Modifizierungen des Enzyms Silicatein alpha zur direkten Immobilisierung auf verschiedenen Oberflächen : neuartige Herstellung von Kompositmaterialien unter physiologischen Bedingungen

Das Silicatein α ist ein 24 kDa großes Enzym, welches im Schwamm Suberites domuncula für die Synthese von Biosilikat verantwortlich ist. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass Silicatein auch die Synthese anderer Metalloxide wie Titandioxid, Galliumoxid und Zirkoniumdioxid katalysieren kann. Diese Fähigkeiten machen das Silicatein α für biomedizinische und biotechnologische Anwendungen interessant, da die Synthese unter nahezu physiologischen Bedingungen ablaufen kann, was die Herstellung neuartiger Kompositmaterialien mit einzigartigen Eigenschaften erleichtern würde. Zur Immobilisierung des Silicatein α auf verschiedenen Oberflächen wurde bislang ein Nickel-NTA-Kopolymer eingesetzt. Diese Art der Immobilisierung bietet eine Reihe von Möglichkeiten in der Nanobiotechnologie, stößt aber in der Biomedizin an ihre Grenzen, da sich nicht alle Oberflächen für ein solches Coating eignen. Zudem können die zur Aktivierung des Polymers nötigen Lösungsmittel und die über die Zeit freigesetzten Monomere aus dem Polymergerüst toxische oder mutagene Wirkung auf das umliegende Gewebe haben. Deshalb wurde das Silicatein α in dieser Arbeit mit zwei Affinitäts-Tags so modifiziert, dass es an verschiedene Oberflächen immobilisiert werden kann und dabei seine Aktivität beibehält. Zuerst wurde das Silicatein mit einem Glu-tag am N-terminalen Ende modifiziert. Dadurch gelang die direkte Immobilisierung an Hydroxyapatit und die folgende, enzymkatalysierte Synthese von Biosilikat-Beschichtungen auf diesem Träger. Die Eigenschaften eines solchen HA-Kompositmaterials können zum Beispiel zu einem verbesserten, schnelleren und stabileren Einwachsen von Knochenimplantaten führen, da Biosilikat die Reifung und Differenzierung von Osteoblasten beschleunigt. rnMit dem an Hydroxyapatit-Plättchen immobilisierten Glu-tag-Silicatein wurde ein modifizierter Pull-down Assay etabliert, wodurch bekannte, aber auch bis dahin noch unbekannte Protein-Interaktionspartner identifiziert werden konnten. rnUm zu zeigen, dass der entwickelte Glu-tag an präformierte, calciumhaltige Oberflächen binden kann, wurden die Nadeln des Kalkschwammes Paraleucilla magna als Modellorganismus verwendet. Die Nadeln konnten durch das immobilisierte Silicatein mit einer Titandioxid-Schicht überzogen werden und unter Verwendung des Interaktionspartners Silintaphin-1 konnte diese Beschichtung noch verstärkt werden. Solche CaCO3-Kompositmaterialien könnten sowohl in der Biomedizin als auch in der Biotechnologie zum Einsatz kommen. Neben den erwähnten calciumhaltigen Materialien finden auch andere Stoffe wie TiO2-Nanodrähte Verwendung in der Forschung. In weiterführenden Experimenten konnte gezeigt werden, dass der entwickelte Glu-tag auch Affinität zu Titandioxid-Oberflächen vermittelt. Auch hier konnte durch das oberflächenimmobilisierte Enzym eine Biosilikatbeschichtung synthetisiert werden. rnMit der zweiten Modifikation - einem Cys-tag - konnte Silicatein direkt auf Goldoberflächen immobilisiert werden. Durch die Verwendung eines Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempels wurde das Cys-getaggte Silicatein in einem linienförmigen Muster auf das Gold übertragen und die Synthese von Titandioxid dort nachgewiesen.rnDie Experimente und Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass Silicatein α durch einfache Modifikationen an verschiedene Oberflächen immobilisiert werden kann und dabei immer noch seine Aktivität behält. rnHierdurch ergibt sich die Möglichkeit, unter Normalbedingungen verschiedenste Kompositmaterialien herzustellen.rn

Charakterisierung einer pflanzlichen Variante des Cytoskelettproteins gamma-Tubulin durch Strukturmodellierung, Überexpression und Analyse der Interaktionspartner

Wie alle Eukaryoten besitzen auch höhere Pflanzen ein mikrotubuläres Cytoskelett. Einige Funktionen dieses Cytoskeletts sind relativ stark konserviert, andere dagegen scheinen sehr pflanzenspezifisch zu sein. Dies betrifft insbesondere charakteristische mikrotubuläre Netzwerke, die bei der Neubildung und der Verstärkung der Zellwände wichtige Rollen übernehmen. Wie der Aufbau dieser Netzwerke kontrolliert wird, ist bisher relativ unklar. Typische Mikrotubuli organisierende Zentren (MTOC), insbesondere Centrosomen oder Spindelpolkörper, sind bei höheren Pflanzen nicht beobachtet worden. Von pilzlichen und tierischen Organismen weiß man, dass gamma-Tubulin (gTUB) mit seinen assoziierten Proteinen in den MTOC bei der Nukleation von Mikrotubuli eine Schlüsselfunktion hat. Dieses Mitglied der Tubulin-Superfamilie wird aber auch in Pflanzen gefunden, dessen genaue Funktion bisher unbekannt ist. Zu Beginn der Arbeit wurden mittels in silico Berechnungen Strukturmodelle des pflanzlichen gTUBs aus Nicotiana tabacum erarbeitet, da die Struktur, die zu einem Verständnis der pflanzlichen Wachstumsregulation beitragen könnte, bisher unbekannt ist. Auf Grundlage der bioinformatischen Daten konnte für weitere Studien eine notwendige gTUB-Deletionsmutante entwickelt werden. Für Röntgendiffraktionsstudien und gTUB-Interaktionspartneranalysen war die Verfügbarkeit verhältnismäßig großer Proteinmengen notwendig. Die Expression der gTUB-Volllängensequenz in gelöster und aktiver Form stellte einen immanent wichtigen Zwischenschritt dar. Das Escherichia coli T7/lacO-Expressionssystem lieferte, trotz vielversprechender Erfolge in der Vergangenheit, kein gelöstes rekombinantes gTUB. So wurden zwar verhältnismäßig hohe Expressionsraten erzielt, aber das rekombinante gTUB lag quantitativ als Inclusion bodies vor. Eine Variationen der Expressionsparameter sowie umfangreiche Versuche mittels verschiedenster Konstrukte sowie potentiell die Löslichkeit erhöhenden Tags gTUB in gelöster Form in E. coli zu exprimieren blieben erfolglos. Eine Denaturierung der Inclusion bodies und Rückfaltung wurde aufgrund der wohl bei der Tubulinfaltung notwendigen komplexeren Chaperone sowie thermodynamischer Überlegungen ausgeschlossen. Die höher evolvierte Chaperonausstattung war ein Hauptgrund für die Verwendung der eukaryotischen Hefe-Expressionssysteme K. lactis und des S. cerevisiae-Stammes FGY217 zur gTUB-Expression. So konnten nach der Selektion nur transgene Hefe-Zellen dokumentiert werden, die die gTUB-Expressionskassette nachweislich an der vorgesehenen Zielposition in ihrem Genom integrierten, aber keine dokumentierbare Expression zeigten. Die wahrscheinlichste Begründung hierfür ist, dass ein erhöhter intrazellulärer gTUB-Titer mit dem Zellwachstum und der Zellteilung dieser eukaryotischen Organismen interferierte und durch Rückkopplungen die rekombinante gTUB-CDS aus N. tabacum ausgeschaltet wurde. Der Versuch einer transienten gTUB-Überexpression in differenzierten Blattgeweben höherer Pflanzen war eine logische Konsequenz aus den vorherigen Ergebnissen und lieferte, wenn auch nicht die für eine Proteinkristallisation notwendigen Mengen, gelöstes gTUB. Bestrebungen einer stabilen Transfektion von A. thaliana oder BY-2-Zellkulturen mit einer gTUB-CDS lieferten keine transgenen Organismen, was starke Interferenzen der rekombinanten gTUB-CDS in den Zellen vermuten lies. Transfektionsversuche mit nur GFP tragenden Konstrukten ergaben hingegen eine hohe Anzahl an transgenen Organismen, die auch verhältnismäßig starke Expressionsraten zeigten. Die erzielten Proteinmengen bei der transienten gTUB-Überexpression in N. benthamiana Blattgeweben, in Co-Expression mit dem Posttransriptional Gene Silencing-Suppressorprotein p19, waren für einen Pull-Down sowie eine massenspektroskopische Analyse der Interaktionspartner ausreichend und ergaben Befunde. Eine abschließende Auswertung des erarbeiteten massenspektroskopischen Datensatzes wird jedoch erst dann möglich sein, wenn das Tabak-Proteom vollständig sequenziert ist. Die Erweiterung der bestehenden pflanzlichen Vergleichsdatenbanken um das bisher bekannte Tabak-Proteom vervielfachte die Anzahl der in dieser Studie identifizierten gTUB-Interaktionspartner. Interaktionen mit dem TCP1-Chaperon untermauern die Hypothese der zur Faltung pflanzlichen gTUBs notwendigen Chaperone. Beobachtete gTUB-Degradationsmuster in Verbindung mit Interaktionen des 26S-Proteasoms deuten auf eine Gegenregulationen bei erhöhtem gTUB-Titer auf Proteinebene hin. Da Blattgewebe selbst nur noch über eine sehr geringe und inhomogene Teilungsaktivität verfügen ist diese Regulation hoch spannend. Auch konnte durch Co-Expression des PTGS-Suppressorproteins p19 gezeigt werden, dass bei der gTUB-Expression eine Regulation auf RNA-Ebene erfolgt.

Indagine teorica e sperimentale sull'aderenza di barre in frp nel calcestruzzo

L’aderenza tra barre fibrorinforzate e calcestruzzo è una chiave fondamentale per comprendere al meglio l’azione composita di strutture rinforzate o armate in FRP. Deve essere mobilitata una certa aderenza tra la barra e calcestruzzo per trasferire gli sforzi da un corpo all’altro. Poiché il materiale composito è anisotropo, in direzione longitudinale le proprietà meccaniche sono governate da quelle delle fibre, mentre in direzione trasversale dalla resina. La matrice presenta in genere resistenze più basse di quella a compressione del calcestruzzo, cosicché il meccanismo di aderenza risulta diverso da quello sviluppato dalle tradizionali barre in acciaio. In questa tesi viene sviluppata appunto un’indagine sperimentale sul fenomeno dell’aderenza di barre in acciaio e barre in CFRP (fibra di carbonio) nel calcestruzzo, cercando di capire come cambia il fenomeno al variare dei parametri da cui dipende principalmente l’aderenza, come ad esempio la resistenza caratteristica a compressione del calcestruzzo, il diametro e la deformazione superficiale della barra e la posizione di questa nel provino di calcestruzzo. Sono state quindi realizzate delle prove di pull-out, ovvero delle prove di estrazione di barre da provini di calcestruzzo, per determinare le tensioni tangenziali d’aderenza in funzione dello scorrimento locale della barra (local bond-slip). Infine sono stati calibrati, sui risultati delle prove sperimentali, i tre modelli analitici più noti in letteratura che descrivono il fenomeno dell’aderenza delle barre in FRP nel calcestruzzo, ovvero quello di Malvar (1994), il CMR Model (1995) e il Modified BPE Model (1996).

Misura di adesione di film polimerici su tappi di sughero

L’industria enologica oggigiorno propone numerosi modi per sigillare le bottiglie in alternativa ai tappi di sughero: tappi sintetici, tappi a vite, tappi a corona. Tuttavia si conosce la preferenza del consumatore medio per il sughero. I motivi sono molteplici: il sughero restituisce un'immagine di qualità del vino, esprime la tradizione ed è un materiale vivo e naturale, così come il vino. La naturalità del sughero però comporta dei rischi. Ad esempio si stima in 10 miliardi di dollari a livello mondiale la perdita economica dovuta al "sentore di tappo" o "cork taint". Recenti ricerche attribuiscono la responsabilità di tale difetto a composti chimici che migrano dal sughero al vino. Innovazione e tradizione si sono incontrate nell'ideazione della "tecnologia a membrana" o "membrane technology". Essa consiste nell'isolare le teste dei tappi con delle pellicole multistrato per non far diffondere nel vino alcun tipo di agente contaminante. In questo studio si espone in dettaglio un metodo per misurare l'adesione di film multistrato polimerici – strato esterno in polietilene – su tappi di sughero monopezzo. I tappi già rivestiti sono stati forniti da un'azienda del settore senza alcuna specifica di fabbricazione. In particolare la fase di trazione è stata ideata in analogia alla prova meccanica nota come pull-off test, usata nell'ambito dell'ingegneria edile. La bontà dell'adesione è indagata dal punto di vista della fisica dei materiali. Per le misurazioni si è utilizzato il Dynamic Mechanical Analyser (DMA), modello Q800, che si trova presso il laboratorio CIRI-MAM ospitato dal Dipartimento di Fisica e Astronomia di Bologna.

Light harvesting and orbital tuning : perylene monoimides and diimides for photovoltaic purposes

Die vorliegende Dissertation beschaftigt sich mit der Steuerung der Absorption und Orbitalenergien von Perylenmonoimiden und Perylendiimiden fur die Anwendung in organischer Photovoltaik (OPV). Eine breite Absorption spielt hier eine wichtige Rolle, um moglichst viel Licht zu ernten, das dann in elektrische Energie umgewandelt wird. Um sicher zu stellen, dass die Zelle ezient arbeiten kann, ist die Abstimmung von Orbitalenergien eine zweite wichtige Voraussetzung. Es werden drei neue Design-Konzepte fur Perylenmonoimid-Sensibilatoren fur Festk orper-Farbstosolarzellen (solid-state dye-sensitised solar cells - sDSSCs) untersucht. Die Synthese, die optischen und elektronischen Eigenschaften der neuen Sensibilisator- Verbindungen sowie ihre Leistungsdaten in sDSSCs werden beschrieben und diskutiert. Die in dieser Arbeit vorgestellten Konzepte reichen von der Einfuhrung von - Abstandhaltern uber neue Funktionalisierungen bis hin zur Erweiterung der Perylenmonimid Grundkorper. Der Push-Pull-Charakter der Systeme variiert von starker Kopplung bis zu kompletter Entkopplung des Donors vom Akzeptor. Dies hat einen starken Ein uss sowohl auf die Absorptionseigenschaften, als auch auf die HOMO/LUMO Energie-Niveaus der Verbindungen. Einige der Konzepte konnen auf Perylendiimide ubertragen werden. Ein Beispiel von Perylendiimid (PDI)-Farbsteuerung wird an einer Reihe von drei Terthiophen-PDIs gezeigt

Molekulare und supramolekulare Eigenschaften von neuen Donor-Akzeptor-Polymeren

Die organische Halbleitertechnologie befindet sich seit Jahrzehnten im Focus des Interesses, da sie eine kostengünstige und umweltverträgliche Alternative zu anorganischen Silizium-basierten Halbleitern darstellt. Die Möglichkeit der gezielten Funktionalisierung von definierten Strukturen durch synthetische Methoden, welche eine große Vielfalt an Materialien ermöglicht, steht dabei besonders im Vordergrund. Die Modifikation von physikalischen Eigenschaften ermöglicht dabei eine stark erleichterte Anpassung für den geplanten Anwendungsbereich. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden organische Halbleitermaterialien basierend auf Cyclopenta[2,1-b:3,4-b']dithiophen (CDT) dargestellt und hinsichtlich ihrer strukturellen und elektronischen Eigenschaften untersucht. In Kombination mit Benzo[c][1,2,5]thiadiazol (BTZ) und weiteren Akzeptoren wurden zunächst Donor(D)-Akzeptor(A)-Polymere synthetisiert und Struktur-Eigenschaft-Beziehungen aufgestellt. So konnte ein sehr hochmolekulares Polymer CDT-BTZ-Polymer (Mn = 36 kg mol-1, PDI = 2.6) erhalten werden, welches sich durch eine hohe lamellare Ordnung und eine gemessene Ladungsträgermobilität in FETs von über 5.0 cm2V-1s-1 bei Raumtemperatur auszeichnete; bei niedrigen Temperaturen (240 K) war letztgenannte 6.5 cm2V-1s-1. Aufgrund dieses hohen Ladungstransports und der Abwesenheit niedermolekularer Polymerketten innerhalb des Polymers konnte erstmals eine Messung eines HALL-Effektes bewerkstelligt werden. Dies war der erste Beweis eines Band-artigen Ladungstransportes an einem Polymerhalbleiter. Des Weiteren wurde durch synthetische Veränderung der Grundstruktur des Polymers zu längeren Alkylketten eine anisotrope Anordnung der Polymerketten erreicht und die Ladungsträgermobilität (6.5 cm2V-1s-1 bei Raumtemperatur) weiter gesteigert. Darauf aufbauend wurde der Einfluss von stereoisomeren Seitenketten an CDT-BTZ-Polymeren auf Packungsverhalten, Parametern (Sperrstrom, Einschaltstrom) in FETs und Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln untersucht. Durch cis-trans-Isomerisierung der Seitenketten wurde hier eine neue Methode zur Optimierung des Packungsverhaltens von Polymeren in dünnen Filmen und Lösung gefunden. Zuletzt wurden D-π-A-Farbstoffen, welche CDT als Verbrückungseinheit (π) beinhalten, dargestellt. Durch Variation von D und A konnten Struktur-Eigenschaft-Beziehungen in der Anwendung in Solarzellen (Feststoffsolarzellen, Flüssigsolarzellen) gefunden werden. Die Untersuchungen der photoinduzierten Absorption und der Photolumisenzenzquantenausbeute lieferten dabei Erklärungen für physikalische Prozesse wie Ladungsinjektion- und rekombination.

Ease of Application of Medical Compression-stocking Systems for the Treatment of Venous Ulcers

OBJECTIVE: To evaluate the ease of application of two-piece, graduated, compression systems for the treatment of venous ulcers. METHODS: Four kits used to provide limb compression in the management of venous ulcers were evaluated. These have been proven to be non-inferior to various types of bandages in clinical trials. The interface pressure exerted above the ankle by the under-stocking and the complete compression system and the force required to pull the over-stocking off were assessed in vitro. Ease of application of the four kits was evaluated in four sessions by five nurses who put stockings on their own legs in a blinded manner. They expressed their assessment of the stockings using a series of visual analogue scales (VASs). RESULTS: The Sigvaris Ulcer X((R)) kit provided a mean interface pressure of 46 mmHg and required a force in the range of 60-90 N to remove it. The Mediven((R)) ulcer kit exerted the same pressure but required force in the range of 150-190 N to remove it. Two kits (SurePress((R)) Comfort and VenoTrain((R)) Ulcertec) exerted a mean pressure of only 25 mmHg and needed a force in the range of 100-160 N to remove them. Nurses judged the Ulcer X and SurePress kits easiest to apply. Application of the VenoTrain kit was found slightly more difficult. The Mediven kit was judged to be difficult to use. CONCLUSIONS: Comparison of ease of application of compression-stocking kits in normal legs revealed marked differences between them. Only one system exerted a high pressure and was easy to apply. Direct comparison of these compression kits in leg-ulcer patients is required to assess whether our laboratory findings correlate with patient compliance and ulcer healing.

Acute Regulation of Renal Na+/H+ Exchanger NHE3 by Dopamine: Role of Protein Phosphatase 2A

Nephrogenic dopamine is a potent natriuretic paracrine/autocrine hormone that is central for mammalian sodium homeostasis. In the renal proximal tubule, dopamine induces natriuresis partly via inhibition of the sodium/proton exchanger NHE3. The signal transduction pathways and mechanisms by which dopamine inhibits NHE3 are complex and incompletely understood. This manuscript describes the role of the serine/threonine protein phosphatase 2A (PP2A) in the regulation of NHE3 by dopamine. The PP2A regulatory subunit B56 delta (coded by the Ppp2r5d gene) directly associates with more than one region of the carboxy-terminal hydrophilic putative cytoplasmic domain of NHE3 (NHE3-cyto), as demonstrated by yeast-two-hybrid, co-immunoprecipitation, blot overlay and in vitro pull-down assays. Phosphorylated NHE3-cyto is a substrate for purified PP2A in an in vitro dephosphorylation reaction. In cultured renal cells, inhibition of PP2A by either okadaic acid or by overexpression of the simian virus 40 (SV40) small t antigen blocks the ability of dopamine to inhibit NHE3 activity and to reduce surface NHE3 protein. Dopamine-induced NHE3 redistribution is also blocked by okadaic acid ex vivo in rat kidney cortical slices. These studies demonstrate that PP2A is an integral and critical participant in the signal transduction pathway between dopamine receptor activation and NHE3 inhibition. Key words: Natriuresis, Sodium transport, Signal transduction.

Haftfestigkeit eines mit β-Trikalziumphosphat angereichertem Knochenadhäsivs

Background: This investigation describes experimental tests of the biomechanical features of a new resorbable bone adhesive based on methacrylate-terminated oligolactides enhanced with osteoconductive β-tricalcium phosphate. Material and Methods: 51 New Zealand white rabbits were randomised to an adhesive group (n = 29) and a control group (n = 22). An extra-articular bone cylinder was taken from the proximal tibia, two stripes of adhesive were applied and the cylinders were replanted. After 10 and 21 days, 3 and 12 months tibial specimens were harvested and the cylinder pull-out test was performed with a servo-hydraulic machine. Additionally the pull-out force was evaluated with the bone-equivalent Ebazell® after 5, 10 and 360 minutes in 14 specimens each. Results: Average pull-out forces in the adhesive group were 28 N after 10 days (control: 57 N), 155 N after 21 days (216 N), 184 N after 3 months (197 N) and 205 N after 12 months (185 N). Investigations with Ebazell® showed almost identical pull-out forces after 5 min, 15 min and 360 min. Adhesive forces were as high as 125 N/cm2 of adhesive surface and more than 1200 N/g of adhesive mass. Conclusions: The adhesive investigated here has a very good primary adhesive power, compared to the literature data, achieved after only 5 minutes. Even in moist surroundings the adhesive capacity remains sufficient. The adhesive has to prove its resorptive properties in further investigations and in first line its medium-term and long-lasting biocompatibility. Furthermore, biomechanical features will have to be compared to those of conventional fixation techniques.

Plectin interacts with the rod domain of type III intermediate filament proteins desmin and vimentin

Plectin is a versatile cytolinker protein critically involved in the organization of the cytoskeletal filamentous system. The muscle-specific intermediate filament (IF) protein desmin, which progressively replaces vimentin during differentiation of myoblasts, is one of the important binding partners of plectin in mature muscle. Defects of either plectin or desmin cause muscular dystrophies. By cell transfection studies, yeast two-hybrid, overlay and pull-down assays for binding analysis, we have characterized the functionally important sequences for the interaction of plectin with desmin and vimentin. The association of plectin with both desmin and vimentin predominantly depended on its fifth plakin repeat domain and downstream linker region. Conversely, the interaction of desmin and vimentin with plectin required sequences contained within the segments 1A-2A of their central coiled-coil rod domain. This study furthers our knowledge of the interaction between plectin and IF proteins important for maintenance of cytoarchitecture in skeletal muscle. Moreover, binding of plectin to the conserved rod domain of IF proteins could well explain its broad interaction with most types of IFs.

Quantification of oxidized levels of specific RNA species using an aldehyde reactive probe

Emerging evidence has shown that oxidation of RNA, including messenger RNA (mRNA), is elevated in several age-related diseases, although investigation of oxidized levels of individual RNA species has been limited. Recently we reported that an aldehyde reactive probe (ARP) quantitatively reacts with oxidatively modified depurinated/depyrimidinated (abasic) RNA. Here we report a novel method to isolate oxidized RNA using ARP and streptavidin beads. An oligo RNA containing abasic sites that were derivatized with ARP was pulled down by streptavidin beads, whereas a control oligo RNA was not. In vitro oxidized RNA, as well as total cellular RNA, isolated from oxidatively stressed cells was also pulled down, dependent on oxidation level, and concentrated in the pull-down fraction. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using RNA in the pull-down fraction demonstrated that several gene transcripts were uniquely increased in the fraction by oxidative stress. Thus, our method selectively concentrates oxidized RNA by pull-down and enables the assessment of oxidation levels of individual RNA species. (C) 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.

The intracellular Ig fold: a robust protein scaffold for the engineering of molecular recognition

Protein scaffolds that support molecular recognition have multiple applications in biotechnology. Thus, protein frames with robust structural cores but adaptable surface loops are in continued demand. Recently, notable progress has been made in the characterization of Ig domains of intracellular origin--in particular, modular components of the titin myofilament. These Ig belong to the I(intermediate)-type, are remarkably stable, highly soluble and undemanding to produce in the cytoplasm of Escherichia coli. Using the Z1 domain from titin as representative, we show that the I-Ig fold tolerates the drastic diversification of its CD loop, constituting an effective peptide display system. We examine the stability of CD-loop-grafted Z1-peptide chimeras using differential scanning fluorimetry, Fourier transform infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance and demonstrate that the introduction of bioreactive affinity binders in this position does not compromise the structural integrity of the domain. Further, the binding efficiency of the exogenous peptide sequences in Z1 is analyzed using pull-down assays and isothermal titration calorimetry. We show that an internally grafted, affinity FLAG tag is functional within the context of the fold, interacting with the anti-FLAG M2 antibody in solution and in affinity gel. Together, these data reveal the potential of the intracellular Ig scaffold for targeted functionalization.

Reciprocal cooperation between unrelated rats depends on cost to donor and benefit to recipient

Background Although evolutionary models of cooperation build on the intuition that costs of the donor and benefits to the receiver are the most general fundamental parameters, it is largely unknown how they affect the decision of animals to cooperate with an unrelated social partner. Here we test experimentally whether costs to the donor and need of the receiver decide about the amount of help provided by unrelated rats in an iterated prisoner's dilemma game. Results Fourteen unrelated Norway rats were alternately presented to a cooperative or defective partner for whom they could provide food via a mechanical apparatus. Direct costs for this task and the need of the receiver were manipulated in two separate experiments. Rats provided more food to cooperative partners than to defectors (direct reciprocity). The propensity to discriminate between helpful and non-helpful social partners was contingent on costs: An experimentally increased resistance in one Newton steps to pull food for the social partner reduced the help provided to defectors more strongly than the help returned to cooperators. Furthermore, test rats provided more help to hungry receivers that were light or in poor condition, which might suggest empathy, whereas this relationship was inverse when experimental partners were satiated. Conclusions In a prisoner's dilemma situation rats seem to take effect of own costs and potential benefits to a receiver when deciding about helping a social partner, which confirms the predictions of reciprocal cooperation. Thus, factors that had been believed to be largely confined to human social behaviour apparently influence the behaviour of other social animals as well, despite widespread scepticism. Therefore our results shed new light on the biological basis of reciprocity.

Characterization of the bovine IkappaB kinases (IKK)alpha and IKKbeta, the regulatory subunit NEMO and their substrate IkappaBalpha

The Nuclear factor (NF)-kappaB signalling pathway plays a critical role in the regulation and coordination of a wide range of cellular events such as cell growth, apoptosis and cell differentiation. Activation of the IKK (inhibitor of NF-kappaB kinase) complex is a crucial step and a point of convergence of all known NF-kappaB signalling pathways. To analyse bovine IKKalpha (IKK1), IKKbeta (IKK2) and IKKgamma (or NF-kappaB Essential MOdulator, NEMO) and their substrate IkappaBalpha (Inhibitor of NF-kappaB), the corresponding cDNAs of these molecules were isolated, sequenced and characterized. A comparison of the amino acid sequences with those of their orthologues in other species showed a very high degree of identity, suggesting that the IKK complex and its substrate IkappaBalpha are evolutionarily highly conserved components of the NF-kappaB pathway. Bovine IKKalpha and IKKbeta are related protein kinases showing 50% identity which is especially prominent in the kinase and leucine zipper domains. Co-immunoprecipitation assays and GST-pull-down experiments were carried out to determine the composition of bovine IKK complexes compared to that in human Jurkat T cells. Using these approaches, the presence of bovine IKK complexes harbouring IKKalpha, IKKbeta, NEMO and the interaction of IKK with its substrate IkappaBalpha could be demonstrated. Parallel experiments using human Jurkat T cells confirmed the high degree of conservation also at the level of protein-protein interactions. Finally, a yeast two-hybrid analysis showed that bovine NEMO molecules, in addition to the binding to IKKalpha and IKKbeta, also strongly interact with each other.

Mycophenolate acid inhibits endothelial NAD(P)H oxidase activity and superoxide formation by a Rac1-dependent mechanism

Endothelial dysfunction precedes hypertension and atherosclerosis and predicts cardiac allograft vasculopathy and death in heart transplant recipients. Endothelial overproduction of reactive oxygen species, such as superoxide anions produced by NAD(P)H oxidase, induces endothelial dysfunction. Because immunosuppressive drugs have been associated with increased reactive oxygen species production and endothelial dysfunction, we sought to elucidate the underlying mechanisms. Reactive oxygen species, release of superoxide anions, and NAD(P)H oxidase activity were studied in human umbilical vein endothelial cells and in polymorphonuclear neutrophils. Gp91ds-tat was used to specifically block NAD(P)H oxidase. Transcriptional activation of different subunits of NAD(P)H oxidase was assessed by real-time RT-PCR. Rac1 subunit translocation and activation were studied by membrane fractionation and pull-down assays. Calcineurin inhibitors significantly increased endothelial superoxide anions production because of NAD(P)H oxidase, whereas mycophenolate acid (MPA) blocked it. MPA also attenuated the respiratory burst induced by neutrophil NAD(P)H oxidase. Because transcriptional activation of NAD(P)H oxidase was not affected, but addition of guanosine restored endothelial superoxide anions formation after MPA treatment, we speculate that the inhibitory effect of MPA was mediated by depletion of cellular guanosine triphosphate content. This prevented activation of Rac1 and, thus, of endothelial NAD(P)H oxidase. Because all heart transplant recipients are at risk for cardiac allograft vasculopathy development, these differential effects of immunosuppressants on endothelial oxidative stress should be considered in the choice of immunosuppressive drugs.