Association atypique d'une démence sémantique, d'un syndrome cortico-basal et d'une tauopathie 4R = [Atypical association of semantic dementia, corticobasal syndrome and 4R tauopathy]

Enjeu et contexte de la recherche La dégénérescence lobaire fronto-temporale (DLFT) est une pathologie neurodégénérative aussi fréquente que la maladie d'Alzheimer parmi les adultes de moins de 65 ans. Elle recouvre une constellation de syndromes neuropsychiatriques et moteurs dont les caractéristiques cliniques et anatomo-pathologiques se recoupent partiellement. La plupart des cas de démence sémantique ne présentent pas de troubles moteurs et révèlent à l'autopsie des lésions ubiquitine-positives. Son association à un syndrome cortico-basal et à une tauopathie 4R est donc très inhabituelle. Le cas que nous présentons est le premier à disposer d'une description clinique complète, tant sur le plan cognitif que moteur, et d'une analyse génétique et histopathologique. Résumé de l'article Il s'agit d'un homme de 57 ans, sans antécédents familiaux, présentant une démence sémantique accompagnée de symptômes inhabituels dans ce contexte, tels qu'une dysfonction exécutive et en mémoire épisodique, une désorientation spatiale et une dyscalculie. Le déclin physique et cognitif fut rapidement progressif. Une année et demie plus tard, il développait en effet des symptômes moteurs compatibles initialement avec un syndrome de Richardson, puis avec un syndrome cortico-basal. Son décès survint à l'âge de 60 ans des suites d'une pneumonie sur broncho-aspiration. L'autopsie cérébrale mit en évidence une perte neuronale et de nombreuses lésions tau-4R-positives dans les lobes frontaux, pariétaux et temporaux, les ganglions de la base et le tronc cérébral. Aucune mutation pathologique n'a été décelée dans le gène MAPT (microtubule-associated protein tau). L'ensemble de ces éléments sont discutés dans le cadre des connaissances actuelles sur la DLFT. Conclusions et perspectives Ce cas illustre le recoupement important des différents syndromes de la DLFT, parfois appelée le « complexe de Pick ». De plus, la démence sémantique pourrait s'avérer cliniquement moins homogène que prévu. Les définitions actuelles de la démence sémantique omettent la description des symptômes cognitifs extra-sémantiques malgré l'accumulation de preuves de leur existence. La faible prévalence de la démence sémantique, ainsi que des différences dans les examens neuropsychologiques, peuvent expliquer en partie la raison de cette omission. La variabilité histopathologique de chaque phénotype de DLFT peut également induire des différences dans leur expression clinique. Dans un domaine aussi mouvant que la DLFT, la co- occurrence ou la succession de plusieurs syndromes cliniques est en outre probablement la règle plutôt que l'exception.

Comparaison de l’ubiquitylation de différentes protéines à domaine SH3 impliquées dans l’endocytose suite à leur interaction avec la ligase de l’ubiquitine Itch

Itch est la seule ligase de l'ubiquitine de type C2-WW-HECT capable d'interagir avec les protéines à domaine SH3. Ce domaine est particulièrement représenté parmi les protéines régulatrices de l'endocytose. Les travaux présentés ici visaient à examiner la capacité d'Itch à interagir avec plusieurs protéines endocytiques. Nous avons utilisé la technique du BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) pour examiner quelques protéines candidates. Nous avons ensuite confirmé les résultats obtenus par BRET avec des tests d'interaction in vitro, puis déterminé la capacité d'Itch à ubiquityler les protéines liées via leurs domaines SH3. Nous avons ainsi découvert deux nouveaux partenaires d'interaction et substrats d'Itch parmi les protéines endocytiques, amphyphisine et pacsine. De plus, Itch interagit avec les domaines SH3 isolés d'intersectine, mais pas avec la protéine complète, suggérant que cette dernière n'est pas un substrat d'Itch. Itch est donc bien positionnée pour exercer un rôle régulateur de l'endocytose en ubiquitylant ses substrats.

Influence de l'ubiquitylation initiale des substrats SH3 sur leur régulation par la ligase Itch

Ce projet de recherche explore un nouveau mécanisme de régulation de l’activité du domaine HECT de la ligase Itch. Ce domaine est responsable de la polyubiquitylation des protéines impliquant le plus souvent leur dégradation par le protéasome. Itch est une ligase de l’ubiquitine de la famille CWH contenant un domaine HECT catalytique en C-terminal, quatre domaines WW, et un domaine C2 N-terminal qui est important pour sa localisation cellulaire. Les ligases CWH interagissent par leur domaine WW avec leurs ligands. Un mécanisme proposé pour ces ligases est que la première molécule d’ubiquitine liée au substrat active le domaine HECT de manière à former une chaine d’ubiquitine sur le substrat. Itch a une particularité dans la famille CWH, car elle possède un domaine riche en proline qui lui permet d’interagir avec plusieurs protéines à domaine SH3. Dans cette étude, nous avons déterminé l’effet de l’ubiquitylation initiale des protéines SH3 sur l’activité du domaine HECT de la ligase Itch, et sur la régulation de ces substrats.

Influence de l'ubiquitylation initiale des substrats SH3 sur leur régulation par la ligase Itch

Ce projet de recherche explore un nouveau mécanisme de régulation de l’activité du domaine HECT de la ligase Itch. Ce domaine est responsable de la polyubiquitylation des protéines impliquant le plus souvent leur dégradation par le protéasome. Itch est une ligase de l’ubiquitine de la famille CWH contenant un domaine HECT catalytique en C-terminal, quatre domaines WW, et un domaine C2 N-terminal qui est important pour sa localisation cellulaire. Les ligases CWH interagissent par leur domaine WW avec leurs ligands. Un mécanisme proposé pour ces ligases est que la première molécule d’ubiquitine liée au substrat active le domaine HECT de manière à former une chaine d’ubiquitine sur le substrat. Itch a une particularité dans la famille CWH, car elle possède un domaine riche en proline qui lui permet d’interagir avec plusieurs protéines à domaine SH3. Dans cette étude, nous avons déterminé l’effet de l’ubiquitylation initiale des protéines SH3 sur l’activité du domaine HECT de la ligase Itch, et sur la régulation de ces substrats.

Caractérisation du domaine cytoplasmique du récepteur du facteur autocrine de motilité et formation du complexe AMFR/p97/ubiquitine

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation du domaine cytoplasmique du récepteur du facteur autocrine de motilité et formation du complexe AMFR/p97/ubiquitine

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The Penicillium chrysogenum aclA gene encodes a broad-substrate-specificity acyl-coenzyme A ligase involved in activation of adipic acid, a side-chain precursor for cephem antibiotics

Activation of the cephalosporin side-chain precursor to the corresponding CoA-thioester is an essential step for its incorporation into the P-lactam backbone. To identify an acyl-CoA ligase involved in activation of adipate, we searched in the genome database of Penicillium chrysogenum for putative structural genes encoding acyl-CoA ligases. Chemostat-based transcriptome analysis was used to identify the one presenting the highest expression level when cells were grown in the presence of adipate. Deletion of the gene renamed aclA, led to a 32% decreased specific rate of adipate consumption and a threefold reduction of adipoyl-6-aminopenicillanic acid levels, but did not affect penicillin V production. After overexpression in Escherichia coli, the purified protein was shown to have a broad substrate range including adipate. Finally, protein-fusion with cyan-fluorescent protein showed co-localization with microbody-borne acyl-transferase. Identification and functional characterization of aclA may aid in developing future metabolic engineering strategies for improving the production of different cephalosporins. (C) 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.

Association of polymorphisms of glutamate-cystein ligase and microsomal triglyceride transfer protein genes in non-alcoholic fatty liver disease

Background and Aims: Although the metabolic risk factors for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) progression have been recognized, the role of genetic susceptibility remains a field to be explored. The aim of this study was to examine the frequency of two polymorphisms in Brazilian patients with biopsy-proven simple steatosis or non-alcoholic steatohepatitis (NASH): -493 G/T in the MTP gene, which codes the protein responsible for transferring triglycerides to nascent apolipoprotein B, and -129 C/T in the GCLC gene, which codes the catalytic subunit of glutamate-cystein ligase in the formation of glutathione. Methods: One hundred and thirty-one biopsy-proven NAFLD patients (n = 45, simple steatosis; n = 86, NASH) and 141 unrelated healthy volunteers were evaluated. Genomic DNA was extracted from peripheral blood cells, and the -129 C/T polymorphism of the GCLC gene was determined by restriction fragment length polymorphism (RFLP). The -493 G/T polymorphism of the MTP gene was determined by direct sequencing of the polymerase chain reaction products. Results: The presence of at least one T allele in the -129 C/T polymorphism of the GCLC gene was independently associated with NASH (odds ratio 12.14, 95% confidence interval 2.01-73.35; P = 0.007), whereas, the presence of at least one G allele in the -493 G/T polymorphism of the MTP gene differed slightly between biopsy-proven NASH and simple steatosis. Conclusion: This difference clearly warrants further investigation in larger samples. These two polymorphisms could represent an additional factor for consideration in evaluating the risk of NAFLD progression. Further studies involving a larger population are necessary to confirm this notion.

Development of ligase-assisted spacer addition for the measurement of microsatellites

Conventional methods for detecting differences in microsatellite repeat lengths rely on electrophoretic fractionation on long denaturing polyacrylamide gels, a time-consuming and labor-intensive method. Therefore, there is a need for the development of new and rapid approaches to routinely detect such length polymorphisms. The advent of techniques allowing the coupling of DNA molecules to solid surfaces has provided new prospects in the area of mutation. We describe here the development and optimization of the ligase-assisted spacer addition (LASA) method, a novel and rapid procedure based on an ELISA format to measure microsatellite repeat lengths. The LASA assay was successfully applied to a set of 11 bird samples to assess its capability as a genotyping method.

Insights into the biological significance of alternative splicing in Arabidopsis: functional characterization of a dual-targeted E3 ligase and the SCL30a SR protein

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Molecular Biology

Evaluation of a commercial test based on ligase chain reaction for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens

A ligase chain reaction DNA amplification method for direct detection of Mycobacterium tuberculosis (Abbott LCx MTB) in respiratory specimens was evaluated. Results from LCx MTB Assay were compared with those from acid fast bacilli smear, culture, and final clinical diagnosis for each patient. A total of 297 respiratory specimens (sputum and bronchial lavage) from 193 patients were tested. The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of LCx vs culture were 92.7%, 93%, 67.8% and 98.7%, respectively. When compared to the clinical final diagnosis, the sensitivity, specificity, PPV and NPV for LCx were 88.9%, 96.8%, 86.5% and 97.4%, respectively. The sensitivity of LCx MTB assay was 75% for smear-negative, culture positive samples. The results indicate that LCx MTB assay is a rapid, simple and valuable technique as a complementary tool for the diagnosis of tuberculosis.

E3 ubiquitin ligase Praja1 inhibits the development of a neuronal phenotype in PC12 cells

Magdeburg, Univ., Med. Fak., Diss., 2015

Molecular mechanisms for the regulation of skin homeostasis

L'ubiquitination est une modification des protéines conservée, consistant en l'addition de résidus « ubiquitine » et régulant le destin cellulaire des protéines. La protéine « TRAF-interacting protein » TRAIP (ou TRIP) est une ligase E3 qui catalyse l'étape finale de l'ubiquitination. TRAIP est conservé dans l'évolution et est nécessaire au développement des organismes puisque l'ablation de TRAIP conduit à la mort embryonnaire aussi bien de la drosophile que de la souris. De plus, la réduction de l'expression de TRAIP dans des kératinocytes épidermiques humains réprime la prolifération cellulaire et induit un arrêt du cycle cellulaire en phase Gl, soulignant le lien étroit entre TRAIP et la prolifération cellulaire. Comme les mécanismes de régulation de la prolifération jouent un rôle majeur dans l'homéostasie de la peau, il est important de caractériser la fonction de TRAIP dans ces mécanismes. En utilisant des approches in vitro, nous avons déterminé que la protéine TRAIP est instable, modifiée par l'addition d'ubiquitine et ayant une demi-vie d'environ 4 heures. Nos analyses ont également révélé que l'expression de TRAIP est dépendante du cycle cellulaire, atteignant un pic d'expression en phase G2/M et que l'induction de son expression s'effectue principalement au cours de la transition Gl/S. Nous avons identifié le facteur de transcription E2F1 comme en étant le responsable, en régulant directement le promoteur de TRAIP. Aussi, TRAIP endogène ou surexprimée est surtout localisée au niveau du nucléole, une organelle nucléaire qui est désassemblée pendant la division cellulaire. Pour examiner la localisation subcellulaire de TRAIP pendant la mitose, nous avons imagé la protéine TRAIP fusionnée à une protéine fluorescente, à l'intérieur de cellules vivantes nommées HeLa, à l'aide d'un microscope confocal. Dans ces conditions, TRAIP est majoritairement localisée autour des chromosomes en début de mitose, puis est arrangée au niveau de l'ADN chromosomique en fin de mitose. La détection de TRAIP endogène à l'aide d'un anticorps spécifique a confirmé cette localisation. Enfin, l'inactivation de TRAIP dans les cellules HeLa par interférence ARN a inhibé leur capacité à s'arrêter en milieu de mitose. Nos résultats suggèrent que le mécanisme sous-jacent peut être lié au point de contrôle de l'assemblage du fuseau mitotique. - Ubiquitination of proteins is a post-translational modification which decides the cellular fate of the protein. The TRAF-interacting protein (TRAIP, TRIP) functions as an E3 ubiquitin ligase mediating addition of ubiquitin moieties to proteins. TRAIP interacts with the deubiquitinase CYLD, a tumor suppressor whose functional inactivation leads to skin appendage tumors. TRAIP is required for early embryonic development since removal of TRAIP either in Drosophila or mice by mutations or knock¬out is lethal due to aberrant regulation of cell proliferation and apoptosis. Furthermore, shRNA- mediated knock-down of TRAIP in human epidermal keratinocytes (HEK) repressed cell proliferation and induced a Gl/S phase block in the cell cycle. Additionally, TRAIP expression is strongly down- regulated during keratinocyte differentiation supporting the notion of a tight link between TRAIP and cell proliferation. We thus examined the biological functions of TRAIP in epithelial cell proliferation. Using an in vitro approach, we could determine that the TRAIP protein is unstable, modified by addition of ubiquitin moieties after translation and exhibits a half-life of 3.7+/-1-6 hours. Our analysis revealed that the TRAIP expression is modulated in a cell-cycle dependent manner, reaching a maximum expression level in G2/M phases. In addition, the expression of TRAIP was particularly activated during Gl/S phase transition and we could identify the transcription factor E2F1 as an activator of the TRAIP gene promoter. Both endogenous and over-expressed TRAIP mainly localized to the nucleolus, a nuclear organelle which is disassembled during cell division. To examine the subcellular localization of TRAIP during M phase, we performed confocal live-cell imaging of a functional fluorescent protein TRAIP-GFP in HeLa cells. TRAIP was distributed in the cytoplasm and accumulated around mitotic chromosomes in pro- and meta-phasic cells. TRAIP was then confined to chromosomal DNA location in anaphase and later phases of mitosis. Immune-detection of endogenous TRAIP protein confirmed its particular localization in mitosis. Finally, inactivating TRAIP expression in HeLa cells using RNA interference abrogated the cells ability to stop or delay mitosis progression. Our results suggested that TRAIP may involve the spindle assembly checkpoint.

Mutation screening of the glutamate cysteine ligase modifier (GCLM) gene in patients with schizophrenia.

BACKGROUND: Experimental evidences show that glutathione and its rate-limiting synthesizing enzyme, the glutamate-cysteine ligase (GCL), are involved in the pathogenesis of schizophrenia. Furthermore, genetic association has been previously reported between two single nucleotide polymorphisms lying in noncoding regions of glutamate cysteine ligase modifier (GCLM) gene, which specifies for the modifier subunit of GCL and schizophrenia. OBJECTIVE: We wanted to investigate the presence of GCLM true functional mutations, likely in linkage disequilibrium with the previously identified single nucleotide polymorphism alleles, in the same set of cases that allowed the detection of the original association signal. METHODS: We screened all the coding regions of GCLM and their intronic flanking vicinities in 353 patients with schizophrenia by direct DNA sequencing. RESULTS: Ten sequence variations were identified, five of which were not previously described. None of these DNA changes was within the GCLM coding sequence and in-silico analysis failed to indicate functional impairment induced by these variations. Furthermore, screening of normal controls and downstream statistical analyses revealed no significant relationship of any of these DNA variants with schizophrenia. CONCLUSION: It is unlikely that functional mutations in the GCLM gene could play a major role in genetic predisposition to schizophrenia and further studies will be required to assess its etiological function in the disease.

Combinatorial Synthesis and Biological Evaluation of Inhibitors of D-Ala-D-Ala-Ligase

Report for the scientific sojourn carried out at the Max Planck Institut of Molecular Phisiology, Germany, from 2006 to 2008.The work carried out during this postdoctoral stage was focused on two different projects. Firstly, identification of D-Ala D-Ala Inhibitors and the development of new synthethic approaches to obtain lipidated peptides and proteins and the use of these lipidated proteins in biological and biophysical studies. In the first project, new D-Ala D-Ala inhibitors were identified by using structural alignments of the ATP binding sites of the bacterial ligase DDl and protein and lipid kinases in complex with ATP analogs. We tested a series of commercially available kinase inhibitors and found LFM-A13 and Tyrphostine derivatives to inhibit DDl enzyme activity. Based on the initial screening results we synthesized a series of malononitrilamide and salicylamide derivatives and were able to confirm the validity of these scaffolds as inhibitors of DDl. From this investigation we gained a better understanding of the structural requirements and limitations necessary for the preparation of ATP competitive DDl inhibitors. The compounds in this study may serve as starting points for the development of bi-substrate inhibitors that incorporate both, an ATP competitive and a substrate competitive moiety. Bisubstrate inhibitors that block the ATP and D-Ala binding sites should exhibit enhanced selectivity and potency profiles by preferentially inhibiting DDl over kinases. In the second project, an optimized synthesis for tha alkylation of cysteins using the thiol ene reaction was establisehd. This new protocol allowed us to obtain large amounts of hexadecylated cysteine that was required for the synthesis of differently lipidated peptides. Afterwards the synthesis of various N-ras peptides bearing different lipid anchors was performed and the peptides were ligated to a truncated N-ras protein. The influence of this differently lipidated N-ras proteins on the partioning and association of N-Ras in model membrane subdomains was studied using Atomic Force Microscopy.