause of hospital infection. In Europe, Latin America, USA and Canada, the group of coagulase negative staphylococci (CoNS) is the second leading cause of these infections, according to SENTRY (antimicrobial surveillance program- EUA). In this study, we investigated the potential of ants (Hymenoptera: Formicidae) as vehicle mechanics of Staphylococcus bacteria in a public hospital, in Natal-RN. The ants were collected, day and night, from June 2007 to may 2008, in the following sectors: hospitals, laundry, kitchen, blood bank. The ants were identified according to the identification key of Bolton, 1997. For the analysis of staphylococci, the ants were incubated in broth Tryptic Soy Broth (TSB) for 24 hours at 35 º C and then incubated on Mannitol Salt Agar. The typical colonies of staphylococci incubated for 24 hours at 35 ° C in Tryptic Soy Agar for the characterization tests (Gram stain, catalase, susceptibility to bacitracin and free coagulase). The identification of CoNS was performed through biochemical tests: susceptibility to novobiocin, growth under anaerobic conditions, presence of urease, the ornithine decarboxylation and acid production from the sugars mannose, maltose, trehalose, mannitol and xylose. The antimicrobial susceptibility examined by disk-diffusion technique. The technique of Polymerase Chain Reaction was used to confirm the presence of mecA gene and the ability to produce biofilm was verified by testing in vitro using polystyrene inert surface, in samples of resistant staphylococci. Among 440 ants, 85 (19.1%) were carrying coagulase-negative staphylococci (CoNS) of the species Staphylococcus saprophyticus (17), Staphylococcus epidermidis (15), Staphylococcus xylosus (13), Staphylococcus hominis hominis (10), Staphylococcus lugdunensis (10), Staphylococcus warneri (6), Staphylococcus cohnii urealyticum (5), Staphylococcus haemolyticus (3), Staphylococcus simulans (3), Staphylococcus cohnii cohnii (2), and Staphylococcus capitis (1). No Staphylococcus aureus was found. Among the isolates, 30.58% showed resistance to erythromycin. Two samples of CoNS (2.35%), obtained from the ant Tapinoma melanocephalum collected in the post-surgical female ward, S. Hominis hominis and S. lugdunensis harbored the mecA gene and were resistant to multiple antibiotics, and the specie S. hominis hominis even showed to be a biofilm producer. This study proves that ants act as carriers of multidrug-resistant coagulase-negative Staphylococci and biofilm producers and points to the risk of the spreading of pathogenic microorganisms by this insect in the hospital environment

Estudio de la calidad de la prescripción hospitalaria de antibioterapia en la población pediátrica y propuesta de mejora con la colaboración de un farmacéutico en el equipo asistencial

El uso incorrecto de los medicamentos ocurre en todos los países, es nocivo para los pacientes y constituye un desperdicio de recursos. Se estima que aproximadamente el 50% de los antibióticos son administrados innecesariamente. Existe una relación entre el uso indiscriminado de agentes antimicrobianos y el aumento de los microorganismos resistentes a dichos agentes. Consecuencia de ello es la aparición cada vez más frecuente de infecciones nosocomiales, cuyas responsables la mayoría de las veces, son bacterias multirresistentes. Se asocian con incidencias más elevadas de morbimortalidad, ya que limitan la opción de tratamiento por la falta de eficacia de los antibióticos, alargando el período convaleciente del paciente y encareciendo los costes del ingreso. Todo esto y el alto costo de los nuevos antibacterianos hacen que por primera vez desde la introducción de los antibióticos, exista la posibilidad de no contar con ninguna quimioterapia efectiva para los pacientes con infecciones. Este hecho es especialmente preocupante en los pacientes pediátricos, ya que por su edad se verán obligados a combatir infecciones futuras, y precisan de la mayor sensibilidad posible a los agentes antimicrobianos y de la mayor cantidad de antibióticos activos frente a ellos. Además, en los primeros años de vida se produce la mayor exposición innecesaria a antibióticos de toda la población, por ser la mayoría de las infecciones a esta edad de etiología viral y autolimitadas. Precisamente por tratarse de niños, es muy importante no olvidar que dentro del mismo Área de Pediatría existe una amplia gama de pacientes, muy diferentes unos de otros, que deben ser tratados de forma individualizada para asegurar una terapia farmacológica efectiva. La población infantil presenta diferencias farmacocinéticas y farmacodinámicas en cuanto a la respuesta a un fármaco, lo cual hace de la farmacología pediátrica una especialidad en sí misma. A día de hoy, los estudios sobre pacientes pediátricos son más bien escasos. Este trabajo podría resultar de gran utilidad para ampliar y enriquecer estos conocimientos...