Biochemical characterization and DNA binding properties of the MocR family member GabR, a PLP-dependent transcription factor

GabR è un fattore di trascrizione chimerico appartenente alla famiglia dei MocR/GabR, costituito da un dominio N-terminale elica-giro-elica di legame al DNA e un dominio effettore e/o di oligomerizzazione al C-terminale. I due domini sono connessi da un linker flessibile di 29 aminoacidi. Il dominio C-terminale è strutturalmente omologo agli enzimi aminotransferasici fold-type I, i quali, utilizzando il piridossal-5’-fosfato (PLP) come cofattore, sono direttamente coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi. L’interazione contemporanea di PLP e acido γ-aminobutirrico (GABA) a GabR fa sì che questa promuova la trascrizione di due geni, gabT e gabD, implicati nel metabolismo del GABA. GabR cristallizza come un omodimero con una configurazione testa-coda. Il legame con la regione promotrice gabTD avviene attraverso il riconoscimento specifico di due sequenze dirette e ripetute (ATACCA), separate da uno spacer di 34 bp. In questo studio sono state indagate le proprietà biochimiche, strutturali e di legame al DNA della proteina GabR di Bacillus subtilis. L’analisi spettroscopica dimostra che GabR interagisce con il PLP formando l’aldimina interna, mentre in presenza di GABA si ottiene l’aldimina esterna. L’interazione fra il promotore gabTD e le forme holo e apo di GabR è stata monitorata mediante Microscopia a Forza atomica (AFM). In queste due condizioni di legame è stata stimata una Kd di circa 40 ηM. La presenza di GABA invece, determinava un incremento di circa due volte della Kd, variazioni strutturali nei complessi GabR-DNA e una riduzione del compattamento del DNA alla proteina, indipendentemente dalla sequenza del promotore in esame. Al fine di valutare il ruolo delle caratteristiche topologiche del promotore, sono state inserite cinque e dieci bp all’interno della regione spacer che separa le due sequenze ripetute dirette riconosciute da GabR. I significativi cambiamenti topologici riscontrati nel frammento aggiunto di cinque bp si riflettono anche sulla forte riduzione dell’affinità di legame verso la proteina. Al contrario, l’inserzione di 10 bp provoca solamente l’allontanamento delle sequenze ripetute dirette. L’assenza quindi di cambiamenti significativi nella topologia di questo promotore fa sì che l’affinità di legame per GabR rimanga pressoché inalterata rispetto al promotore non mutato. L’analisi del potenziale elettrostatico superficiale di GabR mostra la presenza di una fascia carica positivamente che si estende lungo un’intera faccia della proteina. Per verificare l’importanza di questa caratteristica di GabR nel meccanismo di interazione al DNA, sono stati preparati ed indagati i mutanti R129Q e K362-366Q, in cui la carica positiva superficiale risultava indebolita. L’affinità di legame dei mutanti di GabR per il DNA era inferiore rispetto alla proteina non mutata, in particolar modo nel mutante K362-366Q. Le evidenze acquisite suggeriscono che la curvatura intrinseca del promotore ed il corretto orientamento delle sequenze sulla doppia elica, più della distanza che le separa, siano critici per sostenere l’interazione con GabR. Oltre a questo, la superficie positiva di GabR è richiesta per accomodare la curvatura del DNA sul corpo della proteina. Alla luce di questo, l’interazione GabR-gabTD è un esempio di come il riconoscimento specifico di sequenze, la topologia del DNA e le caratteristiche strutturali della proteina siano contemporaneamente necessarie per sostenere un’interazione proteina-DNA stabile.

GabR is a chimeric transcriptional regulator belonging to the novel MocR/GabR family, characterized by a short N-terminal helix-turn-helix DNA-binding domain and a long Cterminal effector binding and/or oligomerization domain connected by a 29 amino acids flexible linker. The C-terminal domain is structurally homologous to the fold-type I aminotransferases, a group of enzymes involved in amino acids metabolism that use pyridoxal 5'-phosphate (PLP) as a cofactor. In the presence of γ-aminobutyrate (GABA) and PLP, GabR activates the transcription of the gabT and gabD genes, which encode two enzymes involved in GABA metabolism. GabR crystalized as a head-to-tail domain-swap homodimer and binds two hexameric direct repeats (ATACCA) separated by a 34 bp spacer at the gabTD promoter. This thesis reports the biochemical, structural and DNA binding properties of Bacillus subtilis GabR. Spectroscopic analysis indicates that GabR binds PLP as an internal aldimine and reacts with GABA to form the external aldimine. GabR-gabTD binding reactions imaged employing Atomic Force Microscopy (AFM) suggests that both holo- GabR and apo-GabR bind the cognate DNA site as a dimer with Kd of about 40 nM. Conversely, in presence of GABA conformational rearrangements of the nucleoprotein complexes, reduction of the DNA wrapping around GabR and a two-fold increase of the Kd were observed, independently form the sequence of the gabTD promoter investigated. To evaluate the role of the DNA topology on the binding of GabR, five and ten bp were inserted within the spacer region, separating the direct repeat sequences. The intrinsic bending of the gabTD promoter region was strongly modified by the insertion of five bp, whereas the insertion of ten bp caused only an increase of the distance between the GabR binding sequences. Interestingly, the insertion of five bp determined a significant loss of affinity, whereas the ten bp insertion had only a slight effect on binding. Electrostatic potential analysis of GabR protein surface showed a positive groove that extends along one entire protein face. To investigate the relevance of this feature on DNAbinding, we constructed the GabR R129Q and K362-366Q mutants, in which the surface positive charge was weakened. DNA binding affinity decreased in both GabR mutants, particularly in GabR K362-366Q for which DNA binding was lost. II Together, our results suggest that the GabR binding at the gabTD promoter relies on the intrinsic DNA bending and the correct orientation of the two binding hexamers rather than on their distance. The positive GabR surface is also critical to accommodate or to favor DNA bending on the protein core. Accordingly, the GabR-gabTD binding could be a typical example in which specific binding site recognition, DNA topology and protein structural and superficial electrostatic features, are simultaneously required to assemble a stable protein-DNA complex.