A single amino acid in gamma-aminobutyric acid rho 1 receptors affects competitive and noncompetitive components of picrotoxin inhibition.

A class of bicuculline-insensitive gamma-aminobutyric acid (GABA) receptors, GABAC, has been identified in retina. Several lines of evidence indicate that GABAC receptors are formed partially or wholly of GABA rho subunits. These receptors generate a Cl- current in response to GABA but differ from GABAA receptors in a number of ways. Picrotoxin, widely accepted as a noncompetitive antagonist of GABAA receptors, displays competitive and noncompetitive antagonism of GABAC receptors in perch and bovine retina and GABA rho 1 receptors expressed in Xenopus oocytes. The aim of this study was to identify the molecular basis of the two components of picrotoxin inhibition of GABA rho 1 receptors. By using a domain-swapping and mutagenesis strategy, a difference in picrotoxin sensitivity between rho 1 and rho 2 receptors was localized to a single amino acid in the putative second transmembrane domain. Substitution of this amino acid with residues found in the analogous position in highly picrotoxin-sensitive glycine alpha and GABAA subunits increased the sensitivity of rho 1 mutants 10- to 500-fold. Importantly, the competitive component of picrotoxin inhibition of the rho 1 mutant receptors was almost eliminated. These findings demonstrate that an amino acid in the putative channel domain of GABA rho 1 receptors influences picrotoxin sensitivity and mediates agonist binding by an allosteric mechanism.

Cloning of a gamma-aminobutyric acid type C receptor subunit in rat retina with a methionine residue critical for picrotoxinin channel block.

Ionotropic receptors for gamma-aminobutyric acid (GABA) are important to inhibitory neurotransmission in the mammalian retina, mediating GABAA and GABAC responses. In many species, these responses are blocked by the convulsant picrotoxinin (PTX), although the mechanism of block is not fully understood. In contrast, GABAC responses in the rat retina are extremely resistant to PTX. We hypothesized that this difference could be explained by molecular characterization of the receptors underlying the GABAC response. Here we report the cloning of two rat GABA receptor subunits, designated r rho 1 and r rho 2 after their previously identified human homologues. When coexpressed in Xenopus oocytes, r rho 1/r rho 2 heteromeric receptors mimicked PTX-resistant GABAC responses of the rat retina. PTX resistance is apparently conferred in native heteromeric receptors by r rho 2 subunits since homomeric r rho 1 receptors were sensitive to PTX; r rho 2 subunits alone were unable to form functional homomeric receptors. Site-directed mutagenesis confirmed that a single amino acid residue in the second membrane-spanning region (a methionine in r rho 2 in place of a threonine in r rho 1) is the predominant determinant of PTX resistance in the rat receptor. This study reveals not only the molecular mechanism underlying PTX blockade of GABA receptors but also the heteromeric nature of native receptors in the rat retina that underlie the PTX-resistant GABAC response.

An anatomical substrate for experience-dependent plasticity of the rat barrel field cortex.

The objective of this study was to examine the influence of sensory experience on the synaptic circuitry of the cortex. For this purpose, the quantitative distribution of the overall and of the gamma-aminobutyric acid (GABA) population of synaptic contacts was investigated in each layer of the somatosensory barrel field cortex of rats which were sensory deprived from birth by continuously removing rows of whiskers. Whereas there were no statistically significant changes in the quantitative distribution of the overall synaptic population, the number and proportion of GABA-immunopositive synaptic contacts were profoundly altered in layer IV of the somatosensory cortex of sensory-deprived animals. These changes were attributable to a specific loss of as many as two-thirds of the GABA contacts targeting dendritic spines. Thus, synaptic contacts made by GABA terminals in cortical layer IV and, in particular, those targeting dendritic spines represent a structural substrate of experience-dependent plasticity. Furthermore, since in this model of cortical plasticity the neuronal receptive-field properties are known to be affected, we propose that the inhibitory control of dendritic spines is essential for the elaboration of these functional properties.

Long-term synaptic transformation of hippocampal CA1 gamma-aminobutyric acid synapses and the effect of anandamide.

Evidence is presented for a distinctive type of hippocampal synaptic modification [previously described for a molluscan gamma-aminobutyric acid (GABA) synapse after paired pre- and postsynaptic excitation]: transformation of GABA-mediated synaptic inhibition into synaptic excitation. This transformation persists with no further paired stimulation for 60 min or longer and is termed long-term transformation. Long-term transformation is shown to contribute to pairing-induced long-term potentiation but not to long-term potentiation induced by presynaptic stimulation alone. Further support for such mechanistic divergence is provided by pharmacologic effects on long-term transformation as well as these two forms of long-term potentiation by Cl- channel blockers, glutamate and GABA antagonists, as well as the endogenous cannabinoid ligand anandamide.

G protein activation kinetics and spillover of gamma-aminobutyric acid may account for differences between inhibitory responses in the hippocampus and thalamus.

We have developed a model of gamma-aminobutyric acid (GABA)ergic synaptic transmission mediated by GABAA and GABAB receptors, including cooperativity in the guanine nucleotide binding protein (G protein) cascade mediating the activation of K+ channels by GABAB receptors. If the binding of several G proteins is needed to activate the K+ channels, then only a prolonged activation of GABAB receptors evoked detectable currents. This could occur if strong stimuli evoked release in adjacent terminals and the spillover resulted in prolonged activation of the receptors, leading to inhibitory responses similar to those observed in hippocampal slices. The same model also reproduced thalamic GABAB responses to high-frequency bursts of stimuli. In this case, prolonged activation of the receptors was due to high-frequency release conditions. This model provides insights into the function of GABAB receptors in normal and epileptic discharges.

Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors.

Vigilance, anxiety, epileptic activity, and muscle tone can be modulated by drugs acting at the benzodiazepine (BZ) site of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors. In vivo, BZ sites are potential targets for endogenous ligands regulating the corresponding central nervous system states. To assess the physiological relevance of BZ sites, mice were generated containing GABAA receptors devoid of BZ sites. Following targeted disruption of the gamma 2 subunit gene, 94% of the BZ sites were absent in brain of neonatal mice, while the number of GABA sites was only slightly reduced. Except for the gamma 2 subunit, the level of expression and the regional and cellular distribution of the major GABAA receptor subunits were unaltered. The single channel main conductance level and the Hill coefficient were reduced to values consistent with recombinant GABAA receptors composed of alpha and beta subunits. The GABA response was potentiated by pentobarbital but not by flunitrazepam. Diazepam was inactive behaviorally. Thus, the gamma 2 subunit is dispensable for the assembly of functional GABAA receptors but is required for normal channel conductance and the formation of BZ sites in vivo. BZ sites are not essential for embryonic development, as suggested by the normal body weight and histology of newborn mice. Postnatally, however, the reduced GABAA receptor function is associated with retarded growth, sensorimotor dysfunction, and drastically reduced life-span. The lack of postnatal GABAA receptor regulation by endogenous ligands of BZ sites might contribute to this phenotype.

A progesterone metabolite stimulates the release of gonadotropin-releasing hormone from GT1-1 hypothalamic neurons via the gamma-aminobutyric acid type A receptor.

The reduced progesterone metabolite tetrahydroprogesterone (3 alpha-hydroxy-5 alpha-pregnan-20-one; 3 alpha,5 alpha-THP) is a positive modulator of the gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor. Experiments performed in vitro with hypothalamic fragments have previously shown that GABA could modulate the release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH). Using GT1-1 immortalized GnRH neurons, we investigated the role of GABAA receptor ligands, including 3 alpha,5 alpha-THP, on the release of GnRH. We first characterized the GABAA receptors expressed by these neurons. [3H]Muscimol, but not [3H]flunitrazepam, bound with high affinity to GT1-1 cell membranes (Kd = 10.9 +/- 0.3 nM; Bmax = 979 +/- 12 fmol/mg of protein), and [3H]muscimol binding was enhanced by 3 alpha,5 alpha-THP. mRNAs encoding the alpha 1 and beta 3 subunits of the GABAA receptor were detected by the reverse transcriptase polymerase chain reaction. In agreement with binding data, the benzodiazepine-binding gamma subunit mRNA was absent. GnRH release studies showed a dose-related stimulating action of muscimol. 3 alpha,5 alpha-THP not only modulated muscimol-induced secretion but also stimulated GnRH release when administered alone. Bicuculline and picrotoxin blocked the effects of 3 alpha,5 alpha-THP and muscimol. Finally, we observed that GT1-1 neurons convert progesterone to 3 alpha,5 alpha-THP. We propose that progesterone may increase the release of GnRH by a membrane mechanism, via its reduced metabolite 3 alpha,5 alpha-THP acting at the GABAA receptor.

Nitric oxide inhibits hypothalamic luteinizing hormone-releasing hormone release by releasing gamma-aminobutyric acid.

Nitric oxide synthase (NOS)-containing neurons, termed NOergic neurons, occur in various regions of the hypothalamus, including the median eminence-arcuate region, which plays an important role in controlling the release of luteinzing hormone-releasing hormone (LHRH). We examined the effect of NO on release of gamma-aminobutyric acid (GABA) from medial basal hypothalamic (MBH) explants incubated in vitro. Sodium nitroprusside (NP) (300 microM), a spontaneous releaser of NO, doubled the release of GABA. This release was significantly reduced by incubation of the tissue with hemoglobin, a scavenger of NO, whereas hemoglobin alone had no effect on the basal release of GABA. Elevation of the potassium concentration (40 mM) in the medium increased GABA release 15-fold; this release was further augmented by NP. Hemoglobin blocked the increase in GABA release induced by NP but had no effect on potassium-induced release, suggesting that the latter is not related to NO. As in the case of hemoglobin, NG-monomethyl-L-arginine (NMMA), a competitive inhibitor of NOS, had no effect on basal release of GABA, which indicates again that NO is not significant to basal GABA release. However, NMMA markedly inhibited the release of GABA induced by high potassium, which indicates that NO plays a role in potassium-induced release of GABA. In conditions in which the release of GABA was substantially augmented, there was a reduction in GABA tissue stores as well, suggesting that synthesis of GABA in these conditions did not keep up with release of the amine. Although NO released GABA, there was no effect of the released GABA on NO production, for incubation of MBH explants with GABA had no effect on NO release as measured by [14C]citrulline production. To determine whether GABA had any effect on the release of LHRH from these MBH explants, GABA was incubated with the tissue and the effect on LHRH release was determined. GABA (10(-5) or 10(-6) M) induced a 70% decrease in the release of LHRH, indicating that in the male rat GABA inhibits the release of this hypothalamic peptide. This inhibition in LHRH release induced by GABA was blocked by NMMA (300 microM), which indicates that GABA converts the stimulatory effect of NO on LHRH release into an inhibitory one, presumably via GABA receptors, which activate chloride channels that hyperpolarize the cell. Previous results have indicated that norepinephrine stimulates release of NO from the NOergic neurons, which then stimulates the release of LHRH. The current results indicate that the NO released also induces release of GABA, which then inhibits further LHRH release. Thus, in vivo the norepinephrinergic-driven pulses of LHRH release may be terminated by GABA released from GABAergic neurons via NO.

Biochemical characterization and DNA binding properties of the MocR family member GabR, a PLP-dependent transcription factor

GabR è un fattore di trascrizione chimerico appartenente alla famiglia dei MocR/GabR, costituito da un dominio N-terminale elica-giro-elica di legame al DNA e un dominio effettore e/o di oligomerizzazione al C-terminale. I due domini sono connessi da un linker flessibile di 29 aminoacidi. Il dominio C-terminale è strutturalmente omologo agli enzimi aminotransferasici fold-type I, i quali, utilizzando il piridossal-5’-fosfato (PLP) come cofattore, sono direttamente coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi. L’interazione contemporanea di PLP e acido γ-aminobutirrico (GABA) a GabR fa sì che questa promuova la trascrizione di due geni, gabT e gabD, implicati nel metabolismo del GABA. GabR cristallizza come un omodimero con una configurazione testa-coda. Il legame con la regione promotrice gabTD avviene attraverso il riconoscimento specifico di due sequenze dirette e ripetute (ATACCA), separate da uno spacer di 34 bp. In questo studio sono state indagate le proprietà biochimiche, strutturali e di legame al DNA della proteina GabR di Bacillus subtilis. L’analisi spettroscopica dimostra che GabR interagisce con il PLP formando l’aldimina interna, mentre in presenza di GABA si ottiene l’aldimina esterna. L’interazione fra il promotore gabTD e le forme holo e apo di GabR è stata monitorata mediante Microscopia a Forza atomica (AFM). In queste due condizioni di legame è stata stimata una Kd di circa 40 ηM. La presenza di GABA invece, determinava un incremento di circa due volte della Kd, variazioni strutturali nei complessi GabR-DNA e una riduzione del compattamento del DNA alla proteina, indipendentemente dalla sequenza del promotore in esame. Al fine di valutare il ruolo delle caratteristiche topologiche del promotore, sono state inserite cinque e dieci bp all’interno della regione spacer che separa le due sequenze ripetute dirette riconosciute da GabR. I significativi cambiamenti topologici riscontrati nel frammento aggiunto di cinque bp si riflettono anche sulla forte riduzione dell’affinità di legame verso la proteina. Al contrario, l’inserzione di 10 bp provoca solamente l’allontanamento delle sequenze ripetute dirette. L’assenza quindi di cambiamenti significativi nella topologia di questo promotore fa sì che l’affinità di legame per GabR rimanga pressoché inalterata rispetto al promotore non mutato. L’analisi del potenziale elettrostatico superficiale di GabR mostra la presenza di una fascia carica positivamente che si estende lungo un’intera faccia della proteina. Per verificare l’importanza di questa caratteristica di GabR nel meccanismo di interazione al DNA, sono stati preparati ed indagati i mutanti R129Q e K362-366Q, in cui la carica positiva superficiale risultava indebolita. L’affinità di legame dei mutanti di GabR per il DNA era inferiore rispetto alla proteina non mutata, in particolar modo nel mutante K362-366Q. Le evidenze acquisite suggeriscono che la curvatura intrinseca del promotore ed il corretto orientamento delle sequenze sulla doppia elica, più della distanza che le separa, siano critici per sostenere l’interazione con GabR. Oltre a questo, la superficie positiva di GabR è richiesta per accomodare la curvatura del DNA sul corpo della proteina. Alla luce di questo, l’interazione GabR-gabTD è un esempio di come il riconoscimento specifico di sequenze, la topologia del DNA e le caratteristiche strutturali della proteina siano contemporaneamente necessarie per sostenere un’interazione proteina-DNA stabile.

Identification and characterization of periplasmic proteins implicated in the adaptation of Helicobacter pylori to the human gastric niche

Helicobacter pylori è un batterio Gram-negativo in grado di colonizzare la mucosa gastrica umana e persistere per l'intero arco della vita dell'ospite. E' associato a patologie gastrointestinali, quali gastrite cronica, ulcere gastriche e duodenali, adenocarcinomi e linfomi gastrici. Si tratta di uno dei patogeni più diffusi, presente in circa metà della popolazione mondiale, e il solo che si è adattato a vivere nell'ambiente ostile dello stomaco umano. Molteplici sono i fattori di virulenza che permettono al batterio la colonizzazione della nicchia gastrica e contribuiscono, anche attraverso l' induzione di una risposta infiammatoria, a profonde modificazioni dell' omeostasi gastrica. Queste ultime si associano, ad esempio, all'iperproduzione di fattori proinfiammatori, ad alterazioni sia della regolazione della secrezione acida gastrica sia del ciclo cellulare e della morte cellulare programmata (apoptosi) delle cellule epiteliali gastriche, a disordini nel metabolismo del ferro e a carenze di elementi essenziali. Studi sulla diversità genetica di H. pylori osservata in ceppi isolati da varie regioni del mondo, dimostrano che tale batterio ha avuto una coevoluzione col genere umano attraverso la storia, ed è verosimile che H. pylori sia stato un costituente del microbiota gastrico per almeno 50.000 anni. Scopo della tesi è stato quello di identificare e caratterizzare proteine importanti per la colonizzazione e l'adattamento di H. pylori alla nicchia gastrica. In particolare gli sforzi si sono concentrati su due proteine periplasmatiche, la prima coinvolta nella difesa antiossidante (l'enzima catalasi-like, HP0485), e la seconda nel trasporto di nutrienti presenti nell'ambiente dello stomaco all'interno della cellula (la componente solubile di un ABC transporter, HP0298). La strategia utilizzata prevede un'analisi bioinformatica preliminare, l'ottenimento del gene per amplificazione, mediante PCR, dal genoma dell'organismo, la costruzione di un vettore per il clonaggio, l'espressione eterologa in E. coli e la successiva purificazione. La proteina così ottenuta viene caratterizzata mediante diverse tecniche, quali spettroscopia UV, dicroismo circolare, gel filtrazione analitica, spettrometria di massa. Il capitolo 1 contiene un'introduzione generale sul batterio, il capitolo 2 e il capitolo 3 descrivono gli studi relativi alle due proteine e sono entrambi suddivisi in un abstract iniziale, un'introduzione, la presentazione dei risultati, la discussione di questi ultimi, i materiali e i metodi utilizzati. La catalasi-like (HP0485) è una proteina periplasmatica con struttura monomerica, appartenente ad una famiglia di enzimi a funzione per la maggior parte sconosciuta, ma evolutivamente correlati alla ben nota catalasi, attore fondamentale nella difesa di H. pylori, grazie alla sua azione specifica di rimozione dell'acqua ossigenata. HP0485, pur conservando il fold catalasico e il legame al cofattore eme, non può compiere la reazione di dismutazione dell'acqua ossigenata; possiede invece un'attività perossidasica ad ampio spettro, essendo in grado di accoppiare la riduzione del perossido di idrogeno all'ossidazione di diversi substrati. Come la catalasi, lavora ad alte concentrazioni di aqua ossigenata e non arriva a saturazione a concentrazioni molto elevate di questo substrato (200 mM); la velocità di reazione catalizzata rimane lineare anche a questi valori, aspetto che la differenzia dalle perossidasi che vengono in genere inattivate da concentrazioni di perossido di idrogeno superiori a 10-50 mM. Queste caratteristiche di versatilità e robustezza suggeriscono che la catalasi-like abbia un ruolo di scavenger dell'acqua ossigenata e probabilmente anche un'altra funzione connessa al suo secondo substrato, ossia l'ossidazione di composti nello spazio periplasmatico cellulare. Oltre alla caratterizzazione dell'attività è descritta anche la presenza di un ponte disolfuro, conservato nelle catalasi-like periplasmatiche, con un ruolo nell'assemblaggio dell'eme per ottenere un enzima attivo e funzionale. La proteina periplasmatica HP0298, componente di un sistema di trasporto ABC, è classificata come trasportatore di dipeptidi e appartiene a una famiglia di proteine in grado di legare diversi substrati, tra cui di- e oligopeptidi, nichel, eme, glutatione. Benchè tutte associate a trasportatori di membrana batterici, queste proteine presentano un dominio di legame al substrato che risulta essere conservato nei domini extracellulari di recettori specifici di mammifero e uomo. Un esempio sono i recettori ionotropici e metabotropici del sistema nervoso. Per caratterizzare questa proteina è stato messo a punto un protocollo di ligand-fishing accoppiato alla spettrometria di massa. La proteina purificata, avente un tag di istidine, è stata incubata con un estratto cellulare di H. pylori per poter interagire con il suo substrato specifico all'interno dell'ambiente naturale in cui avviene il legame. Il complesso proteina-ligando è stato poi purificato per cromatografia di affinità e analizzato mediante HPLC-MS. L'identificazione dei picchi differenziali tra campioni con la proteina e 5 campioni di controllo ha portato alla caratterizzazione di pentapeptidi particolarmente ricchi in aminoacidi idrofobici e con almeno un residuo carico negativamente. Considerando che H. pylori necessita di alcuni aminoacidi essenziali, per la maggior parte idrofobici, e che lo stomaco umano è particolarmente ricco di peptidi prodotti dalla digestione delle proteine introdotte con il cibo, il ruolo fisiologico di HP0298 potrebbe essere l'internalizzazione di peptidi, con caratteristiche specifiche di lunghezza e composizione, che sono naturalmente presenti nella nicchia gastrica.

Estudio cronobiológico de la respuesta farmacológica y la variación de parámetros hemodinámicos de la combinación etomidato-Midazolam en perros y gatos

Una doctrina fundamental de la biología, la medicina, la fisiología o la farmacología es la relativa constancia del medio biológico interno (Homeostasis). Las variables homeostáticas no se mantienen a un nivel constante, sino dentro de un cierto intervalo de valores repetidos a intervalos regulares (Ritmos Biológicos); cuando dicho ciclo se cumple en un periodo de 24 h se denomina Ritmo Circadiano. Los sincronizadores que definen este ritmo son, entre otros, la alternancia luz-oscuridad o la rutina de sueño (descanso-actividad). La Cronobiología estudia los ritmos biológicos y sus mecanismos de cronometraje, determinando la influencia que los mismos pueden ejercer en los seres vivos. La Cronofarmacología, a su vez, estudia los efectos de los fármacos en función del ritmo circadiano (bien por alteraciones en su cinética: cronofarmacocinética; o en su dinamia: cronofarmacodinamia), determinando el período decisivo de su administración, para conseguir un aumento de su eficacia y/o disminución de sus efectos adversos. Estas alteraciones son, particularmente, importantes en aquellos grupos farmacológicos más críticos como los anestésicos, ya que existen diferencias en la capacidad anestesia dependientes de la hora del día en que se administran estos fármacos. El etomidato es un agente anestésico no barbitúrico de acción rápida, recomendado para la inducción anestésica en animales que presentan patologías que comprometen su estabilidad hemodinámica, ya que no provoca alteraciones severas en el sistema cardiovascular o en la presión intracraneal. Actúa facilitando la transmisión mediada por GABA, al interactuar con una zona alostérica del complejo receptor GABA – ionóforo Cl-...

Low doses of ivermectin cause sensory and locomotor disorders in dung beetles

Ivermectin is a veterinary pharmaceutical generally used to control the ecto- and endoparasites of livestock, but its use has resulted in adverse effects on coprophilous insects, causing population decline and biodiversity loss. There is currently no information regarding the direct effects of ivermectin on dung beetle physiology and behaviour. Here, based on electroantennography and spontaneous muscle force tests, we show sub-lethal disorders caused by ivermectin in sensory and locomotor systems of Scarabaeus cicatricosus, a key dung beetle species in Mediterranean ecosystems. Our findings show that ivermectin decreases the olfactory and locomotor capacity of dung beetles, preventing them from performing basic biological activities. These effects are observed at concentrations lower than those usually measured in the dung of treated livestock. Taking into account that ivermectin acts on both glutamate-gated and GABA-gated chloride ion channels of nerve and muscle cells, we predict that ivermectin’s effects at the physiological level could influence many members of the dung pat community. The results indicate that the decline of dung beetle populations could be related to the harmful effects of chemical contamination in the dung.

BASES NEUROBIOLOGICAS DE LA FORMACION DE MEMORIAS TRAUMATICAS EN MODELOS ANIMALES: APROXIMACIÓN FARMACOLOGICA PARA SU REVERSION

La hipótesis de la reconsolidación propone que una memoria consolidada entra nuevamente en un estado lábil seguido por un nuevo proceso de estabilización dependiente de síntesis de proteínas, definido como reconsolidación. Durante el proceso de desestabilización, la traza puede actualizarse incorporando nueva información ajustándose a nuevas exigencias ambientales. Esta visión le otorga a la memoria una propiedad flexible y dinámica, contrariamente a lo sugerido por la clásica teoría de la consolidación que definía el trazo de memoria como algo inflexible e inmutable. La reconsolidación de la memoria consta de dos fases: un proceso de labilización o desestabilización, seguido de una fase de re-estabilización. Evidencias recientes de nuestro laboratorio sugieren que la ocurrencia de un estado emocional negativo, como el generado por un evento traumático (estrés) reduce la vulnerabilidad de la traza durante la evocación, es decir la memoria bajo estas condiciones se vuelve resistente a la interferencia y disminuye las probabilidades de la ocurrencia de la reconsolidación. La abstinencia al etanol genera un estado emocional negativo de características similares al generado por estrés en el complejo basolateral de la Amígdala (BLA). El presente proyecto está dirigido a estudiar los mecanismos neurobiológicos implicados en la memoria resistente, en dos áreas cerebrales críticamente involucradas en la memoria de miedo contextual: BLA y el hipocampo dorsal (HD). Se verificará la reactividad a los agentes interferentes (Midazolam y Propranolol) sobre la reconsolidación tanto en animales estresados como en abstinentes. Además, estudiaremos la expresión de las subunidades de receptores NMDA y GABA-A en las áreas mencionadas. Además nos proponemos re-establecer la capacidad dinámica de la traza con herramientas farmacológicas como la infusión local de un agonista parcial de receptores NMDA. Bajo este esquema hipotético, este tratamiento permitirá re-establecer las propiedades biológicas que definen el proceso de labilización/reconsolidación, con la recuperación de la vulnerabilidad a los agentes interferentes de esta fase ante la presentación del recordatorio. En síntesis, proponemos que los cambios originados por la instauración de un estado emocional negativo modelan la dinámica de la memoria resultante al momento de la evocación. Listado de abreviaturas usadas: BLA: Complejo basolateral de la amígdala HD: hipocampo dorsal R-NMDA: receptores NMDA R-GABAA: receptores GABAA MDZ: Midazolam PROP: propranolol DCS: d-cycloserina

Psicoses em patologias não psiquiátricas

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

Role of the cotransporter KCC2 in cortical excitatory synapse development and febrile seizure susceptibility

Le co-transporteur KCC2 spécifique au potassium et chlore a pour rôle principal de réduire la concentration intracellulaire de chlore, entraînant l’hyperpolarisation des courants GABAergic l’autorisant ainsi à devenir inhibiteur dans le cerveau mature. De plus, il est aussi impliqué dans le développement des synapses excitatrices, nommées aussi les épines dendritiques. Le but de notre projet est d’étudier l’effet des modifications concernant l'expression et la fonction de KCC2 dans le cortex du cerveau en développement dans un contexte de convulsions précoces. Les convulsions fébriles affectent environ 5% des enfants, et ce dès la première année de vie. Les enfants atteints de convulsions fébriles prolongées et atypiques sont plus susceptibles à développer l’épilepsie. De plus, la présence d’une malformation cérébrale prédispose au développement de convulsions fébriles atypiques, et d’épilepsie du lobe temporal. Ceci suggère que ces pathologies néonatales peuvent altérer le développement des circuits neuronaux irréversiblement. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne sont pas encore compris. Nous avons pour but de comprendre l'impact des altérations de KCC2 sur la survenue des convulsions et dans la formation des épines dendritiques. Nous avons étudié KCC2 dans un modèle animal de convulsions précédemment validé, qui combine une lésion corticale à P1 (premier jour de vie postnatale), suivie d'une convulsion induite par hyperthermie à P10 (nommés rats LHS). À la suite de ces insultes, 86% des rats mâles LHS développent l’épilepsie à l’âge adulte, au même titre que des troubles d’apprentissage. À P20, ces animaux presentent une augmentation de l'expression de KCC2 associée à une hyperpolarisation du potentiel de réversion de GABA. De plus, nous avons observé des réductions dans la taille des épines dendritiques et l'amplitude des courants post-synaptiques excitateurs miniatures, ainsi qu’un déficit de mémoire spatial, et ce avant le développement des convulsions spontanées. Dans le but de rétablir les déficits observés chez les rats LHS, nous avons alors réalisé un knock-down de KCC2 par shARN spécifique par électroporation in utero. Nos résultats ont montré une diminution de la susceptibilité aux convulsions due à la lésion corticale, ainsi qu'une restauration de la taille des épines. Ainsi, l’augmentation de KCC2 à la suite d'une convulsion précoce, augmente la susceptibilité aux convulsions modifiant la morphologie des épines dendritiques, probable facteur contribuant à l’atrophie de l’hippocampe et l’occurrence des déficits cognitifs. Le deuxième objectif a été d'inspecter l’effet de la surexpression précoce de KCC2 dans le développement des épines dendritiques de l’hippocampe. Nous avons ainsi surexprimé KCC2 aussi bien in vitro dans des cultures organotypiques d’hippocampe, qu' in vivo par électroporation in utero. À l'inverse des résultats publiés dans le cortex, nous avons observé une diminution de la densité d’épines dendritiques et une augmentation de la taille des épines. Afin de confirmer la spécificité du rôle de KCC2 face à la région néocorticale étudiée, nous avons surexprimé KCC2 dans le cortex par électroporation in utero. Cette manipulation a eu pour conséquences d’augmenter la densité et la longueur des épines synaptiques de l’arbre dendritique des cellules glutamatergiques. En conséquent, ces résultats ont démontré pour la première fois, que les modifications de l’expression de KCC2 sont spécifiques à la région affectée. Ceci souligne les obstacles auxquels nous faisons face dans le développement de thérapie adéquat pour l’épilepsie ayant pour but de moduler l’expression de KCC2 de façon spécifique.