Localisation et fonction de CHK2 en mitose

Les centrosomes dont le rôle principal est d’organiser le cytosquelette de microtubules et le fuseau mitotique servent aussi de sites d’interaction pour plusieurs protéines régulatrices du cycle cellulaire et de la réponse aux dommages à l’ADN. Une de ces protéines est la kinase CHK2 et plusieurs publications montrent une sous-population de CHK2 localisée aux centrosomes dans les cellules en interphase et en mitose. Toutefois, la localisation de CHK2 aux centrosomes demeure controversée, car des doutes subsistent en ce qui concerne la spécificité des anticorps utilisés en immunocytochimie. En utilisant des lignées cellulaires du cancer du côlon, les cellules HCT116 sauvages et HCT116 CHK2-/- ainsi que différentes lignées d’ostéosarcome humain dans lesquelles l’expression de CHK2 a été inhibée par ARN interférence, nous montrons que les anticorps anti-CHK2 qui donnent un signal centrosomal sont non spécifiques et reconnaissent un antigène inconnu sur les centrosomes. Cependant, par des expériences d’immunofluorescence réalisées avec des cellules U2OS qui expriment les protéines de fusion GFP-CHK2 ou FLAG-CHK2, nous révélons une localisation centrosomale de CHK2 dans les cellules en mitose, mais pas en interphase. Ce résultat a été confirmé par vidéomicroscopie dans les cellules vivantes exprimant GFP-CHK2. Pour déterminer le ou les rôles potentiels de CHK2 en mitose nous avons réalisé des expériences pour explorer le rôle de CHK2 dans la progression de la mitose, la nucléation des microtubules aux centrosomes et la progression de la mitose en présence de problèmes d’attachement des chromosomes où de lésions génotoxiques. Nos données suggèrent que CHK2 n’est pas impliquée dans la régulation de la mitose dans les cellules U2OS.

Processus post-transcriptionnels inédits dans la mitochondrie des diplonémides

Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant.

La RNase P mitochondriale chez Neurospora crassa

Résumé La Ribonucléase P (RNase P) est une enzyme principalement reconnue pour sa participation à la maturation en 5’des ARN de transfert (ARNt). Cependant, d’autres substrats sont reconnus par l’enzyme. En général, la RNase P est composée d’une sous-unité ARN (le P-ARN, codé par le gène rnpB) qui porte le centre actif de l’enzyme et d’une ou de plusieurs sous-unités protéiques (la P-protéine). Les P-ARN chez toutes les bactéries, la majorité des archéobactéries et dans le génome nucléaire de la plupart des eucaryotes, possèdent généralement une structure secondaire très conservée qui inclut le noyau (P1-P4); l’hélice P4 constitue le site catalytique de l’enzyme et l’hélice P1 apparie les extrémités du P-ARN en stabilisant sa structure globale. Les P-ARN mitochondriaux sont souvent moins conservés et difficiles à découvrir. Dans certains cas, les seules régions de structure primaire qui restent conservées sont celles qui définissent le P4 et le P1. Pour la détection des gènes rnpB, un outil de recherche bioinformatique, basé sur la séquence et le profil de structure secondaire, a été développé dans le laboratoire. Cet outil permet le dépistage de toutes les séquences eucaryotes (nucléaires et mitochondriales) du gène avec une très grande confiance (basée sur une valeur statistique, E-value). Chez les champignons, plusieurs ascomycètes encodent un gène rnpB dans leur génome mitochondrial y compris tous les membres du genre d’Aspergillus. Cependant, chez les espèces voisines, Neurospora crassa, Podospora anserina et Sordaria macrospora, une version mitochondriale de ce gène n’existe pas. Au lieu de cela, elles contiennent deux copies nucléaires du gène, légèrement différentes en taille et en contenu nucléotidique. Mon projet a été établi dans le but d’éclaircir l’évolution de la RNase P mitochondriale (mtRNase P) chez ces trois espèces voisines d’Aspergillus. En ce qui concerne les résultats, des modèles de structures secondaires pour les transcrits de ces gènes ont été construits en se basant sur la structure consensus universelle de la sous-unité ARN de la RNase P. Pour les trois espèces, par la comparaison de ces modèles, nous avons établi que les deux copies nucléaires du gène rnpB sont assez distinctes en séquence et en structure pour pouvoir y penser à une spécialisation de fonction de la RNase P. Chez N. crassa, les deux P-ARN sont modifiés probablement par une coiffe et les extrémités 5’, 3’ sont conformes à nos modèles, ayant un P1 allongé. Encore chez N. crassa, nous avons constaté que les deux copies sont transcrites au même niveau dans le cytoplasme et que la plus petite et la plus stable d’entre elles (Nc1) se retrouve dans l’extrait matriciel mitochondrial. Lors du suivi du P-ARN dans diverses sous-fractions provenant de la matrice mitochondriale soluble, Nc1 est associée avec l’activité de la RNase P. La caractérisation du complexe protéique, isolé à partir de la fraction active sur un gel non dénaturant, révèle qu’il contient au moins 87 protéines, 73 d’entre elles ayant déjà une localisation mitochondriale connue. Comme chez la levure, les protéines de ce complexe sont impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires comme le processing de l’ADN/ARN, le métabolisme, dans la traduction et d’autres (par exemple : la protéolyse et le repliement des protéines, ainsi que la maintenance du génome mitochondrial). Pour trois protéines, leur fonction est non déterminée.

Caractérisation de l’interaction entre la protéine Lin28 et le précurseur du microARN let-7g

La régulation de l’expression des gènes est ce qui permet à nos cellules de s’adapter à leur environnement, de combattre les infections ou, plus généralement, de produire la quantité exacte de protéine nécessaire pour répondre à un besoin spécifique. Parmi les joueurs les plus importants dans cette régulation de l’expression des gènes on retrouve les microARN (miARN). Ces petits ARN de 22 nucléotides sont présents chez la majorité des espèces multicellulaires et sont responsables du contrôle direct de plus de 30% des gènes exprimant des protéines chez les vertébrés. La famille de miARN lethal-7 (let-7) est composée de miARN parmi les plus connus et ayant des fonctions cruciales pour la cellule. La régulation du niveau des miARN let-7 est essentielle au bon développement cellulaire. La biogenèse de ces miARN, du transcrit primaire jusqu’à leur forme mature, est régulée principalement par Lin28, une protéine pluripotente très conservée. Cette protéine est composée d’un domaine cold shock (CSD) et de deux domaines de liaison au zinc. C’est grâce à ces domaines de liaison à l’ARN que Lin28 peut lier et inhiber la maturation des miARN let-7. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’interaction entre Lin28 et le microARN précurseur let-7g afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’inhibition de la biogenèse du miARN. À l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, nous avons d’abord défini les principaux déterminants de l’interaction entre Lin28 et la boucle terminale du miARN précurseur let-7g (TL-let-7g). Nous avons conclu que le domaine C-terminal de Lin28, composé d’un motif riche en lysines et arginines ainsi que de deux motifs de liaison au zinc, permet à la protéine de lier spécifiquement et avec haute affinité un renflement riche en guanine conservé chez les précurseurs de la famille let-7. Aussi, parce que la séquence et la spécificité de liaison à l’ARN de ce domaine C-terminal sont semblables à celles de la protéine NCp7 du VIH, nous avons défini ce dernier comme le domaine NCp7-like de Lin28. Par la suite, nous avons caractérisé la multimérisation de trois protéines Lin28 sur la boucle terminale de pre-let-7g. Ceci a permis de réconcilier d’apparentes contradictions retrouvées dans la littérature actuelle concernant les sites de liaison de Lin28 lors de sa liaison aux miARN précurseurs. Nous avons identifié trois sites de liaison à haute affinité sur TL-let-7g qui sont liés dans un ordre précis par trois protéines Lin28. Lors de la formation du complexe multimérique, le CSD permet une déstabilisation de l’ARN, ce qui rend accessible plusieurs sites de liaison. Le domaine NCp7-like permet plutôt un assemblage ordonné de la protéine et facilite la liaison initiale de cette dernière. Ces nouveaux résultats rendent possible la mise au point d’un nouveau modèle de l’interaction entre Lin28 et le miARN précurseur let-7g. En conclusion, les études réalisées dans cette thèse apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d’une importante famille de miARN et permettront de guider les futures études dans le domaine de recherche en pleine effervescence qu’est celui de la biogenèse des miARN.

Purification par affinité et marquage isotopique spécifique pour études d’ARN fonctionnels

Il existe un lien étroit entre la structure tridimensionnelle et la fonction cellulaire de l’ARN. Il est donc essentiel d’effectuer des études structurales de molécules d’ARN telles que les riborégulateurs afin de mieux caractériser leurs mécanismes d’action. Une technique de choix, permettant d’obtenir de l’information structurale sur les molécules d’ARN est la spectroscopie RMN. Cette technique est toutefois limitée par deux difficultés majeures. Premièrement, la préparation d’une quantité d’ARN nécessaire à ce type d’étude est un processus long et ardu. Afin de résoudre ce problème, notre laboratoire a développé une technique rapide de purification des ARN par affinité, utilisant une étiquette ARiBo. La deuxième difficulté provient du grand recouvrement des signaux présents sur les spectres RMN de molécules d’ARN. Ce recouvrement est proportionnel à la taille de la molécule étudiée, rendant la détermination de structures d’ARN de plus de 15 kDa extrêmement complexe. La solution émergeante à ce problème est le marquage isotopique spécifique des ARN. Cependant, les protocoles élaborées jusqu’à maintenant sont très coûteux, requièrent plusieurs semaines de manipulation en laboratoire et procurent de faibles rendements. Ce mémoire présente une nouvelle stratégie de marquage isotopique spécifique d’ARN fonctionnels basée sur la purification par affinité ARiBo. Cette approche comprend la séparation et la purification de nucléotides marqués, une ligation enzymatique sur support solide, ainsi que la purification d’ARN par affinité sans restriction de séquence. La nouvelle stratégie développée permet un marquage isotopique rapide et efficace d’ARN fonctionnels et devrait faciliter la détermination de structures d’ARN de grandes tailles par spectroscopie RMN.

Étude de l’expression de « Bcl-2 modifying factor » (Bmf) et son implication dans la néphropathie diabétique

Objectif : Étudier les mécanismes apoptotiques impliqués dans la néphropathie diabétique en identifiant les gènes responsables de l’apoptose et activés par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules de tubules proximaux rénaux (RPTC) de différents modèles diabétiques. Méthodes : Une hybridation par puce à AND a été réalisée sur les ARN extraits à partir de RPTC de souris heterozygotes db/m+, db/db and db/db catalase (CAT)-transgénique (Tg) de 20 semaines. Des expériences de PCR en temps réel et d’immunohistochimie réalisées sur ces modèles et sur le modèle ou le diabète avait été induit par traitement au streptozotocin (STZ) ont permis de valider les gènes apoptotiques identifiés par puce à ADN. Des RPTC immortalisées de rat ont été utilisées pour montrer l’activité de ces gènes apoptotique et la régulation de leur expression. De plus, une étude additionnelle réalisée sur des sections rénales provenant de patients diabétiques et non diabétiques a démontré également une surexpression de ces gènes apoptotiques dans les IRPTC. Résultats: L’expression de Bcl-2-modifying factor (Bmf), une protéine apoptotique, semble augmentée dans les RPTC de souris db/db comparé aux souris contrôles db/m+, ou aux souris db/db CAT-tg. La surexpression de Bmf a également été identifiée dans les RPTC du modèle diabétique STZ. La normalisation de l’hyperglycémie chez ces souris par traitement à l’insuline semble normaliser également l’expression de Bmf. In vitro, la surexpression du cDNA de Bmf dans les RPTC promouvoit l’apoptose et augmente l’activité de caspase 3. La stimulation de RPTC de Rat avec le glucose élevé (25mM de D-glucose) semble augmenter l’expression de Bmf et le traitement de ces cellules avec la roténone, les Diphénylène iodonium, la catalase et l’apocynine semble renverser cette stimulation. L’inhibition de Bmf avec un siRNA semble réduire l’apoptose induite par le glucose élevé. L’expression de Bmf a également été démontrée dans les RPTC de patients diabétiques. Conclusion: Ces résultats ont démontré une surexpression de Bmf dans les RPTC de différents modèles diabétiques et suggèrent son potentiel rôle dans la régulation de l’apoptose et de l’atrophie tubulaire chez les diabétiques.

Rôle du régulateur Fur et des petits ARN non codants RfrA et RfrB dans l’homéostasie du fer et la virulence de Salmonella

La régulation de l’homéostasie du fer est cruciale chez les bactéries. Chez Salmonella, l’expression des gènes d’acquisition et du métabolisme du fer au moment approprié est importante pour sa survie et sa virulence. Cette régulation est effectuée par la protéine Fur et les petits ARN non codants RfrA et RfrB. Le rôle de ces régulateurs est d’assurer que le niveau de fer soit assez élevé pour la survie et le métabolisme de Salmonella, et assez faible pour éviter l’effet toxique du fer en présence d’oxygène. Les connaissances concernant le rôle de ces régulateurs ont été principalement obtenues par des études chez S. Typhimurium, un sérovar généraliste causant une gastro-entérite chez les humains. Très peu d’informations sont connues sur le rôle de ces régulateurs chez S. Typhi, un sérovar humain-spécifique responsable de la fièvre typhoïde. Le but de cette étude était de déterminer les rôles de Fur, RfrA et RfrB dans l’homéostasie du fer et la virulence de Salmonella, et de démontrer qu’ils ont une implication distincte chez les sérovars Typhi et Typhimurium. Premièrement, Fur, RfrA et RfrB régulent l’homéostasie du fer de Salmonella. Les résultats de cette étude ont démontré que Fur est requis pour la résistance au stress oxydatif et pour une croissance optimale dans différentes conditions in vitro. La sensibilité du mutant fur est due à l’expression des petits ARN RfrA et RfrB, et cette sensibilité est beaucoup plus importante chez S. Typhi que chez S. Typhimurium. Également, Fur inhibe la transcription des gènes codant pour les sidérophores en conditions riches en fer, tandis que les petits ARN RfrA et RfrB semblent être importants pour la production d’entérobactine et de salmochélines chez S. Typhi lors de conditions pauvres en fer. Ensuite, ces régulateurs affectent la virulence de Salmonella. Fur est important pour la motilité de Salmonella, particulièrement chez S. Typhi. Fur est nécessaire pour l’invasion des deux sérovars dans les cellules épithéliales, et pour l’entrée et la survie de S. Typhi dans les macrophages. Chez S. Typhimurium, Fur ne semble pas impliqué dans l’interaction avec les macrophages. De plus, les petits ARN RfrA et RfrB sont importants pour la multiplication intracellulaire de Salmonella dans les macrophages pour les deux sérovars. Finalement, la protéine Fur et les petits ARN RfrA et RfrB régulent l’expression de l’opéron fimbriaire tcf, absent du génome de S. Typhimurium. Un site de liaison putatif de la protéine Fur a été identifié dans la région promotrice de tcfA chez S. Typhi, mais une régulation directe n’a pas été confirmée. L’expression de tcf est induite par le fer et par Fur, et est inhibée par les petits ARN RfrA et RfrB. Ainsi, ces régulateurs affectent des gènes de virulence qui sont retrouvés spécifiquement chez S. Typhi. En somme, ce projet a permis de démontrer que les régulateurs de l’homéostasie du fer de Salmonella peuvent affecter la résistance de cette bactérie pathogène à différents stress, notamment le stress oxydatif, la croissance en conditions de carence en fer ainsi que la virulence. Ces régulateurs jouent un rôle distinct chez les sérovars Typhi et Typhimurium.

Hypertension et régulation de l'expression moléculaire de l'angiotensinogène par la ribonucléoprotéine hétérogène nucléaire K

Le diabète est une maladie chronique dont la principale caractéristique est un niveau plasmatique élevé de glucose, qui est causé soit par un défaut dans la production d’insuline, l’action de l’insuline, ou les deux à la fois. Plusieurs études ont démontré que l’hyperglycémie chronique peut mener à la dysfonction et même la défaillance de plusieurs organes, dont le coeur, le système vasculaire, les yeux et les reins, se traduisant par des infarctus du myocarde, des accidents cérébro-vasculaires et des complications rétinales et rénales, respectivement. La néphropathie diabétique (DN) est la principale cause de déficience rénale et affecte près de 25-40% des patients diabétiques. La DN est invariablement associée à un risque élevé d’accident cérébrovasculaire et de dysfonction cardivasculaire. L’angiotensinogène (Agt) est l’unique précurseur de tous les types d’angiotensines. En plus du système rénine-angiotensine (RAS) sytémique, le rein possède son propre système intrarénal et exprime tous les composants du RAS. L’Agt est fortement exprimé dans les cellules du tubule proximal rénal (RPTC) et y est converti en angiotensine II (AngII), le peptide biologiquement actif du RAS. Les patients diabétiques présentent de hauts niveaux d’AngII et une augmentation de l’expression des gènes du RAS, suggérant que l’activation du RAS intrarénal joue un rôle important dans la progression de la DN. Les mécanismes qui contrôlent la régulation du niveau rénal d’Agt par l’hyperglycémie et l’insuline demeurent mal compris. Le but global de cette thèse est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression du gène Agt chez la souris Akita (un modèle murin de diabète de type 1). Dans cette optique, la première partie de la thèse se concentre sur deux facteurs de transcription de la famille des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP). Chan et collaborateurs ont déjà identifié 2 protéines nucléaires hnRNP F et hnRNP K, de 48kD et 70kD respectivement. HnRNP F et hnRNP K forment un hétérodimère et se lient à l’élément de réponse à l’insuline (IRE) présent dans le promoteur du gène Agt du rat et inhibent la transcription du gène Agt in vitro. Afin de déterminer si hnRNP F / K sont responsables de l’inhibition de l’expression rénale de Agt par l’insuline in vivo, nous avons étudié des souris Akita males traités ou non avec des implants d’insuline pour une période de 4 semaines. Des souris non-Akita males ont été employées comme contrôles. Les souris Akita développent de l’hypertension et de l’hypertrophie rénale. Le traitement à l’insuline rétablit les niveaux de glucose plasmatiques et la pression systolique (SBP), et atténue l’hypertrophie rénale, l’albuminurie (ratio albumine/créatinine urinaire, ACR) et les niveaux urinaires d’Agt et AngII chez les souris Akita. De plus, le traitement à l’insuline inhibe l’expression rénale du gène Agt, tout en augmentant l’expression des gènes hnRNP F, hnRNP K et ACE2 (enzyme de conversion de l’angiotensine-2). Dans des RPTC in vitro, l’insuline inhibe Agt, mais stimule l’expression de hnRNP F et hnRNP K en présence de hautes concentrations de glucose, et ce via la voie de signalisation MAPK p44/42 (protéine kinase activée par un mitogène). La transfection avec des petits ARN interférents (siRNA) contre hnRNP F et hnRNP K prévient l’inhibition de l’expression d’Agt par l’insuline dans les RPTC. Cette étude démontre bien que l’insuline prévient l’hypertension et atténue les dommages rénaux observés chez les souris Akita diabétiques, en partie grâce à la suppression de la transcription rénale de Agt, via une augmentation de l’expression de hnRNP F et hnRNP K. La seconde partie de cette thèse change de focus et se tourne vers le facteur Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2). Nrf2 est un facteur de transcription qui contrôle les gènes de la réponse antioxydante cellulaire en réponse au stress oxydant ou aux électrophiles. Le but de cette étude est d’examiner l’impact de la surexpression de la catalase (Cat) dans les RPTC sur l’expression du gène Agt via Nrf2 et sur le développement de l’hypertension et des dommages rénaux résultants chez les souris diabétiques Akita transgéniques (Tg). Nos études ont démontré que la surexpression de Cat dans les souris Akita Cat-Tg normalise la SBP, atténue les dommages rénaux et inhibe l’expression des gènes Nrf2 et Agt dans les RPTC. In vitro, le glucose élevé (HG) et l’oltipraz (un activateur de Nrf2) stimulent l’expression de Nrf2 et Agt, et cet effet peut être bloqué par la trigonelline (inhibiteur de Nrf2), des siRNA contre Nrf2, des antioxydants ou des inhibiteurs pharmacologiques NF-κB et MAPK p38. La suppression de sites de réponse à Nrf2 présents dans le promoteur du gène Agt du rat abolit la stimulation par l’oltipraz. Finalement, des souris males adultes non-transgéniques traitées avec l’oltipraz montrent une augmentation de l’expression de Nrf2 et Agt dans leurs RPTC et cette augmentation peut être normalisée par la trigonelline. Ces données permettent d’identifier un nouveau mécanisme d’action de Nrf2, par la stimulation du gène Agt intrarénal et l’activation du RAS, qui induisent l’hypertension et les dommages rénaux par le glucose élevé et les espèces réactives de l’oxygène chez les souris diabétiques. Nos conclusions permettent de démontrer que l’insuline induit l’expression de hnRNP F et hnRNP K, qui jouent ensuite un rôle protecteur en prévenant l’hypertension. La surexpression de la catalase dans les RPTC vient quant à elle atténuer l’activation de Nrf2 et ainsi réduit la SBP chez les souris Akita.

Interpretation of the centromere epigenetic mark to maintain genome stability

Le centromère est la région chromosomique où le kinétochore s'assemble en mitose. Contrairement à certaines caractéristiques géniques, la séquence centromérique n'est ni conservée entre les espèces ni suffisante à la fonction centromérique. Il est donc bien accepté dans la littérature que le centromère est régulé épigénétiquement par une variante de l'histone H3, CENP-A. KNL-2, aussi connu sous le nom de M18BP1, ainsi que ces partenaires Mis18α et Mis18β sont des protéines essentielles pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères. Des évidences expérimentales démontrent que KNL-2, ayant un domaine de liaison à l'ADN nommé Myb, est la protéine la plus en amont pour l'incorporation de CENP-A aux centromères en phase G1. Par contre, sa fonction dans le processus d'incorporation de CENP-A aux centromères n'est pas bien comprise et ces partenaires de liaison ne sont pas tous connus. De nouveaux partenaires de liaison de KNL-2 ont été identifiés par des expériences d'immunoprécipitation suivies d'une analyse en spectrométrie de masse. Un rôle dans l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères a été attribué à MgcRacGAP, une des 60 protéines identifiées par l'essai. MgcRacGAP ainsi que les protéines ECT-2 (GEF) et la petite GTPase Cdc42 ont été démontrées comme étant requises pour la stabilité de CENP-A incorporé aux centromères. Ces différentes observations ont mené à l'identification d'une troisième étape au niveau moléculaire pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé en phase G1, celle de la stabilité de CENP-A nouvellement incorporé aux centromères. Cette étape est importante pour le maintien de l'identité centromérique à chaque division cellulaire. Pour caractériser la fonction de KNL-2 lors de l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères, une technique de microscopie à haute résolution couplée à une quantification d'image a été utilisée. Les résultats générés démontrent que le recrutement de KNL-2 au centromère est rapide, environ 5 minutes après la sortie de la mitose. De plus, la structure du domaine Myb de KNL-2 provenant du nématode C. elegans a été résolue par RMN et celle-ci démontre un motif hélice-tour-hélice, une structure connue pour les domaines de liaison à l'ADN de la famille Myb. De plus, les domaines humain (HsMyb) et C. elegans (CeMyb) Myb lient l'ADN in vitro, mais aucune séquence n'est reconnue spécifiquement par ces domaines. Cependant, il a été possible de démontrer que ces deux domaines lient préférentiellement la chromatine CENP-A-YFP comparativement à la chromatine H2B-GFP par un essai modifié de SIMPull sous le microscope TIRF. Donc, le domaine Myb de KNL-2 est suffisant pour reconnaître de façon spécifique la chromatine centromérique. Finalement, l'élément reconnu par les domaines Myb in vitro a potentiellement été identifié. En effet, il a été démontré que les domaines HsMyb et CeMyb lient l'ADN simple brin in vitro. De plus, les domaines HsMyb et CeMyb ne colocalisent pas avec CENP-A lorsqu'exprimés dans les cellules HeLa, mais plutôt avec les corps nucléaires PML, des structures nucléaires composées d'ARN. Donc, en liant potentiellement les transcrits centromériques, les domaines Myb de KNL-2 pourraient spécifier l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé uniquement aux régions centromériques.

Caractérisation structurale et thermodynamique de la reconnaissance du substrat par le ribozyme VS de Neurospora

Les interactions ARN/ARN de type kissing-loop sont des éléments de structure tertiaire qui jouent souvent des rôles clés chez les ARN, tant au niveau fonctionnel que structural. En effet, ce type d’interaction est crucial pour plusieurs processus dépendant des ARN, notamment pour l’initiation de la traduction, la reconnaissance des ARN antisens et la dimérisation de génome rétroviral. Les interactions kissing-loop sont également importantes pour le repliement des ARN, puisqu’elles permettent d’établir des contacts à longue distance entre différents ARN ou encore entre les domaines éloignés d’un même ARN. Ce type d’interaction stabilise aussi les structures complexes des ARN fonctionnels tels que les ARNt, les riborégulateurs et les ribozymes. Comme d’autres ARN fonctionnels, le ribozyme VS de Neurospora contient une interaction kissing-loop importante. Celle-ci est impliquée dans la reconnaissance du substrat et se forme entre la tige-boucle I (stem-loop I, SLI) du substrat et la tige-boucle V (stem-loop V, SLV) du domaine catalytique. Des études biochimiques ont démontré que l’interaction kissing-loop I/V, dépendante du magnésium, implique trois paires de bases Watson-Crick (W-C). De plus, cette interaction est associée à un réarrangement de la structure du substrat, le faisant passer d’une conformation inactive dite unshifted à une conformation active dite shifted. Les travaux présentés dans cette thèse consistent en une caractérisation structurale et thermodynamique de l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme VS, laquelle est formée de fragments d’ARN représentant les tige-boucles I et V dérivées du ribozyme VS (SLI et SLV). Cette caractérisation a été réalisée principalement par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et par titrage calorimétrique isotherme (isothermal titration calorimetry, ITC) en utilisant différents complexes SLI/SLV dans lesquels l’ARN SLV est commun à tous les complexes, alors que différentes variations de l’ARN SLI ont été utilisées, soit en conformation shiftable ou preshifted. Les données d’ITC ont permis de démontrer qu’en présence d’une concentration saturante de magnésium, l’affinité d’un substrat SLI preshifted pour SLV est extrêmement élevée, rendant cette interaction plus stable que ce qui est prédit pour un duplexe d’ARN équivalent. De plus, l’étude effectuée par ITC montre que des ARN SLI preshifted présentent une meilleure affinité pour SLV que des ARN SLI shiftable, ce qui a permis de calculer le coût énergétique associé au réarrangement de structure du substrat. En plus de confirmer la formation des trois paires de bases W-C prédites à la jonction I/V, les études de RMN ont permis d’obtenir une preuve structurale directe du réarrangement structural des substrats SLI shiftable en présence de magnésium et de l’ARN SLV. La structure RMN d’un complexe SLI/SLV de grande affinité démontre que les boucles terminales de SLI et SLV forment chacune un motif U-turn, ce qui facilite l’appariement W-C intermoléculaire. Plusieurs autres interactions ont été définies à l’interface I/V, notamment des triplets de bases, ainsi que des empilements de bases. Ces interactions contribuent d’ailleurs à la création d’une structure présentant un empilement continu, c’est-à-dire qui se propage du centre de l’interaction jusqu’aux bouts des tiges de SLI et SLV. Ces études de RMN permettent donc de mieux comprendre la stabilité exceptionnelle de l’interaction kissing-loop I/V au niveau structural et mènent à l’élaboration d’un modèle cinétique de l’activation du substrat par le ribozyme VS. En considérant l’ensemble des données d’ITC et de RMN, l’étonnante stabilité de l’interaction I/V s’explique probablement par une combinaison de facteurs, dont les motifs U-turn, la présence d’un nucléotide exclu de la boucle de SLV (U700), la liaison de cations magnésium et l’empilement de bases continu à la jonction I/V.

Adaptations de la méthode de purification d’ARN par affinité avec l’étiquette ARiBo

Dans les dernières années, une explosion de la recherche sur les ARN a eu lieue à cause de nombreuses découvertes démontrant l’importance de l’ARN dans plusieurs processus biologiques. Ainsi, de grandes quantités d’ARN sont devenues indispensables au bon déroulement de plusieurs études, notamment pour la biologie structurale et la caractérisation fonctionnelle. Cependant, il existe encore peu de méthodes de purification simples, efficaces, fiables et produisant un ARN sous forme native. Dans les dernières années, le laboratoire Legault a mis au point une méthode de purification par affinité utilisant une étiquette ARiBo pour la purification d’ARN transcrits in vitro par la polymérase à ARN du phage T7. Cette méthode de purification d’ARN a été spécifiquement développée pour maximiser la pureté et le rendement. De plus, elle est très rapide et fonctionne avec plusieurs types d’ARN. Cependant, comme plusieurs autres méthodes de purification, cette méthode produit des ARN avec des extrémités 5′ hétérogènes. Dans ce mémoire, des solutions sont proposées pour remédier au problème d’hétérogénéité en 5ʹ′ des ARN transcrits avec la polymérase à ARN du phage T7 et purifiés par la méthode ARiBo. La première solution consiste à choisir la séquence en 5′ parmi celles des 32 séquences testées qui ne présentent pas d’hétérogénéité en 5ʹ′. La seconde solution est d’utiliser une étiquette clivable en 5ʹ′ de l’ARN d’intérêt, tel que le ribozyme hammerhead, déjà utilisée pour ce genre d’application, ou le système CRISPR/Cse3 que nous proposons dans l’article présenté dans ce mémoire. De plus, nous avons adapté la méthode ARiBo pour rendre possible la purification d’un long ARN de 614 nt, le polycistron miR-106b-25. Nous avons également démontré la possibilité d’utiliser la méthode ARiBo pour l’isolation de protéines qui se lient à un ARN donné, le précurseur de miRNA pre-miR-153-2. En conclusion, ce mémoire démontre la possibilité d’adapter la méthode ARiBo à plusieurs applications.

Études structurales par résonance magnétique nucléaire du ribozyme VS de Neurospora

Le ribozyme VS de Neurospora catalyse des réactions de clivage et de ligation d’un lien phosphodiester spécifique essentielles à son cycle de réplication. Il est formé de six régions hélicales (I à VI), qui se divisent en deux domaines, soit le substrat (SLI) et le domaine catalytique (tiges II à VI). Ce dernier comprend deux jonctions à trois voies qui permettent de reconnaître le substrat en tige-boucle de façon spécifique. Ce mode de reconnaissance unique pourrait être exploité pour cibler des ARN repliés pour diverses applications. Bien que le ribozyme VS ait été caractérisé biochimiquement de façon exhaustive, aucune structure à haute résolution du ribozyme complet n’a encore été publiée, ce qui limite la compréhension des mécanismes inhérents à son fonctionnement. Précédemment, une approche de divide-and-conquer a été initiée afin d’étudier la structure des sous-domaines importants du ribozyme VS par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) mais doit être complétée. Dans le cadre de cette thèse, les structures de la boucle A730 et des jonctions III-IV-V et II-III-VI ont été déterminées par spectroscopie RMN hétéronucléaire. De plus, une approche de spectroscopie RMN a été développée pour la localisation des ions divalents, tandis que diverses approches de marquage isotopique ont été implémentées pour l’étude d’ARN de plus grandes tailles. Les structures RMN de la boucle A730 et des deux jonctions à trois voies révèlent que ces sous-domaines sont bien définis, qu’ils sont formés de plusieurs éléments structuraux récurrents (U-turn, S-turn, triplets de bases et empilement coaxial) et qu’ils contiennent plusieurs sites de liaison de métaux. En outre, un modèle du site actif du ribozyme VS a été construit sur la base des similarités identifiées entre les sites actifs des ribozymes VS et hairpin. Dans l’ensemble, ces études contribuent de façon significative à la compréhension de l’architecture globale du ribozyme VS. De plus, elles permettront de construire un modèle à haute résolution du ribozyme VS tout en favorisant de futures études d’ingénierie.

MicroRNA–mRNA interaction network using TSK-type recurrent neural fuzzy network

MicroRNAs are short non-coding RNAs that can regulate gene expression during various crucial cell processes such as differentiation, proliferation and apoptosis. Changes in expression profiles of miRNA play an important role in the development of many cancers, including CRC. Therefore, the identification of cancer related miRNAs and their target genes are important for cancer biology research. In this paper, we applied TSK-type recurrent neural fuzzy network (TRNFN) to infer miRNA–mRNA association network from paired miRNA, mRNA expression profiles of CRC patients. We demonstrated that the method we proposed achieved good performance in recovering known experimentally verified miRNA–mRNA associations. Moreover, our approach proved successful in identifying 17 validated cancer miRNAs which are directly involved in the CRC related pathways. Targeting such miRNAs may help not only to prevent the recurrence of disease but also to control the growth of advanced metastatic tumors. Our regulatory modules provide valuable insights into the pathogenesis of cancer

HelF, a suppressor of RNAi mediated gene silencing in Dictyostelium discoideum

RNA interference (RNAi) is a recently discovered process, in which double stranded RNA (dsRNA) triggers the homology-dependant degradation of cognate messenger RNA (mRNA). In a search for new components of the RNAi machinery in Dictyostelium, a new gene was identified, which was called helF. HelF is a putative RNA helicase, which shows a high homology to the helicase domain of Dicer, to the helicase domain of Dictyostelium RdRP and to the C. elegans gene drh-1, that codes for a dicer related DExH-box RNA helicase, which is required for RNAi. The aim of the present Ph.D. work was to investigate the role of HelF in PTGS, either induced by RNAi or asRNA. A genomic disruption of the helF gene was performed, which resulted in a distinct mutant morphology in late development. The cellular localization of the protein was elucidated by creating a HelF-GFP fusion protein, which was found to be localized in speckles in the nucleus. The involvement of HelF in the RNAi mechanism was studied. For this purpose, RNAi was induced by transformation of RNAi hairpin constructs against four endogenous genes in wild type and HelF- cells. The silencing efficiency was strongly enhanced in the HelF K.O. strain in comparison with the wild type. One gene, which could not be silenced in the wild type background, was successfully silenced in HelF-. When the helF gene was disrupted in a secondary transformation in a non-silenced strain, the silencing efficiency was strongly improved, a phenomenon named here “retrosilencing”. Transcriptional run-on experiments revealed that the enhanced gene silencing in HelF- was a posttranscriptional event, and that the silencing efficiency depended on the transcription levels of hairpin RNAs. In HelF-, the threshold level of hairpin transcription required for efficient silencing was dramatically lowered. The RNAi-mediated silencing was accompanied by the production of siRNAs; however, their amount did not depend on the level of hairpin transcription. These results indicated that HelF is a natural suppressor of RNAi in Dictyostelium. In contrast, asRNA mediated gene silencing was not enhanced in the HelF K.O, as shown for three tested genes. These results confirmed previous observations (H. Martens and W. Nellen, unpublished) that although similar, RNAi and asRNA mediated gene silencing mechanisms differ in their requirements for specific proteins. In order to characterize the function of the HelF protein on a molecular level and to study its interactions with other RNAi components, in vitro experiments were performed. Besides the DEAH-helicase domain, HelF contains a double-stranded RNA binding domain (dsRBD) at its N-terminus, which showed high similarity to the dsRBD domain of Dicer A from Dictyostelium. The ability of the recombinant dsRBDs from HelF and Dicer A to bind dsRNA was examined and compared. It was shown by gel-shift assays that both HelF-dsRBD and Dicer-dsRBD could bind directly to long dsRNAs. However, HelF-dsRBD bound more efficiently to dsRNA with imperfect matches than to perfect dsRNA. Both dsRBDs bound specifically to a pre-miRNA substrate (pre-let-7). The results suggested that most probably there were two binding sites for the proteins on the pre-miRNA substrate. Moreover, it was shown that HelF-dsRBD and Dicer-dsRBD have siRNA-binding activity. The affinities of the two dsRBDs to the pre-let-7 substrate were also examined by plasmon surface resonance analyses, which revealed a 9-fold higher binding affinity of the Dicer-dsRBD to pre-let-7 compared to that of the HelF-dsRBD. The binding of HelF-dsRBD to the pre-let-7 was impaired in the presence of Mg2+, while the Dicer-dsRBD interaction with pre-let-7 was not influenced by the presence of Mg2+. The results obtained in this thesis can be used to postulate a model for HelF function. In this, HelF acts as a nuclear suppressor of RNAi in wild type cells by recognition and binding of dsRNA substrates. The protein might act as a surveillance system to avoid RNAi initiation by fortuitous dsRNA formation or low abundance of dsRNA trigger. If the protein acts as an RNA helicase, it could unwind fold-back structures in the nucleus and thus lead to decreased RNAi efficiency. A knock-out of HelF would result in initiation of the RNAi pathway even by low levels of dsRNA. The exact molecular function of the protein in the RNAi mechanism still has to be elucidated. RNA interferenz (RNAi) ist ein in jüngster Zeit entdeckter Mechanismus, bei dem doppelsträngige RNA Moleküle (dsRNA) eine Homologie-abhängige Degradation einer verwandten messenger-RNA (mRNA) auslösen. Auf der Suche nach neuen Komponenten der RNAi-Maschinerie in Dictyostelium konnte ein neues Gen (helF) identifiziert werden. HelF ist eine putative RNA-Helikase mit einer hohen Homologie zur Helikasedomäne der bekannten Dicerproteine, der Helikasedomäne der Dictyostelium RdRP und zu dem C. elegans Gen drh-1, welches für eine Dicer-bezogene DExH-box RNA Helikase codiert, die am RNAi-Mechanismus beteiligt ist. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion von HelF im Zusammenhang des RNAi oder asRNA induzierten PTGS zu untersuchen. Es wurde eine Unterbrechung des helF-Gens auf genomischer Ebene (K.O.) vorgenommen, was bei den Mutanten zu einer veränderten Morphologie in der späten Entwicklung führte. Die Lokalisation des Proteins in der Zelle konnte mit Hilfe einer GFP-Fusion analysiert werden und kleinen Bereichen innerhalb des Nukleus zugewiesen werden. Im Weiteren wurde der Einfluss von HelF auf den RNAi-Mechanismus untersucht. Zu diesem Zweck wurde RNAi durch Einbringen von RNAi Hairpin-Konstrukten gegen vier endogene Gene im Wiltypstamm und der HelF--Mutante induziert. Im Vergleich zum Wildtypstamm konnte im HelF--Mutantenstamm eine stark erhöhte „Silencing“-Effizienz nachgewiesen werden. Ein Gen, welches nach RNAi Initiation im Wildtypstamm unverändert blieb, konnte im HelF--Mutantenstamm erfolgreich stillgelegt werden. Durch sekundäres Einführen einer Gendisruption im helF-Locus in einen Stamm, in welchem ein Gen nicht stillgelegt werden konnte, wurde die Effizienz des Stilllegens deutlich erhöht. Dieses Phänomen wurde hier erstmals als „Retrosilencing“ beschrieben. Mit Hilfe von transkriptionellen run-on Experimenten konnte belegt werden, dass es sich bei dieser erhöhten Stilllegungseffizienz um ein posttranskriptionelles Ereignis handelte, wobei die Stillegungseffizienz von der Transkriptionsstärke der Hairpin RNAs abhängt. Für die HelF--Mutanten konnte gezeigt werden, dass der Schwellenwert zum Auslösen eines effizienten Stillegens dramatisch abgesenkt war. Obwohl die RNAi-vermittelte Genstilllegung immer mit der Produktion von siRNAs einhergeht, war die Menge der siRNAs nicht abhängig von dem Expressionsniveau des Hairpin-Konstruktes. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei der HelF um einen natürlichen Suppressor des RNAi-Mechanismus in Dictyostelium handelt. Im Gegensatz hierzu war die as-vermittelte Stilllegung von drei untersuchten Genen im HelF-K.O. im Vergleich zum Wildyp unverändert. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Beobachtungen (H. Martens und W. Nellen, unveröffentlicht), wonach die Mechanismen für RNAi und asRNA-vermittelte Genstilllegung unterschiedliche spezifische Proteine benötigen. Um die Funktion des HelF-Proteins auf der molekularen Ebene genauer zu charakterisieren und die Interaktion mit anderen RNAi-Komponenten zu untersuchen, wurden in vitro Versuche durchgeführt. Das HelF-Protein enthält, neben der DEAH-Helikase-Domäne eine N-terminale Doppelstrang RNA bindende Domäne (dsRBD) mit einer hohen Ähnlichkeit zu der dsRBD des Dicer A aus Dictyostelium. Die dsRNA-Bindungsaktivität der beiden dsRBDs aus HelF und Dicer A wurde analysiert und verglichen. Es konnte mithilfe von Gel-Retardationsanalysen gezeigt werden, dass sowohl HelF-dsRBD als auch Dicer-dsRBD direkt an lange dsRNAs binden können. Hierbei zeigte sich, dass die HelF-dsRBD eine höhere Affinität zu einem imperfekten RNA-Doppelstrang besitzt, als zu einer perfekt gepaarten dsRNA. Für beide dsRBDs konnte eine spezifische Bindung an ein pre-miRNA Substrat nachgewiesen werden (pre-let-7). Dieses Ergebnis legt nah, dass es zwei Bindestellen für die Proteine auf dem pre-miRNA Substrat gibt. Überdies hinaus konnte gezeigt werden, dass die dsRBDs beider Proteine eine siRNA bindende Aktivität besitzen. Die Affinität beider dsRBDs an das pre-let-7 Substrat wurde weiterhin mit Hilfe der Plasmon Oberflächen Resonanz untersucht. Hierbei konnte eine 9-fach höhere Bindeaffinität der Dicer-dsRBD im Vergleich zur HelF-dsRBD nachgewiesen werden. Während die Bindung der HelF-dsRBD an das pre-let-7 durch die Anwesenheit von Mg2+ beeinträchtigt war, zeigte sich kein Einfluß von Mg2+ auf das Bindeverhalten der Dicer-dsRBD. Mit Hilfe der in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse lässt sich ein Model für die Funktion von HelF postulieren. In diesem Model wirkt HelF durch Erkennen und Binden von dsRNA Substraten als Suppressor von der RNAi im Kern. Das Protein kann als Überwachungsystem gegen eine irrtümliche Auslösung von RNAi wirken, die durch zufällige dsRNA Faltungen oder eine zu geringe Häufigkeit der siRNAs hervorgerufen sein könnte. Falls das Protein eine Helikase-Aktivität besitzt, könnte es rückgefaltete RNA Strukturen im Kern auflösen, was sich in einer verringerten RNAi-Effizienz wiederspiegelt. Durch Ausschalten des helF-Gens würde nach diesem Modell eine erfolgreiche Auslösung von RNAi schon bei sehr geringer Mengen an dsRNA möglich werden. Das Modell erlaubt, die exakte molekulare Funktion des HelF-Proteins im RNAi-Mechanismus weiter zu untersuchen.

Studies of cap-independent mRNA translation in Drosophila melanogaster

Control of protein synthesis is a key step in the regulation of gene expression during apoptosis and the heat shock response. Under such conditions, cap-dependent translation is impaired and Internal Ribosome Entry Site (IRES)-dependent translation plays a major role in mammalian cells. Although the role of IRES-dependent translation during apoptosis has been mainly studied in mammals, its role in the translation of Drosophila apoptotic genes has not been yet studied. The observation that the Drosophila mutant embryos for the cap-binding protein, the eukaryotic initiation factor eIF4E, exhibits increased apoptosis in correlation with up-regulated proapoptotic gene reaper (rpr) transcription constitutes the first evidence for the existence of a cap-independent mechanism for the translation of Drosophila proapoptotic genes. The mechanism of translation of rpr and other proapoptotic genes was investigated in this work. We found that the 5 UTR of rpr mRNA drives translation in an IRES-dependent manner. It promotes the translation of reporter RNAs in vitro either in the absence of cap, in the presence of cap competitors, or in extracts derived from heat shocked and eIF4E mutant embryos and in vivo in cells transfected with reporters bearing a non functional cap structure, indicating that cap recognition is not required in rpr mRNA for translation. We also show that rpr mRNA 5 UTR exhibits a high degree of similarity with that of Drosophila heat shock protein 70 mRNA (hsp70), an antagonist of apoptosis, and that both are able to conduct IRES-mediated translation. The proapoptotic genes head involution defective (hid) and grim, but not sickle, also display IRES activity. Studies of mRNA association to polysomes in embryos indicate that both rpr, hsp70, hid and grim endogenous mRNAs are recruited to polysomes in embryos in which apoptosis or thermal stress was induced. We conclude that hsp70 and, on the other hand, rpr, hid and grim which are antagonizing factors during apoptosis, use a similar mechanism for protein synthesis. The outcome for the cell would thus depend on which protein is translated under a given stress condition. Factors involved in the differential translation driven by these IRES could play an important role. For this purpose, we undertook the identification of the ribonucleoprotein (RNP) complexes assembled onto the 5 UTR of rpr mRNA. We established a tobramycin-affinity-selection protocol that allows the purification of specific RNP that can be further analyzed by mass spectrometry. Several RNA binding proteins were identified as part of the rpr 5 UTR RNP complex, some of which have been related to IRES activity. The involvement of one of them, the La antigen, in the translation of rpr mRNA, was established by RNA-crosslinking experiments using recombinant protein and rpr 5 UTR and by the analysis of the translation efficiency of reporter mRNAs in Drosophila cells after knock down of the endogenous La by RNAi experiments. Several uncharacterized proteins were also identified, suggesting that they might play a role during translation, during the assembly of the translational machinery or in the priming of the mRNA before ribosome recognition. Our data provide evidence for the involvement of La antigen in the translation of rpr mRNA and set a protocol for purification of tagged-RNA-protein complexes from cytoplasmic extracts. To further understand the mechanisms of translation initiation in Drosophila, we analyzed the role of eIF4B on cap-dependent and cap-independent translation. We showed that eIF4B is mostly involved in cap-, but not IRES-dependent translation as it happens in mammals.