Prevalência de resistência a antimicrobianos em isolados ambientais de Escherichia coli e enterococos

A água é um recurso escasso e indispensável à vida, podendo ser um importante veículo de microrganismos patogénicos com origem fecal. A matéria fecal é também uma fonte de microrganismos resistentes a antimicrobianos e contribui para a sua disseminação e dos seus genes de resistência no ambiente e entre as comunidades microbianas comensais e microrganismos patogénicos humanos e animais. A qualidade microbiológica da água é monitorizada recorrendo à utilização de bioindicadores como Escherichia coli, enterococos e microrganismos totais. O presente estudo apresentou como principal objetivo determinar a prevalência de ESBLs e AmpCs e ainda avaliar a prevalência de estirpes de enterococos com resistência à vancomicina (VRE) em águas do rio Douro e da orla costeira da cidade do Porto. As amostragens de água foram realizadas em quatro locais localizados no estuário do rio Douro e orla costeira da cidade do Porto entre o mês de Abril e Julho. A deteção e quantificação dos bioindicadores foram realizadas pelo método de filtração por membrana. A suscetibilidade das estirpes de E. coli e enterococos foi testada pelo método de difusão em disco relativamente a várias classes de antimicrobianos. As contagens microbianas mais elevadas foram determinadas entre Abril e Junho e em amostras de água doce. Foram isoladas 62 estirpes de E. coli e 49 estirpes de enterococos que apresentaram prevalências de resistência a antimicrobianos de 90,3% (56/62) e 83,7% (41/49), respetivamente. As estirpes de E. coli apresentaram altas frequências de resistência à ampicilina (74,2%) e tetraciclina (61,3%). Nestas estirpes verificou-se ainda fenótipos associados a multirresistência a um mínimo de três classes de antimicrobianos em 56,5% (35/62) dos isolados. Verificou-se que as estirpes de enterococos apresentaram altos níveis de resistência à rifampicina (34,7%) e azitromicina (40,8%), detetando-se ainda a manifestação de fenótipo de resistência à vancomicina em 26,5% das estirpes. Observou-se uma prevalência de 36,7% (18/49) de estirpes de enterococos associadas a fenómenos de multirresistência antimicrobiana. Ana Martins vi Os resultados obtidos sugerem que o rio Douro e orla costeira, bem como os ambientes aquáticos, constituem reservatórios de bactérias e genes de resistência a antimicrobianos e possuem um papel preponderante na sua disseminação.

Caracterização molecular da resistência a antimicrobianos em Escherichia coli produtoras de β-lactamases de espectro alargado isoladas em cães e estudo da partilha de clones bacterianos entre animais de companhia e coabitantes humanos

A pressão seletiva originada pelo uso excessivo de antimicrobianos na medicina humana e veterinária tem contribuído para a emergência de estirpes bacterianas multirresistentes, sendo os estudos mais escassos relativamente à sua presença nos animais de companhia. Porque os animais e os seus proprietários partilham o mesmo espaço habitacional, apresentando comportamentos de contacto próximo, existe uma hipótese elevada de transferência microbiana inter-espécie. Ante esta possibilidade é importante escrutinar o papel dos animais de companhia enquanto reservatórios de estirpes e de genes de resistência, bem como a sua envolvência na disseminação de estirpes bacterianas multirresistentes. Importa também, investigar o papel das superfícies e objetos domésticos partilhados por ambos, como potenciadores deste fenómeno. O objetivo deste trabalho foi, identificar o filogrupo e fazer a caracterização molecular dos genes que conferem resistência aos β-lactâmicos e às quinolonas, em quarenta isolados de Escherichia coli produtoras de β-lactamases de espectro alargado (ESBL), obtidas em zaragatoas fecais de cães consultados no Hospital Veterinário do ICBAS-UP. Complementarmente pretendeu-se inferir sobre a partilha de clones de Escherichia coli e Enterococcus spp. com elevadas resistências, em cinco agregados familiares (humanos e seus animais de companhia) assim como avaliar a potencial disseminação de estirpes multirresistentes no ambiente doméstico. Previamente foram recolhidas zaragatoas de fezes, pelo e mucosa oral dos animais e em alguns casos, dos seus proprietários, e ainda do ambiente doméstico. As zaragatoas foram processadas e as estirpes isoladas com base em meios seletivos. Foram realizados testes de suscetibilidade antimicrobiana de modo a estabelecer o fenótipo de resistência de cada isolado. O DNA foi extraído por varias metodologias e técnicas de PCR foram utilizadas para caracterização de filogrupos (Escherichia coli) e identificação da espécie (Enterococcus spp.). A avaliação da proximidade filogenética entre isolados foi efetuada por ERIC PCR e PFGE. No conjunto de quarenta isolados produtores de ESBL e/ou resistentes a quinolonas verificou-se que 47,5% pertenciam ao filogrupo A, havendo uma menor prevalência do filogrupo D (25,0%), B1 (17,5%), e B2 (10,0%).A frequência de resistência nestes isolados é factualmente elevada, sendo reveladora de uma elevada pressão seletiva. Com exceção de dois isolados, os fenótipos foram justificados pela presença de β-lactamases. A frequência da presença de genes foi: 47% blaTEM, 34% blaSHV, 24% blaOXA , 18% blaCTX-M-15, 8% blaCTX-M-2, 3% blaCTX-M-9. Nos isolados resistentes às quinolonas verificou-se maioritariamente a presença de mutações nos genes cromossomais gyrA e parC, e em alguns casos a presença de um determinante de resistência mediado por plasmídeo – qnrS. Nos cinco “agregados familiares” (humanos e animais) estudados foi observada uma partilha frequente de clones de E. coli e Enterococcus faecalis com múltiplas resistências, isolados em fezes e mucosa oral de cães e gatos e fezes e mãos dos respetivos proprietários, evidenciando-se assim uma possível transferência direta entre coabitantes (agregados A, C, D, E). Ficou também comprovado com percentagens de similaridade genotípica superiores a 94% que essa disseminação também ocorre para o ambiente doméstico, envolvendo objetos dos animais e de uso comum (agregados A, E). Os resultados obtidos reforçam a necessidade de um uso prudente dos antimicrobianos, pois elevados padrões de resistências terão um impacto não só na qualidade de vida dos animais mas também na saúde humana. Adicionalmente importa sensibilizar os proprietários para a necessidade de uma maior vigilância relativamente às formas de interação com os animais, bem como para a adoção de medidas higiénicas cautelares após essa mesma interação.

Resistência a β-lactâmicos em Acinetobacter spp isolados de efluente hospitalar no sul do Brasil

Acinetobacter spp é um importante patógeno causador de infecções nosocomiais que acomete pacientes imunocomprometidos e capaz de adquirir resistência a antimicrobianos com facilidade. Os esgotos hospitalares são importantes disseminadores de genes de resistência a antimicrobianos para a microbiota ambiental. Neste contexto, 30 cepas de Acinetobacter spp provenientes de efluente de um hospital em Porto Alegre, RS, foram analisados quanto ao perfil de susceptibilidade a β-lactamases, quinolonas e aminoglicosídeos através de antibiograma e testes de triagem para metalo beta-lactamases e β-lactamases de espectro estendido. O perfil encontrado revela cepas multi-resistentes e que mecanismos de resistência como a produção de β-lactamases de espectro estendido e bombas de efluxo podem estar presentes nesses isolados.

Introducing resistance genes against ToMV, TYLCV and TSWV infections in two tomato varieties (Muchamiel and De la Pera)

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas

Genética da resistência à ferrugem-da-folha em aveia

A ferrugem-da-folha (Puccinia coronata f. sp. avenae) é a principal doença da cultura da aveia (Avena sativa L.), e o uso de cultivares resistentes é o método de controle mais importante. Este trabalho teve por objetivo determinar o controle genético da resistência à ferrugem-da-folha em aveia e identificar fontes de genes diferentes para resistência a esta doença. Foram utilizados três genótipos resistentes (UFRGS 15, UFRGS 881920 e UFRGS 86A1194-2), três genótipos suscetíveis (UFRGS 7, UFRGS 8 e UFRGS 14) e a geração segregante F3 proveniente dos cruzamentos entre estes genótipos. As plantas foram avaliadas individualmente quanto à presença ou ausência da ferrugem-da-folha, sendo os dados destas leituras utilizados numa análise genética em que a hipótese de um ou dois genes de resistência foi testada pelo qui-quadrado. Os resultados evidenciaram um gene dominante de resistência no genótipo UFRGS 881920 e dois genes complementares no genótipo UFRGS 15 quando estes foram cruzados com os suscetíveis. A análise genética feita não permitiu determinar se estes dois genótipos são ou não a mesma fonte genética de resistência.

Comportamento de somaclones de arroz derivados de híbridos da geração F1 para resistência à brusone

A indução de variabilidade genética em relação à resistência à brusone, utilizando cultura de tecidos como material, constitui uma das alternativas para a obtenção de novas fontes de genes de resistência. O objetivo deste estudo foi aumentar a freqüência de variantes usando como explante panículas imaturas da geração F1 de cruzamentos envolvendo fontes altamente suscetíveis e moderadamente resistentes à brusone como parentais. Somaclones de arroz derivados de plantas F1 dos cruzamentos Bluebelle/Araguaia e Maratelli/Basmati-370 foram avaliados, nas gerações avançadas, quanto à resistência à brusone e a algumas características agronômicas. Nos testes de inoculações em casa de vegetação, todos os somaclones, de ambos os cruzamentos, na geração R4, apresentaram alto grau de resistência aos patótipos IB-1 e IB-9. Alguns dos somaclones mantiveram-se resistentes na geração R5, em avaliações realizadas com alta pressão de brusone. No campo, os somaclones R5 e R6 mostraram alta freqüência de variação quanto à resistência à doença, altura da planta, produtividade, peso e tipo de grãos. Dois somaclones derivados do cruzamento Bluebelle/Araguaia e 31 somaclones derivados do cruzamento Maratelli/Basmati-370 foram identificados como novas fontes de resistência à brusone, e podem ser utilizados no programa de melhoramento de arroz irrigado.

Análise multivariada dos componentes da resistência à ferrugem-asiática em genótipos de soja

O objetivo deste trabalho foi detalhar os ciclos de infecção da Phakopsora pachyrhizi Syd. & P. Syd. em genótipos de soja, para o estabelecimento de grupos de genótipos mais promissores para o uso como fontes de resistência à ferrugem. Os componentes do ciclo de infecção foram quantificados em 48 genótipos. Foram avaliados: tipo de lesão, intensidade de esporulação, severidade, número de lesões e de urédias e produtividade de urediniósporos. Pela análise de agrupamentos, formaram-se quatro grupos: A - desenvolveu a maior quantidade de doença; B - desenvolveu a menor quantidade de doença; C - baixa resistência inicial e D - alta resistência inicial. Os genótipos dos grupos B, C e D apresentaram lesões RB ("redish-brown") e variaram quanto à resistência inicial, resistência tardia, intensidade de esporulação, estabilidade da resposta qualitativa, produtividade de urediniósporos e número de dias para atingir 50% da severidade máxima. Entre as variáveis analisadas, as que apresentaram importância prática foram as avaliações das respostas qualitativas e as de severidade. Esta última reflete os efeitos combinados de resistência sobre todos os componentes da infecção e apresentam importância prática na diferenciação de genótipos, quanto à resistência à doença. Os genótipos dos grupos B, C e D manifestaram resistência qualitativa e quantitativa, em diferentes graus, e promissores para serem utilizados como fontes de genes de resistência à ferrugem-asiática-da-soja.

Marcadores moleculares derivados de sequências expressas do genoma café potencialmente envolvidas na resistência à ferrugem

O objetivo deste trabalho foi identificar marcadores moleculares relacionados à resistência do cafeeiro (Coffea arabica) à ferrugem (Hemileia vastatrix). Foram identificadas sequências de DNA potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro a doenças, por meio de análise "in silico", a partir das informações geradas pelo Projeto Brasileiro do Genoma Café. A partir das sequências mineradas, foram desenhados 59 pares de iniciadores para amplificá-las. Os 59 iniciadores foram testados em 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a H. vastatrix. Vinte e sete iniciadores resultaram em bandas únicas e bem definidas, enquanto um deles amplificou fragmento de DNA em todos os cafeeiros resistentes, mas não nos suscetíveis. Esse marcador molecular polimórfico amplificou uma região do DNA que corresponde a uma janela aberta de leitura parcial do genoma de C. arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças. O marcador CARF 005 é capaz de diferenciar os cafeeiros analisados em resistentes e susceptíveis a H. vastatrix.

Fontes de resistência múltipla à murcha de fusário em tomateiro

Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a reação de 48 acessos de tomateiro (Solanum lycopersicum), inclusive de espécies selvagens, a diferentes isolados das três raças de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL). Utilizaram-se marcadores moleculares ligados aos genes de resistência I-1, I-2 e I-3. A combinação de bioensaios e marcadores moleculares específicos mostrou elevada correlação para a maioria dos acessos. Acessos de S. peruvianum e S. corneliomuelleri apresentaram resistência contra todas as raças de FOL; a introgressão de fatores de resistência destes genótipos em germoplasma-elite de tomateiro é de elevado interesse para o melhoramento genético desta cultura.

Resistência genética dos acessos do banco de germoplasma de macieira da epagri à mancha foliar de glomerella (Colletotrichum gloeosporioides)

Uma das prioridades do Programa de Melhoramento Genético de Macieira da Epagri é a obtenção de cultivares resistentes à mancha foliar de glomerella - MFG, doença essa causada principalmente pela espécie Colletotrichum gloeosporioides, que tem causado elevadas perdas na produção. Os resultados obtidos neste estudo têm, dentre outras, a finalidade de subsidiar os programas de melhoramento genético da macieira na seleção de parentais, objetivando a incorporação de resistência genética à MFG nas futuras novas cultivares. Para tanto, o primeiro passo é a identificação de germoplasma portador dos genes de resistência. No presente trabalho, foram utilizados 3 isolados de C. gloeosporioides provenientes de diferentes regiões produtoras de maçã. Estes isolados foram inoculados em 245 acessos pertencentes ao Banco de Germoplasma de Macieira - BGM, da Epagri / Estação Experimental de Caçador - EECd, SC. Para a inoculação em tecido foliar, a concentração de conídios foi ajustada para 10³ esporos/mL. Após 72h de incubação, sob temperatura de 25ºC, foi realizada a avaliação da incidência para presença ou ausência de sintomas e para a severidade da doença. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com três repetições. As diferenças de severidade entre os acessos foram testadas através da Anova não paramétrica Kruskal Wallis. Entre os acessos testados, 187 (76,3%) manifestaram resistência e 58 (23,7%) suscetibilidade à MFG. Entre as cultivares suscetíveis, não houve diferença no grau de severidade de ataque da MFG.

Herança da resistência à mancha-angular do feijoeiro e identificação de marcadores moleculares flanqueando o loco de resistência

A mancha-angular, cujo agente causal é o fungo Phaeoisariopsis griseola, é uma das principais doenças do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris). Os marcadores moleculares disponíveis ainda não são suficientes para monitorar todos os genes de resistência a essa doença. Por isso, objetivou-se neste trabalho estudar a herança da resistência aos patótipos 63.39 e 31.23 de P. griseola, em populações derivadas de 'Ouro Negro' (ON) e 'US Pinto 111' (PT), e identificar marcadores moleculares ligados a genes de resistência presentes nessas cultivares. Quando inoculadas com o patótipo 63.39, as plantas ON, F1 (ON x PT) e 3/4 da população F2 mostraram-se resistentes enquanto que PT e 1/4 da população F2 foram suscetíveis. Quando inoculadas com o patótipo 31.23, as plantas PT e 1/4 das famílias F2:3 foram resistentes e todas as demais, suscetíveis. Esses dados indicam que a resistência proveniente de ON é conferida por um gene dominante enquanto que a de PT, por um recessivo. Esses dois genes segregaram independentemente. Amostras de DNA das plantas F2 foram amplificadas pela técnica de RAPD (random amplified polymorphic DNA) de acordo com a estratégia de análise de bulks segregantes. Foram identificados os marcadores OPM02(460C) e OPAA19(600C,) respectivamente a 5,3 e 10 centimorgans (cM) do loco de resistência proveniente de ON. Eles flanqueiam este loco e, quando empregados simultaneamente, proporcionam uma eficiência de seleção de 97,4%. Não foram identificados marcadores para o loco de resistência proveniente de PT.

Resistência de cultivares de feijoeiro-comum à ferrugem e à mancha-angular em condições de casa de vegetação

Foram inoculadas 17 cultivares de feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris) recomendadas para plantio em Minas Gerais com cinco patótipos (6, 7, 9, 10 e 12) de Uromyces appendiculatus e cinco (63.55, 31.23, 63.39, 31.55 e 63.23) de Phaeoisariopsis griseola. Foi conduzido um ensaio separadamente para cada um dos patótipos dos dois patógenos, totalizando 10 ensaios. Nos ensaios de ferrugem foi avaliada a freqüência de infecção (FI) e estimado o tamanho médio das pústulas (TMP) e, nos ensaios de mancha-angular foram avaliados os sintomas utilizando uma escala de notas variando de 1 a 9. A maioria das cultivares se mostrou suscetível a pelo menos três dos cinco patótipos de ferrugem. As cultivares mais suscetíveis foram Roxo 90 e Meia Noite e a mais resistente foi a Ouro Negro, a qual apresentou proteção completa aos cinco patótipos testados. Com relação à mancha angular, além do Roxo 90, as cultivares Carioca MG, Pérola, Carioca 1030 e Aporé, extensivamente plantadas em Minas Gerais, foram altamente suscetíveis. As cultivares Ouro Negro e EMGOPA 201-Ouro apresentaram genes de resistência a diferentes patótipos e a combinação desses genes em uma nova cultivar resultaria em resistência a todos os patótipos testados.

Identificação de marcadores RAPD ligados a um gene de resistência ao cancro da haste da soja

O cancro da haste da soja (Glycine max) é uma importante doença causada pelo fungo Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis/Phomopsis phaseoli f. sp. meridionalis. Visando identificar marcadores RAPD associados a genes de resistência ao cancro da haste, causado pelo isolado CH8, presentes na linhagem UFV 91-61, foi realizado, inicialmente, um estudo sobre a herança da resistência, por meio do cruzamento desta linhagem com a variedade suscetível Paranaíba. Os resultados indicaram que um gene dominante controla a resistência a este isolado. Através de análises com marcadores moleculares na população F2 foram identificados dois marcadores RAPD produzidos pela amplificação do primer OPAB19. Os dois fragmentos de DNA de aproximadamente 1.150 e 1.320 pb produzidos por este primer estão ligadas em fases de repulsão e acoplamento, respectivamente, a uma distância de 4,7 cM do gene de resistência da linhagem UFV 91-61. Estes marcadores poderão ser usados para monitorar a introgressão deste gene em cultivares de soja adaptados e abre a possibilidade de uma sistemática procura de marcadores ligados a outros genes de resistência para o cancro da haste da soja, os quais poderiam ser posteriormente piramidados num único background genético.

Herança da resistência à antracnose na cultivar de feijoeiro comum Cornell 49-242

A cultivar de feijoeiro (Phaseolus vulgaris) Cornell 49-242, possuidora do gene de resistência Co-2 (Are), é uma das mais antigas fontes de resistência à antracnose, causada por Colletotrichum lindemuthianum. Visando a utilização desta fonte no programa de piramidação de genes em cultivares do tipo "carioca" do BIOAGRO/UFV, este trabalho teve como objetivos: (1) definir o padrão de herança da resistência da cultivar de feijoeiro Cornell 49-242 em cruzamentos com cultivares suscetíveis às raças 81 (Rudá) e 65 (Rudá e Ouro Negro) de C. lindemuthianum e (2) avaliar o marcador RAPD OPQ04(1440C) ligado ao gene Co-2 em populações F2 do cruzamento Rudá vs. Cornell 49-242. Os resultados indicaram que três genes dominantes, sendo dois de caráter complementar, controlam a resistência ao patótipo 81 de C. lindemuthianum, enquanto que um gene dominante e um recessivo controlam a resistência ao patótipo 65. O marcador OPQ04(1440C), previamente identificado como ligado ao gene Co-2 , pode ser usado, na prática, nesta população, para selecionar linhagens F2:3 contendo o gene Co-2.

Avaliação da resistência de isolinhas de feijoeiro a diferentes patótipos de Colletotrichum lindemuthianum, Uromyces appendiculatus e Phaeoisariopsis griseola

Isolinhas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris)derivadas da cultivar Rudá, com grãos do tipo "carioca", contendo os genes de resistência à antracnose (Co-4 do cv. TOou Co-6 do cv. AB 136 ou Co-10 do cv. Ouro Negro), ferrugem (gene do cv. Ouro Negro) e mancha-angular (phg-1 da linhagem AND 277) foram desenvolvidas pelo Programa de Melhoramento do Feijoeiro do BIOAGRO/UFV, para serem utilizadas na piramidação desses genes em uma única cultivar. Este trabalho teve como objetivo determinar o espectro de resistência dessas isolinhas a diferentes patótipos de Colletotrichum lindemuthianum, Uromyces appendiculatus e Phaeoisariopsis griseola, visando selecionar as linhagens mais similares aos progenitores doadores quanto à sua resistência. Para isto, foram conduzidas inoculações artificiais com 18 patótipos de C. lindemuthianum, dez patótipos de U. appendiculatus e quatro patótipos de P. griseola. Para resistência à antracnose, foi selecionada uma linhagem do cruzamento Rudá x TO, homozigota resistente a 17 patótipos, uma linhagem do retrocruzamento Rudá x AB 136, homozigota resistente a 15 patótipos e uma linhagem do cruzamento Rudá x Ouro Negro, homozigota resistente a 15 patótipos de C. lindemuthianum. Para resistência à ferrugem, uma linhagem do cruzamento Rudá x Ouro Negro, apresentou-se homozigota resistente aos dez patótipos de U. appendiculatus testados. Para resistência à mancha-angular, uma linhagem do cruzamento Rudá x AND277 apresentou-se homozigota resistente aos quatro patótipos de P. griseola inoculados. As melhores isolinhas estão sendo intercruzadas visando a piramidação de genes de resistência à ferrugem, à antracnose e à mancha-angular e o desenvolvimento de cultivares essencialmente derivadas da cultivar Rudá.