Integrating receptor interactions and dynamics and Interference with endocrine disruptors in the mechanisms of action of PPAR nuclear receptors

Abstract Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) form a family of three nuclear receptors regulating important cellular and metabolic functions. PPARs control gene expression by directly binding to target promoters as heterodimers with the Retinoid X Receptor (RXR), and their transcriptional activity is enhanced upon activation by natural or pharmacological ligands. The binding of PPAR/RXR heterodimers on target promoters allows the anchoring of a series of coactivators and corepressors involved in promoter remodeling and the recruitment of the transcription machinery. The transcriptional output finally depends on a complex interplay between (i) the respective expression levels of PPARs, RXRs and of other nuclear receptors competing for DNA binding and RXR recruitment, (ii) the availability and the nature of PPAR and RXR ligands, (iii) the expression levels and the nature of the different coactivators and corepressors and (iv) the sequence and the epigenetic status of the promoter. Understanding how all these factors and signals integrate and fine-tune transcription remains a challenge but is necessary to understand the specificity of the physiological functions regulated by PPARs. The work presented herein focuses on the molecular mechanisms of PPAR action and aims at understanding how the interactions and mobility of the receptor modulate transcription in the physiological context of a living cell: Such observations in vivo rely on the use of engineered fluorescent protein chimeras and require the development and the application of complementary imaging techniques such as Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). Using such techniques, PPARs are shown to reside solely in the nucleus where they are constitutively associated with RXR but transcriptional activation by ligand binding -does not promote the formation of sub-nuclear structures as observed with other nuclear receptors. In addition, the engagement of unliganded PPARs in large complexes of cofactors in living cells provides a molecular basis for their ligand-independent activity. Ligand binding reduces receptor diffusion by promoting the recruitment of coactivators which further enlarge the size of PPAR complexes to acquire full transcriptional competence. Using these molecular approaches, we deciphered the molecular mechanisms through which phthalates, a class of pollutants from the plastic industry, interfere with PPARγ signaling. Mono-ethyl-hexyl-phthalate (MEHP) binding induces the recruitment of a specific subset of cofactors and translates into the expression of a specific subset of target genes, the transcriptional output being strongly conditioned by the differentiation status of the cell. This selective PPARγ modulation induces limited adipogenic effects in cellular models while exposure to phthalates in animal models leads to protective effects on glucose tolerance and diet-induced obesity. These results demonstrate that phthalates influence lipid and carbohydrate metabolism through complex mechanisms which most likely involve PPARγ but also probably PPARα and PPARß, Altogether, the molecular and physiological demonstration of the interference of pollutants with PPAR action outlines an important role of chemical exposure in metabolic regulations. Résumé Les PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) forment une famille de récepteurs nucléaires qui régulent des fonctions cellulaires et métaboliques importantes. Les PPARs contrôlent l'expression des gènes en se liant directement à leurs promoteurs sous forme d'hétérodimères avec les récepteurs RXR (Retinoid X Receptor), et leur activité transcriptionnelle est stimulée par la liaison de ligands naturels ou pharmacologiques. L'association des hétérodimères PPAR/RXR avec les promoteurs des gènes cibles permet le recrutement de coactivateurs et de corépresseurs qui vont permettre le remodelage de la chromatine et le recrutement de la machinerie transcriptionnelle. Les actions transcriptionnelles du récepteur dépendent toutefois d'interactions complexes qui sont régulées par (i) le niveau d'expression des PPARs, des RXRs et d'autres récepteurs nucléaires entrant en compétition pour la liaison à l'ADN et l'association avec RXR, (ii) la disponibilité et la nature de ligands de PPAR et de RXR, (iii) les niveaux d'expression et la nature des différents coactivateurs et corépresseurs et (iv) la séquence et le marquage épigénétique des promoteurs. La compréhension des mécanismes qui permettent d'intégrer ces aspects pour assurer une régulation fine de l'activité transcriptionnelle est un défi qu'il est nécessaire de relever pour comprendre la spécificité des fonctions physiologiques régulées par les PPARs. Ce travail concerne l'étude des mécanismes d'action moléculaire des PPARs et vise à mieux comprendre comment les interactions du récepteur avec d'autres protéines ainsi que la mobilité de ce dernier régulent son activité transcriptionnelle dans le contexte physiologique des cellules vivantes. De telles observations reposent sur l'emploi de protéines fusionnées à des protéines fluorescentes ainsi que sur le développement et l'utilisation de techniques d'imagerie complémentaires telles que le FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ou la FCS (Fluorescence Corrélation Spectroscopy). En appliquant ces méthodes, nous avons pu montrer que les PPARs résident toujours dans le noyau où ils sont associés de manière constitutive à RXR, mais que l'ajout de ligand n'induit pas la formation de structures sub-nucléaires comme cela a pu être décrit pour d'autres récepteurs nucléaires. De plus, les PPARs sont engagés dans de larges complexes protéiques de cofacteurs en absence de ligand, ce qui procure une explication moléculaire à leur activité ligand-indépendante. La liaison du ligand réduit la vitesse de diffusion du récepteur en induisant le recrutement de coactivateurs qui augmente encore plus la taille des complexes afin d'acquérir un potentiel d'activation maximal. En utilisant ces approches moléculaires, nous avons pu caractériser les mécanismes permettant aux phtalates, une classe de polluants provenant de l'industrie plastique, d'interférer avec PPARγ. La liaison du mono-ethyl-hexyl-phtalate (NERF) à PPARγ induit un recrutement sélectif de cofacteurs, se traduisant par l'induction spécifique d'un sous-ensemble de gènes qui varie en fonction du niveau de différentiation cellulaire. La modulation sélective de PPARγ par le MEHP provoque une adipogenèse modérée dans des modèles cellulaires alors que l'exposition de modèles animaux aux phtalates induit des effets bénéfiques sur la tolérance au glucose et sur le développement de l'obésité. Toutefois, les phtalates ont une action complexe sur le métabolisme glucido-lipidique en faisant intervenir PPARγ mais aussi probablement PPARα et PPARß. Cette démonstration moléculaire et physiologique de l'interférence des polluants avec les récepteurs nucléaires PPAR souligne un rôle important de l'exposition à de tels composés dans les régulations métaboliques.

Functional complementation of Leishmania (Leishmania) amazonensis AP endonuclease gene (lamap) in Escherichia coli mutant strains challenged with DNA damage agents

During its life cycle Leishmania spp. face several stress conditions that can cause DNA damages. Base Excision Repair plays an important role in DNA maintenance and it is one of the most conserved mechanisms in all living organisms. DNA repair in trypanosomatids has been reported only for Old World Leishmania species. Here the AP endonuclease from Leishmania (L.) amazonensis was cloned, expressed in Escherichia coli mutants defective on the DNA repair machinery, that were submitted to different stress conditions, showing ability to survive in comparison to the triple null mutant parental strain BW535. Phylogenetic and multiple sequence analyses also confirmed that LAMAP belongs to the AP endonuclease class of proteins.

Role for inducible cAMP early repressor in promoting pancreatic beta cell dysfunction evoked by oxidative stress in human and rat islets.

AIMS/HYPOTHESIS: Pro-atherogenic and pro-oxidant, oxidised LDL trigger adverse effects on pancreatic beta cells, possibly contributing to diabetes progression. Because oxidised LDL diminish the expression of genes regulated by the inducible cAMP early repressor (ICER), we investigated the involvement of this transcription factor and of oxidative stress in beta cell failure elicited by oxidised LDL. METHODS: Isolated human and rat islets, and insulin-secreting cells were cultured with human native or oxidised LDL or with hydrogen peroxide. The expression of genes was determined by quantitative real-time PCR and western blotting. Insulin secretion was monitored by EIA kit. Cell apoptosis was determined by scoring cells displaying pycnotic nuclei. RESULTS: Exposure of beta cell lines and islets to oxidised LDL, but not to native LDL raised the abundance of ICER. Induction of this repressor by the modified LDL compromised the expression of important beta cell genes, including insulin and anti-apoptotic islet brain 1, as well as of genes coding for key components of the secretory machinery. This led to hampering of insulin production and secretion, and of cell survival. Silencing of this transcription factor by RNA interference restored the expression of its target genes and alleviated beta cell dysfunction and death triggered by oxidised LDL. Induction of ICER was stimulated by oxidative stress, whereas antioxidant treatment with N-acetylcysteine or HDL prevented the rise of ICER elicited by oxidised LDL and restored beta cell functions. CONCLUSIONS/INTERPRETATION: Induction of ICER links oxidative stress to beta cell failure caused by oxidised LDL and can be effectively abrogated by antioxidant treatment.

Automatització d'un tanc de cocció

En una empresa alimentària, hi havia la necessitat de millorar una part del procés de cocció del pernil cuit. El pernil, un cop està envasat i posat en gàbies, està a punt de ser cuit. La forma de coure’l és posar-lo en una banyera a uns 60 graus de temperatura i a mesura d’anarli introduïnt vapor, escalfen l’aigua i couen el producte. Un cop cuit s’ha de refredar abans de posar en cambres frigorífiques. La manera que ho feien, era de transportar les gàbies pesants d’una banyera freda a una altra i així anaven refredant el producte.Era objecte d’aquest projecte, optimitzar aquest procés. És pretén, per tant, dissenyar un nou tanc on tot sigui més senzill i es realitzin el menor nombre de tasques, que es millorin parts, com laseguretat, els riscos laborals, els costos de manteniment i la qualitat de producte, així com la flexibilitat del sistema.Aquest projecte inclou, la selecció de tots els mecanismes actuadors, preactivadors, de control.. Distribuïr-los en tot el tanc a fi de tenir un control i seguretats total. Inclou també el disseny d’un programa automatitzat, on es s’ha seleccionat la CPU que millor ens ha convingut i l’elecció també d’un sistema de control visual i tàctil, com és l’Scada, així com la seva programació. També inclou, tots els connexionats elèctrics

Estudi medi ambiental del centre de mecanitzat Kondia HS1000 quan s'utilitza com a màquina d'ISF

Aproximadament deu anys enrere, es va començar a desenvolupar un nou procés industrial de deformació de xapa anomenat conformació incremental de xapa, Incremental Sheet Forming (ISF) en anglès. En aquest procés, una làmina de xapa és subjectada per un suport i conformada per una eina que normalment és un punxó amb punta semiesfèrica que es mou segons les directrius d’un software de control numèric. Aquest moviment de l’eina es fa en el pla, i un cop ja s’ha realitzat un contorn, l’eina baixa per realitzar-ne un altre i així successivament fins a la realització de la peça desitjada. Aquest procés de conformat de xapa està considerat com una alternativa al procés d’embotició, i la seva principal avantatge és que es pot considerar una gran alternativa al procés d’embotició per a la fabricació de petits lots de producte. La diferència més destacable és que en el procés de conformació incremental de xapa no es necessiten grans matrius ni punxons, que són molt costosos ja que han de garantir unes precisions molt elevades. A l’actualitat, aquest sistema encara es troba en fase d’investigació, no hi ha estudis definitius que aportin resultats fiables sobre la viabilitat del procés en aplicacions industrials, però cada vegada hi ha més equips de treball universitaris que es dediquen a estudiar-lo i més empreses que l’estan introduint en els seus departaments de I+D per tal d’adaptar els seus processos de fabricació a aquesta nova tecnologia. Un dels equips de treball que estan investigant aquest procés es el Grup de Recerca d’Enginyeria de Producte, Procés i Producció (GREP) situat al parc científic i tecnològic de l’Universitat de Girona. Disposen d’un centre de mecanitzat CNC de la marca Kondia model HS1000 que actualment es troba en període d’adaptació per tal de desenvolupar una màquina híbrida en la qual es duran a terme processos de conformació de xapa i sinterització per làser. Per tal d’adaptar la màquina, una part dels estudis que s’han de realitzar és la investigació sobre el consum i emissions de CO2 generades durant el procés de fabricació. Així doncs, aquest projecte final de carrera és aquest estudi de forma experimental i teòrica sobre el consum energètic del centre de mecanitzat, quan s’utilitza amb la tècnica de Incremental Sheet Forming (ISF). Es pretén estudiar el consum energètic de la tecnologia tenint en compte paràmetres de procés com ara el material, geometries, energia elèctrica consumida i programació de la trajectòria de l’eina, paràmetres relacionats amb l’origen de l’energia i aspectes relacionats amb els costos de producció

Disseny dels elements constitutius per adaptar un centre de mecanitzat de control numèric a la tecnologia Incremental Sheet Forming (ISF)

Un dels processos tradicionals de conformació de xapa més utilitzats a nivell industrial, degut a la seva rapidesa d’operació i la seva maduresa del procés, és l’embotició. Per a dur a terme aquest procés és necessària la construcció d’uns utillatges (matriu i punxó) per a cada tipus de producte. Aquests utillatges estan fabricats amb materials altament resistents ja que han de poder suportar càrregues molt importants durant la deformació. A més, s’han de garantir unes precisions dimensionals molt bones per tal d’evitar el xoc entre les dues parts de l’utillatge i per a assegurar que la peça obtinguda tingui les dimensions desitjades. Aquest fet implica que el procés d’obtenció de les matrius i punxons tingui un cost molt elevat i per a amortitzar-lo és necessari que la producció sigui en massa.L’objecte d’aquest projecte és adaptar el centre de mecanitzat Kondia HS1000 per tal de poder dur a terme recerca bàsica de la tecnologia de conformat incremental de xapa (ISF) en el Grup de Recerca en Enginyeria del Producte, Procés i Producció (GREP)

Rehabilitació i control d'un manipulador industrial

El grup de visió per computadora de la Universitat de Girona, disposava d’un manipulador lineal com a sistema de posicionament, per poder inspeccionar mitjançant visió artificial, la superfície de diverses peces. El control es realitzava a partir d’un PLC, controlant la posició de la plataforma de posicionament a partir d’un servomotor, un servocontrolador i una targeta d’entrada i sortida de polsos. Es pretén la recuperació d’aquest sistema de posicionament lineal a partir de la recopilació de la informació inicial. El nou ús serà enfocat al posicionament i a la classificació de diversos elements. D’aquesta forma es podrà estudiar el funcionament d’un servomotor governat per un servodriver i una targeta d’entrada i sortida de polsos i s’utilitzarà com a element didàctic per a la universitat. Es complementarà la documentació disponible i s’elaborarà informació tècnica

Exome sequencing identifies DYNC2H1 mutations as a common cause of asphyxiating thoracic dystrophy (Jeune syndrome) without major polydactyly, renal or retinal involvement.

BACKGROUND: Jeune asphyxiating thoracic dystrophy (JATD) is a rare, often lethal, recessively inherited chondrodysplasia characterised by shortened ribs and long bones, sometimes accompanied by polydactyly, and renal, liver and retinal disease. Mutations in intraflagellar transport (IFT) genes cause JATD, including the IFT dynein-2 motor subunit gene DYNC2H1. Genetic heterogeneity and the large DYNC2H1 gene size have hindered JATD genetic diagnosis. AIMS AND METHODS: To determine the contribution to JATD we screened DYNC2H1 in 71 JATD patients JATD patients combining SNP mapping, Sanger sequencing and exome sequencing. RESULTS AND CONCLUSIONS: We detected 34 DYNC2H1 mutations in 29/71 (41%) patients from 19/57 families (33%), showing it as a major cause of JATD especially in Northern European patients. This included 13 early protein termination mutations (nonsense/frameshift, deletion, splice site) but no patients carried these in combination, suggesting the human phenotype is at least partly hypomorphic. In addition, 21 missense mutations were distributed across DYNC2H1 and these showed some clustering to functional domains, especially the ATP motor domain. DYNC2H1 patients largely lacked significant extra-skeletal involvement, demonstrating an important genotype-phenotype correlation in JATD. Significant variability exists in the course and severity of the thoracic phenotype, both between affected siblings with identical DYNC2H1 alleles and among individuals with different alleles, which suggests the DYNC2H1 phenotype might be subject to modifier alleles, non-genetic or epigenetic factors. Assessment of fibroblasts from patients showed accumulation of anterograde IFT proteins in the ciliary tips, confirming defects similar to patients with other retrograde IFT machinery mutations, which may be of undervalued potential for diagnostic purposes.

ASIC1a oligomerization structure-function of its extracellular vestibule and functional characterization of αS243Pβɣ ENaC

Quatre cristaux du canal ASIC1a ont été publiés et soutiennent une stoechiométrie trimérique. Cependant, ces données contredisant de précédentes analyses fonctionnelles effectuées sur des canaux de la même famille, notre intérêt fut porté sur l'oligomérisation d'ASIC1a. Dans ce sens, un nouvel essai couplant la méthode d'analyse par substitution de cystéines (SCAM) avec l'utilisation de réactifs sulfhydryls bifonctionnels (crosslinkers) a été mis en place. Le but étant de stabiliser, puis sélectionner les canaux fonctionnels, pour ensuite les séparer selon leur taille par SDS-PAGE. Grâce à cette technique, nous avons démontré que le complexe stabilisé a une taille coïncidant avec une organisation tétramérique. En plus de son oligomérisation, le chemin emprunté par les ions pour traverser le canal n'est pas clairement défini dans ces structures. De ce fait, utilisant une approche électrophysiologique, nous avons étudié le lien entre la structure et la fonction du vestibule extracellulaire d'ASIC1a. Dans ce but, nous nous sommes intéressés l'accessibilité de cystéines spécifiques localisées dans ce vestibule pour des réactifs méthanethiosulfonates (MTS). Ainsi, nous avons pu corréler les cinétiques de modification de ces cystéines par les MTS avec les effets sur le courant sodique, et donc avoir des informations supplémentaires sur la voie empruntée par les ions. De plus, la simulation informatique de liaison de ces réactifs illustre le remplissage total de ce vestibule. Fonctionnellement, cette interaction ne perturbe pas le passage de ions, c'est pourquoi il nous apparaît probable que le vestibule présente une taille plus large que celle illustrée par les cristaux. Dans un deuxième temps, notre intérêt fut porté sur ENaC. Ce canal est composé des trois sous-unités (a, ß et y) et est exprimé dans divers épithéliums, dont les tubules des reins. Il participe à l'homéostasie sodique et est essentiellement régulé par voie hormonale via l'aldostérone et la Vasopressine, mais également par des sérines protéases ou le Na+. Nous avons étudié la répercussion fonctionnelle de la mutation aS243P, découverte chez un nouveau-né prématuré atteint de pseudohypoaldostéronisme de type 1. Cette maladie autosomale récessive se caractérise, généralement, par une hyponatrémie liée à d'importantes pertes de sel dans les urines, une hyperkaliémie, ainsi qu'un niveau élevé d'aldostérone. Tout d'abord aucune des expériences biochimiques et électrophysiologiques n'a pu démontrer un défaut d'expression ou une forte diminution de l'activité soutenant les données cliniques. Cependant, en challengeant aS243PßyENaC avec une forte concentration de Na+ externe, une hypersensibilité de canal fut observée. En effet, ni les phénomènes régulateurs de « feedback inhibition » ou de « Na+ self-inhibition » n'étaient semblables au canal sauvage. De ce fait, ils apparaissaient exacerbés en présence de la mutation, amenant ainsi à une diminution de la réabsorption de Na+. Ceci corrobore entièrement l'hyponatrémie diagnostiquée. Le rein d'un prématuré étant immature, la quantité de Na+ atteignant la partie distale du néphron est plus élevée, du fait que les autres mécanismes de réabsorption en amont ne sont probablement pas encore en place. Cette hypothèse est renforcée par l'existence d'un frère présentant la même mutation, mais qui, né à terme, ne présentait aucun signe d'hyponatrémie. - The main topic of my thesis is the structure-function relationship of the ENaC/Deg family of ion channels, namely the Acid-Sensing Ion Channel ASIC1a and the Epithelial Na Channel ENaC. The primary part of this research is dedicated to the structure of ASIC1a. Four channel crystals have been published, which support a trimeric stoichiometry, although these data contradict previous functional experiments on other ENaC/Deg members. We are therefore interested in ASIC1a oligomerization and have set up a new assay combining the Substituted- Cysteine Accessibility Method (SCAM) with Afunctional sulfhydryl reagents (crosslinkers) allowing its study. The aim was to first stabilize the channels, then select those that are functional and then resolve them according to their size on SDS-PAGE. We demonstrated that the stabilized complex has a molecular weight corresponding to a tetrameric stoichiometry. In addition to our interest in the oligomerization of the ENaC/Deg family of ion channels, we also wanted to investigate the thus far undefined way of permeation for these channels. Therefore, taking the advantage of a more electrophysiological approach, we studied the accessibility of specific cysteines for methanethiosulfonate reagents (MTS) and were able to correlate the MTS association kinetics on cysteine residues with Na+ currents. These results have given us an insight into ion permeation and our functional evidence indicates that the extracellular is larger than that depicted by the crystal structures. As a side project, we focused on ENaC, which is made up of three subunits (a, ß and y) and is expressed in various epithelia, especially in the distal nephron of the kidneys. It plays a role in Na+ homeostasis and is essentially regulated by hormones via aldosterone and vasopressin, but also by serine proteases or Na+. We have studied the functional impact of the aS243P mutation, discovered in a premature baby suffering from pseudohypoaldosteronism of type 1. This autosomal recessive disease is characterized by hyponatremia, hyperkalemia and high aldosterone levels. Firstly, neither biochemical nor electrophysiological experiments indicated an expression defect or a strong decrease in activity. However, challenging aS243PßyENaC with increased external Na+ concentration showed channel hypersensitivity. Indeed, both the "feedback inhibition" and the "Na+ self-inhibition" regulatory mechanisms are impaired, leading to a decrease in Na+ reabsorption, entirely supports the diagnosis. The kidneys in preterm infants are immature and Na+ levels reaching the distal nephron are higher than normally observed. We hypothesize that the upstream reabsorption machinery is unlikely to be sufficiently matured and this assumption is supported by an asymptomatic sibling carrying the same mutation, but born at term. - La cellule, unité fonctionnelle du corps humain, est délimitée par une membrane plasmique servant de barrière biologique entre les milieux intra et extracellulaires. Une communication entre cellules est indispensable pour un fonctionnement adéquat. Sa survie dépend, entre autres, du maintien de la teneur en ions dans chacun des milieux qui doivent pouvoir être réabsorbés, ou sécrétés, selon les besoins. Les protéines insérées dans la membrane forment un canal et sont un moyen de communication permettant spécifiquement à des ions tel que le sodium (Na+) de traverser. Le Na+ se trouve dans la plupart des aliments et le sel, et est spécifiquement réabsorbé au niveau des reins grâce au canal sodique épithélial ENaC. Cette réabsorption se fait de l'urine primaire vers l'intérieur de la cellule, puis est transporté vers le sang. Pour maintenir un équilibre, une régulation de ce canal est nécessaire. En effet, des dysfonctionnements impliquant la régulation ou l'activité d'ENaC lui-même sont à l'origine de maladies telles que la mucoviscidose, l'hypertension ou encore, le pseudohypoaldostéronisme (PHA). Cette maladie est caractérisée, notamment, par d'importantes pertes de sel dans les urines. Des pédiatres ont diagnostiqué un PHA chez un nouveau-né, ce dernier présentant une modification du canal ENaC, nous avons recréé cette protéine afin d'étudier l'impact de ce changement sur son activité. Nous avons démontré que la régulation d'ENaC était effectivement perturbée, conduisant ainsi à une forte réduction de la réabsorption sodique. Afin de développer des molécules capables de moduler l'activité de protéines. Il est nécessaire d'en connaître la structure. Celle du canal sodique sensible à l'acidification ASIC1, un canal cousin d'ENaC, est connue. Ces données structurales contredisant cependant les analyses fonctionnelles, nous nous sommes penchés une nouvelle fois sur ASIC1. Une protéine est une macromolécule biologique composée d'une chaîne d'acides aminés (aa). De l'enchaînement d'aa à la protéine fonctionnelle, quatre niveaux de structuration existent. Chaque aa donne une indication quant au repliement et plus particulièrement la cystéine. Arborant un groupe sulfhydryle (SH) capable de former une liaison spécifique et stable avec un autre SH, celle-ci est souvent impliquée dans la structure tridimensionnelle de la protéine. Ce type de liaison intervient également dans la stabilisation de la structure quaternaire, qui est l'association de plusieurs protéines identiques (homomère), ou pas (hétéromère). Dans cette partie, nous avons remplacé des aa par des cystéines à des endroits spécifiques. Le but était de stabiliser plusieurs homomères d'ASICl ensemble avec des réactifs créant des ponts entre deux SH. Ainsi, nous avons pu déterminer le nombre de protéines ASIC1 participant à la formation d'un canal fonctionnel. Nos résultats corroborent les données fonctionnelles soutenant un canal tétramérique. Nous avons également étudié l'accessibilité de ces nouvelles cystéines afin d'obtenir des informations supplémentaires sur la structure du chemin emprunté par le Na+ à travers ASIC1 et plus particulièrement du vestibule extracellulaire.

Pregnancy-induced chromatin remodeling in the breast of postmenopausal women.

Early pregnancy and multiparity are known to reduce the risk of women to develop breast cancer at menopause. Based on the knowledge that the differentiation of the breast induced by the hormones of pregnancy plays a major role in this protection, this work was performed with the purpose of identifying what differentiation-associated molecular changes persist in the breast until menopause. Core needle biopsies (CNB) obtained from the breast of 42 nulliparous (NP) and 71 parous (P) postmenopausal women were analyzed in morphology, immunocytochemistry and gene expression. Whereas in the NP breast, nuclei of epithelial cells were large and euchromatic, in the P breast they were small and hyperchromatic, showing strong methylation of histone 3 at lysine 9 and 27. Transcriptomic analysis performed using Affymetrix HG_U133 oligonucleotide arrays revealed that in CNB of the P breast, there were 267 upregulated probesets that comprised genes controlling chromatin organization, transcription regulation, splicing machinery, mRNA processing and noncoding elements including XIST. We concluded that the differentiation process induced by pregnancy is centered in chromatin remodeling and in the mRNA processing reactome, both of which emerge as important regulatory pathways. These are indicative of a safeguard step that maintains the fidelity of the transcription process, becoming the ultimate mechanism mediating the protection of the breast conferred by full-term pregnancy.

Ecology and evolution of soil nematode chemotaxis.

Plants influence the behavior of and modify community composition of soil-dwelling organisms through the exudation of organic molecules. Given the chemical complexity of the soil matrix, soil-dwelling organisms have evolved the ability to detect and respond to these cues for successful foraging. A key question is how specific these responses are and how they may evolve. Here, we review and discuss the ecology and evolution of chemotaxis of soil nematodes. Soil nematodes are a group of diverse functional and taxonomic types, which may reveal a variety of responses. We predicted that nematodes of different feeding guilds use host-specific cues for chemotaxis. However, the examination of a comprehensive nematode phylogeny revealed that distantly related nematodes, and nematodes from different feeding guilds, can exploit the same signals for positive orientation. Carbon dioxide (CO(2)), which is ubiquitous in soil and indicates biological activity, is widely used as such a cue. The use of the same signals by a variety of species and species groups suggests that parts of the chemo-sensory machinery have remained highly conserved during the radiation of nematodes. However, besides CO(2), many other chemical compounds, belonging to different chemical classes, have been shown to induce chemotaxis in nematodes. Plants surrounded by a complex nematode community, including beneficial entomopathogenic nematodes, plant-parasitic nematodes, as well as microbial feeders, are thus under diffuse selection for producing specific molecules in the rhizosphere that maximize their fitness. However, it is largely unknown how selection may operate and how belowground signaling may evolve. Given the paucity of data for certain groups of nematodes, future work is needed to better understand the evolutionary mechanisms of communication between plant roots and soil biota.

Disseny d'un banc d'assaig per a ventiladors d'alta pressió

L’objectiu d’aquest projecte és dissenyar un banc que mesuri ventiladors centrífugs d’alta pressió i que a l’hora pugui analitzar ventiladors helicoïdals de petits cabals. D’aquesta manera es modernitzarien els mètodes de mesura que hi ha actualment, i a més es podrien fer mesures amb més regularitat dels ventiladors industrials que fabrica Casals. El banc d’assaig serveix per determinar les prestacions del ventilador, ha de mesurar el cabal, la pressió estàtica, la pressió dinàmica i el consum del ventilador. El projecte inclou el disseny del banc, els plànols, la corresponent documentació, i un manual d’ús i manteniment. El disseny del software està delegat a una empresa externa, i el disseny de quadre elèctric està delegat al departament electrònic de l’empresa

The transcriptome of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices (DAOM 197198) reveals functional tradeoffs in an obligate symbiont.

? The arbuscular mycorrhizal symbiosis is arguably the most ecologically important eukaryotic symbiosis, yet it is poorly understood at the molecular level. To provide novel insights into the molecular basis of symbiosis-associated traits, we report the first genome-wide analysis of the transcriptome from Glomus intraradices DAOM 197198. ? We generated a set of 25,906 nonredundant virtual transcripts (NRVTs) transcribed in germinated spores, extraradical mycelium and symbiotic roots using Sanger and 454 sequencing. NRVTs were used to construct an oligoarray for investigating gene expression. ? We identified transcripts coding for the meiotic recombination machinery, as well as meiosis-specific proteins, suggesting that the lack of a known sexual cycle in G. intraradices is not a result of major deletions of genes essential for sexual reproduction and meiosis. Induced expression of genes encoding membrane transporters and small secreted proteins in intraradical mycelium, together with the lack of expression of hydrolytic enzymes acting on plant cell wall polysaccharides, are all features of G. intraradices that are shared with ectomycorrhizal symbionts and obligate biotrophic pathogens. ? Our results illuminate the genetic basis of symbiosis-related traits of the most ancient lineage of plant biotrophs, advancing future research on these agriculturally and ecologically important symbionts.

The expressions of GABA and glutannate transporters are altered in the spared nerve injury model of neuropathic pain in the rat

Neuropathic pain is a common form of chronic pain, and is unsuccessfully alleviated by usual medications. Mounting evidence strongly point at non-neuronal glial cells in the spinal cord as key actors behind the persistence of pain. In particular, a change in the astrocytic capacity to regulate extracellular concentrations of neurotransmitters might account for the strengthened spinal nociceptive neurotransmission. Therefore, we investigated whether spinal expressions of GABA (GAT) and glutamate (EAAT) transporters were affected in the spared nerve injury (SNI) rat model of neuropathic pain. SNI was induced in male Sprague-Dawley rats by a unilateral section of tibial and common peroneal branches of the sciatic nerve, leaving the sural branch untouched. Western-blot analysis was performed to study the expression of GAT-1 and GAT-3 as well as EAAT-1 and EAAT-2, the main astrocytic GABA and glutamate transporters respectively. Seven days post-surgery, a significant increase in GAT-1, GAT-3 and EAAT-1 expressions is detected in both ipsilateral and contralateral sides of lumbar spinal cord in comparison to sham animals. No change in EAAT-2 signal could be detected. Furthermore, the astrocytic reaction parallels the glutamate and GABA transporters changes as we found an increased GFAP expression compared to the sham condition, in both spinal sides. Together, our results indicate that modifications in GABA and glutamate transport may occur along with SNI-associated painful neuropathy and identify spinal neurotransmitter reuptake machinery as a putative pharmacological target in neuropathic pain.

Antiretroviral activity of ancestral TRIM5alpha.

The antiretroviral protein TRIM5alpha is known to have evolved different restriction capacities against various retroviruses, driven by positive Darwinian selection. However, how these different specificities have evolved in the primate lineages is not fully understood. Here we used ancestral protein resurrection to estimate the evolution of antiviral restriction specificities of TRIM5alpha on the primate lineage leading to humans. We used TRIM5alpha coding sequences from 24 primates for the reconstruction of ancestral TRIM5alpha sequences using maximum-likelihood and Bayesian approaches. Ancestral sequences were transduced into HeLa and CRFK cells. Stable cell lines were generated and used to test restriction of a panel of extant retroviruses (human immunodeficiency virus type 1 [HIV-1] and HIV-2, simian immunodeficiency virus [SIV] variants SIV(mac) and SIV(agm), and murine leukemia virus [MLV] variants N-MLV and B-MLV). The resurrected TRIM5alpha variant from the common ancestor of Old World primates (Old World monkeys and apes, approximately 25 million years before present) was effective against present day HIV-1. In contrast to the HIV-1 restriction pattern, we show that the restriction efficacy against other retroviruses, such as a murine oncoretrovirus (N-MLV), is higher for more recent resurrected hominoid variants. Ancestral TRIM5alpha variants have generally limited efficacy against HIV-2, SIV(agm), and SIV(mac). Our study sheds new light on the evolution of the intrinsic antiviral defense machinery and illustrates the utility of functional evolutionary reconstruction for characterizing recently emerged protein differences.