Untersuchungen zum Engraftment primärer humaner akuter myeloischer Leukämieblasten in einem immundefizienten Mausmodel

Die akute myeloische Leukämie (AML) stellt ein äußerst heterogenes hämatologisches Krankheitsbild dar, welches durch die unkontrollierte Proliferation unausdifferenzierter und gleichzeitig nicht-funktioneller hämatopoetischer Zellen gekennzeichnet ist. Sowohl die unterschiedliche Zellherkunft, als auch zytogenetische Aberrationen und molekulargenetische Mutationen sorgen für eine große Diversität der Erkrankung. In der Therapie kommen Chemotherapeutika zum Einsatz, welche die Leukämie in eine komplette Remission bringen sollen. Der einzige kurative Ansatz besteht aus der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation. Abgesehen von den gewünschten kurativen Effekten, induzieren die im Transplantat befindlichen Spender-T-Lymphozyten ebenfalls die Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung – eine Hauptursache von Mortalität und Morbidität nach erfolgter allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Da bei vielen Patienten aufgrund ihres Alters und ihrer Begleiterkrankungen eine Transplantation nicht tolerieren und da viele akuten myeloischen Leukämien trotz Chemotherapie progredient sind, schlägt die Therapie fehl und es gibt keine Chance auf Heilung. rnZur Erforschung der pathologischen Prozesse der akuten myeloischen Leukämie sowie für die Entwicklung neuer Therapiekonzepte bedarf es stabiler Tiermodelle, die die maligne Erkrankung des Menschen darstellen können. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Engraftments humaner primärer akuter myeloischer Leukämien in immuninkompetenten NSG-Mäusen. Die Untersuchungen zeigten, dass lediglich 61,5% der getesteten Leukämien in den Versuchstieren nach der Xenotransplantation nachgewiesen werden konnten. Die Gründe hierfür sind noch nicht ausreichend geklärt, beinhalten jedoch vermutlich Elemente des Homings, des Überlebens der Zelle in der fremden murinen Knochenmarknische, der Abwesenheit spezifischer humaner Wachstumsfaktoren, sowie intrinsische Unterschiede unter den verschiedenen Leukämieproben. Leukämien, die mit einer schlechten Prognose beim Patienten verbunden sind, wachsen in den Tieren stärker an. In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass Leukämien mit einer Längenmutation des FLT3-Rezeptors eher häufiger in den NSG-Mäusen anwachsen, als wenn diese Mutation fehlt. Die Analyse der erstellten Wachstumskinetiken zweier Leukämien ergab, dass die Höhe des Engraftments in den einzelnen Organen sowohl von der transplantierten Zellmenge, als auch von der Höhe der angesetzten Versuchszeit abhängt. Zudem wurde ein Wachstum humaner T-Lymphozyten in den xenotransplantierten Mäusen beobachtet, welches sowohl mit einem höheren Engraftment der Leukämie in der Maus verbunden war, als auch mit einer höheren Tiersterblichkeit vergesellschaftet war.rnZum Verhindern dieses Wachstums wurden zwei unterschiedliche Methoden angewendet und miteinander verglichen. Dabei erzielten sowohl die medikamentöse Behandlung der Tiere mit dem Calcineurininhibitor Cyclosporin A, als auch die CD3-Depletion der Leukämie vor der Transplantation ein T-Zell-freies Wachstum in den Mäusen, letzteres erwies sich jedoch als das schonendere Verfahren. In den T-Zell-freien Tieren konnte bei dem Großteil der Tiere kein Engraftment im Knochenmark festgestellt werden, was auf einen positiven Einfluss der humanen T-Lymphozyten beim Vorgang des Engraftments schließen lässt.rn

Untersuchungen zum Ectodomain shedding des Receptor for advanced glycation endproducts

Zu den Liganden des Zelloberflächenrezeptors RAGE gehören AGEs, S100-Proteine, HMGB1 und Aβ. RAGE wird daher eine Rolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen sowie Diabetes, Arteriosklerose und Krebs zugesprochen. Des Weiteren geht eine Verringerung der Menge an sRAGE häufig mit diesen Krankheiten einher. Aus diesen Gründen stellt die pharmakologische Stimulierung der Proteolyse von RAGE eine vielversprechende Therapieform dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Steigerung der sRAGE-Bildung über PAC1-, V2- und OT-Rezeptoren möglich ist. Die Untersuchung der PAC1-Signalwege zeigte, dass PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+-Ionen, PI3-Kinase und der MAP-Kinase-Weg wichtig für die Stimulierung sind und dass der PKA-Weg nicht beteiligt ist. Die dreimonatige Behandlung von Mäusen mit PACAP-38 weist darauf hin, dass eine Stimulierung des Ectodomain Sheddings von RAGE auch in vivo erfolgen kann. Die Untersuchung der Signalwege, ausgehend von den V2- und OT-Rezeptoren, zeigte, dass ebenfalls PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+-Ionen zur Aktivierung der Proteasen führen, dagegen konnte weder ein Einfluss des PKA- noch des MAP-Kinase-Weges festgestellt werden. Außerdem wurden sowohl MMP-9 als auch ADAM-10 als RAGE-spaltende Proteasen identifiziert. Die nähere Untersuchung der RAGE-Spaltstelle erbrachte, dass keine spezifische Sequenz, sondern vielmehr die Sekundärstruktur eine Rolle bei der Erkennung durch die Proteasen spielt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin ein anti-RAGE Antikörper anhand einer neu entwickelten Methode zunächst gereinigt und dann erfolgreich an ein mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin markiertes Polymer gekoppelt. Die Stimulierung der Proteolyse von Meprin β wurde auch untersucht und es konnte ebenfalls eine Beteiligung von ADAM-10 an der Spaltung nachgewiesen werden.

Mechanistic study of cell death induction by O 6-methylating agents, focusing on the role of homologous recombination as a molecular target for sensitization of tumor cells to chemotherapeutic alkylating agents

Chemotherapeutic SN1‑methylating agents are important anticancer drugs. They induce several covalent modifications in the DNA, from which O6‑methylguanine (O6MeG) is the main toxic lesion. In this work, different hypotheses that have been proposed to explain the mechanism of O6MeG‑triggered cell death were tested. The results of this work support the abortive processing model, which states that abortive post‑replicative processing of O6MeG‑driven mispairs by the DNA mismatch repair (MMR) machinery results in single‑strand gaps in the DNA that, upon a 2nd round of DNA replication, leads to DNA double‑strand break (DSB) formation, checkpoint activation and cell death. In this work, it was shown that O6MeG induces an accumulation of cells in the 2nd G2/M‑phase after treatment. This was accompanied by an increase in DSB formation in the 2nd S/G2/M‑phase, and paralleled by activation of the checkpoint kinases ATR and CHK1. Apoptosis was activated in the 2nd cell cycle. A portion of cells continue proliferating past the 2nd cell cycle, and triggers apoptosis in the subsequent generations. An extension to the original model is proposed, where the persistence of O6MeG in the DNA causes new abortive MMR processing in the 2nd and subsequent generations, where new DSB are produced triggering cell death. Interestingly, removal of O6MeG beyond the 2nd generation lead to a significant, but not complete, reduction in apoptosis, pointing to the involvement of additional mechanisms as a cause of apoptosis. We therefore propose that an increase in genomic instability resulting from accumulation of mis‑repaired DNA damage plays a role in cell death induction. Given the central role of DSB formation in toxicity triggered by chemotherapeutic SN1‑alkylating agents, it was aimed in the second part of this thesis to determine whether inhibition of DSB repair by homologous recombination (HR) or non‑homologous end joining (NHEJ) is a reasonable strategy for sensitizing glioblastoma cells to these agents. The results of this work show that HR down‑regulation in glioblastoma cells impairs the repair of temozolomide (TMZ)‑induced DSB. HR down‑regulation greatly sensitizes cells to cell death following O6‑methylating (TMZ) or O6‑chlorethylating (nimustine) treatment, but not following ionizing radiation. The RNAi mediated inhibition in DSB repair and chemo‑sensitization was proportional to the knockdown of the HR protein RAD51. Chemo‑sensitization was demonstrated for several HR proteins, in glioma cell lines proficient and mutated in p53. Evidence is provided showing that O6MeG is the primary lesion responsible for the increased sensitivity of glioblastoma cells following TMZ treatment, and that inhibition of the resistance marker MGMT restores the chemo‑sensitization achieved by HR down‑regulation. Data are also provided to show that inhibition of DNA‑PK dependent NHEJ does not significantly sensitized glioblastoma cells to TMZ treatment. Finally, the data also show that PARP inhibition with olaparib additionally sensitized HR down‑regulated glioma cells to TMZ. Collectively, the data show that processing of O6MeG through two rounds of DNA replication is required for DSB formation, checkpoint activation and apoptosis induction, and that O6MeG‑triggered apoptosis is also executed in subsequent generations. Furthermore, the data provide proof of principle evidence that down‑regulation of HR is a reasonable strategy for sensitizing glioma cells to killing by O6‑alkylating chemotherapeutics.

Ursachen der Anthrazyklin-induzierten Kardiotoxizität : Einfluss der individuellen genetischen Ausstattung, des oxidativen Stresses und der Metabolisierung

Doxorubizin (Dox) gehört zur Gruppe der Anthrazykline, welche seit mehreren Jahrzehnten erfolgreich gegen ein breites Spektrum an Tumoren eingesetzt wird. Neben der guten Wirksamkeit besitzt Dox jedoch auch ein sehr hohes Nebenwirkungspotential. Die wohl folgenschwerste Nebenwirkung stellt die irreversible Schädigung des Herzens dar. Zahlreiche Faktoren, wie zum Beispiel die kumulative Dox-Dosis konnten bereits mit einer erhöhten Inzidenz an kardialen Schäden in Verbindung gebracht werden. Bislang ungeklärt war jedoch die Frage, warum Patienten unterschiedlich sensibel auf die Verabreichung von Dox reagierten. rnAn dem Patientenkollektiv der Ricover60-Studie wurde der Einfluss der individuellen genetischen Ausstattung auf die Entstehung der Anthrazyklin-induzierten Herzschädigung untersucht. Alle Patienten mit Dox-induzierten Herzschäden wurden identifiziert und auf das Vorhandensein von genetischen Polymorphismen der NAD(P)H-Oxidase (CYBA, RAC2 und NCF4) und der Anthrazyklin-Transporter (MRP1 und MRP2) untersucht. Sowohl für CYBA als auch für RAC2 konnte eine Anreicherung bestimmter Genotypen (CYBA: CT/TT; RAC2: TA/AA) in der Gruppe der herzgeschädigten Patienten nachgewiesen werden. In der Multivariaten Analyse von RAC2 erreichte diese Anreicherung ein signifikantes Niveau (p=0.028). Damit konnte für diesen Polymorphismus die klinische Relevanz bestätigt werden.rnDie Ursachen der Dox-induzierten Toxizität wurden außerdem an verschiedenen Mäusestämmen und Zelllinien untersucht. Balb/c- und C57BL/6-Mäuse, die bekanntermassen unterschiedlich sensibel auf Dox reagierten, wurden mit Dox behandelt. Anschliessend wurden die Organe Herz, Leber und Blut via HPLC untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich 1. die Hauptanreicherungsorte für Dox und Doxol (Balb/c: Herz und Blut versus C57BL/6: Leber), 2. die nachgewiesenen Gesamtmengen an Dox+Doxol+Doxon in den drei Organen (MengeC57BL/6 > MengeBalb/c) sowie 3. die An- und Abflutungsgeschwindigkeiten von Dox zwischen den beiden Mäusestämmen unterscheiden. Schlussendlich konnte im Vergleich zu den Balb/c-Mäusen, bei den C57BL/6-Mäusen eine stärkere kardiale Anreicherung von Dox nach der mehrmaligen Dox-Injektion nachgewiesen werden. Somit scheinen der deutlich höhere Dox-Gehalt und die längere Verweilzeit in den Herzen für die stärkere kardiale Schädigung der C57BL/6-Mäuse verantwortlich zu sein. Hingegen verlief die Art der Dox-Metabolisierung in beiden Mäusestämmen ähnlich. rnBei der Betrachtung des oxidativen Stresses konnte gezeigt werden, dass in den Herzen der C57BL/6-Mäusen ein gröβerer oxidativer Stress vorlag, als bei den Balb/c-Mäusen. Ähnlich wie bei der Ricover60-Studie ließ sich auch bei den Mäusen eine Beteiligung der NAD(P)H-Oxidase am Dox-induzierten oxidativen Stress nachweisen. rnMit der HTETOP-Zelllinie konnte gezeigt werden, dass Dox unter physiologischen Bedingungen oxidativen Stress auslösen kann. Die Art und die Konzentration der gebildeten ROS waren abhängig von der Dox-Konzentration, der Einwirkzeit und der Kompensationsfähigkeit der Zellen. Durch die Gabe von Dex ließ sich das Ausmaß des oxidativen Stresses lediglich in den Mäuseherzen reduzieren. In den HTETOP-Zellen zeigte Dex selbst stressauslösende Eigenschaften. Durch die Behandlung mit Dex / DOXY konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der Topo IIα selbst oxidativen Stress in den HTETOP-Zellen auslöst. Jedoch scheint weder die Topo IIalpha-Hemmung, noch der Dox-induzierte oxidative Stress bei physiologischen Dox-Konzentrationen (< 1 µM) eine entscheidende Rolle für die Toxizität zu spielen. rnIn der Mikroarray-Analyse der HTETOP-Zellen konnten verschiedene Gene identifiziert werden, die in den oxidativen Stress involviert sind und die durch die Gabe von Dox differentiell reguliert werden. Durch die Komedikation mit Dex / DOXY ließen sich diese Veränderungen teilweise modulieren. rn

Stress & structure of thin polymer brush films

Polymer brushes have unique properties with a large variety of possible applications ranging from responsive coatings and drug delivery to lubrication and sensing. For further development a detailed understanding of the properties is needed. Established characterization methods, however, only supply information of the surface. Experimental data about the inner “bulk” structure of polymer brushes is still missing.rnScattering methods under grazing incidence supply structural information of surfaces as well as structures beneath it. Nanomechanical cantilevers supply stress data, which is giving information about the forces acting inside the polymer brush film. In this thesis these two techniques are further developed and used to deepen the understanding of polymer brushes. rnThe experimental work is divided into four chapters. Chapter 2 deals with the preparation of polymer brushes on top of nanomechanical cantilever sensors as well as large area sample by using a “grafting-to” technique. The further development of nanomechanical cantilever readout is subject of chapter 3. In order to simplify cantilever sensing, a method is investigated which allows one to perform multiple bending experiments on top of a single cantilever. To do so, a way to correlate different curvatures is introduced as well as a way to conveniently locate differently coated segments. In chapter 4 the change in structure upon solvent treatment of mixed polymer brushes is investigated by using scattering methods and nanomechanical cantilevers amongst others. This allows one to explain the domain memory effect, which is typically found in such systems. Chapter 5 describes the implementation of a phase shifting interferometer - used for readout of nanomechanical cantilevers - into the µ-focused scattering beamline BW4, allowing simultaneous measurements of stress and structure information. The last experimental chapter 6 deals with the roughness correlation in polymer brushes and its dependence on the chain tethered density.rnIn summary, the thesis deals with utilization of new experimental techniques for the investigation of polymer brushes and further development of the techniques themselves.rn

Untersuchungen zur Chemosensitivität von testikulären Tumorzellen gegenüber Cisplatin

Metastasierender Krebs ist bei Erwachsenen in der Regel nicht heilbar. Eine Ausnahme stellen testikuläre Keimzelltumoren (TKZT) dar, da über 75 % der Patienten mit fortgeschrittenen metastasierenden TKZT mit einer auf Cisplatin basierenden Kombinations-Chemotherapie geheilt werden können. Zelllinien, die aus TKZT isoliert wurden, behalten diese Cisplatin-Sensitivität in vitro bei. Somit spiegeln Testistumorzelllinien die klinische Situation wider und sind deswegen ein gutes Modellsystem um zu untersuchen, welche Faktoren der Cisplatin-Sensitivität zugrunde liegen. Die Ursachen der Cisplatin-Sensitivität in Testistumoren sind nicht bekannt. Es wurde bereits gezeigt, dass Testistumorzellen eine geringe Kapazität für die Entfernung von Cisplatin-induzierten DNA-Platinierungen aufweisen. Dieser Defekt in der DNA-Reparatur könnte ein Faktor für die beobachtete Cisplatin-Sensitivität sein. Cisplatin induziert sowohl Intrastrang-Vernetzungen als auch Interstrang-Vernetzungen (ICLs). Die Bildung und Reparatur der Cisplatin-induzierten Intrastrang-Vernetzungen wurde mittels DNA-Slot-Blot, die Bildung und Entfernung von Interstrang-Vernetzungen wurde mithilfe des Comet-Assays untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Reparatur von Intrastrang-Vernetzungen in Testis- und Blasentumorzelllinien vergleichbar ist. Somit sind Testistumorzellen in diesem Reparaturweg nicht beeinträchtigt. Im Unterschied dazu zeigte sich, dass Testistumorzellen die ICLs nicht oder nur mit einer reduzierten Kapazität entfernen können.Da die ICL-Reparatur über die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) mit anschließender DSB-Reparatur verläuft, wurde die Kinetik der DSB-Reparatur anhand der Immundetektion der Histon-Variante γH2AX, die zur Visualisierung von DSB verwendet wird, verfolgt. γH2AX Foci wurden nach Behandlung mit Cisplatin in Testistumorzellen und Blasentumorzellen gebildet. Anders als in Blasentumorzellen blieb der Prozentsatz an γH2AX-positiven Zellen in Testistumorzellen bestehen. Offensichtlich konnten die Testistumorzellen die Cisplatin-induzierten ICLs nicht korrekt prozessieren, was dazu führte, dass γH2AX Foci persistierten. Da unreparierte DNA-Läsionen eine DNA-schadensabhängige Antwort einleiten können, wurde die Aktivierung der Hauptfaktoren dieser Signalwege untersucht. In den Testistumorzellen zeigte sich eine Erhöhung der p53 Proteinmenge nach Cisplatin-Behandlung. Des Weiteren wurde die durch Cisplatin induzierte Aktivierung von ATM/ATR, Chk1/Chk2, Bax und Noxa in Testis- und Blasentumorzellen vergleichend untersucht. Es wurde bereits gezeigt, dass der Reparaturfaktor ERCC1-XPF in Testistumorzelllinien reduziert vorliegt. Um eine mögliche Rolle von ERCC1-XPF für die Reparatur-Defizienz der ICLs und Cisplatin-Sensitivität in Testistumorzellen zu analysieren, wurde ERCC1-XPF in der Testistumorenzelllinie 833K mithilfe eines Expressionsvektors überexprimiert, und der Einfluss von ERCC1-XPF auf ICL-Reparatur sowie Cisplatin-Sensitivität wurde ermittelt. Überexpression von ERCC1-XPF führte zur Reparatur der ICLs in 833K-Zellen und verminderte die Cisplatinsensitivität. Somit scheint die Cisplatinsensitivität der Testistumorzellen, zumindest zum Teil, auf einer verminderten ICL-Reparatur zu beruhen. Des Weiteren wurde in „proof of principle“ Experimenten ERCC1-XPF in der Cisplatin-resistenten Blasentumorzelllinie MGH-U1 mittels siRNA herunterreguliert, und die Auswirkung der Herunterregulation auf die ICL-Reparatur und die Cisplatinsensitivität wurde geprüft. RNA-Interferenz-vermittelte Herunterregulierung von ERCC1-XPF reduzierte die Prozessierung der Cisplatin-induzierten ICLs und verstärkte die Cisplatinsensitivität in MGH-U1 Zellen. Somit wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt, dass die Testistumorzellen in Vergleich zu Blasentumorzellen in der Reparatur von ICLs defizient sind, wobei die verminderte ICL-Reparatur auf die geringe Expression von ERCC1-XPF zurückgeführt werden konnte. Diese ICL-Reparatur-Defizienz könnte, zumindest zu einem Teil, für die Sensitivität der Testistumoren gegenüber Cisplatin verantwortlich sein.

Die Bedeutung von KSRP für die pro-inflammatorische Genexpression in Autoimmunerkrankungen - Einfluss des Naturstoffes Resveratrol auf KSRP-vermittelte Regulationsmechanismen

Die Pathogenese chronisch inflammatorischer Erkrankungen ist von einer Dysregulation der pro-inflammatorischen Genexpression geprägt. Dieser liegen wahrscheinlich pathologische Veränderungen der Aktivität von verschiedenen Transkriptionsfaktoren und RNA-bindenden Proteinen zugrunde. In dieser Arbeit konnte die Regulation der KSRP-Expression in einem murinen Modell der rheumatoiden Arthritis (RA) nachgewiesen werden. In humanen Chondrozyten führte eine erhöhte KSRP-Expression zu einer Reduktion der Expression von bekannten KSRP-Zielgenen. Der Vergleich von verschiedenden Microarray-Analysen aus den verwendeten humanen und murinen Modellen der RA führte zur Identifikation von pro-inflammatorischen und pro-angiogenetischen Faktoren (SPARC, MMP2, MMP3, PLA2G2D, GZMA, HPSE, TNMD und IL-18-R), die in der RA eine Rolle spielen und höchstwahrscheinlich durch eine erhöhte KSRP-Expression reguliert werden. Daher könnte eine Modulation der KSRP-Expression bei der Therapie von Autoimmunerkrankungen von Bedeutung sein. In diesem Zusammenhang ist die Detektion der Bindung des cardioprotektiven und anti-inflammatorisch wirkenden Naturstoffs Resveratrol an KSRP zu nennen. Diese spezifische Interaktion führte zu einer Reduktion der p38-MAPK-vermittelten Thr-Phosphorylierung des KSRP-Proteins (in situ und in vivo), was eine Aktivierung der KSRP-vermittelten Mechanismen zur Folge hatte. Somit konnte in situ die mRNA-Stabilität der iNOS reduziert und die miR-155-Expression erhöht werden. Im murinen Atherosklerosemodell führte die Behandlung mit Resveratrol zu einer verringerten Expression bekannter KSRP-Ziel-mRNAs. rnNeben diesem post-translationalen Regulationsmechanismus von KSRP durch Resveratrol konnte die Modulation der KSRP-Expression auf transkriptioneller Ebene durch KSRP selbst gezeigt werden. Dies geschieht möglicherweise über die Bindung von KSRP an das FUSE-analoge Element innerhalb des KSRP-Promotors, welches eine positive Autoregulation der KSRP-Expression bewirkt. Bei der Analyse der post-transkriptionellen Regulation der KSRP-Expression interagierten die mRNA-bindenden Proteine HuR, PABP und die AUF-1-Isoformen p40, p42 und p45 in vitro mit der KSRP-3’UTR. Dabei konnte in Expressionsanalysen nachgewiesen werden, dass die KSRP-mRNA durch PABP positiv und durch p42 negativ reguliert wird.rnZusammenfassend ist zu sagen, dass die KSRP-Expression neben post-translationalen Mechanismen auch auf transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene moduliert wird. Zusätzlich wurde eine Regulation der KSRP-Expression innerhalb entzündlicher Erkrankungen nachgewiesen, die Bedeutung dieser Modulation für die pro-inflammatorischen Genexpression diskutiert und ein möglicher therapeutischer Angriffspunkt durch Resveratrol identifiziert.

Untersuchungen zu der Rolle der extrazellulären Matrix bei Fibrose und bei Tumoren

Diese Arbeit befasst sich mit der Rolle der extrazellulären Matrix und insbesondere des Proteins Fibronektin bei der Leberfibrose und bei der Einnistung von Tumorzellen in die Stammzellnische im Knochenmark.rnrnHierfür wurde in einem Fibrosemodell das Peptid pUR4b verwendet, welches die Assemblierung einer Fibronektinmatrix verhindert. Bei der Verwendung dieses Peptids während und nach der Induktion einer Leberfibrose durch die Chemikalie Dimethylnitrosamin konnte eine Verminderung der Kollagenmenge (und damit des fibrotischen Narbengewebes) in der Leber im Vergleich zu fibrotischen Kontrolltieren beobachtet werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass dieser Effekt unabhängig von der Aktivierung der hepatischen Stellatezellen ist, jedoch zum Teil von einer verminderten Anzahl entzündlicher Zellen abhängig sein könnte. Eine verminderte Bildung von Gesamt- und aktivem TGF-β, welche zum Teil auf Effekte der verringerten Zahl der inflammatorischen Zellen zurückzuführen sein könnte, unterstützt den Effekt des verminderten Aufbaus von Narbengewebe. In vitro Untersuchungen zeigten, dass hepatische Stellatezellen bei einer Behandlung mit pUR4b weniger Fibronektin in die extrazelluläre Matrix einbauten als unbehandelte hepatische Stellatezellen. Insgesamt sprechen die Daten dafür, dass das Peptid pUR4b den Aufbau einer Fibronektinmatrix verhinderte bzw. verminderte, wodurch die Ablagerung anderer Komponenten der extrazellulären Matrix wie z.B. Kollagen gestört war und es daher zu einem Rückgang des fibrotischen Narbengewebes kam.rnrnFür die Untersuchung des Einflusses der extrazellulären Matrix und des Fibronektins bei der Einnistung von Tumorzellen wurde zunächst das Fibronektin mit Hilfe konditioneller Knockout-Mäuse in verschiedenen Zellen bzw. Organen der Tiere ausgeschaltet. Weder die Ausschaltung des zirkulierenden, noch des durch Osteoblasten und Osteozyten gebildeten, noch des zirkulierenden und von Zellen des Knochenmarks gebildeten Fibronektins beeinträchtigte die Einnistung von Tumorzellen. Auch die Bildung eines Hämatoms im Knochen hatte weder einen Einfluss auf die Einnistung von Tumorzellen noch auf die spätere Tumorentwicklung. Die Ausschaltung des tumorzellendogenen Fibronektins führte hingegen zu einer signifikant verminderten Einnistung von Tumorzellen. Diese ist wahrscheinlich auf die verstärkte Affinität dieser Tumorzellen zu Zellen des Immunsystems zurückzuführen. Diese Beobachtung konnte zum Teil durch eine verstärkte eCadherin Expression erklärt werden, welche die Bindung an verschiedene Zellen des Immunsystems vermittelt. Eine Untersuchung der osteoblastischen Stammzellnische durch die kombinierte Gabe von Parathormon und Zoledronsäure führte zu keiner Veränderung der Fibronektinkonzentration innerhalb des Knochenmarks der behandelten Tiere. Dennoch nisteten sich in dem Knochenmark der mit Parathormon und Zoledronsäure behandelten Tiere signifikant mehr Tumorzellen ein als in dem von Kontrolltieren. Dieser Effekt konnte auf einen synergetischen Effekt von Parathormon und Zoledronsäure zurückgeführt werden, der zu einer gesteigerten Osteoblastenaktivität und Änderungen der Zytokinkonzentrationen im Knochenmark führte.rnZusammenfassend zeigte sich, dass eine Veränderung der extrazelluläre Matrix und insbesondere des Proteins Fibronektin bei Leberfibrose zu einem veränderten Krankheitsbild führt und die Einnistung von Tumorzellen in das Knochenmark beeinflusst.rn

Synthetic routes toward functional block copolymers and bioconjugates via RAFT polymerization

Synthetic Routes toward Functional Block Copolymers and Bioconjugates via RAFT PolymerizationrnSynthesewege für funktionelle Blockcopolymere und Biohybride über RAFT PolymerisationrnDissertation von Dipl.-Chem. Kerstin T. WissrnIm Rahmen dieser Arbeit wurden effiziente Methoden für die Funktionalisierung beider Polymerkettenenden für Polymer- und Bioanbindung von Polymeren entwickelt, die mittels „Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer“ (RAFT) Polymerisation hergestellt wurden. Zu diesem Zweck wurde ein Dithioester-basiertes Kettentransferagens (CTA) mit einer Aktivestereinheit in der R-Gruppe (Pentafluorphenyl-4-phenylthiocarbonylthio-4-cyanovaleriansäureester, kurz PFP-CTA) synthetisiert und seine Anwendung als universelles Werkzeug für die Funktionalisierung der -Endgruppe demonstriert. Zum Einen wurde gezeigt, wie dieser PFP-CTA als Vorläufer für die Synthese anderer funktioneller CTAs durch einfache Aminolyse des Aktivesters genutzt werden kann und somit den synthetischen Aufwand, der üblicherweise mit der Entwicklung neuer CTAs verbunden ist, reduzieren kann. Zum Anderen konnte der PFP-CTA für die Synthese verschiedener Poly(methacrylate) mit enger Molekulargewichtsverteilung und wohl definierter reaktiver -Endgruppe verwendet werden. Dieses Kettenende konnte dann erfolgreich mit verschiedenen primären Aminen wie Propargylamin, 1-Azido-3-aminopropan und Ethylendiamin oder direkt mit den Amin-Endgruppen verschiedener Peptide umgesetzt werden.rnAus der Reaktion des PFP-CTAs mit Propargylamin wurde ein Alkin-CTA erhalten, der sich als effizientes Werkzeug für die RAFT Polymerisation verschiedener Methacrylate erwiesen hat. Der Einbau der Alkin-Funktion am -Kettenende wurde mittels 1H und 13C NMR Spektroskopie sowie MALDI TOF Massenspektroskopie bestätigt. Als Modelreaktion wurde die Kopplung eines solchen alkin-terminierten Poly(di(ethylenglykol)methylethermethacrylates) (PDEGMEMA) mit azid-terminiertem Poly(tert-butylmethacrylat), das mittels Umsetzung einer Aktivester-Endgruppe erhalten wurde, als kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) durchgeführt. Die Aufarbeitung des resultierenden Diblockcopolymers durch Fällen ermöglichte die vollständige Abtrennung des Polymerblocks 1, der im Überschuss eingesetzt wurde. Darüber hinaus blieb nur ein sehr kleiner Anteil (< 2 Gew.-%) nicht umgesetzten Polymerblocks 2, was eine erfolgreiche Polymeranbindung und die Effizienz der Endgruppen-Funktionalisierung ausgehend von der Aktivester--Endgruppe belegt.rnDie direkte Reaktion von stimuli-responsiven Polymeren mit Pentafluorphenyl(PFP)ester-Endgruppen, namentlich PDEGMEMA und Poly(oligo(ethylenglykol)methylethermethacrylat), mit kollagen-ähnlichen Peptiden ergab wohl definierte Polymer-Peptid-Diblockcopolymere und Polymer-Peptid-Polymer-Triblockcopolymer unter nahezu quantitativer Umsetzung der Endgruppen. Alle Produkte konnten vollständig von nicht umgesetztem Überschuss des Homopolymers befreit werden. In Analogie zu natürlichem Kollagen und dem nicht funktionalisierten kollagen-ähnlichen Peptid bilden die PDEGMEMA-basierten, entschützten Hybridcopolymere Trimere mit kollagen-ähnlichen Triple-Helices in kalter wässriger Lösung, was mittels Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie (CD) nachgewiesen werden konnte. Temperaturabhängige CD-Spektroskopie, Trübungsmessungen und dynamische Lichtstreuung deuteten darauf hin, dass sie bei höheren Temperaturen doppelt stimuli-responsive Überstrukturen bilden, die mindestens zwei konformative Übergänge beim Aufheizen durchlaufen. Einer dieser Übergänge wird durch den hydrophoben Kollaps des Polymerblocks induziert, der andere durch Entfalten der kollagen-ähnlichen Triple-Helices.rnAls Ausweitung dieser synthetischen Strategie wurde homotelecheles PDEGMEMA mit zwei PFP-Esterendgruppen dargestellt, wozu der PFP-CTA für die Funktionalisierung der -Endgruppe und die radikalische Substitution des Dithioesters durch Behandlung mit einem Überschuss eines funktionellen AIBN-Derivates für die Funktionalisierung der -Endgruppe ausgenutzt wurde. Die Umsetzung der beiden reaktiven Kettenenden mit dem N-Terminus eines Peptidblocks ergab ein Peptid-Polymer-Peptid Triblockcopolymer.rnSchließlich konnten die anorganisch-organischen Hybridmaterialien PMSSQ-Poly(2,2-diethoxyethylacrylat) (PMSSQ-PDEEA) und PMSSQ-Poly(1,3-dioxolan-2-ylmethylacrylat) (PMSSQ-PDMA) für die Herstellung robuster, peptid-reaktiver Oberflächen durch Spin Coaten und thermisch induziertes Vernetzen angewendet werden. Nach saurem Entschützen der Acetalgruppen in diesen Filmen konnten die resultierenden Aldehydgruppen durch einfaches Eintauchen in eine Lösung mit einer Auswahl von Aminen und Hydroxylaminen umgesetzt werden, wodurch die Oberflächenhydrophilie modifiziert werden konnte. Darüber hinaus konnten auf Basis der unterschiedlichen Stabilität der zwei hier verglichenen Acetalgruppen Entschützungsprotokolle für die exklusive Entschützung der Diethylacetale in PMSSQ-PDEEA und deren Umsetzung ohne Entschützung der zyklischen Ethylenacetale in PMSSQ-PDMA entwickelt werden, die die Herstellung multifunktioneller Oberflächenbeschichtungen z.B. für die Proteinimmobilisierung ermöglichen.

Effects of glucocorticoids on vascular NADPH oxidases and endothelial NO synthase

Glukokortikoide (GCs) stellen wichtige Hormone in der Regulation der metabolischen Homöostase dar. Synthetische GCs, wie Dexamethasone (DEX), spielen eine essentielle Rolle in der Behandlung inflammatorischer Krankheiten. Jedoch sind unter einer Dexamethason-Therapie zahlreiche Nebenwirkungen bekannt, so z.B. auch die Entwicklung einer Hypertonie, in deren Pathogenese oxidativer Stress eine entscheidende Rolle spielt. Obwohl sich in den vergangenen Jahren zahlreiche Studien zum Ziel setzten die GC-induzierte Hypertonie (GC-HT) aufzuklären, sind die genauen Mechanismen bis heute unklar. Eine erhöhte Expression von NADPH Oxidasen (Nox) und eine Entkopplung der endothelialen NO Synthase (eNOS), die Hauptquellen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im vaskulären System, tragen maßgeblich zur Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen bei. Daher ist eine Beteiligung dieser Enzyme in GC-induziertem oxidativen Stress sehr wahrscheinlich. Folglich wurde die Hypothese aufgestellt, dass NADPH Oxidasen und eine entkoppelte eNOS die vielversprechendsten unter den zahlreichen involvierten pro- und anti-oxidativen Enzymen sind. Mit Fokus auf die oben genannten Systeme wurde in der vorliegenden Studie der Effekt von DEX mit Hilfe von in vivo (WKY Ratten) ebenso wie in vitro Experimenten (A7r5 und EA.hy 926 Zellen) untersucht. Dabei zeigte sich, dass Nox1, Nox4 und p22phox durch DEX unterschiedlich reguliert wurden. Nox1 wurde hoch-, Nox4 hingegen herunterreguliert, während p22phox unverändert blieb. Die Modufikation schien hierbei auf transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene stattzufinden. Durch die gegensätzliche Regulation von Nox1 und Nox4 bleibt die Nettowirkung der verschiedenen Nox Isoformen unklar. Immer mehr Studien bringen vaskulären oxidativen Stress mit der Pathogenese einer GC-HT in Zusammenhang, welche letztendlich zu einer verminderten Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) führt. Durch die eNOS produziertes NO stellt einen essentiellen Schutzfaktor der Blutgefäße dar. Eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit könnte die Folge einer eNOS-Entkopplung darstellen, ausgelöst durch oxidativen Stress. Da die Verfügbarkeit von Tetrahydrobiopterin (BH4) entscheident ist für die Aktivität und enzymatische Kopplung der eNOS, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit GC-induzierten Veränderungen in der BH4-Versorgung. Die Behandlung von EA.hy 926 Zellen mit DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von eNOS auf mRNA- und Proteinebene. Gleichzeitig wurde die Phosphorylierung an Serine1177 vermindert. Als maßgeblicher “Kopplungs-Schalter” kann BH4 endogen über zwei verschiedene Signalwege synthetisiert werden, welche durch die Enzyme GCH1 und DHFR reguliert werden. DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von BH4, BH2 und Biopterin, wobei ebenso das BH4 / BH2 -Verhältnis vermindert wurde. Beide Enzyme, GCH1 genauso wie DHFR, wurden auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert, was auf einen Effekt von GCs auf beide rnBH4-produzierenden Signalwege schließen lässt. Nach Behandlung mit DEX wurde die Produktion von NO in Endothelzellen maßgeblich vermindert. In ROS-Messungen zeigte sich eine Tendenz hin zu einer eNOS-Entkopplung, jedoch war es mit unserem experimentellen Aufbau nicht möglich, diese endgültig zu beweisen.rnZusammenfassend lässt sich sagen, dass die Behandlung mit GCs zu Veränderungen in beiden untersuchten Systemen, den NADPH Oxidasen ebenso wie dem eNOS-NO System, führte. DEX erhöhte die Expression von Nox1 in glatten Muskelzellen und reduzierte die Nox4-Expression in Endothelzellen. Gleichzeitig verminderte DEX die Verfügbarkeit von BH4 und inhibierte die Phosphorylierung / Aktivität von eNOS. Mithilfe weiterer Studien muss die endgültige Beteiligung von NADPH Oxidasen und einer eNOS-Entkopplung an oxidativem Stress in GC-HT abschließend aufgeklärt werden.rn

Molekulare Mechanismen der Knochenmetastasierung des Nierenzellkarzinoms

Die schlechte Prognose des Nierenzellkarzinoms (NZK) kommt nicht durch den Primärtumor an sich zustande, sondern durch das Vorhandensein von Fernmetastasen. Obwohl bereits vieles über die Mechanismen der Metastasierung bekannt ist, sind die Hintergründe der Organspezifität metastasierender Tumorzellen weitgehend ungeklärt. In 30% der Fälle kommt es zur Entstehung von Knochenmetastasen. Diese hohe Frequenz deutet darauf hin, dass NZK-Zellen bevorzugt in dieses Organ metastasieren, da die Knochenmatrix ein günstiges Mikromilieu für ihr Wachstum bietet. Hierbei könnte extrazellulärem Calcium und dem für die Detektion zuständigen Calcium-sensitiven Rezeptor (CaSR) eine entscheidende Rolle zukommen, da sich Knochen durch ihren hohen Gehalt an Calcium auszeichnen und von anderen Organen unterscheiden. Das Ziel der vorliegenden Dissertation lag in der Aufklärung der Mechanismen, die zu einer Knochenmetastasierung des NZK führen.rnrnIn ersten Analysen konnte gezeigt werden, dass sich bereits der Primärtumor durch eine von Calcium unabhängige charakteristische Expression bestimmter Signalmediatoren auszeichnet, die Metastasierungspotenzial und –ort bestimmen. So wurden in Gewebeproben und primären Tumorzellen von NZK-Patienten, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie Knochenmetastasen entwickelten, in Westernblot-Analysen eine sehr hohe Expression der α5-Integrine, eine starke Aktivität von Akt, FAK und eine Reduktion der PTEN-Expression detektiert. Diese Veränderungen begünstigten die chemotaktische Migration in Richtung Fibronektin (bestimmt in einer Boyden-Kammer) und die Adhäsion dieser NZK-Zellen an Komponenten der Extrazellularmatrix (Fibronektin und Kollagen I – beides ist Bestandteil der Knochenmatrix). Migration und Adhäsion sind essentielle Schritte beim Austreten der Tumorzellen aus dem Primärtumor und Infiltration des Knochens. In NZK-Zellen von Patienten, die keine Metastasen oder Lungenmetastasen entwickelten, waren diese Charakteristika nicht oder deutlich schwächer ausgeprägt. Bestimmte Primärtumore sind somit prädestiniert Knochenmetastasen auszubilden.rnrnUm die Bedeutung von extrazellulärem Calcium und dem CaSR darzustellen, wurde die Expression des CaSR mittels Real-Time PCR, Westernblot-Analysen und durchflusszytometrisch in NZK-Gewebeproben und –Zellen von Patienten untersucht, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie keine bzw. Lungen- oder Knochenmetastasen ausbildeten. Proben von Patienten mit Knochenmetastasen zeigten die stärkste Expression von CaSR-mRNA und CaSR-Protein. Durch eine Behandlung der NZK-Zellen mit Calcium in physiologischen Konzentrationen, konnte Calcium als möglicher Regulator der CaSR-Expression ausgeschlossen werden. Der Einfluss von Calcium auf die Metastasierungsfähigkeit der primären NZK-Zellen wurde anhand eines weiteren chemotaktischen Migrationsversuchs mit Calcium als Chemotaxin analysiert. Die Zellproliferationsrate konnte nach Behandlung der Zellen mit Calcium mittels BrdU-Inkorporation gemessen werden. NZK-Zellen, die aus dem Primärtumor von Patienten mit Knochenmetastasen kultiviert wurden, konnten durch eine erhöhte extrazelluläre Calcium-Konzentration verstärkt zu Migration und Proliferation (Konzentrations-abhängige Steigerung) angeregt werden. Diese stellen weitere essentielle Schritte bei der Infiltration und Vermehrung der NZK-Zellen in den Knochen dar. Die Effekte traten bei NZK-Zellen aus Patienten, die keine oder Lungenmetastasen ausbildeten, nicht auf. Die Identifizierung der beteiligten Signalwege erfolgte in Westernblot-Analysen und einem Phospho-Kinase Array. Hierdurch konnten eine verstärkte Aktivierung des Akt-, JNK-, p38α- und PLCγ-1-Signalwegs und eine beinahe vollständige Reduktion der PTEN-Expression nach Calcium-Behandlung in Knochen-metastasierenden NZK-Zellen aufgedeckt werden. Durch Blockierung des CaSR mittels des Inhibitors NPS 2143 konnte bestätigt werden, dass die metastasierungs-fördernde Wirkung von Calcium über den CaSR zustande kommt. rnrnNZK-Zellen zeichnen sich somit bereits im Primärtumor durch eine charakteristische Expression verschiedener Signalmediatoren aus, die ihr Metastasierungspotenzial und die mögliche Lokalisation der Metastase bestimmen. Gelangen metastasierende NZK-Zellen auf ihrem Weg durch den Blutkreislauf in das Knochenmilieu, verhilft ihnen hier eine hohe Expression des CaSR zu einem wichtigen Überlebensvorteil. Extrazelluläres Calcium wirkt über den CaSR, verstärkt ihre metastatischen Eigenschaften und fördert schließlich die Ausbildung einer Knochenmetastase. Aus diesem Grund kommt dem CaSR eine Rolle als möglicher prognostischer Marker hinsichtlich der Knochenmetastasierung beim NZK zu. Die Charakteristika des Primärtumors sollten daher die Auswahl des adjuvanten Therapeutikums und die Nachsorgeuntersuchungen beeinflussen. um die Medizin dem Ziel einer individualisierten Therapie näher zu bringen.rn

Das Phosphoproteom von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs nach Bestrahlung und Applikation des Cyclooxygenase-Inhibitors Flurbiprofen

Ziel: Die Radiotherapie hat in der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf- und Halsbereichs nach wie vor einen hohen Stellenwert. Der Erfolg eines Therapieregimes, das die Behandlung mit ionisierenden Strahlen einschließt, ist jedoch häufig limitiert durch die Entwicklung radioresistenter Tumorzellpopulationen, die nicht selten durch die Bestrahlung selbst induziert wird. Die Mechanismen, die zu einer solchen bestrahlungsinduzierten Radioresistenz führen sind bisher nur unvollständig verstanden und Methoden, durch die die Entwicklung von Radioresistenz verhindert werden könnte, wie beispielsweise der präventive Einsatz von Pharmazeutika, sind bislang nicht systematisch untersucht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu überprüfen, ob der Cyclooxygenase-Inhibitor Flurbiprofen durch Bestrahlung induzierte Veränderungen der Phosphoprotein-Expression verstärken oder abschwächen kann und ob sich aus solchen Modifikationen des Bestrahlungsergebnisses ein radioprotektiver Effekt der Flurbiprofenapplikation ableiten lässt. Methoden: Es wurde ein experimenteller Ansatz gewählt, der mittels 2D PAGE und anschließender MALDI-TOF Massenspektrometrie das Phosphoproteom einer HNSCC-Zelllinie unter verschiedenen Bedingungen untersuchte. Die Zellen wurden entweder mit einer Energiedosis von 8 Gy bestrahlt, mit einer 200 μM Flurbiprofen enthaltenden Lösung inkubiert oder sie wurden mit einer Kombination aus Flurbiprofenapplikation und Bestrahlung behandelt. Vor der 2D PAGE wurden die Phosphoproteine durch IMAC angereichert. Zur Verbesserung der Gel-Analytik wurde die Software Delta 2D angewendet, die zum Ausgleich von Laufweitenunterschieden zwischen den Gelen ein Warping vorsieht. Ergebnisse und Diskussion: Bei der Analyse, der unter den verschiedenen experimentellen Bedingungen differentiell exprimierten Phosphoproteinen mittels bioinformatischer Hilfsprogramme wie z.B. WEBGestalt und STRING, wurden sieben Proteine mit Bedeutung für das Wachstum und die Entdifferenzierung von Tumoren identifiziert und einer ausführlichen Literaturrecherche unterzogen. Auf diese Weise konnten die Ergebnisse der für die vorliegende Arbeit durchgeführten Experimente in den systembiologischen Kontext eingeordnet werden. Besonders hervorzuheben ist die Herabregulierung der möglicherweise Radioresistenz vermittelnden Proteine GRP-75, 14-3-3 sigma und CRT sowie die Herabregulierung des anti-apoptotischen und tumor-begünstigenden Hsp60 durch Flurbiprofen. Die Verminderung der Expression unterstreicht das Potential dieses Pharmakons sowie der Klasse der COX-Inhibitoren als mögliche radiosensitivierende und tumorsuppressive Substanzen.

Untersuchungen zum Einfluss des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors Lovastatin auf die Toxizität ionisierender Strahlung sowie des Anthrazyklinderivats Doxorubicin im Mausmodell

Hintergund: HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine) sind klinisch etablierte Cholesterinsenker. Über die Inhibition der intrinsischen Cholesterinbiosynthese hinaus zeigen sie sogenannte pleiotrope biologische Effekte. Ein Großteil dieser Wirkungen wird auf die Inhibition kleiner Ras homologer GTPasen (Rho GTPasen) zurückgeführt. In vitro schützt das Statinderivat Lovastatin (Lova) primäre humane Endothelzellen vor der Zytotoxizität von ionisierender Strahlung (IR) und dem Krebsmedikament Doxorubicin (Doxo). Zielsetzung: Die Relevanz dieser Befunde für ein in vivo Mausmodell sollte in der vorliegenden Arbeit überprüft werden. Dafür wurden BALB/c-Mäuse mit IR oder Doxo behandelt und der Einfluss einer Kobehandlung mit Lova auf verschiedene Toxizitätsendpunkte untersucht (24 h nach einer einzelnen hohen Dosis IR (i), 14 Tage nach zwei geringen Dosen IR (ii), 48 h nach einer einzelnen hohen Dosis Doxo (iii), sowie 8 Tage nach drei niedrigen Dosen Doxo (iv)). Eine mögliche gleichzeitige Protektion von Tumorzellen durch die Statingabe wurde in einem Xenotransplantationsexperiment überprüft (v), in dem das gleiche Behandlungsschema wie bei iv angewendet wurde. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass eine Statinbehandlung Normalgewebe vor Doxo- und IR-induzierter Toxizität schützt, ohne gleichzeitig protektiv auf transformierte Zellen zu wirken. Dieser Effekt ist wahrscheinlich von einer Inhibition der kleinen GTPasen Rac1 und RhoA abhängig und einer daraus folgenden Modifizierung der DNA-Schadensantwort. i: Die Statinvorbehandlung der Mäuse hatte keinen Einfluss auf die Bildung von initialen IR-induzierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) in der Leber. Die Lova-Behandlung wirkte sich jedoch auf IR-induzierte Stressantworten aus, was sich in einer Minderung der Expression von Inflammations- und Fibrosesurrogatmarkern in Leber und Darm widerspiegelte. ii: In der Lunge der Tiere wurde ein Anstieg von molekularen Inflammations- und Fibrosesurrogatmarkern detektiert, der bei Statinkobehandlung ausblieb. Zudem verhinderte die Kobehandlung mit Lova eine IR-induzierte Abnahme der Thrombozytenzahl, ohne sich auf die durch IR verringerte Leukozytenzahl im Blut auszuwirken. iii: Die Verabreichung einer hohen Dosis Doxo induzierte DSB-Formation in der Leber. Die Statinvorbehandlung reduzierte deren Menge um ca. 50 %. Dieser genoprotektive Effekt war unabhängig von der Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies sowie einer Änderung des Doxo-Imports oder Exports. Die Expression von proinflammatorischen und profibrotischen Genen fiel besonders in der Leber und im Herzen durch die Lova-Kobehandlung geringer aus, als in der nur mit Doxo behandelten Gruppe. Zudem verringerte Lova die durch Doxo induzierte Hochregulation von für den AP1-Komplex kodierenden Genen sowie von Zellzykluskontrollfaktoren. Die Lova-Vorbehandlung führte darüber hinaus im Herzen zu einem reduzierten mRNA-Spiegel der Topoisomerasen II α und β. iv: Es konnten schwere Herz- und Leberschäden detektiert werden (gemessen an Gldh-, Gpt- sowie cTn-I-Serumkonzentrationen), die bei einer Kobehandlung mit dem Statin nicht auftraten. Die Lova-Kobehandlung verhinderte außerdem eine durch die Doxo-Behandlung verringerte Leukozytenzahl. Molekulare Marker für frühe fibrotische Ereignisse, sowie für Inflammation und Hypertrophie waren in der Leber und im Herzen nach der Doxo-Behandlung erhöht. Das Statin war auch hier in der Lage, diese toxischen Wirkungen des Anthrazyklins zu mindern. Auch die Doxo-induzierte Expression von Surrogatmarkern für Zellantworten auf oxidativen Stress wurde in der Leber abgeschwächt. In der Leber und im Herzen wiesen die mit Doxo behandelten Tiere höhere mRNA Spiegel von an Zellzykluskontrolle beteiligten Faktoren sowie von DNA-Reparatur und Fremdstoffmetabolismus assoziierten Genen auf. Am stärksten wurde die Expression von Topoisomerase II alpha - ein molekularer Marker für Zellproliferation und bedeutsame Zielstruktur von Doxo - in der Leber hochreguliert. Die Statin-Kobehandlung verhinderte all diese Doxo-induzierten Expressionsänderungen. Im Gegensatz zur Leber wurde die Top2a-mRNA Menge im Herzen durch die Doxo-Applikation reduziert. Auch hier bewirkte die Kobehandlung mit dem Statin, dass die Expression nahe dem Kontrollniveau blieb. v: Die Kobehandlung mit Lova führte zu keinem Schutz der Tumorzellen vor Doxo, sondern erhöhte sogar dessen antineoplastisches Potential.rnFazit: Die Erkenntnisse aus vorhergegangenen in vitro Versuchen konnten zum großen Teil auf die in vivo Situation im Mausmodell übertragen werden. Sie stehen im Einklang mit Ergebnissen anderer Gruppen, welche die Inhibition kleiner GTPasen mit einer geringeren, durch zytotoxische Substanzen induzierten, Inflammation und Fibrose korrelieren konnten. Eine Kobehandlung mit Lova während einer Krebstherapie erscheint somit als vielversprechende Möglichkeit Doxo- oder IR-induzierte Nebenwirkungen auf Normalgewebe zu mildern.

Simulations of amphiphilic peptides at the air-water interface

Amphiphile Peptide, Pro-Glu-(Phe-Glu)n-Pro, Pro-Asp-(Phe-Asp)n-Pro, und Phe-Glu-(Phe-Glu)n-Phe, können so aus n alternierenden Sequenzen von hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren konstruiert werden, dass sie sich in Monolagen an der Luft-Wasser Grenzfläche anordnen. In biologischen Systemen können Strukturen an der organisch-wässrigen Grenzfläche als Matrix für die Kristallisation von Hydroxyapatit dienen, ein Vorgang der für die Behandlung von Osteoporose verwendet werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden Computersimulationenrneingesetzt, um die Strukturen und die zugrunde liegenden Wechselwirkungen welche die Aggregation der Peptide auf mikroskopischer Ebene steuern, zu untersuchen. Atomistische Molekulardynamik-Simulationen von einzelnen Peptidsträngen zeigen, dass sie sich leicht an der Luft-Wasser Grenzfläche anordnen und die Fähigkeit haben, sich in β-Schleifen zu falten, selbst für relativ kurze Peptidlängen (n = 2). Seltene Ereignisse wie diese (i.e. Konformationsänderungen) erfordern den Einsatz fortgeschrittener Sampling-Techniken. Hier wurde “Replica Exchange” Molekulardynamik verwendet um den Einfluss der Peptidsequenzen zu untersuchen. Die Simulationsergebnisse zeigten, dass Peptide mit kürzeren azidischen Seitenketten (Asp vs. Glu) gestrecktere Konformationen aufwiesen als die mit längeren Seitenketten, die in der Lage waren die Prolin-Termini zu erreichen. Darüber hinaus zeigte sich, dass die Prolin-Termini (Pro vs. Phe) notwendig sind, um eine 2D-Ordnung innerhalb derrnAggregate zu erhalten. Das Peptid Pro-Asp-(Phe-Asp)n-Pro, das beide dieser Eigenschaften enthält, zeigt das geordnetste Verhalten, eine geringe Verdrehung der Hauptkette, und ist in der Lage die gebildeten Aggregate durch Wasserstoffbrücken zwischen den sauren Seitenketten zu stabilisieren. Somit ist dieses Peptid am besten zur Aggregation geeignet. Dies wurde auch durch die Beurteilung der Stabilität von experimentnah-aufgesetzten Peptidaggregaten, sowie der Neigung einzelner Peptide zur Selbstorganisation von anfänglich ungeordneten Konfigurationen unterstützt. Da atomistische Simulationen nur auf kleine Systemgrößen und relativ kurze Zeitskalen begrenzt sind, wird ein vergröbertes Modell entwickelt damit die Selbstorganisation auf einem größeren Maßstab studiert werden kann. Da die Selbstorganisation an der Grenzfläche vonrnInteresse ist, wurden existierenden Vergröberungsmethoden erweitert, um nicht-gebundene Potentiale für inhomogene Systeme zu bestimmen. Die entwickelte Methode ist analog zur iterativen Boltzmann Inversion, bildet aber das Update für das Interaktionspotential basierend auf der radialen Verteilungsfunktion in einer Slab-Geometrie und den Breiten des Slabs und der Grenzfläche. Somit kann ein Kompromiss zwischen der lokalen Flüssigketsstruktur und den thermodynamischen Eigenschaften der Grenzfläche erreicht werden. Die neue Methode wurde für einen Wasser- und einen Methanol-Slab im Vakuum demonstriert, sowie für ein einzelnes Benzolmolekül an der Vakuum-Wasser Grenzfläche, eine Anwendung die von besonderer Bedeutung in der Biologie ist, in der oft das thermodynamische/Grenzflächenpolymerisations-Verhalten zusätzlich der strukturellen Eigenschaften des Systems erhalten werden müssen. Daraufrnbasierend wurde ein vergröbertes Modell über einen Fragment-Ansatz parametrisiert und die Affinität des Peptids zur Vakuum-Wasser Grenzfläche getestet. Obwohl die einzelnen Fragmente sowohl die Struktur als auch die Wahrscheinlichkeitsverteilungen an der Grenzfläche reproduzierten, diffundierte das Peptid als Ganzes von der Grenzfläche weg. Jedoch führte eine Reparametrisierung der nicht-gebundenen Wechselwirkungen für eines der Fragmente der Hauptkette in einem Trimer dazu, dass das Peptid an der Grenzfläche blieb. Dies deutet darauf hin, dass die Kettenkonnektivität eine wichtige Rolle im Verhalten des Petpids an der Grenzfläche spielt.

Entwicklung und Anwendung von mobilen Messstrategien und Analysemethoden zur Untersuchung urbanen Aerosols

Seit Anbeginn der Menschheitsgeschichte beeinflussen die Menschen ihre Umwelt. Durch anthropogene Emissionen ändert sich die Zusammensetzung der Atmosphäre, was einen zunehmenden Einfluss unter anderem auf die Atmosphärenchemie, die Gesundheit von Mensch, Flora und Fauna und das Klima hat. Die steigende Anzahl riesiger, wachsender Metropolen geht einher mit einer räumlichen Konzentration der Emission von Luftschadstoffen, was vor allem einen Einfluss auf die Luftqualität der windabwärts gelegenen ruralen Regionen hat. In dieser Doktorarbeit wurde im Rahmen des MEGAPOLI-Projektes die Abluftfahne der Megastadt Paris unter Anwendung des mobilen Aerosolforschungslabors MoLa untersucht. Dieses ist mit modernen, zeitlich hochauflösenden Instrumenten zur Messung der chemischen Zusammensetzung und Größenverteilung der Aerosolpartikel sowie einiger Spurengase ausgestattet. Es wurden mobile Messstrategien entwickelt und angewendet, die besonders geeignet zur Charakterisierung urbaner Emissionen sind. Querschnittsmessfahrten durch die Abluftfahne und atmosphärische Hintergrundluftmassen erlaubten sowohl die Bestimmung der Struktur und Homogenität der Abluftfahne als auch die Berechnung des Beitrags der urbanen Emissionen zur Gesamtbelastung der Atmosphäre. Quasi-Lagrange’sche Radialmessfahrten dienten der Erkundung der räumlichen Erstreckung der Abluftfahne sowie auftretender Transformationsprozesse der advehierten Luftschadstoffe. In Kombination mit Modellierungen konnte die Struktur der Abluftfahne vertieft untersucht werden. Flexible stationäre Messungen ergänzten den Datensatz und ließen zudem Vergleichsmessungen mit anderen Messstationen zu. Die Daten einer ortsfesten Messstation wurden zusätzlich verwendet, um die Alterung des organischen Partikelanteils zu beschreiben. Die Analyse der mobilen Messdaten erforderte die Entwicklung einer neuen Methode zur Bereinigung des Datensatzes von lokalen Störeinflüssen. Des Weiteren wurden die Möglichkeiten, Grenzen und Fehler bei der Anwendung komplexer Analyseprogramme zur Berechnung des O/C-Verhältnisses der Partikel sowie der Klassifizierung der Aerosolorganik untersucht. Eine Validierung verschiedener Methoden zur Bestimmung der Luftmassenherkunft war für die Auswertung ebenfalls notwendig. Die detaillierte Untersuchung der Abluftfahne von Paris ergab, dass diese sich anhand der Erhöhung der Konzentrationen von Indikatoren für unprozessierte Luftverschmutzung im Vergleich zu Hintergrundwerten identifizieren lässt. Ihre eher homogene Struktur kann zumeist durch eine Gauß-Form im Querschnitt mit einem exponentiellen Abfall der unprozessierten Schadstoffkonzentrationen mit zunehmender Distanz zur Stadt beschrieben werden. Hierfür ist hauptsächlich die turbulente Vermischung mit Umgebungsluftmassen verantwortlich. Es konnte nachgewiesen werden, dass in der advehierten Abluftfahne eine deutliche Oxidation der Aerosolorganik im Sommer stattfindet; im Winter hingegen ließ sich dieser Prozess während der durchgeführten Messungen nicht beobachten. In beiden Jahreszeiten setzt sich die Abluftfahne hauptsächlich aus Ruß und organischen Partikelkomponenten im PM1-Größenbereich zusammen, wobei die Quellen Verkehr und Kochen sowie zusätzlich Heizen in der kalten Jahreszeit dominieren. Die PM1-Partikelmasse erhöhte sich durch die urbanen Emissionen im Vergleich zum Hintergrundwert im Sommer in der Abluftfahne im Mittel um 30% und im Winter um 10%. Besonders starke Erhöhungen ließen sich für Polyaromaten beobachten, wo im Sommer eine mittlere Zunahme von 194% und im Winter von 131% vorlag. Jahreszeitliche Unterschiede waren ebenso in der Größenverteilung der Partikel der Abluftfahne zu finden, wo im Winter im Gegensatz zum Sommer keine zusätzlichen nukleierten kleinen Partikel, sondern nur durch Kondensation und Koagulation angewachsene Partikel zwischen etwa 10nm und 200nm auftraten. Die Spurengaskonzentrationen unterschieden sich ebenfalls, da chemische Reaktionen temperatur- und mitunter strahlungsabhängig sind. Weitere Anwendungsmöglichkeiten des MoLa wurden bei einer Überführungsfahrt von Deutschland an die spanische Atlantikküste demonstriert, woraus eine Kartierung der Luftqualität entlang der Fahrtroute resultierte. Es zeigte sich, dass hauptsächlich urbane Ballungszentren von unprozessierten Luftschadstoffen betroffen sind, advehierte gealterte Substanzen jedoch jede Region beeinflussen können. Die Untersuchung der Luftqualität an Standorten mit unterschiedlicher Exposition bezüglich anthropogener Quellen erweiterte diese Aussage um einen Einblick in die Variation der Luftqualität, abhängig unter anderem von der Wetterlage und der Nähe zu Emissionsquellen. Damit konnte gezeigt werden, dass sich die entwickelten Messstrategien und Analysemethoden nicht nur zur Untersuchung der Abluftfahne einer Großstadt, sondern auch auf verschiedene andere wissenschaftliche und umweltmesstechnische Fragestellungen anwenden lassen.