Simulating short lived carbonaceous compounds with an atmospheric chemistry general circulation model

Ein neu entwickeltes globales Atmosphärenchemie- und Zirkulationsmodell (ECHAM5/MESSy1) wurde verwendet um die Chemie und den Transport von Ozonvorläufersubstanzen zu untersuchen, mit dem Schwerpunkt auf Nichtmethankohlenwasserstoffen. Zu diesem Zweck wurde das Modell durch den Vergleich der Ergebnisse mit Messungen verschiedenen Ursprungs umfangreich evaluiert. Die Analyse zeigt, daß das Modell die Verteilung von Ozon realistisch vorhersagt, und zwar sowohl die Menge als auch den Jahresgang. An der Tropopause gibt das Modell den Austausch zwischen Stratosphäre und Troposphäre ohne vorgeschriebene Flüsse oder Konzentrationen richtig wieder. Das Modell simuliert die Ozonvorläufersubstanzen mit verschiedener Qualität im Vergleich zu den Messungen. Obwohl die Alkane vom Modell gut wiedergeben werden, ergibt sich einige Abweichungen für die Alkene. Von den oxidierten Substanzen wird Formaldehyd (HCHO) richtig wiedergegeben, während die Korrelationen zwischen Beobachtungen und Modellergebnissen für Methanol (CH3OH) und Aceton (CH3COCH3) weitaus schlechter ausfallen. Um die Qualität des Modells im Bezug auf oxidierte Substanzen zu verbessern, wurden einige Sensitivitätsstudien durchgeführt. Diese Substanzen werden durch Emissionen/Deposition von/in den Ozean beeinflußt, und die Kenntnis über den Gasaustausch mit dem Ozean ist mit großen Unsicherheiten behaftet. Um die Ergebnisse des Modells ECHAM5/MESSy1 zu verbessern wurde das neue Submodell AIRSEA entwickelt und in die MESSy-Struktur integriert. Dieses Submodell berücksichtigt den Gasaustausch zwischen Ozean und Atmosphäre einschließlich der oxidierten Substanzen. AIRSEA, welches Informationen über die Flüssigphasenkonzentration des Gases im Oberflächenwasser des Ozeans benötigt wurde ausgiebig getestet. Die Anwendung des neuen Submodells verbessert geringfügig die Modellergebnisse für Aceton und Methanol, obwohl die Verwendung einer vorgeschriebenen Flüssigphasenkonzentration stark den Erfolg der Methode einschränkt, da Meßergebnisse nicht in ausreichendem Maße zu Verfügung stehen. Diese Arbeit vermittelt neue Einsichten über organische Substanzen. Sie stellt die Wichtigkeit der Kopplung zwischen Ozean und Atmosphäre für die Budgets vieler Gase heraus.

Untersuchungen zur Induktion von Filopodien durch das Amyloid Precursor Like Protein 1 (APLP1), ein Mitglied der APP-Genfamilie

Die Alzheimer Krankheit ist eine fortschreitendende Demenzerkrankung von der in Deutschland ca. 1,6 Millionen Menschen betroffen sind. Im Gehirn der Patienten finden sich sogenannte amyloide Plaques, deren Hauptbestandteil das Aβ-Protein ist. Dieses Peptid ist ein Spaltprodukt des APP-Proteins (engl. amyloid precursor protein). APP ist das namensgebende Mitglied der APP-Proteinfamilie zu der neben APP die beiden APP-Homologen APLP1 und APLP2 (engl. amyloid precursor like protein) gehören. Obwohl inzwischen über die pathologische Rolle dieser Proteinfamilie bei der Alzheimer Krankheit vieles bekannt ist, bleiben die physiologischen Funktionen dieser Proteine bisher größtenteils ungeklärt. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmals einen APLP1-spezifischen Effekt auf die Ausbildung von Filopodien. Sowohl das humane als auch das murine APLP1 induzierten nach transienter Überexpression die Bildung zahlreicher filopodialer Fortsätze auf der Membran von PC12-Zellen. Vergleichbare Resultate konnten mit beiden APLP1-Proteinen auch auf der Membran von embryonalen (E18.5), cortikalen Neuronen der Ratte gezeigt werden. Dass APLP1 einen derartigen Effekt auf Neuronen und PC12-Zellen zeigt, begründet die Annahme, dass APLP1 in vivo eine Funktion bei der Entwicklung und Differenzierung von Neuronen übernimmt. Anhand von Versuchen mit deletierten APLP1-Proteinen und APLP1/APLP2-Chimärproteinen konnte gezeigt werden, dass die von Exon 5 und Exon 6 codierten Bereiche des APLP1 für die Induktion der Filopodien essentiell sind. Unter Einbeziehung von in ihrer räumlichen Struktur bereits bekannten Domänen und aufgrund von Homologievergleichen der primären Aminosäuresequenz dieser Region mit entsprechenden Bereichen der APP- bzw. APLP2-Proteine wurde die wahrscheinliche Lage der Filopodien-induzierenden Domäne innerhalb des von Exon 6 codierten Bereiches diskutiert. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die untersuchte Induktion von Filopodien durch die sogenannte α-Sekretierung moduliert werden kann. Unter den gewählten Versuchsbedingungen war nur membranständiges APLP1, nicht aber sekretiertes APLP1 in der Lage, Filopodien zu induzieren. Abschliessend wurden Ergebnisse gezeigt, die erste Einblicke in Signalkaskaden erlauben, die von APLP1 angesteuert werden und so die Enstehung der Filopodien auslösen. Bezüglich des primären Prozesses der Signalkaskade, der Bindung von APLP1 an einen bisher unbekannten Rezeptor, wurde die Möglichkeit diskutiert, ob APP oder APLP2 oder sogar APLP1 selbst als Rezeptor fungieren könnten. Die beobachteten Prozesse nach Überexpression von APLP1 entsprechen vermutlich einer physiologischen Funktion bei der Differenzierung von Neuronen, die mit der Interaktion einer extrazellulär gelegenen Domäne mit einem Rezeptor beginnt, die Aktivierung einer Signalkaskade zur Akrinreorganisation zu Folge hat und die Entstehung filopodialer Strukturen auslöst.

Aktivierung von Hämocyanin zur Tyrosinase

Ziel der Arbeit war die enzymatische Aktivierung von Cheliceraten-Hämocyanin zur Erforschung ihrer Phenoloxidase-Aktivität. Hierzu wurden zwei Hämocyanine in vergleichenden Untersuchungen herangezogen: Das bekannte 24-mer aus der Spinne Eurypelma californicum und das ebenfalls 24-mere Hämocyanin des Skorpions Pandinus imperator, dessen Struktur hier aufgeklärt wurde. Elektronenmikroskopisch und in der dynamischer Lichtstreuung sind sich beide Hämocyanine sehr ähnlich und sedimentieren bei analytischer Ultrazentrifugation ebenfalls in gleicher Weise (Sedimentationskoeffizient von 37 S (S20, W)). Durch Dissoziation im alkalischen Milieu gewinnt man bis zu zwölf Untereinheiten, von denen sich neun immunologisch unterscheiden lassen. Das absorptionsspektroskopische Verhalten von P. imperator- und E. californicum-Hämocyanin sowie Sekundärstrukturanalyse mittels CD-Spektroskopie ist nahezu identisch. Die Stabilität des Hämocyanins gegenüber Temperatur und Denaturierungsmitteln wurde mit Circulardichroismus- und Fluoreszenzspektroskopie sowie durch die enzymatische Aktivität untersucht. Erstmals konnten die Hämocyanine von P. imperator und E. californicum nicht nur zu einer stabilen Diphenoloxidase umgewandelt werden, sondern auch eine Monophenolhydroxylase-Aktivität induziert und reguliert werden. Für letztere Aktivität ist dabei die Präsenz von Tris- oder Hepes-Puffer wesentlich. Während sich die Monophenolhydroxylase-Aktivität nur auf Ebene der oligomeren Zustände beobachten lässt, erkennt man bei den isolierten Untereinheiten-Typen lediglich eine Diphenoloxidase-Aktivität. Bei dem Spinnen-Hämocyanin zeigen die Untereinheiten bc die stärkste katalytische Aktivität auf, bei P. imperator-Hämocyanin findet man drei bis vier Untereinheiten, die enzymatisch aktiv sind. Die Aktivierung mit SDS liefert den Hinweis, dass die Quartärstruktur in eine andere Konformation gebracht und nicht durch SDS denaturiert wird. Zugabe von Mg2+ reguliert die Phenoloxidase-Aktivität und verschiebt bei P. imperator-Hämocyanin die enzymatische Aktivität zugunsten der Diphenoloxidase. Mit keiner der zur Verfügung stehenden Methoden konnte jedoch ein Konformationsübergang eindeutig nachgewiesen werden. Die Stabilität scheint durch die niedrigen SDS-Konzentrationen nicht beeinträchtigt zu werden. Die sehr lange “Verzögerungsphase“ bei der Monophenolhydroxylase-Aktivität konnte durch Zugabe von katalytischem Diphenol drastisch verkürzt werden, was ein Hinweis auf die echte Tyrosinase-Aktivität des aktivierten Hämocyanins ist. Ein in vivo-Aktivator konnte bis jetzt noch nicht gefunden werden. Trotzdem scheinen die Hämocyanine in der Immunologie von Cheliceraten eine bedeutende Rolle zu spielen, indem sie die Rolle der Tyrosinasen / Phenoloxidasen beziehungsweise Catecholoxidasen übernehmen, die bei Cheliceraten nicht vorkommen. Weitere Möglichkeiten des Cheliceraten-Immunsystems, eindringende Fremdorganismen abzuwehren, wurden untersucht. Das Fehlen einer ´echten` Phenoloxidase-Aktivität bei den Cheliceraten, mit der Fähigkeit, sowohl mono- als auch diphenolische Substrate umzusetzen, stützt die Hypothese, dass aktiviertes Hämocyanin in vivo an die Stelle der Phenoloxidase tritt.

Charakterisierung zentraler Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus Rauvolfia serpentina

In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina charakterisiert. Dabei handelt es sich einerseits um die Vomilenin-Reduktase und die 2β-(R)-1.2-Dihydrovomilenin-Reduktase. Es wurden Versuche unternommen, diese Enzyme heterolog zu exprimieren. Eine aktive Expression konnte nicht durchgeführt werden, was mit großer Wahrscheinlichkeit auf Modifikationen in der Ursprungspflanze zurückzuführen ist. Allerdings bestehen auch Zweifel, ob es sich bei den Volllängenklonen um die cDNAs der Reduktasen handelte. Zum anderen sollte eine Strukturaufklärung der Vinorin-Synthase im Komplex mit Liganden vorgenommen werden. Die erhaltenen Proteinkristalle stellten sich als derart empfindlich gegenüber Schwankungen ihrer Umgebung und dem Eindringen von Liganden in den Kristall dar, dass eine erfolgreiche Komplexierung und strukturelle Beschreibung durch Röntgenstrukturanalyse nicht möglich war. Weiterhin wurden Mutagenesestudien mit der Vinorin-Synthase durchgeführt. Eine Asparaginsäure bildet eine Salzbrücke mit einem Arginin. Alle durchgeführten Mutationen dieser Asparaginsäure führten zu einem absoluten Aktivitätsverlust. Eine Funktion des Asparagins 277, als mitverantwortliche Aminosäure zur Bindung des Co-Substrats Acetyl-CoA, konnte anhand der Mutagenesestudien ausgeschlossen werden. Weiterhin ist es erstmals gelungen die Polyneuridinaldehyd-Esterase aus Rauvolfia serpentina zu kristallisieren. Schließlich konnte die dreidimensionale Struktur der Polyneuridinaldehyd-Esterase aufgeklärt werden. Es folgte eine Beschreibung struktureller Eigenschaften der Polyneuridinaldehyd-Esterase im Vergleich zu einem Modell, welches durch ein „Molecular Modelling“ erstellt wurde.

Evolutionary tendencies in flowers of Marantaceae with special reference to the style movement mechanism

One of the quickest plant movements ever known is made by the ´explosive´ style in Marantaceae in the service of secondary pollen presentation – herewith showing a striking apomorphy to the sister Cannaceae that might be of high evolutionary consequence. Though known already since the beginning of the 19th century the underlying mechanism of the movement has hitherto not been clarified. The present study reports about the biomechanics of the style-staminode complex and the hydraulic principles of the movement. For the first time it is shown by experiment that in Maranta noctiflora through longitudinal growth of the maturing style in the ´straitjacket´ of the hooded staminode both the hold of the style prior to its release and its tensioning for the movement are brought about. The longer the style grows in relation to the enclosing hooded staminode the more does its capacity for curling up for pollen transfer increase. Hereby I distinguish between the ´basic tension´ that a growing style builds up anyway, even when the hooded staminode is removed beforehand, and the ´induced tension´ which comes about only under the pressure of a ´too short´ hooded staminode and which enables the movement. The results of these investigations are discussed in view of previous interpretations ranging from possible biomechanical to electrophysiological mechanisms. To understand furthermore by which means the style gives way to the strong bending movement without suffering outwardly visible damage I examined its anatomical structure in several genera for its mechanical and hydraulic properties and for the determination of the entire curvature after release. The actual bending part contains tubulate cells whose walls are extraordinarily porous and large longitudinal intercellular spaces. SEM indicates the starting points of cell-wall loosening in primary walls and lysis of middle lamellae - probably through an intense pectinase activity in the maturing style. Fluorescence pictures of macerated and living style-tissue confirm cell-wall perforations that do apparently connect neighbouring cells, which leads to an extremely permeable parenchyma. The ´water-body´ can be shifted from central to dorsal cell layers to support the bending. The geometrical form of the curvature is determined by the vascular bundles. I conclude that the style in Marantaceae contains no ´antagonistic´ motile tissues as in Mimosa or Dionaea. Instead, through self-maceration it develops to a ´hydraulic tissue´ which carries out an irreversible movement through a sudden reshaping. To ascertain the evolutionary consequence of this apomorphic pollination mechanism the diversity and systematic value of hooded staminodes are examined. For this hooded staminodes of 24 genera are sorted according to a minimalistic selection of shape characters and eight morphological types are abstracted from the resulting groups. These types are mapped onto an already available maximally parsimonious tree comprising five major clades. An amazing correspondence is found between the morphological types and the clades; several sister-relationships are confirmed and in cases of uncertain position possible evolutionary pathways, such as convergence, dispersal or re-migration, are discussed, as well as the great evolutionary tendencies for the entire family in which – at least as regards the shape of hooded staminodes – there is obviously a tendency from complicated to strongly simplified forms. It suggests itself that such simplifying derivations may very likely have taken place as adaptations to pollinating animals about which at present too little is known. The value of morphological characters in relation to modern phylogenetic analysis is discussed and conditions for the selection of morphological characters valuable for a systematic grouping are proposed. Altogether, in view of the evolutionary success of Marantaceae compared with Cannaceae the movement mechanism of the style-staminode complex can safely be considered a key innovation within the order Zingiberales.

Design, Synthese und biochemische/biologische Evaluierung bioisosterer Oligopyrrolcarboxamide mit aliphatisch-amidisch verknüpften DNA-Interkalatoren

Die DNA stellt aufgrund der genetischen Krankheitsursache nach wie vor ein überaus attraktives Target für das Design antitumoraktiver Zytostatika dar. Ein wesentlicher Schwerpunkt der heutigen Forschung besteht vor allem in der Entwicklung niedermolekularer, sequenzspezifischer DNA-Liganden zur gezielten Ausschaltung defekter Gene. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte daher in Anlehnung an die antitumoral wirksame Leitsubstanz Netropsin - ein AT-selektiver Minor Groove Binder mit Bispyrrolcarboxamid-Grundstruktur - erstmals der systematische Aufbau einer neuen Serie bioisosterer Hybridmoleküle, bestehend aus einem interkalierenden Strukturelement (Acridon, Naphthalimid, 5-Nitronaphthalimid, Anthrachinon, 11H-Pyrido[2,3-a]carbazol) und Thiophenpyrrol-, Imidazolpyrrol-, Thiazolpyrrol- bzw. Bisimidazolcarboxamid als rinnenbindende Oligoamid-Einheit (sog. Combilexine). Die chromophoren Systeme am N-Terminus wurden hierbei über aliphatische Linker variabler Kettenlänge mit der Carboxamid-Kette verknüpft. Als C-terminale Funktion kam sowohl die N,N-Dimethyl-1,3-diaminopropan- als auch die um ein C-Atom kürzere Dimethylaminoethylamin-Seitenkette zum Einsatz. Unter Verwendung modernster Reagenzien aus der Peptidkupplungschemie ist es gelungen, ein präparativ gut zugängliches, reproduzierbares Verfahren zur Synthese dieser bioisosteren Combilexine zu entwickeln. Anhand biophysikalischer/biochemischer, zellbiologischer und physikochemischer (1H-NMR-spektroskopischer und röntgenstrukturanalytischer) Methoden sowie Molecular Modelling Studien wurden erstmals bezüglich der DNA-Bindung, der Topoisomerase-Hemmung und der Antitumor-Zellzytotoxizität in einem breiten Rahmen vororientierende Struktur-Wirkungsbeziehungen an bioisosteren Liganden erstellt. Wenngleich zwischen den in vitro und in silico ermittelten Befunden keine konkreten Gesetzmäßigkeiten zu erkennen waren, so ließ die Summation der Ergebnisse dennoch darauf schließen, dass es sich bei den Naphthalimidpropion- und Acridonbuttersäure-Derivaten mit C-terminaler Propylendiamin-Funktion um die aussichtsreichsten Kandidaten in Bezug auf die DNA-Affinität bzw. Zytotoxizität handelte.

Modeling of complex chemical reactions and macromolecular orientation phenomena in confined geometries

The cooperative motion algorithm was applied on the molecular simulation of complex chemical reactions and macromolecular orientation phenomena in confined geometries. First, we investigated the case of equilibrium step-growth polymerization in lamellae, pores and droplets. In such systems, confinement was quantified as the area/volume ratio. Results showed that, as confinement increases, polymerization becomes slower and the average molecular weight (MW) at equilibrium decreases. This is caused by the sterical hindrance imposed by the walls since chain growth reactions in their close vicinity have less realization possibilities. For reactions inside droplets at surfaces, contact angles usually increased after polymerization to compensate conformation restrictions imposed by confinement upon growing chains. In a second investigation, we considered monodisperse and chemically inert chains and focused on the effect of confinement on chain orientation. Simulations of thin polymer films showed that chains are preferably oriented parallel to the surface. Orientation increases as MW increases or as film thickness d decreases, in qualitative agreement with experiments with low MW polystyrene. It is demonstrated that the orientation of simulated chains results from a size effect, being a function of the ratio between chain end-to-end distance and d. This study was complemented by experiments with thin films of pi-conjugated polymers like MEH-PPV. Anisotropic refractive index measurements were used to analyze chain orientation. With increasing MW, orientation is enhanced. However, for MEH-PPV, orientation does not depend on d even at thicknesses much larger than the chain contour length. This contradiction with simulations was discussed by considering additional causes for orientation, for instance the appearance of nematic-like ordering in polymer films. In another investigation, we simulated droplet evaporation at soluble surfaces and reproduced the formation of wells surrounded by ringlike deposits at the surface, as observed experimentally. In our simulations, swollen substrate particles migrate to the border of the droplet to minimize the contact between solvent and vacuum, which costs the most energy. Deposit formation in the beginning of evaporation results in pinning of the droplet. When polymer chains at the substrate surface have strong uniaxial orientation, the resulting pattern is no longer similar to a ring but to a pair of half-moons. In a final stage, as an extension for the model developed for polymerization in nanoreactors, we studied the effect of geometrical confinement on a hypothetical oscillating reaction following the mechanism of the so called periodically forced Brusselator. It was shown that a reaction which is chaotic in the bulk may be driven to periodicity by confinement and vice-versa, opening new perspectives for chaos control.

Helix-coil-transition in solid polypeptides

Abstract Poly(L-glutamic acid) (PLGA) was synthesized by living anionic ring-opening polymerization of the NCA monomer, which was obtained by reacting diphosgene with an amino acid derivative. The chemical structures and thermal properties were characterized by 1H-NMR, 13C-NMR, TGA and DSC. XRD powder patterns found to be amorphous for all polymers obtained. The molecular weights could be determined under severe limitations due to low solubility and high aggregation tendency. The secondary structure of the PLGA films was analyzed in the solid state by IR spectroscopy; the order was determined mainly by XRD. Uniform bulk films (1-5 µm) were produced by drop-casting of PLGA solutions in TFA on silica. The XRD film analysis indicated the absence of a long range order or an orientation even if a helical microstructure was confirmed by IR spectroscopy. The coil solvent TFA delivered constantly a helical or a β-sheet structure in the solid state depending on the water content of the solvent which was observed for the first time to exhibit a high influence on the crystallization process for PLGA. Temperature dependent in-situ IR measurements were examined to analyze if a helix-coil transition occurs, but there could be no solvent system determined, which resulted in a disordered coil structure in the solid state. General parameters like solvent systems, evaporation conditions, concentration, substrates etc. were analyzed. New crystallizations were obtained on silica prepared by drop-casting of solutions of PLGA in DMF, DMA, TMU, NMP, and pyridine/water mixtures, respectively. PSCBC in DMF, CDCl3/TFA-d, and PSBC in CDCl3/TFA-d exhibited the same crystalline diffraction patterns like PLGA. The long range order in the X-ray diffraction pattern is proven by extremely sharp crystalline signals, which are not changing the shape or the position of the peak by increasing the temperature up to 160°C. The substrate seems to play a decisive role because the crystalline structures were not obtainable on glass. The crystal structure consists probably of two different layered structures based on the intensity ratios of the two series of crystalline signals in the X-ray diffraction patterns. The source of the layered structure remains unclear and needs further studies to investigate the spatial arrangement of the chains in more detail. The secondary structure was still not changing upon heating even if a highly crystalline diffraction pattern occurs. Concluding that even the newly investigated crystallization did not show a helix-coil transition in the solid state by annealing, the phenomenon known in solution has to be claimed as unachievable in the solid state based on the results of this work. A remaining open question represents the observation that the same crystalline pattern can be reproducibly prepared with exhibiting two different ordered secondary structures (helix and β-sheet). After the investigation that the evaporation time cannot be decisive for the crystal growth, the choice of a strong hydrogen bonding interrupting solvent is most probably the key to support and induce the crystallization process.

Untersuchung von Morphologie, Enzymverteilungen und Transportdynamik des Golgi-Apparates lebender Säugerzellen mittels hochauflösender MMM-4Pi-Mikroskopie in zwei Farben

Seit der Entdeckung des Golgi-Apparates im Jahre 1898 wurden seine Struktur, seine enzymatische Zusammensetzung und die Dynamik des in ihm stattfindenden Proteintransports intensiv untersucht. Dennoch blieben bis heute wesentliche Fragen zu seiner Funktionsweise unbeantwortet. So existieren nach wie vor mehrer konkurrierende Modelle zur Organisation der hoch komplexen räumlichen Verteilung seiner Enzyme sowie zum grundlegenden Mechanismus des Intra-Golgi Transports. Die Beantwortung dieser und weiterer Fragen ist für das Verständnis des Golgi-Apparates essentiell, aber aus methodischen Gründen höchst schwierig, da es bisher nicht möglich war die Struktur und Dynamik des Golgi-Apparates lebender Zellen mit der hierfür notwendigen Auflösung und Geschwindigkeit zu untersuchen. Bis heute gibt es für die funktionsmorphologischen Untersuchungen des Golgi-Apparates lebender Zellen keine echte Alternative zur Fernfeld- Fluoreszenzmikroskopie. Das MMM-4Pi-Mikroskop ermöglicht als erstes Fluoreszenzmikroskop, aufgrund seiner Auflösung von ~200 nm in der Fokalebene und 100-150 nm entlang der optischen Achse, die Untersuchung der Subkompartimente des Golgi-Apparates und kann, aufgrund seiner hohen Aufnahmegeschwindigkeit von 0.5 Hz, die Dynamik des Intra-Golgi Transports zeitlich auflösen. Ziel dieser Arbeit war es daher, den Golgi-Apparate lebender Zellen in zwei Farben sowie mit einer bisher nicht möglichen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu untersuchen. Um die Leistungsfähigkeit der dreidimensionalen Bildgebung dieser Methode zu überprüfen, wurde erstmals der Golgi-Apparat fixierter Säugerzellen korrelativ mit dem Transmissionselektronenmikroskop und dem MMM-4Pi-Mikroskop aufgenommen. Die rekonstruierten Strukturen korrelierten in allen drei Raumrichtungen zu über 80%, was die Validität beider Methoden eindrucksvoll unter Beweis stellt. Zudem konnten mit dem MMM-4Pi-Mikroskop Aussackungen von Golgi-Cisternen aufgelöst werden, was die Eignung dieser Methode zur strukturellen Analyse der Subkompartimente des Golgi-Apparates unterstreicht. Des Weiteren wurde, in einer Reihe zweifarbiger Aufnahmeserien, die Verteilung dreier Golgi-Enzyme in lebenden Säugerzellen untersucht, und ihre mittlere relative Distanz bestimmt. Ihre aus der Literatur bekannten Lokalisationen konnten in zwei Fällen bestätigt (GalT, MannII) und in einem Fall korrigiert werden (2-OST). Im Gegensatz zu der konfokal bestimmten Cis-/Mid-Lokalisation von 2-OST zeigen die Ergebnisse der hoch aufgelösten Distanzanalyse deutlich, dass eine Mid-/Trans-Lokalisation vorliegt. Dieses Ergebnis wurde elektronenmikroskopisch überprüft und bestätigt. Da die räumliche Anordnung der Golgi-Enzyme die Reihenfolge ihrer Akitvität wiederspiegelt, ist eine möglichst präzise Bestimmung ihrer Konzentrationsverteilungen essentiell, um die Funktion des Golgi-Apparates zu verstehen. Insbesondere zeigt dieses Resultat, dass die Bestimmung der Lokalisation von Golgi-Enzymen über konfokale Kolokalisationsstudien zu falschen Ergebnissen führen kann. Die Kombination hoher räumlicher Auflösung mit einer schnellen Datenaufnahme erlaubte die Analyse der Transportdynamik innerhalb des Golgi-Apparates von Säugerzellen. In mehreren Zeitserien zweifarbiger Aufnahmen wurde der Transport des Frachtproteins VSVG relativ zum Trans-Golgi-Marker GalT untersucht. Dabei zeigte sich, dass das Trans-Golgi-Kompartiment in einigen Fällen durch eine deutliche Formänderung auf die Ankunft eines VSVG-Transportpulses reagierte und sich insgesamt wesentlich dynamischer verhielt als der Transportpuls selbst. Diese Beobachtung bestätigt tendenziell Transportmodelle, die den Golgi-Apparat nicht als statisches, sondern als dynamisches, aktiv am Transport beteiligtes Organell beschreiben. Die hier vorgestellten Experimente stellen die ersten Untersuchungen zur Verteilung von Golgi-Enzymen sowie zur Transportdynamik des Golgi-Apparates lebender Zellen mit einer dreidimensionalen Auflösung im Bereich von 100-200 nm dar. Wie am Beispiel von 2 OST gezeigt, ist es mit dem MMM-4Pi-Mikroskop allgemein möglich, die Lokalisation von Golgi-Enzymen wesentlich präziser als bisher zu bestimmen. Bei der Untersuchung dynamischer Prozesse ist in naher Zukunft eine Steigerung der Leistungsfähigkeit der Methode zu erwarten. Zum einen werden CCD-Kameras mit kürzeren Auslesezeiten und einer elektronischen Verstärkung des Signals die Datenaufnahme weiter beschleunigen. Zum anderen könnte durch die Entwicklung eines parallelisierten Mikroskops mit Einphotonen-Anregung das Bleichen konsekutiver Aufnahmen verringert werden, wodurch längere Aufnahmeserien möglich sein werden.

Quantum effects and dynamics in hydrogen-bonded systems: a first-principles approach to spectroscopic experiments

Computer simulations have become an important tool in physics. Especially systems in the solid state have been investigated extensively with the help of modern computational methods. This thesis focuses on the simulation of hydrogen-bonded systems, using quantum chemical methods combined with molecular dynamics (MD) simulations. MD simulations are carried out for investigating the energetics and structure of a system under conditions that include physical parameters such as temperature and pressure. Ab initio quantum chemical methods have proven to be capable of predicting spectroscopic quantities. The combination of these two features still represents a methodological challenge. Furthermore, conventional MD simulations consider the nuclei as classical particles. Not only motional effects, but also the quantum nature of the nuclei are expected to influence the properties of a molecular system. This work aims at a more realistic description of properties that are accessible via NMR experiments. With the help of the path integral formalism the quantum nature of the nuclei has been incorporated and its influence on the NMR parameters explored. The effect on both the NMR chemical shift and the Nuclear Quadrupole Coupling Constants (NQCC) is presented for intra- and intermolecular hydrogen bonds. The second part of this thesis presents the computation of electric field gradients within the Gaussian and Augmented Plane Waves (GAPW) framework, that allows for all-electron calculations in periodic systems. This recent development improves the accuracy of many calculations compared to the pseudopotential approximation, which treats the core electrons as part of an effective potential. In combination with MD simulations of water, the NMR longitudinal relaxation times for 17O and 2H have been obtained. The results show a considerable agreement with the experiment. Finally, an implementation of the calculation of the stress tensor into the quantum chemical program suite CP2K is presented. This enables MD simulations under constant pressure conditions, which is demonstrated with a series of liquid water simulations, that sheds light on the influence of the exchange-correlation functional used on the density of the simulated liquid.

Modeling of deep-convective

Deep convection by pyro-cumulonimbus clouds (pyroCb) can transport large amounts of forest fire smoke into the upper troposphere and lower stratosphere. Here, results from numerical simulations of such deep convective smoke transport are presented. The structure, shape and injection height of the pyroCb simulated for a specific case study are in good agreement with observations. The model results confirm that substantial amounts of smoke are injected into the lower stratosphere. Small-scale mixing processes at the cloud top result in a significant enhancement of smoke injection into the stratosphere. Sensitivity studies show that the release of sensible heat by the fire plays an important role for the dynamics of the pyroCb. Furthermore, the convection is found to be very sensitive to background meteorological conditions. While the abundance of aerosol particles acting as cloud condensation nuclei (CCN) has a strong influence on the microphysical structure of the pyroCb, the CCN effect on the convective dynamics is rather weak. The release of latent heat dominates the overall energy budget of the pyroCb. Since most of the cloud water originates from moisture entrained from the background atmosphere, the fire-released moisture contributes only minor to convection dynamics. Sufficient fire heating, favorable meteorological conditions, and small-scale mixing processes at the cloud top are identified as the key ingredients for troposphere-to-stratosphere transport by pyroCb convection.

Expressions- und Funktionsanalysen von Neuroglobin und Cytoglobin

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten durchgeführt. Beide Globine wurden erst kürzlich entdeckt, und ihre Funktionen konnten trotz vorliegender Daten zur Struktur und biochemischen Eigenschaften dieser Proteine bisher nicht eindeutig geklärt werden. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre und subzelluläre Lokalisation von Neuroglobin und Cytoglobin in murinen Gewebeschnitten untersucht. Die Expression von Ngb in neuronalen und endokrinen Geweben hängt offensichtlich mit den hohen metabolischen Aktivitäten dieser Organe zusammen. Insbesondere im Gehirn konnten regionale Unterschiede in der Ngb-Expression beobachtet werden. Dabei korrelierte eine besonders starke Neuroglobin-Expression mit Gehirnbereichen, die bekanntermaßen die höchsten Grundaktivitäten aufweisen. In Anbetracht dessen liegt die Funktion des Neuroglobins möglicherweise im basalen O2-Metabolismus dieser Gewebe, wobei Ngb als O2-Lieferant und kurzfristiger O2-Speicher den vergleichsweise hohen Sauerstoffbedarf vor Ort sicherstellen könnte. Weitere Funktionen in der Entgiftung von ROS bzw. RNS oder die kürzlich publizierte mögliche Rolle des Ngb bei der Verhinderung der Mitochondrien-vermittelten Apoptose durch eine Reduktion des freigesetzten Cytochrom c wären darüber hinaus denkbar. Die Cygb-Expression im Gehirn beschränkte sich auf relativ wenige Neurone in verschiedenen Gehirnbereichen und zeigte dort vorwiegend eine Co-Lokalisation mit der neuronalen NO-Synthase. Dieser Befund legt eine Funktion des Cytoglobins im NO-Metabolismus nahe. Quantitative RT-PCR-Experimente zur mRNA-Expression von Ngb und Cygb in alternden Säugern am Bsp. der Hamsterspezies Phodopus sungorus zeigten keine signifikanten Änderungen der mRNA-Mengen beider Globine in alten im Vergleich zu jungen Tieren. Dies widerspricht publizierten Daten, in denen bei der Maus anhand von Western Blot-Analysen eine Abnahme der Neuroglobin-Menge im Alter gezeigt wurde. Möglicherweise handelt es sich hierbei um speziesspezifische Differenzen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte vergleichende Sequenzanalyse der humanen und murinen NGB/Ngb-Genregion liefert zum einen Hinweise auf die mögliche Regulation der Ngb-Expression und zum anderen eine wichtige Grundlage für die funktionellen Analysen dieses Gens. Es konnte ein minimaler Promotorbereich definiert werden, der zusammen mit einigen konservierten regulatorischen Elementen als Basis für experimentelle Untersuchungen der Promotoraktivität in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen dienen wird. Bioinformatische Analysen führten zur Identifizierung des sog. „neuron restrictive silencer element“ (NRSE) im Ngb-Promotor, welches vermutlich für die vorwiegend neuronale Expression des Proteins verantwortlich ist. Die kontrovers diskutierte O2-abhängige Regulation der Ngb-Expression konnte hingegen anhand der durchgeführten komparativen Sequenzanalysen nicht bestätigt werden. Es wurden keine zwischen Mensch und Maus konservierten Bindestellen für den Transkriptionsfaktor HIF-1 identifiziert, der die Expression zahlreicher hypoxieregulierter Gene, z.B. Epo und VEGF, vermittelt. Zusammen mit den in vivo-Daten spricht dies eher gegen eine Regulation der Ngb-Expression bei verminderter Verfügbarkeit von Sauerstoff. Die Komplexität der Funktionen von Ngb und Cygb im O2-Stoffwechsel der Vertebraten macht den Einsatz muriner Modellsysteme unerlässlich, die eine sukzessive Aufklärung der Funktionen beider Proteine erlauben. Die vorliegende Arbeit liefert auch dazu einen wichtigen Beitrag. Die hergestellten „gene-targeting“-Vektorkonstrukte liefern in Verbindung mit den etablierten Nachweisverfahren zur Genotypisierung von embryonalen Stammzellen die Grundlage zur erfolgreichen Generierung von Ngb-knock out sowie Ngb- und Cygb-überexprimierenden transgenen Tieren. Diese werden für die endgültige Entschlüsselung funktionell relevanter Fragestellungen von enormer Bedeutung sein.

Structural and strain analysis in the Late Paleozoic coastal accretionary wedge of central Chile

Abstract In this study structural and finite strain data are used to explore the tectonic evolution and the exhumation history of the Chilean accretionary wedge. The Chilean accretionary wedge is part of a Late Paleozoic subduction complex that developed during subduction of the Pacific plate underneath South America. The wedge is commonly subdivided into a structurally lower Western Series and an upper Eastern Series. This study shows the progressive development of structures and finite strain from the least deformed rocks in the eastern part of the Eastern Series of the accretionary wedge to higher grade schist of the Western Series at the Pacific coast. Furthermore, this study reports finite-strain data to quantify the contribution of vertical ductile shortening to exhumation. Vertical ductile shortening is, together with erosion and normal faulting, a process that can aid the exhumation of high-pressure rocks. In the east, structures are characterized by upright chevron folds of sedimentary layering which are associated with a penetrative axial-plane foliation, S1. As the F1 folds became slightly overturned to the west, S1 was folded about recumbent open F2 folds and an S2 axial-plane foliation developed. Near the contact between the Western and Eastern Series S2 represents a prominent subhorizontal transposition foliation. Towards the structural deepest units in the west the transposition foliation became progressively flat lying. Finite-strain data as obtained by Rf/Phi and PDS analysis in metagreywacke and X-ray texture goniometry in phyllosilicate-rich rocks show a smooth and gradual increase in strain magnitude from east to west. There are no evidences for normal faulting or significant structural breaks across the contact of Eastern and Western Series. The progressive structural and strain evolution between both series can be interpreted to reflect a continuous change in the mode of accretion in the subduction wedge. Before ~320-290 Ma the rocks of the Eastern Series were frontally accreted to the Andean margin. Frontal accretion caused horizontal shortening and upright folds and axial-plane foliations developed. At ~320-290 Ma the mode of accretion changed and the rocks of the Western Series were underplated below the Andean margin. This basal accretion caused a major change in the flow field within the wedge and gave rise to vertical shortening and the development of the penetrative subhorizontal transposition foliation. To estimate the amount that vertical ductile shortening contributed to the exhumation of both units finite strain is measured. The tensor average of absolute finite strain yield Sx=1.24, Sy=0.82 and Sz=0.57 implying an average vertical shortening of ca. 43%, which was compensated by volume loss. The finite strain data of the PDS measurements allow to calculate an average volume loss of 41%. A mass balance approximates that most of the solved material stays in the wedge and is precipitated in quartz veins. The average of relative finite strain is Sx=1.65, Sy=0.89 and Sz=0.59 indicating greater vertical shortening in the structurally deeper units. A simple model which integrates velocity gradients along a vertical flow path with a steady-state wedge is used to estimate the contribution of deformation to ductile thinning of the overburden during exhumation. The results show that vertical ductile shortening contributed 15-20% to exhumation. As no large-scale normal faults have been mapped the remaining 80-85% of exhumation must be due to erosion.

Untersuchung der Bindung des humanen Papillomvirus HPV16 an Heparansulfate der Zelloberfläche

In 99,7% aller Zervixkarzinome kann die DNA humaner Papillomviren (HPV) nachgewiesen werden, die somit den Hauptauslöser für eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen weltweit darstellen. HPV16 ist verantwortlich für etwa 50% aller Zervixkarzinome. Für die Infektion von Zellen mit HPV16 ist die Interaktion mit Heparansulfatproteoglykanen der Zelloberfläche essentiell. Um Aminosäuren auf der Oberfläche des majoren Kapsidproteins L1 von HPV16 zu identifizieren, die zu dieser Interaktion beitragen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zahlreiche Punktmutanten hergestellt und analysiert. Der Austausch der drei Lysine K278, K356 und K361 zu Alaninen führte zu signifikant verminderter Zell-, Heparin- und Heparansulfatbindung, die noch weiter reduziert wurde, wenn zwei oder drei der Lysine gleichzeitig mutiert waren. Auch die Infektiosität der mutanten Pseudovirionen war stark beeinträchtigt, die Trippelmutante zeigte nur noch 5% Infektiosität. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die drei Lysine gemeinsam die Bindestelle für Heparansulfate bilden. Ihr Austausch zu Argininen beeinflusste die Infektiosität der Partikel hingegen nicht, was bestätigt, dass die Interaktion mit Heparansulfaten von der positiven Ladungsdichte abhängt und nicht sequenzspezifisch ist. Die drei Lysine befinden sich auf der Spitze des HPV16-Kapsomers in einer flachen Tasche, die aufgrund ihrer Struktur bereits früher als potentielle Rezeptorbindestelle vorgeschlagen wurde. Fab-Fragmente des bindungsneutralisierenden Antikörpers H16.56E, dessen Epitop in direkter Nachbarschaft der Lysine liegt, inhibierten die heparansulfatvermittelte Zellbindung viraler Partikel. Auch Epitope anderer bindungsneutralisierender Antikörper befinden sich in der Nähe. Dies untermauert die Hypothese, dass die Lysine K278, K356 und K361 die Heparansulfatbindestelle von HPV16 bilden. Der Austausch von Threoninen, die genau zwischen den Lysinen liegen, hatte keine Auswirkung auf Bindung der Partikel und Infektiosität. Sie könnten jedoch durch die Bildung von Wasserstoffbrücken die Bindung an Heparansulfat stabilisieren. Die Bedeutung der Lysine K278, K356 und K361 bei der primären Interaktion von HPV16 mit Heparansulfaten konnte durch die Computersimulation der Interaktion der Virusoberfläche mit einem Heparinmolekül bestätigt werden. Des Weiteren konnten Anforderungen ermittelt werden, die eine solche Interaktion an das Heparinmolekül stellt. Weiterhin zeigten die Ergebnisse dieser Arbeit, dass basische Aminosäuren in der interkapsomeren Grube nicht an der primären Zellbindung an Heparansulfate beteiligt zu sein scheinen, aber eine Rolle bei sekundären Interaktionen mit der Zelloberfläche spielen könnten.

Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften neuer Nukleobasen-gekoppelter Pyrrolcarboxamide, Combilexine und Hetaren[a]carbazol-Derivate: Validierung und Etablierung von in-vitro- und in-silico-Methoden

Da maligne Neoplasien durch Mutationen in Proto-Onko- und/oder Tumorsuppressorgenen ausgelöst werden, stellt die DNA eines der wichtigsten Targets für die Entwicklung neuer Zytostatika dar. Auch bei den im Arbeitskreis Pindur designten und synthetisier-ten Verbindungen der Nukleobasen-gekoppelten Pyrrolcarboxamid-, der Hetaren[a]carbazol- und der Combilexin-Reihe handelt es sich um DNA-Liganden mit potentiell antitumoraktiven Eigenschaf-ten. Die einen dualen Bindemodus aufweisenden Combilexine bestehen aus einem Interkalator (u. a. Naphthalimid, Acridon), der über einen Linker variabler Kettenlänge mit einer rinnenbin-denden, von Netropsin abgeleiteten Bispyrrol-, oder einer bioisosteren Imidazol-, Thiazol- oder Thiophen-pyrrolcarboxamid-struktur verknüpft ist. Das N-terminale Ende der Combilexine wird von einer N,N-Dimethylaminopropyl- oder -ethyl-Seitenkette gebildet. Die DNA-Affinitäten der Liganden wurden mittels Tm-Wert-Messung-en bestimmt. Diese Denaturierungsexperimente wurden sowohl mit poly(dAdT)2- als auch mit Thymus-DNA (~42% GC-Anteil) durchge-führt, um Aussagen zur Stärke und zur Sequenzselektivität der DNA-Bindung machen zu können. Des Weiteren wurden die Bindekon-stanten einiger ausgewählter Vertreter mit Hilfe des Ethidium-bromid-Verdrängungsassays ermittelt; einige Testverbindungen wurden zudem auf potentiell vorhandene, TOPO I-inhibierende Eigenschaften untersucht. Diese biochemischen und biophysika-lischen Tests wurden durch Molecular Modelling-Studien ergänzt, die die Berechnung von molekularen Eigenschaften, die Durch-führung von Konformerenanalysen und die Simulation von DNA-Ligand-Komplexen (Docking) umfassten. Durch Korrelation der in vitro-Befunde mit den in silico-Daten gelang es, vor allem für die Substanzklasse der Combilexine einige richtungweisende Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen. So konnte gezeigt werden, dass die Einführung eines Imidazol-Rings in die rinnen-bindende Hetaren-pyrrolcarboxamid-Struktur der Combilexine aufgrund der H-Brücken-Akzeptor-Funktion des sp2-hybridisierten N-Atoms eine Verschiebung der Sequenzselektivität der DNA-Bindung von AT- zu GC-reichen Arealen der DNA bedingt. Zudem erwies sich ein C3-Linker für die Verknüpfung des Naphthalimids mit dem rinnenbindenden Strukturelement als am besten geeignet, während bei den Acridon-Derivaten die Verbindungen mit einem N-terminalen Buttersäure-Linker die höchste DNA-Affinität aufwiesen. Dies ist sehr wahrscheinlich auf die im Vergleich zum Naphthalimid-Molekül geringere y-Achsen-Ausdehnung (bzgl. eines x/y-Koordinatensystems) des Acridons zurückzuführen. Die ermittelten Struktur-Wirkungsbeziehungen können dazu herangezogen werden, das rationale Design neuer DNA-Liganden mit potentiell stärkerer DNA-Bindung zu optimieren.