Anti-VEGFA therapy reduces tumor growth and extends survival in a murine model of ovarian granulosa cell tumor

Les tumeurs des cellules de la granulosa (GCTs) sont des tumeurs avec un potentiel malin ayant tendance à récidiver, provoquant ainsi la mort dans 80% des cas de stade avancé consécutif à une rechute. Bien que les GCTs représentent 5% des tumeurs ovariennes, peu d’études ont évalué les protocoles de traitement adjuvant pour la maladie avancée ou récurrente. Notre but était d’évaluer l’efficacité de la voie de signalisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A (VEGFA) comme cible pour le traitement de la GCT utilisant le modèle murin transgénique Ptentm1Hwu/tm1Hwu; Ctnnb1tm1Mmt/+; Amhr2tm3(cre)Bhr/+ (PCA) qui reproduit le stade avancé de la maladie humaine. Un anticorps anti-VEGFA a été administré une fois par semaine par voie intrapéritonéale (IP) à partir de 3 semaines d’âge. La thérapie anti-VEGFA a permis une réduction de la taille des tumeurs à 6 semaines d’âge (p<0.05) et une prolongation de la survie des animaux traités, lorsque comparé aux animaux contrôles. L’analyse des GCTs a montré une réduction significative de la prolifération cellulaire (p<0.05) et de la densité microvasculaire (p<0.01) mais aucune différence significative n’a été détectée dans l’apoptose cellulaire. p44/p42 MAPK, un effecteur de la signalisation pour le récepteur 2 de VEGFA (VEGFR2) associé à la prolifération cellulaire, était moins activé dans les tumeurs traitées (p<0.05). Par contre, l’activation d’AKT, un effecteur impliqué dans la survie cellulaire, était similaire d’un groupe à l’autre. Ces résultats suggèrent que l’anticorps anti-VEGFA réduit la prolifération cellulaire et la densité microvasculaire chez les souris PCA par inhibition de la voie de signalisation VEGFR2-MAPK, inhibant ainsi la croissance tumorale. En conclusion, l’efficacité de la thérapie anti- VEGFA mérite d’être évaluée en essais contrôlés randomisés pour le traitement des GCTs chez l’homme.

Simulation de profils de gravure et de dépôt à l’échelle du motif pour l’étude des procédés de microfabrication utilisant une source plasma de haute densité à basse pression

En lien avec l’avancée rapide de la réduction de la taille des motifs en microfabrication, des processus physiques négligeables à plus grande échelle deviennent dominants lorsque cette taille s’approche de l’échelle nanométrique. L’identification et une meilleure compréhension de ces différents processus sont essentielles pour améliorer le contrôle des procédés et poursuivre la «nanométrisation» des composantes électroniques. Un simulateur cellulaire à l’échelle du motif en deux dimensions s’appuyant sur les méthodes Monte-Carlo a été développé pour étudier l’évolution du profil lors de procédés de microfabrication. Le domaine de gravure est discrétisé en cellules carrées représentant la géométrie initiale du système masque-substrat. On insère les particules neutres et ioniques à l’interface du domaine de simulation en prenant compte des fonctions de distribution en énergie et en angle respectives de chacune des espèces. Le transport des particules est effectué jusqu’à la surface en tenant compte des probabilités de réflexion des ions énergétiques sur les parois ou de la réémission des particules neutres. Le modèle d’interaction particule-surface tient compte des différents mécanismes de gravure sèche telle que la pulvérisation, la gravure chimique réactive et la gravure réactive ionique. Le transport des produits de gravure est pris en compte ainsi que le dépôt menant à la croissance d’une couche mince. La validité du simulateur est vérifiée par comparaison entre les profils simulés et les observations expérimentales issues de la gravure par pulvérisation du platine par une source de plasma d’argon.

A proteome-wide strategy reveals a novel mechanism of control of cell cycle progression through modulation of cyclin mRNA stability

La quantité de données générée dans le cadre d'étude à grande échelle du réseau d'interaction protéine-protéine dépasse notre capacité à les analyser et à comprendre leur sens; d'une part, par leur complexité et leur volume, et d'un autre part, par la qualité du jeu de donnée produit qui semble bondé de faux positifs et de faux négatifs. Cette dissertation décrit une nouvelle méthode de criblage des interactions physique entre protéines à haut débit chez Saccharomyces cerevisiae, la complémentation de fragments protéiques (PCA). Cette approche est accomplie dans des cellules intactes dans les conditions natives des protéines; sous leur promoteur endogène et dans le respect des contextes de modifications post-traductionnelles et de localisations subcellulaires. Une application biologique de cette méthode a permis de démontrer la capacité de ce système rapporteur à répondre aux questions d'adaptation cellulaire à des stress, comme la famine en nutriments et un traitement à une drogue. Dans le premier chapitre de cette dissertation, nous avons présenté un criblage des paires d'interactions entre les protéines résultant des quelques 6000 cadres de lecture de Saccharomyces cerevisiae. Nous avons identifié 2770 interactions entre 1124 protéines. Nous avons estimé la qualité de notre criblage en le comparant à d'autres banques d'interaction. Nous avons réalisé que la majorité de nos interactions sont nouvelles, alors que le chevauchement avec les données des autres méthodes est large. Nous avons pris cette opportunité pour caractériser les facteurs déterminants dans la détection d'une interaction par PCA. Nous avons remarqué que notre approche est sous une contrainte stérique provenant de la nécessité des fragments rapporteurs à pouvoir se rejoindre dans l'espace cellulaire afin de récupérer l'activité observable de la sonde d'interaction. L'intégration de nos résultats aux connaissances des dynamiques de régulations génétiques et des modifications protéiques nous dirigera vers une meilleure compréhension des processus cellulaires complexes orchestrés aux niveaux moléculaires et structuraux dans les cellules vivantes. Nous avons appliqué notre méthode aux réarrangements dynamiques opérant durant l'adaptation de la cellule à des stress, comme la famine en nutriments et le traitement à une drogue. Cette investigation fait le détail de notre second chapitre. Nous avons déterminé de cette manière que l'équilibre entre les formes phosphorylées et déphosphorylées de l'arginine méthyltransférase de Saccharomyces cerevisiae, Hmt1, régulait du même coup sont assemblage en hexamère et son activité enzymatique. L'activité d'Hmt1 a directement un impact dans la progression du cycle cellulaire durant un stress, stabilisant les transcrits de CLB2 et permettant la synthèse de Cln3p. Nous avons utilisé notre criblage afin de déterminer les régulateurs de la phosphorylation d'Hmt1 dans un contexte de traitement à la rapamycin, un inhibiteur de la kinase cible de la rapamycin (TOR). Nous avons identifié la sous-unité catalytique de la phosphatase PP2a, Pph22, activé par l'inhibition de la kinase TOR et la kinase Dbf2, activé durant l'entrée en mitose de la cellule, comme la phosphatase et la kinase responsable de la modification d'Hmt1 et de ses fonctions de régulations dans le cycle cellulaire. Cette approche peut être généralisée afin d'identifier et de lier mécanistiquement les gènes, incluant ceux n'ayant aucune fonction connue, à tout processus cellulaire, comme les mécanismes régulant l'ARNm.

Identification de modifications post-traductionnelles de Staufen1 et étude de leur fonction régulatrice

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle de premier plan dans le contrôle fin de l’expression génique en permettant une modulation de la synthèse de protéines dans le temps et l’espace, en fonction des besoins de la cellule. Ainsi, des protéines reconnaissant des éléments d’ARN présents sur des transcrits peuvent influencer toutes les étapes de leur existence, soit leur épissage, leur export nucléaire, leur localisation subcellulaire, leur traduction et leur dégradation. Staufen1 (Stau1) est un membre de la famille des protéines liant l’ARN double-brin qui contribue à la régulation post-transcriptionnelle par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir l’épissage alternatif, le transport, la dé-répression de la traduction et l’induction de la dégradation d’ARN messagers (ARNm) spécifiques. L’identité des cibles potentielles de Stau1 est maintenant connue puisqu’une étude à l’échelle du génome a montré que la protéine s’associe à près de 7% du transcriptome des cellules HEK293T. Ces ARNm se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles, mais il est tout de même intéressant de noter qu’une grande proportion d’entre eux code pour des protéines reliées au métabolisme cellulaire et à la régulation de processus cellulaires. En considérant toutes ces informations, nous avons émis l’hypothèse que les différentes activités de Stau1 puissent être modulées afin de contrôler adéquatement l’expression des transcrits liés par la protéine. Dans la mesure où certains ARNm faisant partie des complexes définis par la présence de Stau1 codent pour des régulateurs clés de la prolifération cellulaire, nous avons voulu examiner si l’expression de la protéine varie au cours du cycle de division cellulaire. Nous avons montré que l’abondance de Stau1 est maximale en début de mitose et qu’elle diminue ensuite lorsque les cellules complètent la division cellulaire. Nous avons ensuite découvert que cette baisse d’expression de Stau1 en sortie de mitose dépend du complexe promoteur d’anaphase/cyclosome (APC/C). En soutien à l’idée que Stau1 soit une cible de cette ubiquitine ligase de type E3, nous avons de plus démontré que Stau1 est ubiquitiné et dégradé par le protéasome. Ce contrôle des niveaux de Stau1 semble important puisque la surexpression de la protéine retarde la sortie de mitose et entraîne une diminution importante de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, nous avons supposé que les différentes fonctions de Stau1 puissent également être sujettes à une régulation. Compte tenu que les activités de nombreuses protéines liant l’ARN peuvent être contrôlées par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, nous avons voulu tester la possibilité que Stau1 soit phosphorylé. L’immunopurification de Stau1 et son analyse par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier trois phosphosites dans la protéine. L’évaluation du rôle de ces événements de phosphorylation à l’aide de mutants phoshomimétiques ou non-phoshorylables a révélé que la modification de Stau1 pourrait compromettre son association à la protéine UPF1. Comme cette interaction est nécessaire pour déstabiliser les transcrits liés par Stau1, nos résultats suggèrent fortement que la fonction de Stau1 dans la dégradation d’ARNm est régulée négativement par sa phosphorylation. Toutes ces données mettent en lumière l’importance des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la phosphorylation dans la modulation de l’expression et des fonctions de Stau 1. Somme toute, il est vraisemblable que ces mécanismes de contrôle puissent avoir un impact significatif sur le destin des ARNm liés par Stau1, particulièrement dans un contexte de progression dans le cycle cellulaire.

Étude du rôle de la phosphorylation du complexe Mre11-Rad50-Xrs2 dans le maintien de l'intégrité génomique

L'ADN de chaque cellule est constamment soumis à des stress pouvant compromettre son intégrité. Les bris double-brins sont probablement les dommages les plus nocifs pour la cellule et peuvent être des sources de réarrangements chromosomiques majeurs et mener au cancer s’ils sont mal réparés. La recombinaison homologue et la jonction d’extrémités non-homologues (JENH) sont deux voies fondamentalement différentes utilisées pour réparer ce type de dommage. Or, les mécanismes régulant le choix entre ces deux voies pour la réparation des bris double-brins demeurent nébuleux. Le complexe Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) est le premier acteur à être recruté à ce type de bris où il contribue à la réparation par recombinaison homologue ou JENH. À l’intersection de ces deux voies, il est donc idéalement placé pour orienter le choix de réparation. Ce mémoire met en lumière deux systèmes distincts de phosphorylation du complexe MRX régulant spécifiquement le JENH. L’un dépend de la progression du cycle cellulaire et inhibe le JENH, tandis que l’autre requiert la présence de dommages à l’ADN et est nécessaire au JENH. Ensembles, nos résultats suggèrent que le complexe MRX intègre différents phospho-stimuli pour réguler le choix de la voie de réparation.

Développement de modèles prédictifs de la toxicocinétique de substances organiques

Les modèles pharmacocinétiques à base physiologique (PBPK) permettent de simuler la dose interne de substances chimiques sur la base de paramètres spécifiques à l’espèce et à la substance. Les modèles de relation quantitative structure-propriété (QSPR) existants permettent d’estimer les paramètres spécifiques au produit (coefficients de partage (PC) et constantes de métabolisme) mais leur domaine d’application est limité par leur manque de considération de la variabilité de leurs paramètres d’entrée ainsi que par leur domaine d’application restreint (c. à d., substances contenant CH3, CH2, CH, C, C=C, H, Cl, F, Br, cycle benzénique et H sur le cycle benzénique). L’objectif de cette étude est de développer de nouvelles connaissances et des outils afin d’élargir le domaine d’application des modèles QSPR-PBPK pour prédire la toxicocinétique de substances organiques inhalées chez l’humain. D’abord, un algorithme mécaniste unifié a été développé à partir de modèles existants pour prédire les PC de 142 médicaments et polluants environnementaux aux niveaux macro (tissu et sang) et micro (cellule et fluides biologiques) à partir de la composition du tissu et du sang et de propriétés physicochimiques. L’algorithme résultant a été appliqué pour prédire les PC tissu:sang, tissu:plasma et tissu:air du muscle (n = 174), du foie (n = 139) et du tissu adipeux (n = 141) du rat pour des médicaments acides, basiques et neutres ainsi que pour des cétones, esters d’acétate, éthers, alcools, hydrocarbures aliphatiques et aromatiques. Un modèle de relation quantitative propriété-propriété (QPPR) a été développé pour la clairance intrinsèque (CLint) in vivo (calculée comme le ratio du Vmax (μmol/h/kg poids de rat) sur le Km (μM)), de substrats du CYP2E1 (n = 26) en fonction du PC n octanol:eau, du PC sang:eau et du potentiel d’ionisation). Les prédictions du QPPR, représentées par les limites inférieures et supérieures de l’intervalle de confiance à 95% à la moyenne, furent ensuite intégrées dans un modèle PBPK humain. Subséquemment, l’algorithme de PC et le QPPR pour la CLint furent intégrés avec des modèles QSPR pour les PC hémoglobine:eau et huile:air pour simuler la pharmacocinétique et la dosimétrie cellulaire d’inhalation de composés organiques volatiles (COV) (benzène, 1,2-dichloroéthane, dichlorométhane, m-xylène, toluène, styrène, 1,1,1 trichloroéthane et 1,2,4 trimethylbenzène) avec un modèle PBPK chez le rat. Finalement, la variabilité de paramètres de composition des tissus et du sang de l’algorithme pour les PC tissu:air chez le rat et sang:air chez l’humain a été caractérisée par des simulations Monte Carlo par chaîne de Markov (MCMC). Les distributions résultantes ont été utilisées pour conduire des simulations Monte Carlo pour prédire des PC tissu:sang et sang:air. Les distributions de PC, avec celles des paramètres physiologiques et du contenu en cytochrome P450 CYP2E1, ont été incorporées dans un modèle PBPK pour caractériser la variabilité de la toxicocinétique sanguine de quatre COV (benzène, chloroforme, styrène et trichloroéthylène) par simulation Monte Carlo. Globalement, les approches quantitatives mises en œuvre pour les PC et la CLint dans cette étude ont permis l’utilisation de descripteurs moléculaires génériques plutôt que de fragments moléculaires spécifiques pour prédire la pharmacocinétique de substances organiques chez l’humain. La présente étude a, pour la première fois, caractérisé la variabilité des paramètres biologiques des algorithmes de PC pour étendre l’aptitude des modèles PBPK à prédire les distributions, pour la population, de doses internes de substances organiques avant de faire des tests chez l’animal ou l’humain.

Étude préclinique de nouveaux médicaments inhibiteurs de PARP et Bcl-2 dans le neuroblastome

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente chez le jeune enfant. En dépit de plusieurs avancements thérapeutiques, seulement 60% survivront à long terme. Cette résistance aux traitements est possiblement due, en partie, à la présence des cellules souches cancéreuses (CSC). PARP-1 joue un rôle important dans la chimiorésistance de certaines tumeurs et son inhibition a montré une potentialisation des agents anticancéreux conventionnels. De plus, Bcl-2 est surexprimé dans le NB et son expression accrue contribuerait à la résistance à la chimiothérapie. Le but de notre travail était de déterminer les effets in vitro d’un PARP inhibiteur, AG-014699 (AG), et d’un inhibiteur de Bcl-2, Obatoclax (Obx), in vitro et in vivo, en monothérapie ou en combinaison avec de la Doxorubicine (Doxo) ou du Cisplatin (Cis), deux agents anticancéreux classiquement utilisés dans le traitement du NB. Afin de déterminer l’expression de PARP-1 dans les tumeurs de NB, nous avons analysé une cohorte de 132 tumeurs. Nous avons utilisé le test MTT afin d’évaluer la sensibilité de 6 lignées cellulaires de NB et des CSC à un traitement avec AG seul ou en combinaison avec de la Doxo ou du Cis. Nous avons déterminé l’étendue de la mort cellulaire par Annexin-V et caractérisé les dommages à l’ADN à l’aide d’un marquage γH2aX. De plus, les modulations des voies de signalisation intracellulaire ont été analysées par Western Blot. La sensibilité des cellules à l’Obx a été analysée par MTT sur 6 lignées cellulaires de NB et sa combinaison avec le Cis a également été déterminée dans 2 lignées cellulaires. Le marquage Annexin-V et des combinaisons avec ZVAD-FMK ont aussi été utilisés pour caractériser les effets d’Obx sur l’apoptose. Des expériences in vivo ont également été faites. Nos résultats démontrent que l’expression de PARP-1 est associée aux tumeurs moins agressives. AG n’a peu ou pas effet sur la croissance tumorale et ne potentialise pas significativement les effets de la Doxo ou de Cis. AG combiné à la Doxo semble sensibiliser les CSC dans une lignée cellulaire. L’Annexin-V et le marquage γH2aX ne révèlent pas d’effets synergiques de cette combinaison et les dommages à l’ADN et la mort cellulaire observés sont attribués à la Doxo. Cependant, on observe une augmentation d’apoptose et de bris d’ADN dans une lignée cellulaire (SK-N-FI) lorsqu’AG est utilisé en monothérapie. On observe une surexpression de pAKT et pERK suite à la combinaison Doxo et AG. Les cellules de NB sont sensibles à l’Obx à des concentrations à l’échelle nanomolaire. De plus, Obx active la mort cellulaire par apoptose. Aussi, Obx a un effet synergique avec le Cis in vitro. In vivo, l’Obx diminue significativement la taille tumorale. Nous concluons que l’Obx présente une avenue thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB alors que l’utilisation d’AG ne semble pas être aussi encourageante.

Facteurs de risque de sévérité de la papillomatose respiratoire juvénile

La papillomatose respiratoire récurrente (PRR) juvénile est causée par les génotypes 6 et 11 du virus du papillome humain (VPH). Cette maladie est caractérisée par des verrues récurrentes généralement au larynx. La forme sévère peut avoir un impact dévastateur sur la santé et la qualité de vie de l’enfant atteint et de sa famille en raison des conséquences des multiples chirurgies nécessaires et du risque d'obstruction des voies respiratoires. Objectif: Examiner les facteurs de risque associés aux manifestations sévères de la PRR. Méthode: Étude rétrospective des 31 cas diagnostiqués entre janvier 1995 et décembre 2008. Les données démographiques, cliniques, génétiques et virologiques ont été évaluées. Des régressions logistiques furent effectuées afin d'évaluer le rôle des variables indépendantes sur la sévérité de la maladie. Résultats: Nos données suggèrent que les facteurs de risque de sévérité de la PRR seraient associés au genre féminin (Rapport de cotes (RC)=2.60, intervalles de confiance (IC) 95% : 0.44-15.44), au fait d’être premier-né (RC=3.51, IC 95% : 0.17-72.32), à un statut économique faible (RC=5.31, IC 95% : 0.17-164.19), à un jeune âge (RC=0.83, IC 95% : 0.68-1.01), à une charge virale élevée (RC=3.81, IC 95% : 0.23-63.16) et aux condylomes chez la mère pendant la grossesse (RC=12.05, IC 95% : 0.97-149.85). Conclusion: La sévérité de la PRR serait le résultat d'une combinaison de déterminants qui favoriseraient la croissance cellulaire particulièrement chez les jeunes enfants. Des mesures préventives et thérapeutiques visant à restreindre la contamination et la réplication du virus pourraient réduire le fardeau de la maladie.

Regulation of excitotoxicity in thiamine deficiency : role of glutamate transporters.

L’excitotoxicité est un mécanisme physiopathologique majeur impliqué dans la pathogenèse de la déficience en thiamine (DT). Dans les régions cérébrales vulnérables à la DT, on observe une mort cellulaire induite par excitotoxicité dont l’origine semble être la conséquence d’une perturbation du métabolisme énergétique mitochondrial, d’une dépolarisation membranaire soutenue et d’une diminution de l’absorption du glutamate par les astrocytes suite à la diminution de l’expression des transporteurs EAAT1 et EAAT2. Il est clairement établi que le glutamate joue un rôle central dans l’excitotoxicité lors de la DT. Ainsi, la mise en évidence des mécanismes impliqués dans la diminution de l’expression des transporteurs du glutamate est essentielle à la compréhension de la physiopathologie de la DT. L’objectif de cette thèse consiste en l’étude de la régulation des transporteurs astrocytaires du glutamate et la mise au point de stratégies thérapeutiques ciblant la pathogenèse de l’excitotoxicité lors de l’encéphalopathie consécutive à la DT. Les principaux résultats de cette thèse démontrent des perturbations des transporteurs du glutamate à la fois dans des modèles animaux de DT et dans des astrocytes en culture soumis à une DT. La DT se caractérise par la perte du variant d’épissage GLT-1b codant pour un transporteur du glutamate dans le thalamus et le colliculus inférieur, les régions cérébrales affectées lors d’une DT, en l’absence de modification des niveaux d’ARNm. Ces résultats suggèrent une régulation post-transcriptionnelle de l’expression des transporteurs du glutamate en condition de DT. Les études basées sur l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des facteurs de transcription NFkB et de l’enzyme nucléaire poly(ADP)ribose polymérase-1 (PARP-1) démontrent que la régulation de l’expression du transporteur GLT-1 est sous le contrôle de voies de signalisation NFkB dépendantes de PARP-1. Cette étude démontre une augmentation de l’activation de PARP-1 et de NFkB dans les régions vulnérables chez le rat soumis à une DT et en culture d’astrocytes DT. L’inhibition pharmacologique du facteur de transcription NFkB par le PDTC induit une augmentation des niveaux d’expression de GLT-1, tandis que l’inhibition de PARP-1 par le DPQ conduit à l’inhibition de l’hyperactivation de NFkB observée lors de DT. L’ensemble de ces résultats met en évidence un nouveau mécanisme de régulation des transporteurs du glutamate par l’activation de PARP-1. L’accumulation de lactate est une caractéristique de la DT. Un traitement avec le milieu de culture d’astrocytes en condition de DT sur des cultures d’astrocytes naïfs induit une diminution de l’expression de GLT-1 ainsi qu’une inhibition de la capacité d’absorption du glutamate par les astrocytes naïfs. En revanche, l’administration de lactate exogène ne modifie pas le niveau d’expression protéique de GLT-1. Ainsi, des facteurs solubles autres que le lactate sont sécrétés par des astrocytes en condition de perturbation métabolique et peuvent potentiellement réguler l’activité des transporteurs du glutamate et contribuer à la pathogenèse du syncytium astroglial. En outre, la ceftriaxone, un antibiotique de la famille des β-lactamines, augmente de façon différentielle l’expression du variant-d’épissage GLT-1 dans le colliculus inférieur chez le rat DT et en culture d’astrocytes DT. Ces résultats suggèrent que la ceftriaxone peut constituer une avenue thérapeutique dans la régulation de l’activité des transporteurs du glutamate lors de DT. Pour conclure, la mort cellulaire d’origine excitotoxique lors de DT survient en conséquence d’une dysfonction mitochondriale associée à une perturbation du métabolisme énergétique cérébral. La modification de l’expression des transporteurs du gluatamate est sous le contrôle des voies de signalisation NFkB dépendantes du facteur PARP-1. De plus, l’inhibition métabolique et l’augmentation des sécrétions de lactate observées lors de DT peuvent également constituer un autre mécanisme physiopathologique expliquant la diminution d’expression des transporteurs de glutamate. Enfin, la ceftriaxone pourrait représenter une stratégie thérapeutique potentielle dans le traitement de la régulation de l’expression des transporteurs du glutamate et de la perte neuronale associés à l’excitotoxicité observée lors de DT.

Étude dans la cellule bêta pancréatique de voies inhibitrices de la sécrétion d'insuline liées au métabolisme des lipides

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques.

Implication des peptides RALFs dans les communications cellulaires lors du développement du gamétophyte femelle chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Chez les angiospermes, la reproduction passe par la double fécondation. Le tube pollinique délivre deux cellules spermatiques au sein du gamétophyte femelle. Une cellule féconde la cellule œuf pour produire un zygote; l’autre féconde la cellule centrale pour produire l’endosperme. Pour assurer un succès reproductif, le développement du gamétophyte femelle au sein de l’ovule doit établir un patron cellulaire qui favorise les interactions avec le tube pollinique et les cellules spermatiques. Pour ce faire, un dialogue doit s’établir entre les différentes cellules de l’ovule lors de son développement, de même que lors de la fécondation. D’ailleurs, plusieurs types de communications intercellulaires sont supposées suite à la caractérisation de plusieurs mutants développementaux. De même, ces communications semblent persister au sein du zygote et de l’endosperme pour permettre la formation d’un embryon viable au sein de la graine. Malgré les développements récents qui ont permis de trouver des molécules de signalisation supportant les modèles d’interactions cellulaires avancés par la communauté scientifique, les voies de signalisation sont de loin très incomplètes. Dans le but de caractériser des gènes encodant des protéines de signalisation potentiellement impliqués dans la reproduction chez Solanum chacoense, l’analyse d’expression des gènes de type RALF présents dans une banque d’ESTs (Expressed Sequence Tags) spécifiques à l’ovule après fécondation a été entreprise. RALF, Rapid Alcalinization Factor, est un peptide de 5 kDa qui fait partie de la superfamille des «protéines riches en cystéines (CRPs)», dont les rôles physiologiques au sein de la plante sont multiples. Cette analyse d’expression a conduit à une analyse approfondie de ScRALF3, dont l’expression au sein de la plante se limite essentiellement à l’ovule. L’analyse de plantes transgéniques d’interférence pour le gène ScRALF3 a révélé un rôle particulier lors de la mégagamétogénèse. Les plantes transgéniques présentent des divisions mitotiques anormales qui empêchent le développement complet du sac embryonnaire. Le positionnement des noyaux, de même que la synchronisation des divisions au sein du syncytium, semblent responsables de cette perte de progression lors de la mégagamétogénèse. L’isolement du promoteur de même que l’analyse plus précise d’expression au sein de l’ovule révèle une localisation sporophytique du transcrit. La voie de signalisation de l’auxine régule également la transcription de ScRALF3. De surcroît, ScRALF3 est un peptide empruntant la voie de sécrétion médiée par le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. En somme, ScRALF3 est un important facteur facilitant la communication entre le sporophyte et le gamétophyte pour amener à maturité le sac embryonnaire. L’identification d’un orthologue potentiel chez Arabidopsis thaliana a conduit à la caractérisation de AtRALF34. L’absence de phénotype lors du développement du sac embryonnaire suggère, cependant, de la redondance génétique au sein de la grande famille des gènes de type RALF. Néanmoins, les peptides RALFs apparaissent comme d’importants régulateurs lors de la reproduction chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Modélisation de réseaux d'interactions des microARN et analyse et validation expérimentale de leurs boucles minimales avec des facteurs de transcription

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants qui répriment la traduction de leurs gènes cibles par hybridation à leur ARN messager (ARNm). L'identification de cibles biologiquement actives de miARN est cruciale afin de mieux comprendre leurs rôles. Ce problème est cependant difficile parce que leurs sites ne sont définis que par sept nucléotides. Dans cette thèse je montre qu'il est possible de modéliser certains aspects des miARN afin d'identifier leurs cibles biologiquement actives à travers deux modélisations d'un aspect des miARN. La première modélisation s'intéresse aux aspects de la régulation des miARN par l'identification de boucles de régulation entre des miARN et des facteurs de transcription (FT). Cette modélisation a permis, notamment, d'identifier plus de 700 boucles de régulation miARN/FT, conservées entre l'humain et la souris. Les résultats de cette modélisation ont permis, en particulier, d'identifier deux boucles d'auto-régulation entre LMO2 et les miARN miR-223 et miR-363. Des expériences de transplantation de cellules souches hématopoïétiques et de progéniteurs hématopoïétiques ont ensuite permis d'assigner à ces deux miARN un rôle dans la détermination du destin cellulaire hématopoïétique. La deuxième modélisation s'intéresse directement aux interactions des miARN avec les ARNm afin de déterminer les cibles des miARN. Ces travaux ont permis la mise au point d'une méthode simple de prédiction de cibles de miARN dont les performances sont meilleures que les outils courant. Cette modélisation a aussi permis de mettre en lumière certaines conséquences insoupçonnées de l'effet des miARN, telle que la spécificité des cibles de miARN au contexte cellulaire et l'effet de saturation de certains ARNm par les miARN. Cette méthode peut également être utilisée pour identifier des ARNm dont la surexpression fait augmenter un autre ARNm par l'entremise de miARN partagés et dont les effets sur les ARNm non ciblés seraient minimaux.

Localisation et fonction de CHK2 en mitose

Les centrosomes dont le rôle principal est d’organiser le cytosquelette de microtubules et le fuseau mitotique servent aussi de sites d’interaction pour plusieurs protéines régulatrices du cycle cellulaire et de la réponse aux dommages à l’ADN. Une de ces protéines est la kinase CHK2 et plusieurs publications montrent une sous-population de CHK2 localisée aux centrosomes dans les cellules en interphase et en mitose. Toutefois, la localisation de CHK2 aux centrosomes demeure controversée, car des doutes subsistent en ce qui concerne la spécificité des anticorps utilisés en immunocytochimie. En utilisant des lignées cellulaires du cancer du côlon, les cellules HCT116 sauvages et HCT116 CHK2-/- ainsi que différentes lignées d’ostéosarcome humain dans lesquelles l’expression de CHK2 a été inhibée par ARN interférence, nous montrons que les anticorps anti-CHK2 qui donnent un signal centrosomal sont non spécifiques et reconnaissent un antigène inconnu sur les centrosomes. Cependant, par des expériences d’immunofluorescence réalisées avec des cellules U2OS qui expriment les protéines de fusion GFP-CHK2 ou FLAG-CHK2, nous révélons une localisation centrosomale de CHK2 dans les cellules en mitose, mais pas en interphase. Ce résultat a été confirmé par vidéomicroscopie dans les cellules vivantes exprimant GFP-CHK2. Pour déterminer le ou les rôles potentiels de CHK2 en mitose nous avons réalisé des expériences pour explorer le rôle de CHK2 dans la progression de la mitose, la nucléation des microtubules aux centrosomes et la progression de la mitose en présence de problèmes d’attachement des chromosomes où de lésions génotoxiques. Nos données suggèrent que CHK2 n’est pas impliquée dans la régulation de la mitose dans les cellules U2OS.

Le rôle de l’inflammation dans le développement des complications neurologiques associées à l’insuffisance hépatique aiguë chez la souris

L’insuffisance hépatique aiguë (IHA) se caractérise par la perte soudaine de la fonction hépatique résultant de la nécrose massive des hépatocytes en l’absence de pathologie hépatique préexistante. L’IHA s’accompagne de perturbations métaboliques et immunologiques qui peuvent entraîner l’apparition de complications périphériques et cérébrales telles qu’un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS), une encéphalopathie hépatique (EH), un œdème cérébral, une augmentation de la pression intracrânienne, et la mort par herniation du tronc cérébral. Les infections sont une complication fréquente de l’IHA et elles sont associées à un risque accru de développer un SIRS et une aggravation subséquente de l’EH avec un taux de mortalité augmenté. L’ammoniaque joue un rôle majeur dans les mécanismes physiopathologiques qui mènent au développement de l’EH et de l’œdème cérébral, et des études récentes suggèrent que les cytokines pro-inflammatoires sont également impliquées. Le but de cette thèse est d’étudier le rôle des cytokines pro-inflammatoires circulantes et cérébrales dans le développement de l’EH et de l’œdème cérébral lors d’IHA. Dans l’article 1, nous démontrons que l’inhibition périphérique du facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) par l’etanercept retarde la progression de l’EH en diminuant le dommage hépatocellulaire, réduisant l’inflammation périphérique et centrale ainsi que le stress oxydatif/nitrosatif hépatique et cérébral associé chez la souris avec une IHA induite par l’azoxyméthane (AOM). Ces résultats démontrent un rôle important du TNF-α dans la physiopathologie de l’EH lors d’IHA d’origine toxique et suggèrent que l’etanercept pourrait constituer une approche thérapeutique dans la prise en charge des patients en attente de transplantation hépatique. Dans l’article 2, nous simulons la présence d’une infection chez la souris avec une IHA induite par l’AOM pour mettre en évidence une éventuelle augmentation de la réponse inflammatoire. Nous démontrons que l’endotoxémie induite par le lipopolysaccharide (LPS) précipite la survenue du coma et aggrave la pathologie hépatique. Les cytokines pro-inflammatoires systémiques et cérébrales sont augmentées de façon synergique par le LPS lors d’IHA et résultent en une activation accrue de la métalloprotéinase matricielle-9 cérébrale qui s’accompagne d’une extravasation d’immunoglobulines G (IgG) dans le parenchyme cérébral. Ces résultats démontrent une augmentation majeure de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui contribue à la pathogenèse de l’EH lors d’IHA en condition infectieuse. Les résultats de l’article 3 démontrent que l’augmentation de la perméabilité de la BHE lors d’IHA induite par l’AOM en condition non infectieuse ne résulte pas de l’altération de l’expression des protéines constitutives de la BHE. Dans l’article 4, nous démontrons que l’exposition d’astrocytes en culture à des concentrations physiopathologiques d’ammoniaque ou d’interleukine-1β résulte en l’altération de gènes astrocytaires impliqués dans la régulation du volume cellulaire et dans le stress oxydatif/nitrosatif. Un effet additif est observé dans le cas d’un traitement combiné au niveau des gènes astrocytaires impliqués dans le stress oxydatif/nitrosatif. L’ensemble des résultats de cette thèse démontre un rôle important de l’inflammation périphérique et cérébrale dans la survenue des complications neurologiques lors d’IHA et une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués pourrait contribuer à la mise en place de stratégies thérapeutiques chez les patients atteints d’IHA en attente de transplantation.

The Role of MicroRNA Regulation of Cardiac Ion Channel in Arrhythmia

La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme le plus fréquemment observé en pratique clinique. Elle constitue un risque important de morbi-mortalité. Le traitement de la FA reste un défi majeur en lien avec les nombreux effets secondaires associés aux approches thérapeutiques actuelles. Dans ce contexte, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la FA est essentielle pour le développement de nouvelles thérapies offrant un meilleur rapport bénéfice/risque pour les patients. La FA est caractérisée par i) un remodelage électrique délétère associé le plus souvent ii) à un remodelage structurel du myocarde favorisant la récurrence et le maintien de l’arythmie. La diminution de la période réfractaire effective au sein du tissu auriculaire est un élément clef du remodelage électrique. Le remodelage structurel, quant à lui, se manifeste principalement par une fibrose tissulaire qui altère la propagation de l’influx électrique dans les oreillettes. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la mise en place de ces deux substrats restent mal connus. Récemment, le rôle des microARNs (miARNs) a été pointé du doigt dans de nombreuses pathologies notamment cardiaques. Dans ce contexte les objectifs principaux de ce travail ont été i) d'acquérir une compréhension approfondie du rôle des miARNs dans la régulation de l’expression des canaux ioniques et ii) de mieux comprendre le rôle de ces molécules dans l’installation d’un substrat favorable a la FA. Nous avons, dans un premier temps, effectué une analyse bio-informatique combinée à des approches expérimentales spécifiques afin d’identifier clairement les miARNs démontrant un fort potentiel de régulation des gènes codant pour l’expression des canaux ioniques cardiaques humains. Nous avons identifié un nombre limité de miARNs cardiaques qui possédaient ces propriétés. Sur la base de ces résultats, nous avons démontré que l’altération de l'expression des canaux ioniques, observée dans diverse maladies cardiaques (par exemple, les cardiomyopathies, l’ischémie myocardique, et la fibrillation auriculaire), peut être soumise à ces miARNs suggérant leur implication dans l’arythmogénèse. La régulation du courant potassique IK1 est un facteur déterminant du remodelage électrique auriculaire associée à la FA. Les mécanismes moléculaires sous-jacents sont peu connus. Nous avons émis l’hypothèse que l'altération de l’expression des miARNs soit corrélée à l’augmentation de l’expression d’IK1 dans la FA. Nous avons constaté que l’expression de miR-26 est réduite dans la FA et qu’elle régule IK1 en modulant l’expression de sa sous-unité Kir2.1. Nous avons démontré que miR-26 est sous la répression transcriptionnelle du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) et que l’activité accrue de NFATc3/c4, aboutit à une expression réduite de miR-26. En conséquence IK1 augmente lors de la FA. Nous avons enfin démontré que l’interférence in vivo de miR-26 influence la susceptibilité à la FA en régulant IK1, confirmant le rôle prépondérant de miR-26 dans le remodelage auriculaire électrique. La fibrose auriculaire est un constituant majeur du remodelage structurel associé à la FA, impliquant l'activation des fibroblastes et l’influx cellulaire du Ca2 +. Nous avons cherché à déterminer i) si le canal perméable au Ca2+, TRPC3, jouait un rôle dans la fibrose auriculaire en favorisant l'activation des fibroblastes et ii) étudié le rôle potentiel des miARNs dans ce contexte. Nous avons démontré que les canaux TRPC3 favorisent l’influx du Ca2 +, activant la signalisation Ca2 +-dépendante ERK et en conséquence activent la prolifération des fibroblastes. Nous avons également démontré que l’expression du TRPC3 est augmentée dans la FA et que le blocage in vivo de TRPC3 empêche le développement de substrats reliés à la FA. Nous avons par ailleurs validé que miR-26 régule les canaux TRPC3 en diminuant leur expression dans les fibroblastes. Enfin, nous avons montré que l'expression réduite du miR-26 est également due à l’activité augmentée de NFATc3/c4 dans les fibroblastes, expliquant ainsi l’augmentation de TRPC3 lors de la FA, confirmant la contribution de miR-26 dans le processus de remodelage structurel lié à la FA. En conclusion, nos résultats mettent en évidence l'importance des miARNs dans la régulation des canaux ioniques cardiaques. Notamment, miR-26 joue un rôle important dans le remodelage électrique et structurel associé à la FA et ce, en régulant IK1 et l’expression du canal TRPC3. Notre étude démasque ainsi un mécanisme moléculaire de contrôle de la FA innovateur associant des miARNs. miR-26 en particulier représente apres ces travaux une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour traiter la FA.