Long-term in vivo expression of the human glucocerebrosidase gene in nonhuman primates after CD34+ hematopoietic cell transduction with cell-free retroviral vector preparations.

Successful gene transfer into stem cells would provide a potentially useful therapeutic modality for treatment of inherited and acquired disorders affecting hematopoietic tissues. Coculture of primate bone marrow cells with retroviral producer cells, autologous stroma, or an engineered stromal cell line expressing human stem cell factor has resulted in a low efficiency of gene transfer as reflected by the presence of 0.1-5% of genetically modified cells in the blood of reconstituted animals. Our experiments in a nonhuman primate model were designed to explore various transduction protocols that did not involve coculture in an effort to define clinically useful conditions and to enhance transduction efficiency of repopulating cells. We report the presence of genetically modified cells at levels ranging from 0.1% (granulocytes) to 14% (B lymphocytes) more than 1 year following reconstitution of myeloablated animals with CD34+ immunoselected cells transduced in suspension culture with cytokines for 4 days with a retrovirus containing the glucocerebrosidase gene. A period of prestimulation for 7 days in the presence of autologous stroma separated from the CD34+ cells by a porous membrane did not appear to enhance transduction efficiency. Infusion of transduced CD34+ cells into animals without myeloablation resulted in only transient appearance of genetically modified cells in peripheral blood. Our results document that retroviral transduction of primate repopulating cells can be achieved without coculture with stroma or producer cells and that the proportion of genetically modified cells may be highest in the B-lymphoid lineage under the given transduction conditions.

Distinct neural correlates of visual long-term memory for spatial location and object identity: a positron emission tomography study in humans.

The purpose of the present study was to investigate by using positron emission tomography (PET) whether the cortical pathways that are involved in visual perception of spatial location and object identity are also differentially implicated in retrieval of these types of information from episodic long-term memory. Subjects studied a set of displays consisting of three unique representational line drawings arranged in different spatial configurations. Later, while undergoing PET scanning, subjects' memory for spatial location and identity of the objects in the displays was tested and compared to a perceptual baseline task involving the same displays. In comparison to the baseline task, each of the memory tasks activated both the dorsal and the ventral pathways in the right hemisphere but not to an equal extent. There was also activation of the right prefrontal cortex. When PET scans of the memory tasks were compared to each other, areas of activation were very circumscribed and restricted to the right hemisphere: For retrieval of object identity, the area was in the inferior temporal cortex in the region of the fusiform gyrus (area 37), whereas for retrieval of spatial location, it was in the inferior parietal lobule in the region of the supramarginal gyrus (area 40). Thus, our study shows that distinct neural pathways are activated during retrieval of information about spatial location and object identity from long-term memory.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Estudos sobre a organização genômica, evolução e expressão de microRNAs

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores de proteínas presentes na maioria dos eucariotos. Esses RNAs regulam a expressão gênica em nível pós-transcricional através do silenciamento de mRNAs-alvo que possuem sítios complementares às suas sequências, atuando em praticamente todos os processos celulares. Embora a estrutura e função dos miRNAs estejam bem caracterizadas, aspectos relacionados à sua organização genômica, evolução e atuação em doenças são tópicos que apresentam enormes lacunas. Nesta tese, utilizamos abordagens computacionais para investigar estes temas em três trabalhos. No primeiro, processamos e integramos um vasto volume de dados publicamente disponíveis referentes aos miRNAs e genes codificadores de proteínas para cinco espécies de vertebrados. Com isso, construimos uma ferramenta web que permite a fácil inspeção da organização genômica dos miRNAs em regiões inter e intragênicas, o acesso a dados de expressão de miRNAs e de genes codificadores de proteínas (classificados em genes hospedeiros e não hospedeiros de miRNAs), além de outras informações pertinentes. Verificamos que a ferramenta tem sido amplamente utilizada pela comunidade científica e acreditamos que ela possa facilitar a geração de hipóteses associadas à regulação dos miRNAs, principalmente quando estão inseridos em genes hospedeiros. No segundo estudo, buscamos compreender como o contexto genômico e a origem evolutiva dos genes hospedeiros influenciam a expressão e evolução dos miRNAs humanos. Nossos achados mostraram que os miRNAs intragênicos surgem preferencialmente em genes antigos (origem anterior à divergência de vertebrados). Observamos que os miRNAs inseridos em genes antigos têm maior abrangência de expressão do que os inseridos em genes novos. Surpreendentemente, miRNAs jovens localizados em genes antigos são expressos em um maior número de tecidos do que os intergênicos de mesma idade, sugerindo uma vantagem adaptativa inicial que pode estar relacionada com o controle da expressão dos genes hospedeiros, e como consequência, expondo-os a contextos celulares e conjuntos de alvos diversos. Na evolução a longo prazo, vimos que genes antigos conferem maior restrição nos padrões de expressão (menor divergência de expressão) para miRNAs intragênicos, quando comparados aos intergênicos. Também mostramos possíveis associações funcionais relacionadas ao contexto genômico, tais como o enriquecimento da expressão de miRNAs intergênicos em testículo e dos intragênicos em tecidos neurais. Propomos que o contexto genômico e a idade dos genes hospedeiros são fatores-chave para a evolução e expressão dos miRNAs. Por fim, buscamos estabelecer associações entre a expressão diferencial de miRNAs e a quimioresistência em câncer colorretal utilizando linhagens celulares sensíveis e resistentes às drogas 5-Fluoruracil e Oxaliplatina. Dentre os miRNAs identificados, o miR-342 apresentou níveis elevados de expressão nas linhagens sensíveis à Oxaliplatina. Com base na análise dos alvos preditos, detectamos uma significativa associação de miR-342 com a apoptose. A superexpressão de miR-342 na linhagem resistente SW620 evidenciou alterações na expressão de genes da via apoptótica, notavelmente a diminuição da expressão do fator de crescimento PDGFB, um alvo predito possivelmente sujeito à regulação direta pelo miR-342.

Estudo e desenvolvimento de lipossomas com potencial para aplicação em base cosmética

A acne vulgar é uma das doenças cutâneas mais comuns, apresentando como um de seus fatores fisiopatológicos primários a colonização pelo microrganismo Propionibacterium acnes. Atualmente, têm-se buscado terapias alternativas para o combate ao P. acnes, destacando-se alguns ácidos graxos, como o ácido laúrico (LA). O LA é uma molécula pouco solúvel em água, sendo possível sua incorporação em lipossomas. Os lipossomas apresentam capacidade de encapsulação/ liberação de ativos e impedem a desidratação da pele, tornando-se ingredientes inovadores na área de cosméticos. Foram preparados lipossomas de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) contendo diferentes concentrações de LA, que variaram de 0 a 50% da concentração total em mol, em quatro pHs: 9,0, 7,4, 5,0 e 3,0. Nestes pHs o estado de protonação do LA muda variando de 0 a -1. Os lipossomas foram extrusados por filtros com poros de 100 nm de diâmetro visando à obtenção de vesículas unilamelares grandes (LUV). As LUV foram caracterizadas quanto a sua estabilidade em condições de prateleira, temperatura de transição de fase da bicamada, encapsulamento no interior aquoso, liberação do LA, difusão das vesículas na pele e seus aspectos morfológicos foram caracterizados por espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) e crio-microscopia eletrônica de transmissão. Estudos de estabilidade mostraram que independentemente da concentração de LA, as formulações são mais estáveis em pHs mais altos, quando LA está em sua maioria na forma de laurato. Os experimentos de DSC revelaram que em pHs 3,0 e 5,0 e concentrações maiores de LA, a interação deste ácido graxo com as bicamadas é favorecida, havendo um aumento da temperatura de transição de fase (Tm) e diminuição da cooperatividade. Análises de taxa de incorporação de sondas hidrofílicas confirmaram a presença de um compartimento aquoso interno para as vesículas de DPPC:LA. O LA conseguiu permear a pele no período avaliado e pouco LA foi liberado das vesículas em condições de temperatura ambiente. A morfologia das LUV se mostrou bem diferente da esperada e se observaram vesículas com mais de uma bicamada e outros formatos que não o esférico. Estes resultados podem auxiliar na otimização das condições para uma formulação que poderá ser usada no tratamento da acne, aumentando a eficácia do LA no sítio alvo.

Desenvolvimento de materiais nanoestruturados à base de SiO2-Nb2O5 preparados por uma nova rota sol-gel com aplicações em fotônica

Este trabalho concentra-se na preparação e caracterizações estrutural e espectroscópica de materiais nanoestruturados à base de SiO2-Nb2O5 dopados e codopados com íons Er3+, Yb3+ e Eu3+ na forma de pós e guias de onda planares. Os nanocompósitos foram preparados através de uma nova rota sol-gel utilizando óxido de nióbio como precursor em substituição ao alcóxido de nióbio. A correlação estrutura propriedades luminescentes foi estudada por difração de raios X, microscopia eletrônica de transmissão, espectroscopia vibracional de absorção no infravermelho, espectroscopia vibracional de espalhamento Raman, análise térmica, reflectância difusa e especular, espectroscopia de fotoluminescência e acoplamento M-line. Inicialmente foi avaliado a influência da concentração de nióbio nas propriedades estruturais e luminescentes de nanocompósitos (100-x)Si-xNb dopados e codopados com íons Er3+, Yb3+ e Eu3+ tratados termicamente a 900 °C por 3h. A cristalização do Nb2O5 foi dependente da concentração de Nb na matriz, com a distribuição dos íons lantanídeos preferencialmente no Nb2O5, afetando as propriedades luminescentes. Para os nanocompósitos codopados com íons Er3+ e Yb3+ foram obtidos valores de largura de banda a meia altura (FWHM) da ordem de 70 nm na região de 1550 nm e tempos de vida de até 5,2 ms. A emissão na região do visível, decorrente de processos de conversão ascendente, revelou-se dependente da concentração de nióbio. Foi verificada emissão preferencial na região do verde para menores concentrações de Nb. Enquanto que, para as maiores concentrações, processos de relaxação cruzada levaram a um aumento relativo na intensidade de emissão na região do vermelho. A eficiência quântica de emissão dos nanocompósitos (100-x)Si-xNb dopados com Eu3+ variou com o comprimento de onda de excitação, refletindo os diferentes sítios de simetria ocupados por este íons nesta estrutura complexa. A influência da temperatura de tratamento térmico no processo de cristalização do Nb2O5 em nanocompósitos 70Si:30Nb codopados com íons Er3+ e Yb3+ foi avaliada. Material amorfo foi obtido a 700 °C enquanto que a 900 e 1100 °C foram identificas as fases ortorrômbica (fase T) e monoclínica (fase M) do Nb2O5. Intensa emissão na região de 1550 nm com valores de FWHM de 52 e 67 nm e tempos de vida de 5,6 e 5,4 ms foram verificados a 700 e 900 °C sob excitação em 977 nm, respectivamente. Por fim, foram obtidos guias de onda planares com excelentes propriedades ópticas e com grande potencial de aplicação em dispositivos de amplificação óptica. Especificamente, materiais fotônicos com banda larga de emissão na região do infravermelho foram preparados, indicando fortemente a potencialidade para a aplicação em telecomunicações envolvendo não somente a banda C como também as bandas L e S em materiais contendo somente íons Er3+ como centros emissores.

Indicadores para avaliação de efeitos de intervenções de saneamento básico: a questão da sustentabilidade

As intervenções de saneamento básico, ou seja, as obras para implantação ou ampliação de sistemas de abastecimento de água e de esgotamento sanitário têm sido relacionadas à redução das taxas de mortalidade infantil ocorrida no estado de São Paulo nas últimas décadas. De fato, a relação entre saneamento básico e saúde pública é antiga, principalmente no que se refere ao controle das doenças de veiculação hídrica. Entretanto, ela se mostra muito fraca, ou até nula, para regiões onde os índices de cobertura por redes de água e esgotos já se encontram em patamares acima da média nacional, como é o caso de grande parte dos municípios do estado de São Paulo. Uma abordagem do saneamento básico, sob o ponto de vista da complexidade de suas relações, considerando aspectos multidimensionais, faz-se necessária como forma de repensar o setor de forma mais ampla, fugindo do senso comum. O objetivo desta pesquisa foi identificar, analisar e descrever indicadores de sustentabilidade que pudessem estabelecer uma nova base para avaliação de efeitos de intervenções de saneamento básico, melhorando a determinação e acompanhamento dos impactos decorrentes, constituindo, então, uma matriz de indicadores específicos para a área, a partir da investigação dos conceitos de sustentabilidade e seus desdobramentos para o setor saneamento básico e o ambiente empresarial. Pesquisas em bases de dados públicas permitiram a identificação e seleção de indicadores multidimensionais para o saneamento, assim como a análise de correlação entre os indicadores selecionados possibilitou identificar possíveis benefícios de curto, médio e longo prazos, oriundos das intervenções de saneamento para os municípios do Vale do Ribeira. Utilizando modelos de organização de indicadores, como o Triple Bottom Line (TBL) e a matriz de indicadores FPSEEA, da Organização Mundial da Saúde (OMS), com algumas adaptações, foi possível agrupar os indicadores de forma a permitir uma visão integrada das dimensões da sustentabilidade e, dessa maneira, determinar que as intervenções de saneamento básico possuem relações sistêmicas com indicadores sociais, ambientais e econômicos, que possibilitem, a partir de sua execução, o estabelecimento de um círculo virtuoso para os municípios

Li I enhancement during a long-duration stellar flare

We report the possible detection of a Li I λ6708 Å line enhancement during an unusual long-duration optical flare in the recently discovered, X-ray/EUV selected, chromospherically active binary 2RE J0743+224. The Li I equivalent width (EW) variations follow the temporal evolution of the flare and large changes are observed in the intensity of the line. The maximum Li I enhancement (40% in EW) occurs just after the maximum chromospheric emission observed in the flare. A significant increase of the Li^-6/Li^-7 isotopic ratio is also detected. No significant simultaneous variations are detected in other photospheric lines. Neither line blends nor starspots seem to be the primary cause of the observed Li I line variation. From all this we suggest that this Li I enhancement is produced by spallation reactions during the flare.

Emission-line galaxy surveys with GTC: The Hα Universe

Emission line galaxies are the most easily detected and studied objects in the high redshift Universe. They are being used to trace the evolution of critical observables of the Universe such as Star Formation Rate densities, starburst properties and abundances. Most of the research is being done using [OII]3727 and UV lines, but Hα is still one the best tracers for Star Formation Rate and physical properties of current star-forming galaxies. As a complementary contribution to studies of galaxy evolution, our team has focused into a long-term project to study the population of Hα-selected star-forming galaxies of the Universe at different redshifts. In 1995 we first determined the local Hα luminosity function, and from it the Star Formation Rate density (SFRd) of the local Universe. We then, using narrow-band imaging in the optical, extended this measurement to z ≃ 0.24 and z ≃ 0.4. Working in the near-infrared, GTC will be a very powerful tool to study the evolution of the Hα emission-line galaxy populations at different redshifts. We will both quantify the SFRd evolution and characterize the star-forming galaxy populations by directly comparing the same observables at all redshifts up to z ≃ 2.5.

Sistemas de gestão integrados como indutor para a sustentabilidade: uma análise do impacto no desempenho das organizações baseado no Triple Bottom Line.

O objetivo deste trabalho é analisar o impacto dos Sistemas de Gestão Integrados (SGI) no desempenho organizacional sob a óptica do Triple Bottom Line (TBL), verificando se esta implementação auxilia a empresa a se tornar mais sustentável. A abordagem multi-método utilizada está dividida em três partes. A primeira compreende uma revisão sistemática da literatura, tendo como base a abordagem bibliométrica. A base de dados escolhida para a seleção dos artigos que compõem a amostra foi a ISI Web of Knowledge (Web of Science). As análises conduzidas sugerem lacunas na literatura a serem pesquisadas de modo a relacionar a integração dos sistemas de gestão como meio para as organizações tornarem-se mais sustentáveis, auxiliando assim na elaboração de um modelo teórico e das hipóteses de pesquisa. Os resultados parciais obtidos ressaltam a lacuna na literatura de estudos nessa área, principalmente que contemplem a dimensão social do Triple Bottom Line. Lacunas na literatura foram identificadas também no que se refere à análise do impacto da adoção dessas abordagens normativas no desempenho organizacional. A segunda etapa da metodologia é composta por estudos de casos múltiplos em empresas de diferentes setores e que tenham implantado sistemas de gestão de maneira integrada. Os resultados obtidos mostram que a certificação auxilia no desenvolvimento de ações sustentáveis, resultando em impactos econômicos, ambientais e sociais positivos. Nesta etapa, testou-se o modelo e as hipóteses levantadas na abordagem bibliométrica. A terceira etapa da metodologia é composta por análises estatísticas de dados secundários extraídos da revista Exame ?Maiores e Melhores\'. Os dados do ano de 2014 das empresas foram tratados por meio do software MINITAB 17 ®. Por meio do teste de mediana de mood, as amostras foram testadas e apresentaram diferenças estatisticamente significativas para o desempenho das empresas em diferentes setores. De maneira geral, as empresas com SGI apresentam melhor desempenho econômico do que as demais. Com a mesma base de dados, utilizando o modelo de equações estruturais e o software Smart PLS 2.0, criou-se um diagrama de caminhos analisando os constructos (SGI) com variáveis de desempenho (Endividamento, Lucratividade, Patrimônio, Crescimento e Retorno). O modelo de equações estruturais testado apresentou força para a relação entre SGI com Endividamento, Lucratividade, Patrimônio e Crescimento. As diferentes metodologias apresentadas contribuíram para responder a hipótese e afirmar com base na amostra deste trabalho que o SGI leva as empresas a terem melhor desempenho econômico, ambiental e social (baseado no TBL).

Red supergiants around the obscured open cluster Stephenson 2

Context. Several clusters of red supergiants have been discovered in a small region of the Milky Way close to the base of the Scutum-Crux Arm and the tip of the Long Bar. Population synthesis models indicate that they must be very massive to harbour so many supergiants. Amongst these clusters, Stephenson 2, with a core grouping of 26 red supergiants, is a strong candidate to be the most massive young cluster in the Galaxy. Aims. Stephenson 2 is located close to a region where a strong over-density of red supergiants had been found. We explore the actual cluster size and its possible connection to this over-density. Methods. Taking advantage of Virtual Observatory tools, we have performed a cross-match between the DENIS, USNO-B1 and 2MASS catalogues to identify candidate obscured luminous red stars around Stephenson 2, and in a control nearby region. More than 600 infrared bright stars fulfill our colour criteria, with the vast majority having a counterpart in the I band and >400 being sufficiently bright in I to allow observation with a 4-m class telescope. We observed a subsample of ~250 stars, using the multi-object, wide-field, fibre spectrograph AF2 on the WHT telescope in La Palma, obtaining intermediate-resolution spectroscopy in the 7500–9000 Å range. We derived spectral types and luminosity classes for all these objects and measured their radial velocities. Results. Our targets turned out to be G and K supergiants, late (≥ M4) M giants, and M-type bright giants (luminosity class II) and supergiants. We found ~35 red supergiants with radial velocities similar to Stephenson 2 members, spread over the two areas surveyed. In addition, we found ~40 red supergiants with radial velocities incompatible in principle with a physical association. Conclusions. Our results show that Stephenson 2 is not an isolated cluster, but part of a huge structure likely containing hundreds of red supergiants, with radial velocities compatible with the terminal velocity at this Galactic longitude (and a distance ~6 kpc). In addition, we found evidence of several populations of massive stars at different distances along this line of sight.

Efavirenz versus Nevirapina : comparação da efectividade e do perfil de segurança, a longo prazo, no tratamento da infecção por vírus da imunodeficiência humana tipo 1

Tese de mestrado, Doenças Infecciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016

Performance of Long-Term Care Systems in Europe. ENEPRI Research Report No. 117, 21 December 2012

This report evaluates the performance of long-term care (LTC) systems in Europe, with a special emphasis on four countries that were selected in Work Package 1 of the ANCIEN project as representative of different LTC systems: Germany, the Netherlands, Spain and Poland. Based on a performance framework, we use the following four core criteria for the evaluation: the quality of life of LTC users, the quality of care, equity of LTC systems and the total burden of LTC (consisting of the financial burden and the burden of informal caregiving). The quality of life is analysed by studying the experience of LTC users in 13 European countries, using data from the Survey of Health, Ageing and Retirement in Europe (SHARE). Older persons with limitations living at home have the highest probability of receiving help (formal or informal) in Germany and the lowest in Poland. Given that help is available, the sufficiency of the help is best ensured in Switzerland, Italy and the Netherlands. The indirectly observed properties of the LTC system are most favourable in France. An older person who considers all three aspects important might be best off living in Belgium or Switzerland. The horizontal and vertical equity of LTC systems are analysed for the four representative countries. The Dutch system scores highest on overall equity, followed by the German system. The Spanish and Polish systems are both less equitable than the Dutch and German systems. To show how ageing may affect the financial burden of LTC, projections until 2060 are given for LTC expenditures for the four representative countries. Under the base scenario, for all four countries the proportions of GDP spent on public and private LTC are projected to more than double between 2010 and 2060, and even treble in some cases. The projections also highlight the large differences in LTC expenditures between the four countries. The Netherlands spends by far the most on LTC. Furthermore, the report presents information for a number of European countries on quality of care, the burden of informal caregiving and other aspects of performance. The LTC systems for the four representative countries are evaluated using the four core criteria. The Dutch system has the highest scores on all four dimensions except the total burden of care, where it has the second-best score after Poland. The German system has somewhat lower scores than the Dutch on all four dimensions. The relatively large role for informal care lowers the equity of the German system. The Polish system excels in having a low total burden of care, but it scores lowest on quality of care and equity. The Spanish system has few extreme scores. Policy implications are discussed in the last chapter of this report and in the Policy Brief based on this report.

Falling Labor Share and Rising Unemployment: Long-Run Consequences of Institutional Shocks? CES Germany & Europe Working Papers, No. 00.2, 1999

The literature on unemployment has mostly focused on labor market issues while the impact of capital foonation is largely neglected Job-creation is often thought to be a matter of encouraging more employment on a given capital stock. In contrast, this paper explicitly deals with the long-run consequences of institutional shocks on capital foonation and employment. It is shown that the usual trade off between employment and wages disappears in the long run. In line with an appropriation model, the estimated values for the long-run elasticities of substitution between capital and labor for Germany and France are substantially greater than one.

Avaliação do desempenho a longo prazo de pavimentos flexivéis : exploração da base de dados LTPP americana

A implementação de programas de LTPP – Long-Term Pavement Performance (avaliação do desempenho de pavimentos a longo prazo), ao criar um registo histórico sobre as características e a evolução do estado dos pavimentos da rede, revela-se uma ferramenta de valor acrescido no auxílio à tomada de decisões, no âmbito da conservação e da reabilitação de pavimentos, por parte das administrações das infraestruturas rodoviárias. O LTPP americano, dentre os existentes no mundo, é o projeto pioneiro e um dos que tem a maior quantidade de informação armazenada. Por isso, foi o escolhido no âmbito desta dissertação para estudar a evolução do estado dos pavimentos em várias secções classificadas no programa como SPS-5, incluídas no estudo de reabilitação de pavimentos betuminosos. A avaliação efetuada considera cerca de 15 anos de registos de dados, na Califórnia, no Texas e no Mississippi. Após uma breve apresentação de vários projetos LTPP existentes no mundo, descreve-se o modo como são recolhidos e estruturados os dados no LTPP americano, referindo os módulos, as tabelas e os campos considerados para estudo que se faz nesta dissertação. Os estados americanos escolhidos apresentam características climáticas que não reproduzem de forma muito próxima o que acontece em Portugal. Mesmo assim, procurou estabelecer-se um paralelo entre aquelas zonas, com base na temperatura do ar e na precipitação, de modo a poder inferir, de forma aproximada, tendências de evolução do estado dos pavimentos para Portugal Continental. A correspondência climática entre os estados americanos e as regiões portuguesas, resultou nos pares Califórnia/Beja, Texas/Lisboa e Mississippi/Porto. No que se refere ao desenvolvimento de patologias nos pavimentos, analisou-se a evolução do fendilhamento longitudinal, transversal, em bloco (ou malha) e por fadiga (ou pele de crocodilo), da desagregação superficial, do Índice de Irregularidade Internacional (IRI) e das rodeiras. O fendilhamento em bloco (ou malha) e a desagregação superficial não foram objeto de estudos estatísticos para determinação de modelos de previsão. A evolução do estado dos pavimentos, traduzida por indicadores relacionados com as patologias analisadas, foi apreciada em função de diversas variáveis associadas às técnicas de reabilitação, tais como a preparação da superfície de trabalho (realização de atividades de fresagem antes da nova camada), a espessura da camada de reforço (50 ou 125 mm) e o tipo de mistura utilizada (nova ou contendo cerca de 30% de material reciclado). Para as situações em que os dados existentes eram coerentes e em quantidade suficiente, apresentam-se análises de regressão multivariada, de modo a prever a evolução no tempo do estado dos pavimentos, tendo em conta um conjunto de variáveis explicativas relacionadas com as técnicas de reabilitação aplicadas e com o tráfego que solicitou os pavimentos. A análise agregada dos dados para cada um dos estados permitiu concluir que a preparação da superfície por fresagem, o aumento da espessura do reforço, e a utilização de misturas betuminosas novas ou com material reciclado, interferem na evolução das degradações. A influência daqueles fatores é variável em função dos diferentes tipos de patologias em análise.