Serum concentrations of acute phase proteins and immunoglobulins of calves with rotavirus diarrhea.

2015

Serum concentrations of acute phase proteins and immunoglobulins of calves with rotavirus diarrhea.

2016

Insulin-regulatable phosphoproteins in 3T3-L1 adipocytes form detergent-insoluble complexes not associated with caveolin

Whole body glucose homeostasis is dependent on the action of insulin. In muscle and adipose tissues, insulin stimulates glucose uptake by inducing the translocation of vesicles containing the glucose transporter GLUT4 to the cell surface. While the mechanisms of insulin-regulated GLUT4 translocation are not fully understood, some signaling intermediates have been implicated in this process. Interestingly, som: of these intermediates, including IRS-1 and PI3K, have been localised to the same intracellular membrane fraction as the GLUT4 storage pool, designated here as the high-speed pellet (HSP) fraction. This raises the possibility that many of the downstream insulin signaling intermediates may be located within close proximity to intracellular GLUT4. The goal of this study was to test this hypothesis in 3T3-L1 adipocytes. A large proportion of adipocyte phosphoproteins co-fractionated in the HSP fraction. In an attempt to resolve insulin-regulatable phosphoproteins, we subjected P-32-labeled subcellular fractions to two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). Insulin reproducibly stimulated the phosphorylation of 12 spots in the HSP fraction. Most of the HSP phosphoproteins were insoluble in the nonionic detergent Triton X-100, whereas integral membrane proteins such as GLUT4 and intracellular caveolin were soluble under the same conditions. These results suggest that insulin-regulatable phosphoproteins in adipocytes may be organized in microdomains within the cell and that this assembly may act as an efficient conductor of the signaling proteins to rapidly facilitate downstream biological responses. Further study is required to establish the molecular basis for these detergent-insoluble signaling complexes.

L’amélioration de la performance et de la structure cardiaque par la moxonidine chez les SHR est accompagnée d’une diminution des cytokines, de la MAPK p38 et de l’Akt

L’hypertrophie du ventricule gauche (HVG) est un processus adaptif et compensatoire qui se développe conséquemment à l’hypertension artérielle pour s’opposer à l’élévation chronique de la pression artérielle. L’HVG est caractérisée par une hypertrophie des cardiomyocytes suite à l’augmentation de la synthèse d’ADN, une prolifération des fibroblastes, une augmentation du dépôt de collagène et une altération de la matrice extracellulaire (MEC). Ces changements génèrent des troubles de relaxation et mènent au dysfonctionnement diastolique, ce qui diminue la performance cardiaque. La suractivité du système nerveux sympathique (SNS) joue un rôle essentiel dans le développement de l’hypertension artérielle et de l’HVG à cause de la libération excessive des catécholamines et de leurs effets sur la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires et sur les différentes voies de signalisation hypertrophiques et prolifératives. Le traitement antihypertenseur avec de la moxonidine, un composé sympatholytique d’action centrale, permet une régression de l’HVG suite à une réduction soutenue de la synthèse d'ADN et d’une stimulation transitoire de la fragmentation de l'ADN qui se produit au début du traitement. En raison de l’interaction entre l’HVG, les cytokines inflammatoires, le SNS et leurs effets sur les protéines de signalisation hypertrophiques, l’objectif de cette étude est de détecter dans un modèle animal d’hypertension artérielle et d’HVG, les différentes voies de signalisation associées à la régression de l’HVG et à la performance cardiaque. Des rats spontanément hypertendus (SHR, 12 semaines) ont reçu de la moxonidine à 0, 100 et 400 µg/kg/h, pour une période de 1 et 4 semaines, via des mini-pompes osmotiques implantées d’une façon sous-cutanée. Après 4 semaines de traitement, la performance cardiaque a été mesurée par écho-doppler. Les rats ont ensuite été euthanasiés, le sang a été recueilli pour mesurer les concentrations des cytokines plasmatiques et les cœurs ont été prélevés pour la détermination histologique du dépôt de collagène et de l'expression des protéines de signalisation dans le ventricule gauche. Le traitement de 4 semaines n’a eu aucun effet sur les paramètres systoliques mais a permis d’améliorer les paramètres diastoliques ainsi que la performance cardiaque globale. Par rapport au véhicule, la moxonidine (400 µg/kg/h) a permis d’augmenter transitoirement la concentration plasmatique de l’IL-1β après une semaine et de réduire la masse ventriculaire gauche. De même, on a observé une diminution du dépôt de collagène et des concentrations plasmatiques des cytokines IL-6 et TNF-α, ainsi qu’une diminution de la phosphorylation de p38 et d’Akt dans le ventricule gauche après 1 et 4 semaines de traitement, et cela avec une réduction de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque. Fait intéressant, les effets anti-hypertrophiques, anti-fibrotiques et anti-inflammatoires de la moxonidine ont pu être observés avec la dose sous-hypotensive (100 µg/kg/h). Ces résultats suggèrent des effets cardiovasculaires bénéfiques de la moxonidine associés à une amélioration de la performance cardiaque, une régulation de l'inflammation en diminuant les niveaux plasmatiques des cytokines pro-inflammatoires ainsi qu’en inhibant la MAPK p38 et Akt, et nous permettent de suggérer que, outre l'inhibition du SNS, moxonidine peut agir sur des sites périphériques.

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endgültige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abhängig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter für die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schlüsselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilität und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabhängigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem kürzeren, ein freies 3´ poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte β-globin 3´ UTR, unabhängig voneinander zu einer Erhöhung der IVT-RNA Stabilität und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erhöhten Proteinexpression führten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination führte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erhöhten Dichte und Stabilität von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfläche transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform für die Induktion einer verstärkten Antikörperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verstärkung der Antikörperantwort führen, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell bestätigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verstärkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verstärkung der Antikörperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA führte zu einer signifikant stärkeren Antikörperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. Für die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen führt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe für eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.

Altered hypertrophic chondrocyte kinetics in GDF-5 deficient murine tibial growth plates

The growth/differentiation factors (GDFs) are a subgroup of the bone morphogenetic proteins best known for their role in joint formation and chondrogenesis. Mice deficient in one of these signaling proteins, GDF-5, exhibit numerous skeletal abnormalities, including shortened limb bones. The primary aim of this study was determine whether GDF-5 deficiency would alter the growth rate in growth plates from the long bones in mice and, if so, how this is achieved. Stereologic and cell kinetic parameters in proximal tibial growth plates from 5-week-old female GDF-5 -/- mice and control littermates were examined. GDF-5 deficiency resulted in a statistically significant reduction in growth rate (-14%, p=0.03). The effect of genotype on growth rate was associated with an altered hypertrophic phase duration, with hypertrophic cells from GDF-5 deficient mice exhibiting a significantly longer phase duration compared to control littermates (+25%, p=0.006). These data suggest that one way in which GDF-5 might modulate the rate of endochondral bone growth could be by affecting the duration of the hypertrophic phase in growth plate chondrocytes.

Variations in IB1/JIP1 expression regulate susceptibility of beta-cells to cytokine-induced apoptosis irrespective of C-Jun NH2-terminal kinase signaling.

We previously reported that interleukin-1beta (IL-1beta) alone does not cause apoptosis of beta-cells, whereas when combined with gamma-interferon (IFN-gamma) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), it exerts a distinct apoptotic effect. Studies in beta-cell lines indicated that IL-1beta reduced expression of islet brain (IB)-1/JNK interacting protein (JIP)-1, a JNK scaffold protein with antiapoptotic action. We examined whether variations in IB1/JIP-1 expression in purified primary beta-cells affect their susceptibility to cytokine-induced apoptosis. Exposure to IL-1beta for 24 h decreased cellular IB1/JIP-1 content by 66 +/- 17%; this IL-1beta effect was maintained in the presence of TNF-alpha + IFN-gamma, which did not influence IB1/JIP-1 levels by themselves. Addition of IL-1beta to TNF-alpha + IFN-gamma increased apoptosis from 20 +/- 2% to 59 +/- 5%. A similar increase in TNF-alpha + IFN-gamma-induced apoptosis was produced by adenoviral expression of antisense IB1/JIP-1 and was not further enhanced by addition of IL-1beta, indicating that IL-1beta-mediated suppression of IB1/JIP-1 in beta-cells increases their susceptibility to cytokine-induced apoptosis. However, adenovirally mediated overexpression of IB1/JIP-1 also potentiated TNF-alpha + IFN-gamma-induced apoptosis, suggesting that the antiapoptotic effect of IB1/JIP-1 depends on well-defined cellular levels. We conclude that the IB1/JIP-1 level in beta-cells can control their susceptibility to apoptosis independent of JNK signaling.

The full-length leptin receptor has signaling capabilities of interleukin 6-type cytokine receptors.

The leptin receptor (OB-R) is a single membrane-spanning protein that mediates the weight regulatory effects of leptin (OB protein). The mutant allele (db) of the OB-R gene encodes a protein with a truncated cytoplasmic domain that is predicted to be functionally inactive. Several mRNA splice variants encoding OB-Rs with different length cytoplasmic domains have been detected in various tissues. Here we demonstrate that the full-length OB-R (predominantly expressed in the hypothalamus), but not a major naturally occurring truncated form or a mutant from found in db/db mice, can mediate activation of signal transducer and activator of transcription (STAT) proteins and stimulate transcription through interleukin 6 responsive gene elements. Reconstitution experiments suggest that, although OB-R mediates intracellular signals with a specificity similar to interleukin 6-type cytokine receptors, signaling appears to be independent of the gp130 signal transducing component of the interleukin 6-type cytokine receptors.

Exercise Increases Pancreatic β-cell Viability In A Model Of Type 1 Diabetes Through Il-6 Signaling.

Type 1 diabetes (T1D) is provoked by an autoimmune assault against pancreatic β cells. Exercise training enhances β-cell mass in T1D. Here, we investigated how exercise signals β cells in T1D condition. For this, we used several approaches. Wild-type and IL-6 knockout (KO) C57BL/6 mice were exercised. Afterward, islets from control and trained mice were exposed to inflammatory cytokines (IL-1β plus IFN-γ). Islets from control mice and β-cell lines (INS-1E and MIN6) were incubated with serum from control or trained mice or medium obtained from 5-aminoimidazole-4 carboxamide1-β-d-ribofuranoside (AICAR)-treated C2C12 skeletal muscle cells. Subsequently, islets and β cells were exposed to IL-1β plus IFN-γ. Proteins were assessed by immunoblotting, apoptosis was determined by DNA-binding dye propidium iodide fluorescence, and NO(•) was estimated by nitrite. Exercise reduced 25, 75, and 50% of the IL-1β plus IFN-γ-induced iNOS, nitrite, and cleaved caspase-3 content, respectively, in pancreatic islets. Serum from trained mice and medium from AICAR-treated C2C12 cells reduced β-cell death, induced by IL-1β plus IFN-γ treatment, in 15 and 38%, respectively. This effect was lost in samples treated with IL-6 inhibitor or with serum from exercised IL-6 KO mice. In conclusion, muscle contraction signals β-cell survival in T1D through IL-6.-Paula, F. M. M., Leite, N. C., Vanzela, E. C., Kurauti, M. A., Freitas-Dias, R., Carneiro, E. M., Boschero, A. C., and Zoppi, C. C. Exercise increases pancreatic β-cell viability in a model of type 1 diabetes through IL-6 signaling.

Function of TRADD in tumor necrosis factor receptor 1 signaling and in TRIF-dependent inflammatory responses.

Tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1) and Toll-like receptors (TLRs) regulate immune and inflammatory responses. Here we show that the TNFR1-associated death domain protein (TRADD) is critical in TNFR1, TLR3 and TLR4 signaling. TRADD deficiency abrogated TNF-induced apoptosis, prevented recruitment of the ubiquitin ligase TRAF2 and ubiquitination of the adaptor RIP1 in the TNFR1 signaling complex, and considerably inhibited but did not completely abolish activation of the transcription factor NF-kappaB and mitogen-activated protein kinases 'downstream' of TNFR1. TRIF-dependent cytokine production induced by the synthetic double-stranded RNA poly(I:C) and lipopolysaccharide was lower in TRADD-deficient mice than in wild-type mice. Moreover, TRADD deficiency inhibited poly(I:C)-mediated RIP1 ubiquitination and activation of NF-kappaB and mitogen-activated protein kinase signaling in fibroblasts but not in bone marrow macrophages. Thus, TRADD is an essential component of TNFR1 signaling and has a critical but apparently cell type-specific function in TRIF-dependent TLR responses.

FANCD2 binds MCM proteins and controls replisome function upon activation of s phase checkpoint signaling.

Proteins disabled in Fanconi anemia (FA) are necessary for the maintenance of genome stability during cell proliferation. Upon replication stress signaling by ATR, the FA core complex monoubiquitinates FANCD2 and FANCI in order to activate DNA repair. Here, we identified FANCD2 and FANCI in a proteomic screen of replisome-associated factors bound to nascent DNA in response to replication arrest. We found that FANCD2 can interact directly with minichromosome maintenance (MCM) proteins. ATR signaling promoted the transient association of endogenous FANCD2 with the MCM2-MCM7 replicative helicase independently of FANCD2 monoubiquitination. FANCD2 was necessary for human primary cells to restrain DNA synthesis in the presence of a reduced pool of nucleotides and prevented the accumulation of single-stranded DNA, the induction of p21, and the entry of cells into senescence. These data reveal that FANCD2 is an effector of ATR signaling implicated in a general replisome surveillance mechanism that is necessary for sustaining cell proliferation and attenuating carcinogenesis.

The role of Notch receptor signaling in T helper 17 cell differentiation

Antigenic recognition by naive CD4+ T cells induces their proliferation and differentiation into functionally distinct T helper (Th) cell. Each CD4+ Th cell subset expresses specific transcription factors and produces signature cytokines that coordinate immune responses against encountered pathogens. Among the factors influencing CD4+ Th cell differentiation, Notch signaling pathway has been reported to play a role in the differentiation and function of multiple CD4+Thcell subsets. Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-to-cell signaling cascade involved in many cell fate decision processes. How Notch signaling modulates the differentiation of CD4+ Th cell subsets and whether Notch signaling alone is sufficient or not for the differentiation of CD4+ Th cells is still a matter of debate. Th17 cells are a distinct subset of CD4+ Th cells. They play a role in the control of extracellular bacterial and fungal infections and may lead to inflammatory and autoimmune diseases if not properly regulated. Th17 cells are defined by the expression of RAR-related orphan receptor (ROR)a and RORyT transcription factors and their secretion of IL-17A, IL-17F cytokines. The involvement of Notch signaling in Th17 cell differentiation has mostly been studied in vitro. However, neither the experimental conditions when Notch signaling might be involved in Th17 cell differentiation in vitro and in vivo nor the precise role of Notch in this process remain clear. To better define how Notch signaling impacts Th17 differentiation, we used mice with T cell specific ablation of Notchl and Notch2 (N1 N2ACD4Cre) or of Notch transcriptional repressor RBP- JK (RBP-J ACD4Cre). We show that impaired Notch signaling in T cells, when TCR activating signal were reduced, increased RORyT and IL-17 mRNA levels during in vitro Th17 cell differentiation. Following immunization with OVA in CFA, an adjuvant that induces mostly Th17 cell response, increased IL-17A mRNA and intracellular IL-17A levels were observed in draining lymph nodes of Notch-deficient CD4+T cells. Our data suggest that Notch limited Th17 cell differentiation. Despite high levels of IL-17 mRNA and intracellular IL-17 proteins observed in Notch-deficient T cells, their release of Th17 cytokines ex vivo was markedly decreased, indicating a role for Notch signaling. During the second part of this thesis, we observed that the impact of Notch on Th17 cell differentiation and effector functions was context-dependent using different in vivo experimental models, in which Th17 cells and IL-17A were reported to contribute in the disease development. Collectively, our data reveal that Notch signaling controls the fine-tuning of Th17 cell differentiation and effector functions by limiting their differentiation but promoting selectively cytokine release through Notch-dependent mechanisms that still need to be defined. -- Lors d'une réponse immunitaire et grâce à la reconnaissance antigénique, les lymphocytes CD4+ T naïfs prolifèrent, puis se différencient en CD4+ T auxiliaires ("T helper" ou Th) fonctionnellement distincts. Chaque sous-population de lymphocytes CD4+ T auxiliaires exprime des facteurs de transcription et des cytokines spécifiques qui coordonnent la réponse immunitaire contre les pathogènes rencontrés. Parmi les facteurs influençant la différenciation des lymphocytes CD4+ T auxiliaires, la voie de signalisation Notch a été identifiée comme ayant un rôle dans la différenciation et la fonction des différents sous-types de cellules CD4+ T auxiliaires. La voie de signalisation Notch est une voie évolutivement conservée, qui est impliquée dans la signalisation entre les cellules et dans de nombreux processus de décisions cellulaires. La manière dont la voie de signalisation Notch régule la différenciation des lymphocytes CD4+ T en sous-types de cellules CD4+ auxiliaires, mais également la question de savoir si la voie de signalisation Notch est capable ou non d'induire la différenciation des cellules CD4+T auxiliaires, restent à débattre. Les cellules T auxiliaires 17 (Th17) sont un sous-type distinct de cellules CD4+T. Elles jouent un rôle important dans la défense immunitaire contre des pathogènes tels que les bactéries extracellulaires et les champignons. Une dérégulation de la réponse des cellules Th17 peut conduire à des inflammations mais également à des maladies auto-immunes. Les cellules Th17 sont définies par l'expression de leurs facteurs de transcription RAR-related orphan receptor (ROR)a, RORyT et par la sécrétion de cytokines comme IL-17A, IL-17F. Le rôle de la voie de signalisation Notch dans la différenciation des cellules Th17 a principalement été démontré in vitro. Malgré tout, ni les conditions expérimentales dans lesquelles cette voie pourrait être impliquée dans la différenciation des cellules Th17 in vitro et in vivo, mais également ni la fonction exacte de Notch dans ces processus, ne sont des questions résolues. Afin de mieux définir comment la voie de signalisation Notch est impliquée dans la différenciation des cellules Th17, nous avons utilisé des souris avec une déficience spécifique dans les cellules T des récepteurs Notchl et Notch2 (N1N2ACD4Cre) ou du répresseur transcriptionnel de Notch RBP-JK (RBP-J ACD4Cre). Nous avons montré que lorsque la voie de signalisation Notch est déficiente, les niveaux d'ARN messager (ARNm) de RORyT et de IL-17A sont augmentés dans les cellules Th17 pendant la différenciation in vitro, en présence de niveaux réduits des signaux activant les cellules T CD4+. Une augmentation dans les niveaux d'ARNm de IL-17A et de IL-17A intracellulaire au niveau protéinique a été observée dans les cellules T CD4+ Notch déficientes, au niveau des ganglions drainants après immunisation avec l'OVA dans le CFA, un adjuvant induisant une réponse des cellules Th17. Nos résultats suggèrent que Notch pourrait réguler négativement l'expression de IL-17A au niveau transcriptionnel mais également protéinique. Malgré une augmentation de IL-17A au niveau de l'ARNm et protéinique dans les cellules CD4+ T Notch déficientes, paradoxalement la sécrétion de IL-17A mais également de cytokines associées aux fonctions effectrices des cellules Th17 sont profondément diminuées 6X vivo, suggérant un rôle de la voie de signalisation Notch dans ce processus. Dans la deuxième partie de ce travail de thèse, nous avons observé que l'impact de Notch dans la différenciation des cellules Th17 et dans leurs fonctions effectrices était dépendant du contexte dans d'autres modèles expérimentaux in vivo, où les cellules Th17 et l'IL-17A ont été identifiées comme ar-.riCociêSM dans le développement ds la pathologie. En résumé, nous avons montré que la voie de la signalisation Notch contrôle la régulation précise de la différenciation des cellules Th17 en limitant leur différenciation, mais en promouvant sélectivement leur relâchement en cytokines associés aux cellules Th17 par l'intermédiaire de mécanismes dépendant de Notch, qui restent toujours à déterminer. -- Lors d'une réponse immunitaire et grâce à la reconnaissance antigénique, les lymphocytes CD4+ T naïfs prolifèrent, puis se différencient en CD4+ T auxiliaires ("T helper" ou Th) fonctionnellement distincts. Chaque sous-population de lymphocytes T auxiliaires exprime des facteurs de transcription et des cytokines spécifiques qui coordonnent une réponse immunitaire contre différents pathogènes. Les mécanismes liés à la différenciation des lymphocytes CD4+ T auxiliaires sont complexes et régulés. Une mauvaise régulation de la différenciation des lymphocytes CD4+ T auxiliaires peut conduire à des maladies auto-immunes, mais également à des processus inflammatoires. Parmi les facteurs influençant la différenciation des lymphocytes T auxiliaires, la voie de signalisation Notch a été identifiée comme ayant un rôle dans la différenciation et la fonction des différents sous-types de cellules CD4+ T auxiliaires. La voie de signalisation Notch est une voie évolutivement conservée, qui est impliquée dans la signalisation entre les cellules, mais également dans de nombreux processus de décisions cellulaires. Quelle est l'implication de la voie de signalisation Notch dans la différenciation des lymphocytes CD4+ en sous-types de cellules CD4+T auxiliaires et comment cette voie agit dans ce processus, sont des questions débattues. Les cellules T auxiliaires 17 (Th17) sont une sous-population distincte de lymphocytes CD4+. Elles jouent un rôle important dans la défense immunitaire contre les bactéries extracellulaires et les champignons. Une dérégulation de la réponse des cellules Th17 a été associée à des maladies auto-immunes et à l'inflammation. Les cellules Th17 sont définies par l'expression du facteur de transcription RAR-related orphan receptor (ROR)yT et des cytokines comme IL-17A, IL-17F. Le rôle de la voie de signalisation Notch dans la différenciation des cellules Th17 a été principalement démontré dans des études expérimentales in vitro. Malgré tout, les conditions expérimentales exactes dans lesquelles la voie de signalisation de Notch pourrait être impliquée dans la différenciation des cellules Th17, mais également le rôle de Notch dans ce processus ne sont pas encore clairement élucidés. Afin de mieux définir comment la voie de signalisation Notch est impliquée dans la différenciation des cellules Th17, nous avons utilisé des souris avec une déficience spécifique dans les cellules T des récepteurs Notchl et Notch2 (N1 N2ACD4Cre) ou du répresseur transcriptionnel de Notch RBP-JK (RBP-JACD4CRE). Nous avons montré que lorsque la voie de signalisation Notch est déficiente, les niveaux d'ARN messager (ARNm) de RORyT et de IL-17 sont augmentés dans les cellules Th17 pendant leur différenciation in vitro. Cet effet de Notch sur la transcription apparaît être facultatif lorsque les conditions environnementales sont en excès in vitro. Après immunisation avec un adjuvant qui induit principalement une réponse des cellules Th17, nous avons observé que les niveaux de ARNm de IL-17A et aussi de IL-17A intracellulaire au niveau protéinique étaient augmentés dans les ganglions drainants dans les cellules CD4+ Notch déficientes. Ces résultats suggèrent que Notch pourrait réguler négativement l'expression de IL- 17 au niveau transcriptionnel mais également protéinique. Malgré des niveaux plus élevés de IL- 17 ARNm et aussi IL-17A intracellulaire dans les cellules T Notch déficientes, le relâchement en cytokines Th17 est profondément diminué indiquant un rôle de la voie de signalisation Notch dans ces processus de sécrétion. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons observé que le rôle de Notch dans ia différenciation dss cellules Ti,17 et dans leurs fonctions effectrices était dépendant du contexte dans d'autres modèles expérimentaux, qui ont été rapportés comme une réponse induisant des cellules Th17. En résumé, nos données montrent que la voie de la signalisation Notch contrôle la régulation précise de la différenciation des cellules Th17 en limitant leur différenciation mais en promouvant sélectivement le relâchement en cytokines associées aux cellules Th17 par des mécanismes dépendant de Notch qui restent toujours à déterminer. Par conséquent, l'inhibition de la voie de signalisation Notch pourrait être utilisée dans des situations inflammatoires ou d'auto-immunité où la réponse des cellules Th17 est exacerbée.

Functional studies of the deubiquitinating enzymes USP19, USP4 and UCH-L1

El marcaje de proteínas con ubiquitina, conocido como ubiquitinación, cumple diferentes funciones que incluyen la regulación de varios procesos celulares, tales como: la degradación de proteínas por medio del proteosoma, la reparación del ADN, la señalización mediada por receptores de membrana, y la endocitosis, entre otras (1). Las moléculas de ubiquitina pueden ser removidas de sus sustratos gracias a la acción de un gran grupo de proteasas, llamadas enzimas deubiquitinizantes (DUBs) (2). Las DUBs son esenciales para la manutención de la homeostasis de la ubiquitina y para la regulación del estado de ubiquitinación de diferentes sustratos. El gran número y la diversidad de DUBs descritas refleja tanto su especificidad como su utilización para regular un amplio espectro de sustratos y vías celulares. Aunque muchas DUBs han sido estudiadas a profundidad, actualmente se desconocen los sustratos y las funciones biológicas de la mayoría de ellas. En este trabajo se investigaron las funciones de las DUBs: USP19, USP4 y UCH-L1. Utilizando varias técnicas de biología molecular y celular se encontró que: i) USP19 es regulada por las ubiquitin ligasas SIAH1 y SIAH2 ii) USP19 es importante para regular HIF-1α, un factor de transcripción clave en la respuesta celular a hipoxia, iii) USP4 interactúa con el proteosoma, iv) La quimera mCherry-UCH-L1 reproduce parcialmente los fenotipos que nuestro grupo ha descrito previamente al usar otros constructos de la misma enzima, y v) UCH-L1 promueve la internalización de la bacteria Yersinia pseudotuberculosis.

Analysis of void volumes in proteins and application to stability of the p53 tumour suppressor protein

We have developed a new method for the analysis of voids in proteins (defined as empty cavities not accessible to solvent). This method combines analysis of individual discrete voids with analysis of packing quality. While these are different aspects of the same effect, they have traditionally been analysed using different approaches. The method has been applied to the calculation of total void volume and maximum void size in a non-redundant set of protein domains and has been used to examine correlations between thermal stability and void size. The tumour-suppressor protein p53 has then been compared with the non-redundant data set to determine whether its low thermal stability results from poor packing. We found that p53 has average packing, but the detrimental effects of some previously unexplained mutations to p53 observed in cancer can be explained by the creation of unusually large voids. (C) 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.