Régulation dépendante du cycle cellulaire de la réparation par excision de nucléotides

La réparation par excision de nucléotides (NER) est une voie critique chez l'homme pour enlever des lésions qui déforment l’hélice d'ADN et qui bloquent à la fois la réplication et la transcription. Parmi ces lésions, il y a les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPDs) et les adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) induient par les rayons ultraviolets. L'importance physiologique de la NER est mise en évidence par l’existence de la maladie Xeroderma pigmentosum (XP), causée par des mutations affectant des gènes impliqués dans cette voie de réparation. Les personnes atteintes sont caractérisées par une photosensibilité extrême et une forte prédisposition à développer des tumeurs cutanées (plus de 1000 fois). Les patients atteints du type variant de la maladie Xeroderma pigmentosum (XPV), apparemment compétents en réparation, portent plutôt des mutations dans le gène codant pour l'ADN polymérase η (polη). Polη est une ADN polymérase translésionnelle capable de contourner avec une grande fidélité certaines lésions telles que les CPDs, qui autrement bloquent les polymérases réplicatives. Ainsi, la polη prévient la formation de mutations et permet la reprise de la synthèse d'ADN. L'objectif principal de cette thèse est d'évaluer le rôle potentiel de voies de signalisation majeures dans la régulation de la NER, dont celles régulées par la kinase ATR (Ataxia Télangiectasia and Rad3-related kinase). Suite à l'irradiation UV, ATR est rapidement activée et phosphoryle des centaines de protéines qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire et joue un rôle notoire dans le maintient de la stabilité génomique. Nous avons postulé qu’ATR puisse réguler la NER de manière dépendante du cycle cellulaire. Cependant, tester cette hypothèse représente un grand défi car, pour des raisons techniques, les méthodes conventionnelles n’ont pas à ce jour été adaptées pour l'évaluation de la cinétique de réparation au cours des différentes phases du cycle cellulaire. Nous avons donc développé une méthode novatrice basée sur la cytométrie en flux permettant de quantifier avec grande précision la cinétique de réparation des 6-4PPs et CPDs dans chacune des phases G0/G1, S et G2/M. Avec cette nouvelle méthode, nous avons pu démontrer que l'inhibition d'ATR ou polη résulte en une très forte inhibition de la NER exclusivement durant la phase S du cycle cellulaire. Ces études ont révélé, pour la première fois, une fonction critique pour ces protéines dans le retrait des lésions qui bloquent la réplication. En outre, nous avons démontré que la synthèse d'ADN est indispensable pour l’inhibition de la réparation en phase-S, reflétant un lien potentiel entre la NER et la réplication. Curieusement, nous avons également montré que parmi six lignées cellulaires tumorales choisies aléatoirement, trois présentent une abrogation totale de la NER uniquement pendant la phase S, ce qui indique que de nombreux cancers humains pourraient être caractérisés par un tel défaut. Nos observations pourraient avoir d'importantes implications pour le traitement du cancer. En effet, le statut de la NER semble constituer un déterminant majeur dans la réponse clinique aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le cisplatine, qui inhibent la croissance des cellules cancéreuses via l'induction de lésions à l’ADN.

Vulnérabilité cardiaque au stress au cours du remodelage ventriculaire pathologique : rôle de la mitochondrie et du pore de perméabilité transitionnelle (PTP)

L’objectif central de cette thèse de Doctorat était d’investiguer les dysfonctions mitochondriales qui surviennent précocement au cours de la phase compensée du remodelage ventriculaire pathologique et qui pourraient jouer un rôle causal dans la progression vers l’insuffisance cardiaque. Nos travaux antérieurs, réalisés à l’aide d’un modèle de surcharge volumique chronique induite par une fistule aorto-cavale (ACF) chez le Rat WKHA, ont montré qu’au cours du remodelage ventriculaire, les mitochondries développaient une vulnérabilité à l’ouverture du pore de perméabilité transitionnelle (PTP : un élément clé de la signalisation de la mort cellulaire) [1]. Ceci était observable au stade compensé du remodelage en absence des dysfonctions mitochondriales majeures typiquement observées dans le cœur insuffisant. Ces résultats nous ont amenés à suggérer que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP pourrait constituer un mécanisme précoce favorisant la progression de la cardiopathie. Dans l’étude 1 de cette thèse, nous avons tenté de tester cette hypothèse en induisant une ACF chez deux souches de rats affichant de très nettes différences au niveau de la propension à développer l’insuffisance cardiaque : les souches WKHA et Sprague Dawley (SD). Nos études in vitro sur organelles isolées et in situ sur l’organe entier ont permis de confirmer que, dans le cœur ACF, les mitochondries développent une vulnérabilité à l’ouverture du PTP et à l’activation de la voie mitochondriale de la mort cellulaire lorsqu’exposées à des stress pertinents à la pathologie (surcharge calcique, ischémie-reperfusion [I-R]). Cependant, bien que comparativement aux animaux WKHA, les animaux SD démontraient un remodelage ventriculaire plus rapide et prononcé et une progression précoce vers l’insuffisance cardiaque, aucune différence n’était observable entre les deux groupes au niveau des dysfonctions mitochondriales, suggérant quelles ne sont pas à l’origine de la progression plus rapide de la pathologie chez la souche SD, à tout le moins en réponse à la surcharge volumique. Nous avons par la suite déterminé, à l’aide des mêmes approches expérimentales, si cette vulnérabilité mitochondriale était observable dans une cardiopathie d’étiologie différente, plus spécifiquement celle qui est associée à la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie génétique causée par une mutation de la protéine dystrophine. Nos études menées (études 2-4) sur de jeunes souris mdx (le modèle murin de la DMD) exemptes de tout signe clinique de cardiopathie n’ont révélé aucune différence au niveau des fonctions mitochondriales de base. Cependant, tout comme dans le modèle d’ACF, les mitochondries dans le cœur de souris mdx étaient significativement plus vulnérables à l’ouverture du PTP lorsque soumises à une I-R (étude 2). Par ailleurs, nous avons démontré que l’administration aiguë de sildénafil aux souris mdx induisait une abolition de l’ouverture du PTP et de ses conséquences signalétiques, une diminution marquée du dommage tissulaire et une meilleure récupération fonctionnelle à la suite de l’I-R (étude 3). Nous avons ensuite testé chez la souris mdx l’administration aiguë de SS31, un peptide anti-oxydant ciblé aux mitochondries, cependant aucun effet protecteur n’a été observé, suggérant que le tamponnement des radicaux libres est d’une utilité limitée si les perturbations de l’homéostasie calcique typiques à cette pathologie ne sont pas traitées simultanément (étude 4). Globalement, les travaux effectués au cours de cette thèse démontrent que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP constitue une dysfonction précoce et commune qui survient au cours de remodelages ventriculaires pathologiques d’étiologies différentes. Par ailleurs, ces travaux suggèrent des stratégies d’intervention pharmacologiques ciblant ce processus, dont l’efficacité pour la prévention de l’insuffisance cardiaque demande à être établie.

Rôle des centrosomes dans la régulation du point de contrôle en G2/M en réponse aux dommages à l'ADN

Les centrosomes sont les centres organisateurs des microtubules et jouent un rôle crucial dans l’organisation du fuseau bipolaire pendant la mitose. Plus récemment, le rôle des centrosomes dans la régulation de l’entrée en mitose a été mis en évidence. Les centrosomes semblent également contribuer à l’activation du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions de l’ADN en servant de point de rencontre pour les régulateurs du cycle cellulaire et les gènes de réponse aux dommages à l’ADN. L’amplification du nombre de centrosomes est une caractéristique des cellules tumorales mais de façon intéressante, elle constitue aussi une réponse des cellules aux dommages à l’ADN. Les mécanismes qui régulent l’homéostasie et la dynamique des centrosomes sont encore mal compris. Pour mieux comprendre le rôle des centrosomes dans la régulation du point de contrôle en G2/M en réponse aux dommages à l’ADN, le recrutement et/ou l’activation au niveau des centrosomes des kinases impliquées dans les voies de signalisation de ce point de contrôle ont été étudiés par immunofluorescence indirecte sur cellules HeLaS3 ou par Western blot sur des fractions enrichies en centrosomes. Nos résultats montrent que les kinases ATM, ATR, CHK1 et CHK2 sont actives dans les centrosomes de cellules en phase G2. En réponse à l’activation du point de contrôle en G2/M, les formes actives de ces kinases diminuent au niveau des centrosomes. Pour identifier de nouveaux acteurs centrosomaux potentiellement impliqués dans la régulation de ce point de contrôle, une analyse comparative des protéomes de centrosomes purifiés a également été réalisée par spectrométrie de masse. Pour étudier plus particulièrement la fonction de CHK2 au niveau des centrosomes, nous avons développer des outils moléculaires qui serviront à déterminer le rôle de la sous population de CHK2 localisée aux centrosomes 1) dans la régulation de l’entrée en mitose au cours d’un cycle normal 2) dans l’activation et la stabilité du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions l’ADN et 3) dans l’homéostasie et la dynamiques des centrosomes en réponse aux dommages à l’ADN. Cette étude permettra de mieux comprendre la fonction des centrosomes dans la réponse cellulaire au stress génotoxiques anti-cancereux et de révéler de nouvelles fonctions potentielles pour la kinase CHK2.

Contenu total en éléments traces de sols forestiers du Québec méridional

Les sols forestiers constituent un réservoir considérable d’éléments nutritifs disponibles pour soutenir la productivité forestière. Ces sols contiennent aussi une quantité, encore inconnue à ce jour, d’éléments traces biodisponibles provenant de sources anthropiques ou naturelles. Or, plusieurs de ces éléments recèlent un potentiel toxique pour les organismes vivants. Ainsi, la quantification de la concentration et du contenu total en éléments traces des sols forestiers s’avère nécessaire afin d’évaluer les impacts des perturbations sur la qualité des sols. Les objectifs de ce projet de recherche sont: 1) de mesurer le contenu total en éléments traces en phase solide (Ag, As, Ba, Cd, Ce, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Rb, Se, Sr, Tl, V, Y, Zn) des divers horizons de sols d’écosystèmes forestiers du Québec méridional; 2) d’établir des liens significatifs entre la fraction soluble dans l’eau des éléments traces et les propriétés des horizons de sols et; 3) d’évaluer le rôle de la proximité d’un centre urbain sur les contenus en éléments traces. Pour répondre à ces objectifs, quatre profils de sols situés dans la région de St-Hippolyte et deux situés dans la région de Montréal furent échantillonnés jusqu'à l'atteinte du matériel parental. Les résultats de ce projet de recherche ont révélé que le contenu total en éléments traces présents dans les profils de sols se retrouve en grande partie dans les fragments grossiers du sol. Il a été démontré que la teneur en carbone organique, les complexes organométalliques et les oxydes de fer et d’aluminium dictent la distribution en profil de la majorité des éléments traces étudiés. Finalement, il fut prouvé que la région de Montréal présente des niveaux de contamination en éléments traces (Ag, As, Ba, Cu, Mn, Pb, Rb, Se, Sr, Tl et Zn) supérieurs à ceux rencontrés dans les Laurentides.

Optimisation du processus de développement du médicament grâce à la modélisation PK et les simulations d’études cliniques

Le développement d’un médicament est non seulement complexe mais les retours sur investissment ne sont pas toujours ceux voulus ou anticipés. Plusieurs médicaments échouent encore en Phase III même avec les progrès technologiques réalisés au niveau de plusieurs aspects du développement du médicament. Ceci se traduit en un nombre décroissant de médicaments qui sont commercialisés. Il faut donc améliorer le processus traditionnel de développement des médicaments afin de faciliter la disponibilité de nouveaux produits aux patients qui en ont besoin. Le but de cette recherche était d’explorer et de proposer des changements au processus de développement du médicament en utilisant les principes de la modélisation avancée et des simulations d’essais cliniques. Dans le premier volet de cette recherche, de nouveaux algorithmes disponibles dans le logiciel ADAPT 5® ont été comparés avec d’autres algorithmes déjà disponibles afin de déterminer leurs avantages et leurs faiblesses. Les deux nouveaux algorithmes vérifiés sont l’itératif à deux étapes (ITS) et le maximum de vraisemblance avec maximisation de l’espérance (MLEM). Les résultats de nos recherche ont démontré que MLEM était supérieur à ITS. La méthode MLEM était comparable à l’algorithme d’estimation conditionnelle de premier ordre (FOCE) disponible dans le logiciel NONMEM® avec moins de problèmes de rétrécissement pour les estimés de variances. Donc, ces nouveaux algorithmes ont été utilisés pour la recherche présentée dans cette thèse. Durant le processus de développement d’un médicament, afin que les paramètres pharmacocinétiques calculés de façon noncompartimentale soient adéquats, il faut que la demi-vie terminale soit bien établie. Des études pharmacocinétiques bien conçues et bien analysées sont essentielles durant le développement des médicaments surtout pour les soumissions de produits génériques et supergénériques (une formulation dont l'ingrédient actif est le même que celui du médicament de marque, mais dont le profil de libération du médicament est différent de celui-ci) car elles sont souvent les seules études essentielles nécessaires afin de décider si un produit peut être commercialisé ou non. Donc, le deuxième volet de la recherche visait à évaluer si les paramètres calculer d’une demi-vie obtenue à partir d'une durée d'échantillonnage réputée trop courte pour un individu pouvaient avoir une incidence sur les conclusions d’une étude de bioéquivalence et s’ils devaient être soustraits d’analyses statistiques. Les résultats ont démontré que les paramètres calculer d’une demi-vie obtenue à partir d'une durée d'échantillonnage réputée trop courte influençaient de façon négative les résultats si ceux-ci étaient maintenus dans l’analyse de variance. Donc, le paramètre de surface sous la courbe à l’infini pour ces sujets devrait être enlevé de l’analyse statistique et des directives à cet effet sont nécessaires a priori. Les études finales de pharmacocinétique nécessaires dans le cadre du développement d’un médicament devraient donc suivre cette recommandation afin que les bonnes décisions soient prises sur un produit. Ces informations ont été utilisées dans le cadre des simulations d’essais cliniques qui ont été réalisées durant la recherche présentée dans cette thèse afin de s’assurer d’obtenir les conclusions les plus probables. Dans le dernier volet de cette thèse, des simulations d’essais cliniques ont amélioré le processus du développement clinique d’un médicament. Les résultats d’une étude clinique pilote pour un supergénérique en voie de développement semblaient très encourageants. Cependant, certaines questions ont été soulevées par rapport aux résultats et il fallait déterminer si le produit test et référence seraient équivalents lors des études finales entreprises à jeun et en mangeant, et ce, après une dose unique et des doses répétées. Des simulations d’essais cliniques ont été entreprises pour résoudre certaines questions soulevées par l’étude pilote et ces simulations suggéraient que la nouvelle formulation ne rencontrerait pas les critères d’équivalence lors des études finales. Ces simulations ont aussi aidé à déterminer quelles modifications à la nouvelle formulation étaient nécessaires afin d’améliorer les chances de rencontrer les critères d’équivalence. Cette recherche a apporté des solutions afin d’améliorer différents aspects du processus du développement d’un médicament. Particulièrement, les simulations d’essais cliniques ont réduit le nombre d’études nécessaires pour le développement du supergénérique, le nombre de sujets exposés inutilement au médicament, et les coûts de développement. Enfin, elles nous ont permis d’établir de nouveaux critères d’exclusion pour des analyses statistiques de bioéquivalence. La recherche présentée dans cette thèse est de suggérer des améliorations au processus du développement d’un médicament en évaluant de nouveaux algorithmes pour des analyses compartimentales, en établissant des critères d’exclusion de paramètres pharmacocinétiques (PK) pour certaines analyses et en démontrant comment les simulations d’essais cliniques sont utiles.

Identification du rôle et des modifications post-traductionnelles modulant l’export nucléaire de l’hélicase virale E1 au cours du cycle de réplication du virus du papillome humain

Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin infectant les épithéliums de la peau et des muqueuses. La réplication nécessaire au maintien de leur génome dans les cellules infectées dépend des protéines virales E1 et E2. Au cours de la réplication, E1 est recrutée à l’origine de réplication par E2 afin d’être assemblée en doubles hexamères capables de dérouler l’ADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de l’activité ATPase/hélicase, un domaine central de liaison à l’origine et une région N-terminale régulant la réplication in vivo. Cette région contient des signaux de localisation et d’export nucléaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a été proposé que ce transport est régulé par la sumoylation de E1. Finalement, la région N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernière régule différemment l’export nucléaire des protéines E1 du VPB et du VPH. Dans la première partie de cette étude, nous avons démontré que bien que la protéine E1 des VPH interagit avec Ubc9, l’enzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie n’est pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons déterminé que l’accumulation nucléaire de E1 est plutôt régulée pas sa phosphorylation. En fait, nous avons démontré que l’export nucléaire de E1 est inhibé par la phosphorylation de sérines conservées de la région N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons établi que l’export nucléaire de E1 n’est pas nécessaire à l’amplification du génome dans les kératinocytes différenciés mais qu’il est requis pour le maintien du génome dans les kératinocytes non différenciés. En particulier, nous avons découvert que l’accumulation nucléaire de E1 inhibe la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifératif est contrecarrée par l’export de E1 au cytoplasme. Dans la troisième partie de cette étude, nous avons démontré que l’arrêt cellulaire induit par E1 dépend de sa liaison à l’ADN et à l’ATP, et qu’il est accompagné par l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN dépendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux événements semblent toutefois distincts puisque la formation d’un complexe E1-E2 réduit l’activation de la voie de réponse aux dommages par E1 sans toutefois prévenir l’arrêt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons démontré que la réplication transitoire de l’ADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrêtées en phase S, indépendamment de l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN et de la kinase ATM. Globalement, nos résultats démontrent que l’export nucléaire de E1 est régulé par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils démontrent également que l’export nucléaire de E1 est essentiel au maintien du génome dans les kératinocytes, possiblement parce qu’il prévient l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN en limitant l’accumulation de E1 au noyau.

Étude du rôle des lymphocytes T chez les receveurs pédiatriques de greffe de sang de cordon ombilical

La transplantation de sang de cordon ombilical (TSCO) est utilisée pour traiter les enfants atteints de maladies hématologiques en l’absence de donneurs apparentés compatibles. Elle est associée avec des risques plus élevés d’échec de greffe et d’infections opportunistes dans les premiers mois qui suivent la transplantation en comparaison avec une greffe de moelle osseuse. Par contre, la TSCO comporte un risque plus faible de maladie du greffon contre l’hôte et une incidence comparable de rechute de leucémie. Ces quatre complications impliquent directement les lymphocytes T. Dans le but de mieux comprendre le schéma particulier des évènements qui suivent la TSCO et d’améliorer le pronostic des patients, nous avons étudié le potentiel fonctionnel, la persistance et la reconstitution antivirale des lymphocytes T au sein d’un groupe d’enfants transplantés de sang de cordon ombilical (SCO). Étant donné que le SCO contient une majorité de lymphocytes T naïfs, nous avons étudié les lymphocytes T spécifiques au HLA-A2:Melan-A26-35 A27L; seul répertoire naïf et abondant caractérisé chez l’homme. Nous avons observé que les lymphocytes T du SCO se différencient en populations effectrices, s’oligoclonalisent, produisent de l’IFN-γ et lysent spécifiquement leur cible suite à la stimulation. Néanmoins, ces cellules produisent moins d’IFN-γ et sont moins bifonctionnelles que leurs homologues issus du sang périphérique d’adultes. Chez les patients, les lymphocytes T du SCO s’épuisent après la TSCO : ils s’oligoclonalisent dramatiquement, sont principalement en différenciation terminale, et une importante fréquence exprime PD-1 (« programmed death-1 ») dans les 3 à 6 premiers mois post-greffe. Très peu de patients sont capables de développer des réponses antivirales durant cette période et la fréquence de lymphocytes T qui expriment PD-1 semble aussi avoir un impact sur le risque subséquent de faire une rechute de leucémie. La deuxième vague de lymphocytes T émergeant à 6 mois post-TSCO mène à une population fonctionnelle et diversifiée. En conclusion, la fonctionnalité des lymphocytes T présents dans les 3 à 6 premiers mois post-TSCO doit être rétablie pour améliorer les risques d’infections opportunistes et de rechute de leucémie.

Étude des mécanismes moléculaires influençant la variation de phase des adhésines P, F1651 et CS31A présentes chez des souches d'Escherichia coli pathogènes.

F1651, les pili Pap et l’antigène CS31A associé aux antigènes de surface K88 sont tout trois des membres de la famille de type P des facteurs d’adhérence jouant un rôle prépondérant lors de l’établissement d’une maladie causée par des souches Escherichia coli pathogènes, en particulier des souches d’E. coli pathogènes extra-intestinales (ExPEC, Extra-intestinal pathogenic E. coli). Leur expression est sous le contrôle d’un mécanisme de régulation transcriptionnel dépendant de l’état de méthylation de l’ADN, résultant dans l’existence de deux populations définies, l’une exprimant l’adhésine (population ON) et l’autre ne l’exprimant pas (population OFF). Malgré de fortes identités de séquences, ces trois systèmes diffèrent l’un de l’autre, principalement par le pourcentage de cellules ON rencontrées. Ainsi, quand CS31A est systématiquement orienté vers un état considéré comme OFF, F1651 présente une phase ON particulièrement élevée et Pap montre deux états OFF et ON bien distincts, selon le phénotype de départ. La protéine régulatrice sensible à la leucine (Lrp, Leucine-responsive regulatory protein) joue un rôle essentiel dans la réversibilité de ce phénomène épigénétique et il est supposé que les différences de séquences au niveau de la région régulatrice modifient la localisation à ces sites de fixation de Lrp; ce qui résulte, en final, aux différences de phase existant entre CS31A, F1651 et Pap.À l’aide de divers techniques parmi lesquelles l’utilisation de gènes rapporteurs, mutagénèses dirigées et d’analyse des interactions ADN-protéines in vitro, nous montrons dans ce présent projet que la phase OFF prédominante chez CS31A est principalement due à une faible interaction de Lrp avec la région distale de l’opéron clp, et que la présence d’un homologue du régulateur local PapI joue un rôle également clef dans la production de CS31A. Dans le cas de F1651, nous montrons dans cette étude que le taux élevé de cellules en phase ON est dû à une altération dans le maintien de Lrp sur les sites répresseurs 1-3. Ceci est dû à la présence de deux nucléotides spécifiques, situé de part et d’autre du site répresseur 1, qui défavorisent la fixation de Lrp sur ce site précis. Tout comme dans le cas de CS31A, la formation d’un complexe, activateur ou répresseur de la phase ON, dépend également de l’action de du régulatuer local FooI, qui favorise alors le déplacement de Lrp des sites répresseurs 1-3 vers les sites activateurs 4-6.

Citoyenneté, identité et mobilisation communautaire autour du VIH dans une organisation de travailleuses du sexe au Karnataka, en Inde

Ce mémoire interroge les possibilités présentes et futures d’actions concertées pour remettre en question les structures sociales d’exclusion qui affectent des groupes désignés à risque, entre autres en les rendant plus vulnérables à l’infection au VIH. En Inde, l’attention grandissante portée aux travailleuse(r)s du sexe (TS) par la santé publique dans les interventions contre le VIH contribue à façonner l’identité des groupes ciblés en les associant à l’épidémie du VIH et à sa prévention. L’acceptation et la réorganisation de cette catégorie servent de base d’organisation d’efforts collectifs pour un groupe de TS de Mysore, dans l’état du Karnataka. Les membres de ce collectif, nommé Ashodaya, déploient des actions concertées pour remettre en question les limites de catégories qui leur sont assignées (avec des tentatives pour désamorcer certaines dynamiques d’exclusion sociale -en limitant la stigmatisation), et s’imposer comme un groupe de citoyennes à part entière en s’incluant dans des sphères civiles comme citoyens, comme représentants d’une occupation et non comme individus marginalisés ou « représentants » d’une maladie. L’inclusion d’Ashodaya dans les efforts de prévention du VIH offre un accès à des ressources humaines et matérielles qui lui seraient autrement inaccessibles, mais limitent les possibilités d’actions du groupe en restreignant sa participation à la prévention. Le contexte particulier de l’engagement et du programme d’Avahan, branche indienne de la Bill and Melinda Gates souligne la fragilité des acquis de groupes comme Ashodaya.

Les Déterminants Génétiques de la Pharmacocinétique du Busulfan et les Résultats de la Transplantation

Le busulfan (Bu) est un composé clé de la phase de conditionnement chez les enfants subissant une transplantation des cellules souches hématopoïétiques (TCSH). Les différences inter-individuelles de la pharmacocinétique (PK) du Bu pourraient affecter son efficacité et sa toxicité. Le Bu est principalement métabolisé par la glutathion-S-transférase (GST). Nous avons étudié la relation des génotypes GSTA1, GSTM1 et GSTP1 avec la PK de la première dose de Bu et la relation avec les résultats de la TCSH chez 69 enfants recevant un régime de conditionnement myéloablatif. Le génotype GSTM1 nul a corrélé avec une exposition élevée du Bu et une faible clairance (CL) chez les patients âgés de 4 ans (p ≤ 0,04). Dans le respect du rôle fonctionnel suggéré d’haplotype GSTA1 *A2, il a été associé à des niveaux plus faibles de médicaments et des niveaux élevés de CL (p ≤ 0,03). L’effet Gène-dose a également été observé (p = ≤ 0,007). L’haplotype de GSTA1 était associé avec les résultats de la TCSH. Les porteurs de deux copies d’haplotype *A2 avaient une meilleure survie sans événement (p = 0,03). En revanche, les individus homozygotes pour haplotypes * B et *B1 ont un risque plus élevé d’atteindre la maladie veino-occlusive (MVO) (p = 0,009). Les individus porteurs de GSTM1 nul âgés de 4 ans possèdent un risque plus fréquent d’avoir la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) (p = 0,03). En conclusion, nous avons montré que les variantes génétiques de GST influencent la PK du BU et les résultats de la TCSH chez les enfants. Pour l'ajustement de la posologie, un modèle avec l'inclusion des facteurs génétiques et non génétiques devrait être évalué et validé dans une étude prospective.

Étude du suivi conjoint par un médecin spécialiste chez les adultes avec maladies chroniques suivis en première ligne

Contexte : Les médecins spécialistes peuvent participer aux soins ambulatoires des personnes atteintes de maladies chroniques (MCs) et comorbidité comme co-gestionnaire ou consultant selon qu’ils sont responsables ou non du suivi du patient. Il y a un manque d’évidences sur les déterminants et l’impact du type d’implication du médecin spécialiste, ainsi que sur la façon optimale de mesurer la comorbidité pour recueillir ces évidences. Objectifs : 1) déterminer chez les patients atteints de MCs les facteurs associés à la cogestion en spécialité, dont les caractéristiques des organisations de première ligne et la comorbidité; 2) évaluer si le type d’implication du spécialiste influence le recours à l’urgence; 3) identifier et critiquer les méthodes de sélection d’un indice de comorbidité pour la recherche sur l’implication des spécialistes dans le suivi des patients. Méthodologie : 709 adultes (65 +/- 11 ans) atteints de diabète, d’arthrite, de maladie pulmonaire obstructive chronique ou d’insuffisance cardiaque furent recrutés dans 33 cliniques de première ligne. Des enquêtes standardisées ont permis de mesurer les caractéristiques des patients (sociodémographiques, comorbidité et qualité de vie) et des cliniques (modèle, ressources). L’utilisation des services de spécialistes et de l’urgence fut mesurée avec une base de données médico-administratives. Des régressions logistiques multivariées furent utilisées pour modéliser les variables associées à la cogestion et comparer le recours à l’urgence selon le type d’implication du spécialiste. Une revue systématique des études sur l’utilisation des services de spécialistes, ainsi que des revues sur les indices de comorbidité fut réalisée pour identifier les méthodes de sélection d’un indice de comorbidité utilisées et recommandées. Résultats : Le tiers des sujets a utilisé les services de spécialistes, dont 62% pour de la cogestion. La cogestion était associée avec une augmentation de la gravité de la maladie, du niveau d’éducation et du revenu. La cogestion diminuait avec l’âge et la réception de soins dans les cliniques avec infirmière ayant un rôle innovateur. Le recours à l’urgence n’était pas influencé par l’implication du spécialiste, en tant que co-gestionnaire (OR ajusté = 1.06, 95%CI = 0.61-1.85) ou consultant (OR ajusté = 0.97, 95%CI = 0.63-1.50). Le nombre de comorbidités n’était pas associé avec la cogestion, ni l’impact du spécialiste sur le recours à l’urgence. Les revues systématiques ont révélé qu’il n’y avait pas standardisation des procédures recommandées pour sélectionner un indice de comorbidité, mais que 10 critères concernant principalement la justesse et l’applicabilité des instruments de mesure pouvaient être utilisés. Les études sur l’utilisation des services de spécialistes utilisent majoritairement l’indice de Charlson, mais n’en expliquent pas les raisons. Conclusion : L’implication du spécialiste dans le suivi des patients atteints de MCs et de comorbidité pourrait se faire essentiellement à titre de consultant plutôt que de co-gestionnaire. Les organisations avec infirmières ayant un rôle innovateur pourraient réduire le besoin pour la cogestion en spécialité. Une méthode structurée, basée sur des critères standardisés devrait être utilisée pour sélectionner l’indice de comorbidité le plus approprié en recherche sur les services de spécialistes. Les indices incluant la gravité des comorbidités seraient les plus pertinents à utiliser.

Carboxydothermus hydrogenoformans comme catalyseur biologique pour la conversion du monoxyde de carbone en hydrogène simultanément a la minéralisation de calcium et phosphate

La gazéification est aujourd'hui l'une des stratégies les plus prometteuses pour valoriser les déchets en énergie. Cette technologie thermo-chimique permet une réduction de 95 % de la masse des intrants et génère des cendres inertes ainsi que du gaz de synthèse (syngaz). Le syngaz est un combustible gazeux composé principalement de monoxyde de carbone (CO), d'hydrogène (H2) et de dioxyde de carbone (CO2). Le syngaz peut être utilisé pour produire de la chaleur et de l'électricité. Il est également la pierre angulaire d'un grand nombre de produits à haute valeur ajoutée, allant de l'éthanol à l'ammoniac et l'hydrogène pur. Les applications en aval de la production de syngaz sont dictées par son pouvoir calorifique, lui-même dépendant de la teneur du gaz en H2. L’augmentation du contenu du syngaz en H2 est rendu possible par la conversion catalytique à la vapeur d’eau, largement répandu dans le cadre du reformage du méthane pour la production d'hydrogène. Au cours de cette réaction, le CO est converti en H2 et CO2 selon : CO + H2O → CO2 + H2. Ce processus est possible grâce à des catalyseurs métalliques mis en contact avec le CO et de la vapeur. La conversion catalytique à la vapeur d’eau a jusqu'ici été réservé pour de grandes installations industrielles car elle nécessite un capital et des charges d’exploitations très importantes. Par conséquent, les installations de plus petite échelle et traitant des intrants de faible qualité (biomasse, déchets, boues ...), n'ont pas accès à cette technologie. Ainsi, la seule utilisation de leur syngaz à faible pouvoir calorifique, est limitée à la génération de chaleur ou, tout au plus, d'électricité. Afin de permettre à ces installations une gamme d’application plus vaste de leurs syngaz, une alternative économique à base de catalyseur biologique est proposée par l’utilisation de bactéries hyperthermophiles hydrogénogènes. L'objectif de cette thèse est d'utiliser Carboxydothermus hydrogenoformans, une bactérie thermophile carboxydotrophe hydrogénogène comme catalyseur biologique pour la conversion du monoxyde de carbone en hydrogène. Pour cela, l’impact d'un phénomène de biominéralisation sur la production d’H2 a été étudié. Ensuite, la faisabilité et les limites de l’utilisation de la souche dans un bioréacteur ont été évaluées. Tout d'abord, la caractérisation de la phase inorganique prédominante lorsque C. hydrogenoformans est inoculé dans le milieu DSMZ, a révélé une biominéralisation de phosphate de calcium (CaP) cristallin en deux phases. L’analyse par diffraction des rayons X et spectrométrie infrarouge à transformée de Fourier de ce matériau biphasique indique une signature caractéristique de la Mg-whitlockite, alors que les images obtenues par microscopie électronique à transmission ont montré l'existence de nanotiges cristallines s’apparentant à de l’hydroxyapatite. Dans les deux cas, le mode de biominéralisation semble être biologiquement induit plutôt que contrôlé. L'impact du précipité de CaP endogène sur le transfert de masse du CO et la production d’H2 a ensuite été étudié. Les résultats ont été comparés aux valeurs obtenues dans un milieu où aucune précipitation n'est observée. Dans le milieu DSMZ, le KLa apparent (0.22 ± 0.005 min-1) et le rendement de production d’H2 (89.11 ± 6.69 %) étaient plus élevés que ceux obtenus avec le milieu modifié (0.19 ± 0.015 min-1 et 82.60 ± 3.62% respectivement). La présence du précipité n'a eu aucune incidence sur l'activité microbienne. En somme, le précipité de CaP offre une nouvelle stratégie pour améliorer les performances de transfert de masse du CO en utilisant les propriétés hydrophobes de gaz. En second lieu, la conversion du CO en H2 par la souche Carboxydothermus hydrogenoformans fut étudiée et optimisée dans un réacteur gazosiphon de 35 L. Parmi toutes les conditions opérationnelles, le paramètre majeur fut le ratio du débit de recirculation du gaz sur le débit d'alimentation en CO (QR:Qin). Ce ratio impacte à la fois l'activité biologique et le taux de transfert de masse gaz-liquide. En effet, au dessus d’un ratio de 40, les performances de conversion du CO en H2 sont limitées par l’activité biologique alors qu’en dessous, elles sont limitées par le transfert de masse. Cela se concrétise par une efficacité de conversion maximale de 90.4 ± 0.3 % et une activité spécifique de 2.7 ± 0.4 molCO·g–1VSS·d–1. Malgré des résultats prometteurs, les performances du bioréacteur ont été limitées par une faible densité cellulaire, typique de la croissance planctonique de C. hydrogenoformans. Cette limite est le facteur le plus contraignant pour des taux de charge de CO plus élevés. Ces performances ont été comparées à celles obtenues dans un réacteur à fibres creuses (BRFC) inoculé par la souche. En dépit d’une densité cellulaire et d’une activité volumétrique plus élevées, les performances du BRFC à tout le moins cinétiquement limitées quand elles n’étaient pas impactées par le transfert de masse, l'encrassement et le vieillissement de la membrane. Afin de parer à la dégénérescence de C. hydrogenoformans en cas de pénurie de CO, la croissance de la bactérie sur pyruvate en tant que seule source de carbone a été également caractérisée. Fait intéressant, en présence simultanée de pyruvate et de CO, C. hydrogenoformans n’a amorcé la consommation de pyruvate qu’une fois le CO épuisé. Cela a été attribué à un mécanisme d'inhibition du métabolisme du pyruvate par le CO, faisant ainsi du pyruvate le candidat idéal pour un système in situ de secours.

Régulation de l'hepcidine et le rôle de la lipocaline 2 dans l'homéostasie du fer / Novel insights into the regulation of hepcidin and the role of lipocalin 2 in iron homeostasis

Le fer, un métal de transition, est requis pour la survie de presque tout les organismes vivant à cause de son habilité à accepter ou donner un électron et donc à catalyser plusieurs réactions biochimique fondamentales. Cependant, la même propriété permet aussi au fer ionique d’accélérer la formation de radicaux libres et donc le fer peut potentiellement avoir des effets néfastes. Conséquemment, l’homéostasie du fer doit être étroitement régulé, tant au niveau cellulaire que systémique. Notre étude met l’emphase sur deux molécules importante pour régulation du métabolisme du fer : la lipocaline 2 (Lcn2) et l’hepcidine. Lcn2, une protéine de phase aiguë, est impliquée dans le transport du fer par les sidérophores. Lcn2 est un candidat potentiel comme transporteur du fer qui pourrait être responsable de l’accumulation excessive du fer non lié à la transferrine dans le foie des patients atteints d’hémochromatose héréditaire (HH). Nous avons généré des souris double-déficiente HfeLcn2 pour évaluer l’importance de Lcn2 dans la pathogenèse de surcharge en fer hépatique dans les souris knock-out Hfe (Hfe -/-). Notre étude révèle que la délétion de Lcn2 dans les souris Hfe-/- n’influence pas leur accumulation de fer hépatique ou leur réponse à une surcharge en fer. Le phénotype des souries HfeLcn2-/- demeure indiscernable de celui des souris Hfe-/-. Nos données impliquent que Lcn2 n’est pas essentiel pour la livraison du fer aux hépatocytes dans l’HH. L’hepcidine, un régulateur clé du métabolisme du fer, est un petit peptide antimicrobien produit par le foie et qui régule l’absorption intestinale du fer et son recyclage par les macrophages. L’expression de l’hepcidine est induite par la surcharge en fer et l’inflammation, tandis que, à l'inverse, elle est inhibée par l'anémie et l'hypoxie. Dans certaine situations pathologique, l’hepcidine est régulée dans des directions opposées par plus d’un régulateur. Nous avons, en outre, analysé comment les différents facteurs influencent l’expression de l’hepcidine in vivo en utilisant un modèle de souris avec un métabolisme du fer altéré. Nous avons examiné la régulation de l’hepcidine en présence de stimuli opposés, ainsi que la contribution des médiateurs et des voix de signalisation en aval de l’expression de l’hepcidine. Nous avons démontré que l'érythropoïèse, lorsque stimulé par l’érythropoïétine, mais pas par l’hypoxie, diminue l’expression de l’hepcidine d’une façon dépendante de la dose, même en présence de lipopolysaccharides ou de surcharge de fer alimentaire, qui peuvent agir de manière additive. De plus, l’entraînement érythropoïétique inhibe tant la voix inflammatoire que celle de détection du fer, du moins en partie, par la suppression du signal IL-6/STAT3 et BMP/SMAD4 in vivo. Au total, nos données suggèrent que le niveau d’expression de l’hepcidine en présence de signaux opposés est déterminé par la force du stimulus individuel plutôt que par une hiérarchie absolue. Ces découvertes sont pertinentes pour le traitement de l’anémie des maladies chronique et les désordres de surcharge en fer.

Effets des diètes de remplacement du maïs sur les performances de croissance, le pH ruminal et les paramètres biochimiques sanguins chez les veaux de grains

L’objectif de cette étude a été d’évaluer l’effet du remplacement total ou partiel du maïs d’une ration alimentaire standard (MS) sur les performances de croissance, le pH ruminal et les paramètres biochimiques sanguins chez les veaux de grain de race Holstein. Quatre groupes de 80 veaux ont été répartisen32 parcs (10 veaux/parc) et ont été assignés au hasard à quatre rations alimentaires. Les rations alimentaires ont été: la ration standard qui est constituée de maïs et un supplément protéique à 43,6% de protéine brute (MS);une ration réduite de maïs, avec tourteau de canola et de drèche de distillerie de maïs avec soluble (MCD); une ration réduite de maïs, avec supplément protéique à 43,6% de protéine brute et de drèche de distillerie de maïs avec soluble (MSD); et finalement une ration d’orge roulé, de tourteau de canola et de drèche de distillerie de maïs avec soluble (OCD). Les rations alimentaires ont été formulées selon une phase de démarrage P1 (j0 à j54), une de croissance P2 (j55 à j85) et une de finition P3 (j86 à j96). Un groupe additionnel de 5 veaux contrôle (CT), a reçu une ration alimentaire non acidogène à base de fourrage et de concentré. Notons qu’avant le début des traitements alimentaires au j0, sauf CT, les veaux ont reçu une ration d’adaptation contenant du maïs et de l’orge (50-50) et un supplément protéique pendant 20j. Les gains moyens quotidiens (GMQ) ont été similaires aux périodes P1 (0j-j27, j28-j54) et P2 (j55-j85), mais à la période P3 (j86-j96), le GMQ de la ration OCD a été plus grand que ceux dans les autres rations (p<0.001). Le rendement carcasse des veaux abattus au poids vifs d’environ 267 kg, de la ration OCD a été plus petit que ceux des rations MS et MSD (p<0.002). La matière sèche ingérée (MSI) a diminué pour le groupe MSD au j96, comparée à celles des groupes MS et BCD (p<0.001). Cependant, les rations alimentaires n’ont pas eu d’effet sur le poids vif des veaux. Les durées moyennes en dessous du pH ruminal de 5.6 (DpH5.6 en h.j.-1) du j68 au j85 (P2) ont été similaires pour les groupes CT et OCD (p=0.09) et plus petites (p<0.001) que celles des groupes du MS, MCD et MSD. Pendant la phase P3, les DpH5.6 des groupes de MS, MCD et MSD, ont été similaires (p>0.83), mais plus grandes que celle du groupe de OCD (p<0.0001). Les DpH5.6 n’ont pas eu d’effet sur les GMQ. Aux j68 et j96, les rations alimentaires n’ont pas eu d’effet sur la L-lactate (p > 0.05), le pH sanguin (p > 0.001; non significatif après l’ajustement de Bonferroni :NSAB) et le trou anionique (p > 0.009; NSAB). La PCO2 des animaux du groupe MS a été plus grande que celle du groupe CT (p = 0.0003). Au j68, HCO3 - du groupe CT a été plus grande que celle du groupe MCD (p = 0.0008). Les traitements alimentaires n’ont pas d’effets sur la lipopolysaccharide binding protein (LBP) aux j0 et j68. Au j96, la LBP du groupe CT a été plus petite que celle du groupe MS et MCD (p=0.001). Les diètes n’ont pas d’effets significatifs sur les épithéliums et les lamina propria du rumen (p0>0.37), ainsi que sur les abcès du foie (p=0.80). Le remplacement total du maïs par l’orge roulé, la drêche de distillerie de maïs avec soluble et le tourteau de canola amélioré le GMQ en phase de finition, a amélioré le pH du rumen, le rapprochant du pH ruminal physiologique, n’a pas modifié les paramètres biochimiques sanguins qui ont été mesurés et a diminué le rendement carcasse moyen de 1,1%.

Évaluation du rôle du récepteur CD36 comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la maladie cardiaque ischémique

La maladie cardiaque ischémique, la plus commune des maladies qui affectent le cœur, est encore aujourd’hui une importante cause de décès dans les pays industrialisés. Une réponse cardio-métabolique inflammatoire à un changement aigu initié par une modification du métabolisme énergétique du cœur ischémique est accentuée après que l’apport en oxygène ait été rétabli. Parmi les altérations délétères dans le myocarde qui en résultent, sont inclus l’accumulation d’acides gras non estérifiés (AGNE) ainsi que leur oxydation au détriment de l’utilisation du glucose, ce qui amplifie la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les tissus en périphérie du cœur tel que le tissu adipeux peuvent affecter l’étendue des blessures au myocarde par la relâche en circulation de substances bioactives comme les AGNE et l’adiponectine. Le CD36 est le principal facilitateur de l’entrée d’AGNE dans le cœur et les adipocytes et constitue une importante cible métabolique spécialement lors d’un stress d’ischémie-reperfusion (I/R). Il a été rapporté précédemment par notre groupe qu’un ligand synthétique et sélectif envers le CD36 exerce un effet protecteur puissant sur le système vasculaire. Cependant, aucune étude in vivo n’a rapporté d’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs envers le CD36. Ainsi, ce projet visait à évaluer le rôle et possiblement l’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs du récepteur CD36 sur la blessure au myocarde en I/R. Des souris CD36+/+ et CD36-/- ont été traitées quotidiennement avec le EP 80317, le CP-3(iv) ou le véhicule pendant 14 jours avant de subir la ligature temporaire de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (LAD). Notre première étude a montré que le EP 80317 exerce un effet cardioprotecteur puissant tel que montré par la réduction de la surface des lésions et l’amélioration de la fonction cardiaque in vivo suivant la blessure au myocarde en I/R. De plus, le EP 80317 a réduit l’internalisation totale d’AGNE dans le myocarde, mesurée in vivo par l’imagerie métabolique cardiaque, en accord avec la diminution du niveau circulant d’AGNE. Une réduction de la lipolyse révélée par une perfusion de radiotraceur de palmitate et une augmentation du niveau d’expression de gènes adipogéniques et anti-lipolytiques appuient davantage l’effet du EP 80317 dans la prévention de la mobilisation délétère d’acides gras du tissu adipeux. Notre deuxième étude a investigué le mécanisme cardioprotecteur d’une nouvelle génération de ligands dotés d’une plus grande affinité de liaison envers le CD36. Cette étude a montré que le CP-3(iv) est aussi pourvu d’un puissant effet cardioprotecteur comme le montre la réduction de la taille de l’infarctus et l’amélioration de la fonction cardiaque post-I/R du myocarde qui est fonction d’une signalisation métabolique et anti-oxydante de l’adiponectine. En effet, l’augmentation des principales voies de signalisation régulant la sécrétion de l’adiponectine et des gènes antioxydants a été démontrée dans le tissu adipeux suivant l’I/R du myocarde et un traitement avec le CP-3(iv). L’activation de la protéine kinase B ou Akt dans le myocarde avec la diminution de la génération de ROS et de la signalisation de mort cellulaire appuient davantage le rôle cardioprotecteur du CP-3(iv) dans l’I/R du myocarde. En conclusion, le travail présenté dans cette thèse soutient qu’une signalisation du CD36 par le EP 80317 et le CP-3(iv) pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement de la maladie cardiaque ischémique. Ces ligands synthétiques sélectifs envers le CD36 provoquent un effet salutaire sur le myocarde ischémique par le biais d’une amélioration du profil métabolique dans les premières heures de la reperfusion. Le EP 80317 réduit le niveau délétère d’AGNE et leur internalisation dans le cœur en situation d’excès, tandis que le CP-3(iv) augmente le niveau bénéfique d’adiponectine et son effet cardioprotecteur.