Intolérence à l'effort en hypertension artérielle pulmonaire : Implication des déterminants périphériques

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie caractérisée par l’augmentation progressive des résistances vasculaires pulmonaires causant une augmentation de la pression artérielle pulmonaire qui mène au décès prématuré des patients. Malgré une amélioration rapide ces dernières années des traitements spécifiques, les patients souffrant d’HTAP demeurent dyspnéiques et intolérants à l’effort. L’atteinte vasculaire pulmonaire est actuellement irréversible. Elle est également la source de plusieurs anomalies au niveau des systèmes cardiovasculaires, ventilatoires et musculaires constituant les principaux déterminants physiologiques de la capacité à l’effort des patients. Cette thèse a investigué différentes facettes de la tolérance à l’effort en HTAP : les différents mécanismes ayant un impact sur l’apport musculaire en oxygène, l’altération des voies de signalisation cellulaire impliquées dans l’angiogenèse musculaire et les mécanismes ayant un impact sur la régulation du débit sanguin et l’oxygénation cérébrale en HTAP. Nous avons premièrement documenté une diminution de l’apport en oxygène aux muscles squelettiques à l’effort des patients en relation avec une diminution de la densité capillaire musculaire. Ce défaut d’angiogenèse corrélait d’ailleurs avec la capacité à l’effort des sujets. Par la suite, nous avons étudié les voies de signalisations cellulaires de l’angiogenèse musculaire. Ces résultats ont permis de démontrer une diminution de l’expression de miR-126, unique aux patients HTAP, qui était responsable de la diminution de la densité capillaire et qui contribuait à leur intolérance à l’effort. De plus, il était possible de moduler in vivo l’expression de miR-126. L’expérimentation in vivo, à l’aide d’un modèle murin d’HTAP, a permis de rétablir l’expression de miR-126, d’augmenter la microcirculation musculaire et d’améliorer la tolérance à l’effort des animaux, ce qui met en lumière le potentiel thérapeutique de l’angiogenèse musculaire pour améliorer la capacité à l’effort en HTAP. Notre dernier projet a démontré que les patients HTAP présentaient une diminution de débit sanguin cérébral. Ce projet a également démontré que les changements de pression artérielle sont moins bien amortis par les vaisseaux cérébraux des patients et que leurs vaisseaux cérébraux étaient moins réactifs aux changements de CO2. Les patients présentaient aussi une augmentation de la sensibilité des chémorécepteurs centraux qui contribuait à augmenter leur ventilation au repos, mais aussi à l’exercice. Finalement, à l’effort, nous avons démontré que le débit sanguin cérébral des patients HTAP était principalement influencé par la pression artérielle alors que chez les sujets sains, le débit sanguin cérébral était influencé principalement par la PETCO2. Nous avons également démontré que les patients HTAP présentaient une diminution progressive de leur oxygénation cérébrale, qui corrélait avec leur capacité à l’effort. Les résultats obtenus au cours de ce doctorat démontrent bien que la capacité à l’effort en HTAP est aussi déterminée par plusieurs anomalies physiopathologiques périphériques.

Regulation of osteoclast activation and autophagy through altered protein kinase pathways in Paget's disease of bone

Résumé : La maladie osseuse de Paget (MP) est un désordre squelettique caractérisé par une augmentation focale et désorganisée du remodelage osseux. Les ostéoclastes (OCs) de MP sont plus larges, actifs et nombreux, en plus d’être résistants à l’apoptose. Même si la cause précise de la MP demeure inconnue, des mutations du gène SQSTM1, codant pour la protéine p62, ont été décrites dans une proportion importante de patients avec MP. Parmi ces mutations, la substitution P392L est la plus fréquente, et la surexpression de p62P392L dans les OCs génère un phénotype pagétique partiel. La protéine p62 est impliquée dans de multiples processus, allant du contrôle de la signalisation NF-κB à l’autophagie. Dans les OCs humains, un complexe multiprotéique composé de p62 et des kinases PKCζ et PDK1 est formé en réponse à une stimulation par Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand (RANKL), principale cytokine impliquée dans la formation et l'activation des OCs. Nous avons démontré que PKCζ est impliquée dans l’activation de NF-κB induite par RANKL dans les OCs, et dans son activation constitutive en présence de p62P392L. Nous avons également observé une augmentation de phosphorylation de Ser536 de p65 par PKCζ, qui est indépendante d’IκB et qui pourrait représenter une voie alternative d'activation de NF-κB en présence de la mutation de p62. Nous avons démontré que les niveaux de phosphorylation des régulateurs de survie ERK et Akt sont augmentés dans les OCs MP, et réduits suite à l'inhibition de PDK1. La phosphorylation des substrats de mTOR, 4EBP1 et la protéine régulatrice Raptor, a été évaluée, et une augmentation des deux a été observée dans les OCs pagétiques, et est régulée par l'inhibition de PDK1. Également, l'augmentation des niveaux de base de LC3II (associée aux structures autophagiques) observée dans les OCs pagétiques a été associée à un défaut de dégradation des autophagosomes, indépendante de la mutation p62P392L. Il existe aussi une réduction de sensibilité à l’induction de l'autophagie dépendante de PDK1. De plus, l’inhibition de PDK1 induit l’apoptose autant dans les OCs contrôles que pagétiques, et mène à une réduction significative de la résorption osseuse. La signalisation PDK1/Akt pourrait donc représenter un point de contrôle important dans l’activation des OCs pagétiques. Ces résultats démontrent l’importance de plusieurs kinases associées à p62 dans la sur-activation des OCs pagétiques, dont la signalisation converge vers une augmentation de leur survie et de leur fonction de résorption, et affecte également le processus autophagique.

Caractérisation des inhibiteurs de DCIR, une lectine de type C participant à la transmission du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 provoque une infection définitive de l’organisme. Il entraine une déroute du système immunitaire depuis la primo-infection occasionnant ainsi, une déplétion massive des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Le DCIR (Dendritic Cell Immuno Receptor) qui constitue le socle de notre travail, est une lectine de type C. Il est exprimé sur les cellules myéloïdes comme les cellules dendritiques mais aussi sur les cellules B, les LTCD4 infectés par le VIH-1 et apoptotiques ainsi que sur les LTCD4 polarisés en Th17. Il constitue un facteur d’attachement et d’internalisation du virus dans la cellule dendritique. Il permet son transfert aux LTCD4 dans les organes lymphoïdes secondaires, jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse associée au VIH-1. En plus, le DCIR assure la régulation négative de la réponse cellulaire, favorisant ainsi la propagation et la réplication du virus au détriment de la réponse immunitaire contre le VIH-1. Le rôle que joue le DCIR est dépendant du sentier de signalisation induit à la suite de la phosphorylation des résidus tyrosine de son motif ITIM. Le blocage de DCIR par des inhibiteurs spécifiques pourrait empêcher cette phosphorylation et réduire l’attachement, l’internalisation et le transfert du virus. Nous avons montré que la stimulation des cellules dendritiques et des LTCD4 polarisés en Th17 avec un anticorps anti-DCIR générait un patron de phosphorylation des résidus tyrosine des protéines. De plus, les inhibiteurs de la portion extracellulaire du DCIR inhibent cette activation. Afin de développer une mesure plus directe de l’interaction de DCIR avec ces inhibiteurs, nous avons purifié le DCIR à partir des cellules Raji-CD4-DCIR. En conclusion, ce projet de maitrise montre que l’activation directe de DCIR peut être renversée par des inhibiteurs montrant ainsi leurs spécificités. De plus, le profil d’activation de DCIR est spécifique pour chaque type cellulaire. A long terme, l’inactivation de DCIR par des inhibiteurs efficaces pourrait être une stratégie thérapeutique capable d’inhiber l’infection et de préserver une réponse immunitaire efficace.

Altération de la régénération musculaire dans la maladie pulmonaire obstructive chronique

Altération de la régénération musculaire dans la maladie pulmonaire obstructive chronique. La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est caractérisée par une obstruction bronchique irréversible et progressive. L’atrophie musculaire périphérique y est fréquente et a un impact négatif sur la capacité fonctionnelle et la survie des sujets atteints. Toutefois, on ignore si une altération du processus de régénération musculaire est un processus ayant cours dans l’atrophie musculaire périphérique. Le but de la présente thèse était donc d’étudier les cellules satellites, principales cellules responsables de la régénération musculaire dans les muscles périphériques de patients ayant une MPOC. Dans un premier temps, nous avons évalué l’historique de réplication du tissu musculaire et la sénescence des cellules satellites. Les changements morphologiques ayant lieu dans le muscle au cours de la progression de la maladie rendent le muscle plus susceptible aux dommages, induisant un raccourcissement prématuré des télomères. Un raccourcissement des télomères chez les sujets ayant une MPOC avec atrophie est concomitant avec une augmentation du nombre de cellules satellites sénescentes et de l’épuisement du potentiel de régénération compromettant le maintien de la masse musculaire chez ces sujets. Dans un deuxième et troisième temps, nous avons étudié les étapes amenant une cellule satellite vers une cellule musculaire dans les muscles périphériques et respiratoires de patients ayant une MPOC comparativement à des sujets contrôles. Les cellules satellites sont impliquées dans la réparation du tissu musculaire. Dans les cellules satellites provenant des sujets ayant une MPOC, une altération de la prolifération et de la différentiation a été observée. Ces résultats sont compatibles avec une altération de la régénération musculaire pouvant conduire à l’atrophie musculaire dans la MPOC. Le quatrième volet de ce projet s’intéressait à l’impact d’un entraînement en résistance sur l’activité des cellules satellites et le rôle joué par la myostatine dans ce contexte. La littérature montre que l’exercice en résistance est bien toléré et aide les patients ayant une MPOC à retrouver une meilleure qualité de vie. Cependant, il semble qu’ils n’y répondent pas tous aussi bien que les sujets contrôles. La capacité de réponse des cellules satellites à un entraînement en résistance semble inadéquate, suggérant ainsi un défaut de leur activation. Dans la dernière étude de cette thèse, nous avons voulu évaluer l’impact de l’inflammation systémique en étudiant SAA1, une protéine de phase aiguë et p21, une protéine du cycle cellulaire dans la dégradation des protéines des cellules musculaires. Les liens de causalité entre l’affection primaire et les différentes comorbidités demeurent nébuleux dans la MPOC. SAA1 et p21 sont augmentés dans les muscles squelettiques des patients ayant une MPOC et par ailleurs, SAA1 est capable d’induire la dégradation des protéines musculaires. Cette thèse expose les premiers éléments impliquant l’altération de la régénération musculaire avec la dysfonction musculaire observée chez les patients ayant une MPOC. Ces résultats vont certainement contribuer au développement de nouvelles thérapies et stratégies d’intervention dans le but d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes d’une MPOC. En somme, les travaux effectués dans le cadre de la présente thèse montrent que plusieurs mécanismes agissent de concert avec l’inactivité physique afin d’induire le phénotype dysfonctionnel dans les muscles des patients ayant une MPOC.

Negative regulation of the hepatic fibrogenic response by suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1)

Abstract: Suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1) is an indispensable regulator of IFN-γ signaling and has been implicated in the regulation of liver fibrosis. However, it is not known whether SOCS1 mediates its anti-fibrotic functions in the liver directly, or via modulating IFN-γ, which has been implicated in attenuating hepatic fibrosis. Additionally, it is possible that SOCS1 controls liver fibrosis by regulating hepatic stellate cells (HSC), a key player in fibrogenic response. While the activation pathways of HSCs have been well characterized, the regulatory mechanisms are not yet clear. The goals of this study were to dissociate IFN-γ-dependent and SOCS1-mediated regulation of hepatic fibrogenic response, and to elucidate the regulatory functions of SOCS1 in H SC activation. Liver fibrosis was induced in Socs1[superscript -/-]Ifng[superscript -/-] mice with dimethylnitrosamine or carbon tetrachloride. Ifng[superscript -/-] and C57BL/6 mice served as controls. Following fibrogenic treatments, Socs1[superscript -/-]Ifng[superscript -/-] mice showed elevated serum ALT levels and increased liver fibrosis com-pared to mice Ifng[superscript -/-]. The latter group showed higher alanine aminotransferase (ALT) levels and fibrosis than C57BL/6 controls. The livers of Socs1-deficient mice showed bridging fibrosis, which was associated with increased accumulation of myofibroblasts and abundant collagen deposition. Socs1-deficient livers showed increased expression of genes coding for smooth muscle actin, collagen, and enzymes involved in remodeling the extracellular matrix, namely matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases. Primary HSCs from Socs1-deficient mice showed increased proliferation in response to growth factors such as HGF, EGF and PDGF, and the fibrotic livers of Socs1-deficient mice showed increased expression of the Pdgfb gene. Taken together, these data indicate that SOCS1 controls liver fibrosis independently of IFN-γ and that part of this regulation may occur via regulating HSC proliferation and limiting growth factor availability.

Involvement of Beta-arrestin 1 and Beta-arrestin 2 in store operated calcium entry

Résumé : La variation de la [Ca2+] intracellulaire participe à nombreux de processus biologiques. Les cellules eucaryotes expriment à la membrane plasmique une variété de canaux par lesquelles le calcium peut entrer. Dans les cellules non excitables, deux mécanismes principaux permettent l'entrée calcique; l'entrée capacitative de Ca2+ via Orai1 (SOCE) et l'entrée calcique activé par un récepteur (ROCE). Plusieurs protéines clés sont impliquées dans la régulation de ces voies d'entrée calcique, ainsi que dans l'homéostasie calcique. TRPC6 est un canal calcique impliquée dans l'entrée calcique dans les cellules à la suite d’une stimulation d’un récepteur hormonal. TRPC6 transloque à la membrane cellulaire et il y demeure jusqu'à ce que le stimulus soit retiré. Les mécanismes qui régulent le trafic et l'activation de TRPC6 sont cependant encore peu connus. Des découvertes récentes ont démontré qu'il y a un rôle potentiel de Rho kinase dans l'activité de TRPC6. Rho kinase est activée par la petite protéine G RhoA qui peut être activée par les protéines G hétérotrimériques Gα12 et Gα13. En plus de Gα12 et Gα13, les protéines de désensibilisation des GPCR β -arrestin 1 et / ou β-arrestin 2 peuvent aussi activer RhoA. Le but de notre étude est d'examiner la participation des protéines Gα12/13 et β-arrestin 1/ β-arrestin 2 dans l'activation de TRPC6 et de la protéine Orai1. Nous avons utilisé des ARN interférant (siRNA) spécifiques pour induire une réduction de l'expression de Gα12/13 ou β-arrestin 1/β-arrestin 2. La conséquence sur l’entrée de Ca2+ dans les cellules a été ensuite déterminée par imagerie calcique en temps réel suite à une stimulation par la vasopressine (AVP), thapsigargin ou carbachol. Nous avons donc identifié que dans des cellules A7r5, une lignée cellulaire de musculaires lisses vasculaires où le canal TRPC6 exprimé de manière endogène, la diminution de l’expression des protéines Gα12 ou Gα13 ne semble pas modifier l’entrée Ca2+ induit par l’AVP par rapport aux cellules témoins. D'autre part, la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 dans des cellules HEK 293 ainsi que des cellules HEK 293 exprimant de façon stable TRPC6 (cellules T6.11) ont augmenté l’entrée de Ca2+ induite par thapsigargin, un activateur pharmacologique de SOCE. Des études de co-immunoprécipitation démontrent une interaction entre la β-arrestin 1 et STIM1, alors qu'aucune interaction n'a été observée entre les β-arrestin 1 et Orai1. Nous avons de plus montré à l'aide d'analyse en microscopie confocale que la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 n’influence pas la quantité d’Orai1 à la périphérie cellulaire. Cependant, des résultats préliminaires indiquent que la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 augmente la quantité de STIM1-YFP dans l'espace intracellulaire et diminue sa quantité à la périphérie cellulaire. En conclusion, nous avons montré que les β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 sont impliquées dans l'entrée capacitative de Ca2+ (SOCE) et contrôlent la quantité de STIM1 dans le réticulum endoplasmique.

Développement et caractérisation de ligands du récepteur à chimiokine CXCR4

Le récepteur à chimiokine CXCR4 est à ce jour l’un des récepteurs couplés aux protéines G les plus étudiés. Le CXCL12, sa chimiokine endogène induit l’activation de plusieurs voies de signalisation cruciales à plusieurs processus physiologiques. Par ailleurs, dans de nombreux processus pathologiques comme le cancer, le récepteur CXCR4 et/ou son ligand endogène sont surexprimés et facilite la dissémination et le maintien de conditions favorables à la prolifération cancéreuse. Afin d’étudier le récepteur CXCR4 et sa signalisation, notre approche vise à développer des ligands ciblant le CXCR4 en se basant sur CXCL12. Par des études de relation structure-activité et du design rationnel, nous avons conçu des chimères du CXCR4. Ces outils pharmacologiques nous permettent de mieux extraire les déterminants structuraux impliqués dans l’activation du CXCR4 mais aussi d’étudier les voies de signalisation associées à ces nouvelles entités chimiques. Nos données de relation structure-activité ont permis de mettre en évidence deux positions clés sur le N-terminal de nos chimères, la position 3 et la position 7 cruciales pour l’affinité et l’efficacité respectivement. Nous avons pu moduler l’efficacité ainsi que l’affinité de nos chimères en introduisant des acides aminés non naturels capables de potentialiser l’effet pharmacologique. Nous avons également corrélé nos résultats de SAR avec de la dynamique moléculaire réalisée à partir des deux structures cristallographiques du CXCR4. Nos données de dynamique moléculaire montrent des différences structurales importantes au niveau des domaines transmembranaires 3 et 7 en présence ou non de nos chimères. Par ailleurs, nous avons développé un nouveau déterminant avec des propriétés pharmacocinétiques améliorées comparativement au déterminant d’affinité des chimères de première génération. La caractérisation de ce déterminant a par ailleurs révélé son caractère agoniste inverse. Tous ces résultats apportent des éléments clés pour un meilleur design de molécules à visée thérapeutique ciblant le CXCR4.

Caractérisation des interactions établies par la région riche en prolines de la ligase de l’ubiquitine Itch

Itch est un membre de la famille des ligases de l’ubiquitine de type CWH (C2-WW- HECT) impliqué dans le contrôle de la signalisation inflammatoire, des facteurs de transcription et le tri des récepteurs membranaires. La fonction d’Itch implique généralement sa capacité à induire la dégradation de ses substrats. Pour accomplir cette fonction, Itch doit d’abord interagir avec ses cibles. Itch possède quatre domaines WW lui permettant d’accomplir la majorité de ses fonctions. En plus de ces domaines, Itch possède une PRR (région riche en prolines) unique parmi les ligases CWH. Cette région est bien conservée chez les vertébrés, ce qui suggère son importance. Cette région permet à Itch d’interagir avec des protéines contenant un domaine SH3 (Src homology 3). Plusieurs partenaires SH3 furent identifiés, cependant l’on connait peu de choses concernant la fonction et l’établissement de ces complexes. Dans ce projet, nous avons analysé les propriétés de liaison d’un sous-groupe de protéines à domaine SH3 impliquées dans l’endocytose et la signalisation cellulaire. Nos travaux ont permis d’identifier de nouveaux partenaires et aussi de déterminer que différents domaines SH3 ciblent la même région riche en prolines, mais impliquent des résidus distincts. Ces résultats démontrent la variété des propriétés de liaison démontrées par la PRR d’Itch et sa préférence marquée pour l’Endophiline. Parmi les partenaires identifiés, Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2) est particulièrement intéressant en raison de son rôle crucial dans la signalisation cellulaire. Nous avons démontré ici qu’Itch ubiquityle Grb2, mais ne cause pas sa dégradation, contrairement à l’Endophiline. Nos travaux démontrent que la PRR d’Itch est versatile quant à ses interactions et leurs conséquences.

Effets préventifs et thérapeutiques des polyphénols dans un modèle in vitro et in vivo de maladie inflammatoire de l’intestin : caractérisation des polyphénols de la pelure de pomme et de la canneberge par spectrométrie de masse

La muqueuse intestinale est exposée à des agents oxydants provenant de l’ingestion d’aliments modifiés, de cellules immuno-inflammatoires et de la flore intestinale. Une diète élevée en fruits et légumes peut diminuer le stress oxydant (SOx) ainsi que l’inflammation via plusieurs mécanismes. Ces effets bénéfiques peuvent être attribuables à leur contenu élevé en polyphénols. La première étude de mon doctorat consistait à tester l’hypothèse que les polyphénols extraits de pelures de pomme (DAPP) pouvaient diminuer le stress oxydant et l'inflammation impliqués dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Nous avons caractérisé les polyphénols des DAPP par spectrométrie de masse (LC-MS) et examiné leur potentiel antioxydant et anti-inflammatoire au niveau des cellules intestinales. L’identification des structures chimiques des polyphénols a été effectuée par LC-MS. Le SOx a été induit par l’ajout du complexe fer/ascorbate (Fe/Asc, 200 µM/2 mM) et l’inflammation par la lipopolysaccharide (LPS, 200µg/mL) à des cellules intestinales Caco-2/15 pré-incubées avec les DAPP (250 µg/mL). L’effet du SOx est déterminé par le dosage du malondialdéhyde (MDA), de la composition des acides gras polyinsaturés et de l’activité des enzymes antioxydantes endogènes (SOD et GPx). L’impact des DAPP sur l’inflammation a été testé par l’analyse de l’expression des marqueurs inflammatoires: cyclooxygénase-2 (COX-2), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a et l’interleukine-6 (IL-6) et les facteurs de transcription NF-KB, Nrf-2 et PGC1α par immunobuvardage. Nos données ont montré que les flavonols et les flavan-3-ols constituent les composés polyphénoliques majoritaires des DAPP. L’ajout de Fer2+/Asc a provoqué une augmentation de la peroxidation lipidique comparativement aux cellules contrôles, un appauvrissement des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, et une modulation des enzymes antioxydantes, se traduisant par une augmentation de l’activité de la SOD et une diminution de la GPx. En contrepartie, les DAPP ont exhibé leur potentiel à corriger la plupart des perturbations, y compris l’expression protéique anormalement élevée du COX-2 et la production de la prostaglandine E2 (PGE2), ainsi que l’inflammation telle que réflétée par les facteurs NF-κB, TNF-α et IL-6. Par ailleurs, les mécanismes sous-jacents à ces changements bénéfiques des DAPP ont fait intervenir les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Vraisemblablement, cette première étude a permis de démontrer la capacité des DAPP à amoindrir le SOx et à réduire l’inflammation, deux processus étroitement impliqués dans les MII. Dans la deuxième étape de mon doctorat, nous avons voulu comparer les résultats de DAPP à ceux des polyphénols dérivant de la canneberge qui est considérée par la communauté scientifique comme le fruit ayant le plus fort potentiel antioxydant. À cette fin, nous avons caractérisé l’effet des composés polyphénoliques de la canneberge (CPC) sur le SOx, la défense antioxydante et l’inflammation au niveau intestinal tout en définissant leur métabolisme intraluminal. Les différents CPC ont été séparés selon leur poids moléculaire par chromatographie et leurs structures chimiques ont été identifiées par LC-MS. Suite à une pré-incubation des cellules Caco-2/15 avec les extraits CPC (250 µg/mL), le Fe/Asc et la LPS ont été administrés comme inducteurs du SOx et de l’inflammation, respectivement. La caractérisation globale des CPC a révélé que les acides phénoliques composaient majoritairement l’extrait de canneberge de petit poids moléculaire (LC) alors que les flavonoïdes et les procyanidines dimériques/trimériques représentaient l’extrait de poids moléculaire moyen (MC) tout en laissant les procyanidines oligo et polymériques à l’extrait de haut poids moléculaire (HC). Les CPC ont permis de restaurer la plupart des perturbations engendrées dans les Caco-2/15 par le Fe/Asc et le LPS. Les CPC exhibaient le potentiel d’abaisser les niveaux de MDA, de corriger la composition des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, d’augmenter l’activité des enzymes antioxydantes (SOD, GPx et CAT) et d’élever l’expression de Nrf2 et PGC1α. En outre, les CPC pouvaient aussi réduire les niveaux élevés des protéines inflammatoires COX-2, TNF-α et IL-6 ainsi que la production des PGE2 par un mécanisme impliquant le NF-κB. Au niveau mitochondrial, les procyanidines oligomériques ont réussi à corriger les dysfonctions reliées à la production d’énergie (ATP), l’apoptose (Bcl-2, Cyt C et AIF) et le statut des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Dans le but de bien comprendre les mécanismes d’action des CPC, nous avons défini par LC-MS les composés polyphénoliques qui ont été transportés ou absorbés par l’entérocyte. Nos analyses soulignent le transport (i) des acides cinnamiques et benzoïques (LC); (ii) la quercétine glycosylée et conjuguée et les procyanidines dimériques de type A (MC); et (iii) l’épicatéchine et les procyanidines oligomériques (HC). Les processus de métabolisation (méthylation, glucuronidation et sulfatation) au niveau de l’entérocyte ont probablement permis le transport de ces CPC surtout sous leur forme conjuguée. Les procyanidines oligomériques ayant un degré de polymérisation supérieur à 2 (HC) ont semblé adhérer aux cellules Caco-2/15. L’épicatéchine suivi par les procyanidines dimériques de type A ont été trouvés majoritaires au niveau des mitochondries. Même si nous ignorons encore l’action biologique de chaque composé polyphénolique, nous pouvons suggérer que leurs effets combinatoires exercent des fonctions antioxydantes, anti-inflammatoires et mitochondriales dans le modèle intestinal Caco-2/15. Dans une troisième étape, nous avons procédé à l’évaluation des aspects préventifs et thérapeutique des DAPP tout en sondant les mécanismes sous-jacents dans une étude préclinique. À cette fin, nous avons exploité le modèle de souris avec colite expérimentale provoquée par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS). L’induction de l’inflammation intestinale chez la souris C57BL6 a été effectuée par l’administration orale de DSS à 2.5% pendant 10 jours. Des doses physiologiques et supra-physiologiques de DAPP (200 et 400 mg/kg/j, respectivement) ont été administrées par gavage pendant 10 jours pré- et post-DSS. L’inflammation par le DSS a provoqué une perte de poids, un raccourcissement du côlon, le décollement dystrophique de l’épithélium, l’exulcération et les infiltrations de cellules mono et polynucléaires au niveau du côlon. De plus, le DSS a induit une augmentation de la peroxidation lipidique, une régulation à la baisse des enzymes antioxydantes, une expression protéique à la hausse de la myéloperoxidase (MPO), du COX-2 et de la production des PGE2. Par ailleurs, les DAPP ont permis de corriger ou du moins d’alléger la plupart de ces anomalies en situation préventive ou thérapeutique, en plus d’abaisser l’expression protéique de NF-κB et des cytokines inflammatoires (TNF-a et l’IL-6) tout en stimulant les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Conséquemment, les polyphénols des DAPP ont exhibé leur puissant pouvoir antioxydant et anti-inflammatoire au niveau intestinal dans un modèle in vivo. Leurs actions sont associées à la régulation des voies de signalisation cellulaire et des changements dans la composition du microbiote. Ces trois projets de recherche permettent d’envisager l’évaluation des effets préventifs et thérapeutiques des DAPP cliniquement chez les patients avec des désordres inflammatoires de l’intestin.

Le rôle des acides gras oméga-3 sur la balance énergétique, la régulation de l’appétit, l’état émotionnel et l’implication du récepteur GPR120

L’obésité est un facteur de risque lié à des problèmes physiques, émotionnels et comportementaux. Aujourd’hui, l’alimentation est composée d’un régime typiquement occidental «Western diet» qui est riche en acides gras saturés (AGS) et pauvre en acides gras polyinsaturés (AGPI) tel que les oméga-3 (N-3) et occasionnant un déséquilibre du ratio alimentaire N-6/N-3. Ce déséquilibre est une des causes de la prévalence des maladies mentales y compris celles des troubles de l'humeur et de l’anxiété. L’acide docosahexaénoïque (ADH, 22: 6 n-3) est l’acide gras (AG) le plus abondant dans le cerveau et son accumulation est particulièrement élevée pendant la période périnatale. Il joue un rôle important dans le développement neuronal et d'autres fonctions du cerveau tel l'apprentissage et la mémoire. Des perturbations de l’environnement périnatal peuvent influencer à très long terme l’avenir de la descendance en la rendant plus susceptible de développer des problèmes d’obésité dans un contexte nutritionnel riche. On ignore cependant si le déficit alimentaire chez la mère et particulièrement en ADH aura un impact sur la motivation alimentaire de la progéniture. L’objectif principal de cette thèse est d’étudier le rôle potentiel des N-3 sur la balance énergétique, la motivation alimentaire, la dépression et le niveau d’anxiété des descendants de souris mâles adultes assujetties à une alimentation riche en gras. Nos données ont démontré qu‘un régime maternel déficitaire en ADH durant la période périnatale incitait la descendance à fournir plus d’effort afin d’obtenir un aliment palatable. Ceci entraînerait un dérèglement de l’homéostasie énergétique en augmentant le gain de poids et en diminuant l’activité locomotrice tout en exacerbant le comportement de type anxieux dès que les souris sont exposées à un milieu obésogène. Les acides gras libres (AGL) sont des nutriments essentiels fonctionnant comme des molécules de signalisation dans le cerveau en ayant des récepteurs qui jouent un rôle important dans le contrôle du métabolisme énergétique. Parmi eux, on distingue un récepteur couplé à la protéine G (GPCR), le GPR120. Ce récepteur activé par les AGPI ω-3 intervient dans les mécanismes anti-inflammatoires et insulino-résistants via les N-3. Une mutation dans le gène GPR120 occasionnée par une réduction de l’activité de signalisation du gène est liée à l’obésité humaine. L'objectif premier de cette deuxième étude était d’évaluer l'impact de la stimulation pharmacologique de GPR120 dans le système nerveux central (SNC) sur l'alimentation, les dépenses d'énergie, le comportement de type anxieux et la récompense alimentaire. Nos résultats démontrent qu’une injection centrale aiguë d'agoniste GPR120 III réduit la prise alimentaire ad libitum et la motivation alimentaire pour un aliment riche en gras et en sucre; ainsi que les comportements de type anxieux. L’injection centrale chronique (21 jours) de ce même agoniste GPR120 III transmis par une pompe osmotique a démontré que les souris placées sous diète hypercalorique (HFD n’ont présenté aucune modification lors de la prise alimentaire ni de gain de poids mais qu’il y avait comparativement au groupe de véhicule, une réduction du comportement de type anxieux, que ce soit dans le labyrinthe en croix surélevé (LCS) ou dans le test à champ ouvert (OFT). L’ADH est reconnu pour ses propriétés anorexigènes au niveau central. De plus, la stimulation des récepteurs de GPR120 au niveau du cerveau avec un agoniste synthétique peut produire un effet intense intervenir sur le comportement lié à l'alimentation des rongeurs. Trouver une approche visant à contrôler à la fois la neuroinflammation, la récompense alimentaire et les troubles émotionnels aiderait assurément au traitement de l'obésité et du diabète de type 2.

Eph kinases and their ligands ephrins act in concert with sex hormones in regulating blood pressure

Les Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) sont la plus grande famille de récepteurs tyrosine kinase. Leurs ligands, les éphrines (EFNs), sont aussi des molécules exprimées à la surface cellulaire. Les EPH/EFNs sont impliqués dans de nombreux processus biologiques. L'hypertension artérielle (PA) est une maladie chronique qui, aujourd'hui, est devenue un problème médical critique dans le monde entier et un enjeu de santé publique. La découverte de nouvelles thérapeutiques de l'hypertension sont d'une grande importance pour la santé publique. Jusqu’à tout récemment, il existe seulement quelques études concernant le rôle de l’axe EPH/EFNs sur la fonction des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Dans nos études précédentes, nous avons montré qu'EPHB6 et EFNB1, de concert avec les hormones sexuelles, régulent la PA. Dans la présente étude, nous avons constaté que les différents membres de la famille EPH/EFN peuvent réguler soit positivement, soit négativement, la contractilité des CMLV et la PA: tandis que EPHB4 et EFNB2 appartiennent à la première catégorie, EFNB1, EFNB3 et EPHB6 appartiennent à la deuxième. In vivo, des souris males, mais non pas des femelles, porteuses d’une mutation EPHB4 (KO) spécifique du muscle lisse présentent une PA diminuée, comparée aux souris témoins (WT). Les CMLV de souris EPHB4 KO, en présence de testostérone, ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par la phényléphrine (PE). Au niveau moléculaire, la phosphorylation de la protéine kinase II dépendante de Ca2+/calmoduline et de la kinase de la chaine légère de la myosine (CLM) est augmentée, tandis que la phosphorylation de la kinase de la CLM est réduite dans les CMLV KO lors de la stimulation par PE, par rapport au WT CMLV. Cela fournit une base moléculaire à la réduction de la PA et de la contractilité des CMLV chez les souris EPHB4 KO. EFNB2 est le ligand majeur de l’EPHB4. Comme attendu, les souris EFNB2 KO spécifique du muscle lisse avaient un phénotype de PA semblable, quoique non identique, aux souris EPHB4 KO. Les souris mâles EFNB2 KO, mais pas femelles, sous régime régulier ou riche en sel, présentent une PA réduite, par rapport à leurs homologues WT. Au niveau cellulaire, les CMLV des souris KO ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par PE par rapport aux témoins WT. Une région de l’acide aminé (aa) 313 à l’aa 331 dans la partie intracellulaire d’EFNB2 est essentielle pour la signalisation inverse qui régule la contractilité des CMLV, selon des études de mutation-délétion. Dans une étude de génétique humaine, nous avons identifié, dans le gène EFNB2, six SNP qui étaient associées significativement au risque d'hypertension artérielle, de façon dépendante du sexe, ce qui corrobore nos résultats chez les souris. En revanche, la délétion du gène EFNB3 (KO) chez les souris femelles aboutit à une PA élevée et à une augmentation des résistances des petites artères in vivo, améliore la contractilité des petites artères ex-vivo et augmente la contractilité des CMLV in vitro. Les souris mâles KO ont une PA normale, mais la castration conduit à une augmentation significative de la PA dans les souris KO, mais pas dans les souris WT. Les CMLV des souris KO femelles ont montré une phosphorylation accrue de la CLM et une phosphorylation réduite de la kinase de la CLM, ce qui fournit à nouveau une base moléculaire aux phénotypes de PA et de contractilité des CMLV observés. Ce changement de signalisation est attribuable à une protéine adaptatrice Grip1. En effet, dans une étude d'association pan génomique par le Consortium International pour la Pression Sanguine, un SNP dans le gène GRIP1 a approché le seuil de significativité de la valeur p pour son association avec la pression diastolique. Nos recherches, pour la première fois, ont révélé que EPH/EFNs sont de nouveaux composants dans le système de régulation de la PA. Les membres de la famille EPH/EFN peuvent agir comme des forces Yin et Yang pour régler finement le tonus des vaisseaux pour assurer l'homéostasie de la PA et de sa régulation. Ces effets de EPH/EFNs dépendent du sexe et des niveaux d’hormones sexuelles. À partir de ces nouvelles connaissances, nous pourrions développer une nouvelle thérapie personnalisée pour l’hypertension artérielle, utilisant des antagonistes d'hormones sexuelles ou des thérapies de remplacement d'hormones sexuelles, selon les niveaux d'hormones sexuelles des patients et les mutations dans les gènes de l'EPH/EFN.

Traitement de la maladie du greffon contre l’hôte chronique par la photophérèse extra corporelle au TH9402 : m écanisme de régulation de la maladie du greffon contre l’hôte chronique par les cellules T régulatrices

La maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) est la principale cause de mortalité et de morbidité suite aux greffes de cellules souches hématopoïétiques. Plusieurs patients demeurent réfractaires aux traitements actuels ce qui rend nécessaire le développement de nouvelles stratégies afin de combattre cette maladie. Dans l’étude qui suit, nous avons utilisé un nouvel agent thérapeutique, le TH9402, une molécule photosensible et démontré qu’elle permet, lorsqu’exposée à la lumière visible (514 nm), d’éliminer sélectivement les cellules T activées in vivo tout en préservant les cellules T au repos et les cellules T régulatrices (Tregs). Les Tregs ainsi préservés peuvent abroger la réponse alloréactive par la sécrétion d’IL-10 ou par contact cellule-cellule via un mécanisme impliquant le CTLA-4. Nous avons découvert que la signalisation du CTLA-4 était associée à une hausse de la population Treg in vitro. Cette hausse est due à la conversion de cellules T CD4+CD25- en Tregs et non à une prolifération sélective des Tregs. Dans la deuxième partie de cette étude, nous avons démontré que la signalisation de CTLA-4 était associée à une augmentation de l’expression de la protéine Indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO). Ces effets nécessitent la déplétion du tryptophane ainsi que de la protéine de phase aigue GCN2. Finalement, nous avons observé que l’infusion de cellules traitées au TH9402 chez des patients souffrant de GVHD chronique est associée à une augmentation de la population Treg chez ces patients sans causer de lymphopénie ni de diminution de la réponse immunitaire dirigée contre les antigènes viraux. Ces résultats suggèrent que le traitement au TH9402 pourrait représenter une approche particulièrement intéressante pour le traitement de la GVHD chronique réfractaire aux traitements actuels. De plus, l’augmentation de l’expression d’IDO pourrait être utilisée comme valeur prédictive de la réponse du patient au traitement. Ceci pourrait permettre d’améliorer la qualité de soins ainsi que de la qualité de vie des patients souffrant de GVHD chronique.

Rôle du facteur de transcription PITX1 dans les pathogenèses de l'ostéoporose et des maladies parodontales

L’ostéoporose est une maladie caractérisée par une faible masse osseuse et une détérioration du tissu osseux. Cette condition entraîne une plus grande fragilité osseuse et des risques de fractures. Plusieurs études ont associé l’ostéoporose à la faible densité osseuse des mandibules, à la perte d’attache parodontale, à l’augmentation de la hauteur de la crête alvéolaire et à la chute des dents. Cette étude vise à comprendre les mécanismes sous-jacents cette perte osseuse. En effet, au cours du développement des souris, PITX1 joue un rôle clé dans l'identité des membres postérieurs et dans le bon développement des mandibules et des dents. Son inactivation complète chez la souris mène à un phénotype squelettique sévère. Tandis que, son inactivation partielle provoque des symptômes apparentés à l'arthrose avec une augmentation de la masse osseuse au niveau de l’os cortical et de l’os trabéculaire. Inversement, une étude antérieure chez des jumelles monozygotiques discordantes pour l’ostéoporose, montrent une augmentation d’environ 8.6 fois du niveau d’expression du gène Pitx1 chez la jumelle ostéoporotique. Collectivement, ces données nous ont poussés à investiguer sur le rôle du facteur de transcription PITX1 dans le métabolisme osseux normal et pathologique. Dans ce contexte, des souris transgéniques Col1α1-Pitx1 sur-exprimant Pitx1 spécifiquement dans le tissu osseux sous le promoteur du collagène de type-I (fragment 2.1kpb) ont été générées et phénotypiquement caractérisées. Ces résultats ont révelé que les souris transgéniques Col1α1-Pitx1 présentaient un phénotype similaire à celui des patients ostéoporotiques accompagné d'une perte de dents et des problèmes dentaires et parodontaux. De plus, cette étude a révélé que la surexpression de Pitx1 induit une altération de l’homéostasie osseuse via l’inactivation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine canonique. Cette hypothèse a été appuyée par le fait que le traitement des souris transgéniques Col1α1-Pitx1 avec du chlorure de lithium, un activateur de la voie Wnt canonique, prévient le phénotype ostéoporotique chez ces souris. Finalement, cette étude établit un rôle crucial de PITX1 dans la régulation de la masse osseuse et une implication possible dans l’ostéoporose et les maladies parodontales via l’inactivation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine canonique.

The regulatory role of eNOS-derived nitric oxide on transcription in endothelial cells: Impact of S-nitrosylation on β-catenin signaling

Les cellules endothéliales forment une couche semi-perméable entre le sang et les organes. La prolifération, la migration et la polarisation des cellules endothéliales sont essentielles à la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, soit l’angiogenèse. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) peut activer la synthase endothéliale du monoxyde d’azote (eNOS) et induire la production de monoxyde d’azote (NO) nécessaire pour la régulation de la perméabilité vasculaire et l’angiogenèse. β- caténine est une composante essentielle du complexe des jonctions d’ancrage ainsi qu’un régulateur majeur de la voie de signalisation de Wnt/β-caténine dans laquelle elle se joint au facteur de transcription TCF/LEF et module l’expression de nombreux gènes, dont certains sont impliqués dans l’angiogenèse. La S-nitrosylation (SNO) est un mécanisme de régulation posttraductionnel des protéines par l’ajout d’un groupement nitroso au niveau de résidus cystéines. Le NO produit par eNOS peut induire la S-nitrosylation de la β−caténine au niveau des jonctions intercellulaires et moduler la perméabilité de l’endothélium. Il a d’ailleurs été montré que le NO peut contrôler l’expression génique par la transcription. Le but de cette thèse est d’établir le rôle du NO au sein de la transcription des cellules endothéliales, spécifiquement au niveau de l’activité de β-caténine. Le premier objectif était de déterminer si la SNO de la β-caténine affecte son activité transcriptionnelle. Nous avons montré que le NO inhibe l’activité transcriptionnelle de β- caténine ainsi que la prolifération des cellules endothéliales induites par l’activation de la voie Wnt/β-caténine. Il est intéressant de constater que le VEGF, qui induit la production de NO via eNOS, réprime l’expression de AXIN2 qui est un gène cible de Wnt s’exprimant suite à la i i stimulation par Wnt3a et ce, dépendamment de eNOS. Nous avons identifié que la cystéine 466 de la β-caténine est un résidu essentiel à la modulation répressive de son activité transcriptionnelle par le NO. Lorsqu’il est nitrosylé, ce résidu est responsable de la perturbation du complexe de transcription formé de β-caténine et TCF-4 ce qui inhibe la prolifération des cellules endothéliales induite par la stimulation par Wnt3a. Puisque le NO affecte la transcription, nous avons réalisé l’analyse du transcriptome afin d’obtenir une vue d’ensemble du rôle du NO dans l’activité transcriptionnelle des cellules endothéliales. L’analyse différentielle de l’expression des gènes de cellules endothéliales montre que la répression de eNOS par siRNA augmente l’expression de gènes impliqués au niveau de la polarisation tels que : PARD3A, PARD3B, PKCZ, CRB1 et TJ3. Cette analyse suggère que le NO peut réguler la polarisation des cellules et a permis d’identifier des gènes responsables de l’intégrité des cellules endothéliales et de la réponse immunitaire. De plus, l’analyse de voies de signalisation par KEGG montre que certains gènes modulés par l’ablation de eNOS sont enrichis dans de nombreuses voies de signalisation, notamment Ras et Notch qui sont importantes lors de la migration cellulaire et la différenciation des cellules de têtes et de tronc (tip/stalk). Le regroupement des gènes exprimés chez les cellules traitées au VEGF (déplétées de eNOS ou non) révèle que le NO peut affecter l’expression de gènes contribuant au processus angiogénique, dont l’attraction chimiotactique. Notre étude montre que le NO module la transcription des cellules endothéliales et régule l’expression des gènes impliqués dans l’angiogenèse et la fonction endothéliale.

Études in vivo et in vitro sur le potentiel néphroprotecteur de plantes médicinales anti-diabétiques de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie-James

Notre équipe a identifié le thé Labrador [Rhododendron groenlandicum L. (Ericaceae)] comme une plante potentiellement antidiabétique de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie James orientale. Dans la présente étude, nous avons évalué les effets néphroprotecteurs potentiels de la plante. De la microalbuminurie et de la fibrose rénale ont été développées chez des souris alimentées avec une diète grasse (DG). Le R. groenlandicum améliore d’une façon non-significative la microalbuminurie, avec des valeurs de l’aire sous la courbe (ACR) diminuant de 0.69 à 0.53. La valeur de la fibrose rénale qui était, à l’origine, de 4.85 unités arbitraires (UA) dans des souris alimentées à la DG, a chuté à 3.27 UA après avoir reçu un traitement de R. groenlandicum. Le R. groenlandicum a réduit la stéatose rénale de presque la moitié alors que l’expression du facteur de modification Bcl-2 (Bmf) a chuté de 13.96 UA à 9.43 UA. Dans leur ensemble les résultats suggèrent que le traitement avec R. groenlandicum peut améliorer la fonction rénale altérée par DG. Dans l’étude subséquente, notre équipe a identifié 17 espèces de la forêt boréale, de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie James orientale, qui ont présenté des activités biologiques prometteuses in vitro et in vivo dans le contexte du DT2. Nous avons maintenant examiné ces 17 extraits afin d’identifier lesquels possèdent un potentiel cytoprotecteur rénale en utilisant des cellules Madin Darby Canine Kidney (MDCK) mises à l’épreuve dans un médium hypertonique. Nous concluons que plusieurs plantes antidiabétiques Cris exercent une activité de protection rénale qui pourrait être pertinente dans le contexte de la néphropathie diabétique (ND) qui affecte une proportion importante des Cris. La G. hispidula et la A. balsamea sont parmi les plantes les plus puissantes dans ce contexte et elles semblent protectrices principalement en inhibant la caspase 9 dans la voie de signalisation apoptotique mitochondriale. Finalement, nous avons utilisé une approche de fractionnement guidée par un test biologique pour identifier les fractions actives et les composés de A. balsamea avec un potentiel de protection rénale in vitro dans des cellules MDCK mises au défi avec un médium hypertonique. La fraction d’hexane (Hex) possède le potentiel le plus élevé parmi toutes les fractions de solvant contre les dommages cellulaires induits par le stress hypertonique. Dans des études précédentes, trois composés purs ont été identifiés à partir de la fraction Hex, à savoir, l’acide abiétique, l’acide déhydroabiétique et le squalène. L’acide abiétique se distinguait par son effet puissant dans le maintien de la viabilité des cellules MDCK (AnnV-/PI-) à un niveau relativement élevé (augmentation de 25.48% relative au stress hypertonique, P<0.0001), ainsi qu’une réduction significative (diminution de 20.20% par rapport au stress hypertonique, P<0.0001) de l’apoptose de stade précoce (AnnV+/PI-). L’acide abiétique peut donc servir à normaliser les préparations traditionnelles d’A. balsamea et à trouver des applications potentielles dans le traitement de la néphropathie diabétique. Les trois études ont été intrinsèquement liées les unes aux autres, par conséquent, nous avons réussi à identifier R. groenlandicum ainsi que A. balsamea comme nouvelles plantes prometteuses contre la néphropathie diabétique. Nous croyons que ces résultats profiteront à la communauté crie pour la gestion des complications diabétiques, en particulier la néphropathie diabétique. En parallèle, nos données pourraient faire avancer l'essai clinique de certaines plantes médicinales de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie James orientale du Canada.