Caracterização molecular da resistência a antimicrobianos em Escherichia coli produtoras de β-lactamases de espectro alargado isoladas em cães e estudo da partilha de clones bacterianos entre animais de companhia e coabitantes humanos

A pressão seletiva originada pelo uso excessivo de antimicrobianos na medicina humana e veterinária tem contribuído para a emergência de estirpes bacterianas multirresistentes, sendo os estudos mais escassos relativamente à sua presença nos animais de companhia. Porque os animais e os seus proprietários partilham o mesmo espaço habitacional, apresentando comportamentos de contacto próximo, existe uma hipótese elevada de transferência microbiana inter-espécie. Ante esta possibilidade é importante escrutinar o papel dos animais de companhia enquanto reservatórios de estirpes e de genes de resistência, bem como a sua envolvência na disseminação de estirpes bacterianas multirresistentes. Importa também, investigar o papel das superfícies e objetos domésticos partilhados por ambos, como potenciadores deste fenómeno. O objetivo deste trabalho foi, identificar o filogrupo e fazer a caracterização molecular dos genes que conferem resistência aos β-lactâmicos e às quinolonas, em quarenta isolados de Escherichia coli produtoras de β-lactamases de espectro alargado (ESBL), obtidas em zaragatoas fecais de cães consultados no Hospital Veterinário do ICBAS-UP. Complementarmente pretendeu-se inferir sobre a partilha de clones de Escherichia coli e Enterococcus spp. com elevadas resistências, em cinco agregados familiares (humanos e seus animais de companhia) assim como avaliar a potencial disseminação de estirpes multirresistentes no ambiente doméstico. Previamente foram recolhidas zaragatoas de fezes, pelo e mucosa oral dos animais e em alguns casos, dos seus proprietários, e ainda do ambiente doméstico. As zaragatoas foram processadas e as estirpes isoladas com base em meios seletivos. Foram realizados testes de suscetibilidade antimicrobiana de modo a estabelecer o fenótipo de resistência de cada isolado. O DNA foi extraído por varias metodologias e técnicas de PCR foram utilizadas para caracterização de filogrupos (Escherichia coli) e identificação da espécie (Enterococcus spp.). A avaliação da proximidade filogenética entre isolados foi efetuada por ERIC PCR e PFGE. No conjunto de quarenta isolados produtores de ESBL e/ou resistentes a quinolonas verificou-se que 47,5% pertenciam ao filogrupo A, havendo uma menor prevalência do filogrupo D (25,0%), B1 (17,5%), e B2 (10,0%).A frequência de resistência nestes isolados é factualmente elevada, sendo reveladora de uma elevada pressão seletiva. Com exceção de dois isolados, os fenótipos foram justificados pela presença de β-lactamases. A frequência da presença de genes foi: 47% blaTEM, 34% blaSHV, 24% blaOXA , 18% blaCTX-M-15, 8% blaCTX-M-2, 3% blaCTX-M-9. Nos isolados resistentes às quinolonas verificou-se maioritariamente a presença de mutações nos genes cromossomais gyrA e parC, e em alguns casos a presença de um determinante de resistência mediado por plasmídeo – qnrS. Nos cinco “agregados familiares” (humanos e animais) estudados foi observada uma partilha frequente de clones de E. coli e Enterococcus faecalis com múltiplas resistências, isolados em fezes e mucosa oral de cães e gatos e fezes e mãos dos respetivos proprietários, evidenciando-se assim uma possível transferência direta entre coabitantes (agregados A, C, D, E). Ficou também comprovado com percentagens de similaridade genotípica superiores a 94% que essa disseminação também ocorre para o ambiente doméstico, envolvendo objetos dos animais e de uso comum (agregados A, E). Os resultados obtidos reforçam a necessidade de um uso prudente dos antimicrobianos, pois elevados padrões de resistências terão um impacto não só na qualidade de vida dos animais mas também na saúde humana. Adicionalmente importa sensibilizar os proprietários para a necessidade de uma maior vigilância relativamente às formas de interação com os animais, bem como para a adoção de medidas higiénicas cautelares após essa mesma interação.

The selective pressure caused by the excessive use of antimicrobials, both in human and veterinary medicine, has triggered the emergence of multidrug-resistant bacterial strains. Studies are relatively scarce to what concerns to the presence of antimicrobial-resistant bacteria in companion animals. Since animals and their owners share the same living space, with close contact behaviors, there is a chance of inter-species microbial transfer. Taking into account this hypothesis, it is important to scrutinize the role of companion animals as reservoir of resistance genes, as well as their involvement in the dissemination of multidrug-resistant bacteria. It is also important to investigate the role of surfaces and objects shared by both animals and humans, as potential enhancers of this phenomenon. The aim of this study was to identify the phylogenetic group and the presence of genes that confer resistance to β-lactams and to quinolones, in forty ESBL producing Escherichia coli, obtained from fecal swabs collected from dogs that had appointments in the Veterinary Hospital of ICBAS-UP. In addition, it was sought to infer about the sharing of Escherichia coli and Enterococcus spp. clones with high resistances, in five households (humans and their pets) as well as observe their dissemination across the domestic environment. Prior to this work, swabs from feces, hair and oral mucosa were collected from the animals, and in some cases from their owners, as well as from the domestic environment. Swabs were processed and strains were isolated by using selective media. Antimicrobial susceptibility tests were performed to establish the resistance phenotype of each isolate. DNA was extracted by various methods, and PCR techniques were used to characterize phylogenetic groups (Escherichia coli), and to species identification (Enterococcus spp.). ERIC PCR and PFGE were used to study the clonal proximity between isolates. In the group of forty ESBL and fluroquinolone resistant isolates, it was verified that 47,5% belonged to the phylogenetic group A, followed by 25,0% in the phylogenetic group D, B1 (17,5%) and B2 (10,0%). The resistance frequency of those isolates is indubitably high, showing an occurring selective pressure. Except for two isolates, the resistance phenotypes were justified by the presence of β-lactamases. The frequency of identified genes was: 47% blaTEM, 34% blaSHV, 24% blaOXA , 18% blaCTX-M-15, 8% blaCTX-M-2 and 3% blaCTX-M-9. In the quinolones resistant isolates, there was a major presence of cromossomal genes mutations (in gyrA and parC), and in some cases there was a plasmid mediated quinolone resistance (qnrS gene). In the five households, it was observed the sharing of E. coli and Enterococcus faecalis clones with multiple resistances, among cats and dogs’ feces and oral mucosa, and their respective owners hands and feces, being evident that there was a possible direct transmission between cohabitants (household: A, C, D, E). It has also been demonstrated with over 94% of similarity in the genotypic profile that this dissemination also occurs in the home environment, with transference to common use objects (household: A, E). Regarding these results, it is easily noticeable that it is necessary to use antibiotics cautiously since high resistance levels will have an impact not only on pet’s quality of life, but also on human health. Additionally, it’s important to make the owners aware of the need of greater vigilance on how they interact with the animals, as well as for the adoption of precautionary hygienic measures after that interaction.