La familia del paciente en Unidad de Cuidado Intensivo (UCI)

Introducción: Ingresar a la UCI no es una experiencia exclusiva del paciente; implica e involucra directamente a la familia, en aspectos generadores de estrés, estrategias de afrontamiento, temores, actitudes y expectativas, la participación de la familia en el cuidado y el rol del psicólogo. Objetivo: Revisar de los antecedentes teóricos y empíricos sobre la experiencia de la familia en UCI. Metodología: Se revisaron 62 artículos indexados en bases de datos. Resultados: la UCI es algo desconocido tanto para el paciente como para la familia, por esto este entorno acentúa la aparición de síntomas ansiosos, depresivos y en algunos casos estrés post traumático. La muerte es uno de los principales temores que debe enfrentar la familia. Con el propósito de ajustarse a las demandas de la UCI, los familiares exhiben estrategias de afrontamiento enfocadas principalmente en la comunicación, el soporte espiritual y religioso y la toma de decisiones. El cuidado centrado en la familia permite una mejor comunicación, relación con el paciente y personal médico. El papel del psicólogo es poco explorado en el espacio de la UCI, pero este puede promover estrategias de prevención y de rehabilitación en el paciente y su grupo familiar. Discusión: es importante tener en cuenta que la muerte en UCI es una posibilidad, algunos síntomas como ansiedad, depresión pueden aparecer y mantenerse en el tiempo, centrar el cuidado en la familia permite tomar las decisiones basados en el diagnóstico y pronóstico y promueve expectativas realistas. Conclusiones: temores, expectativas, actitudes, estrategias de afrontamiento, factores generadores de estrés permiten explicar y comprender la experiencia de la familia del paciente en UCI.

Uma contribuição ao estudo do stress: introversão-extroversão, dogmatismo e vulnerabilidade ao stress

Os dois tipos de stress fisiológico e psicológico constituem, a meu ver, um único fenômeno, embora, do ponto de vista didático, faça-se necessária esta divisão. Neste estudo ambos os tipos foram abordados teoricamente, mas o mesmo se propõe a analisar a influência dos fatores de personalidade - extroversão, introversão e dogmatismo- na vulnerabilidade ao stress. Os determinantes cognitivos foram considerados como mediadores desta relação. O instrumental utilizado para a verificação empírica foi composto dos seguintes testes: 16 PF de Cattell e Eber, Fator P de Toulouse-Pieron, Escala de Dogmatismo de Rokeach e o Sorting-Test, adaptado para esse estudo. Esses instrumentos foram utilizados para testar as hipóteses; o introvertido e o não-dogmático, tanto na condição isolada quanto em combinação, apresentam vulnerabilidade ao stress maior do que o extrovertido e o dogmático nas mesmas condições. A análise da regressão múltipla demonstrou que nenhuma diferença quanto à vulnerabilidade ao stress foi observada em relação aos tipos extrovertido, introvertido, dogmátlco e não-dogmático, quer isoladamente, quer nas combinações extrovertido-dogmático e introvertido-não-dogmático. É provável que algumas circunstâncias possam explicar esse fenômeno. Em primeiro lugar é possível que a vulnerabilidade ao stress esteja mais relacionada com traço de personalidade do que com tipo. Em segundo lugar, pode ser que o instrumento utilizado para medir extroversão-introversão não forneça uma medida válida: uma vez que o conceito se baseia nas primeiras formulações da teoria da ativação. Poderíamos, ainda, acrescentar uma outra relação na influência dos fatores de personalidade na vulnerabilidade ao stress . Esta relação pode ser estudada sob os dois aspectos do stress: a especificidade e a não-especificidade. Assim sendo, poder-se-ia conjecturar que tanto os fatores de personalidade quanto os determinantes cognitivos estariam mais relacionados com a especificidade do que com a não-especificidade. Esta última estaria mais vinculada aos aspectos fisiológicos. Esta última proposição poderia servir de um esquema para uma diferente análise teórica e empírica da influência dos fatores de personalidade na vulnerabilidade ao stress, enfatizando mais a especificidade do que a não-especificidade.

Implication de TLE3 et KDM5A dans la régulation de la transcription des gènes cibles du récepteur des œstrogènes ERα

Dans le noyau cellulaire, l’ADN est compacté autour de petites protéines appelées histones formant ainsi le nucléosome, unité de base de la chromatine. Les nucléosomes contrôlent la liaison des facteurs de transcription à l’ADN et sont ainsi responsables de la régulation des processus cellulaires tels que la transcription. Afin de permettre l’expression des gènes, la chromatine est remodelée, c’est-à-dire que les nucléosomes sont repositionnés de manière à ce que la machinerie générale de la transcription puisse atteindre l’ADN afin de produire l’ARN messager. La moindre petite modification dans la fonction des facteurs de transcription ou des enzymes responsables du remodelage de la chromatine entraine des variations d’expression des gènes, et donc des maladies telles que les cancers. Le cancer du sein est le cancer le plus couramment développé chez les femmes. Cette maladie est principalement causée par l’activité du récepteur des œstrogènes ERα et de ses co-régulateurs ayant, pour la plupart, un rôle direct sur le remodelage de la chromatine. Afin de mieux comprendre le développement et la progression du cancer du sein, nous avons décidé d’étudier le rôle de deux co-régulateurs de ERα, TLE3 et KDM5A, impliqués dans le remodelage de la chromatine et dont la fonction dans le cancer du sein est indéterminée. Nous avons démontré que TLE3 est un partenaire d’interaction du facteur pionnier FoxA1, facteur nécessaire à la liaison de ERα sur l’ADN pour la transcription des gènes cibles de ce récepteur. L’interaction de TLE3 avec FoxA1 inhibe la liaison de ERα à l’ADN en absence d’œstrogènes, via le recrutement de HDAC2 qui déacétyle la chromatine, empêchant alors l’activation fortuite de la transcription en absence de signal. Quant à KDM5A, malgré sa réputation de répresseur de la transcription, dans le cancer du sein, cette déméthylase de H3K4me2/3 est un coactivateur de ERα, dû à son rôle direct sur l’expression du récepteur.

Exploration d’un modèle d’étude simplifié de la spermiogenèse par l’utilisation de la levure à fission

Résumé: Les cellules germinales mâles remodèlent leur chromatine pour compacter leur noyau afin de protéger leur matériel génétique et assurer un transit optimal vers le gamète femelle. Il a été démontré que tous les spermatides de plusieurs mammifères, incluant l’homme et la souris, présentaient ce mécanisme de remodelage de la chromatine. Celui-ci est caractérisé par une augmentation transitoire de cassures d’ADN dont une quantité importante sont bicaténaires. Ce remodelage chromatinien a été étudié et semble être conservé chez plusieurs espèces, allant de l’algue à l’humain. Dans le contexte de la recherche fondamentale sur le phénomène de la spermiogenèse, il devient parfois très difficile d’investiguer certains aspects importants en vertu de l’impossibilité de réaliser des manipulations génétiques simples. Il est donc impératif de développer un nouveau modèle d’étude plus permissif afin de palier à ces difficultés encourues. Comme le processus de maturation des spores chez la levure à fission présente de grandes similitudes avec la spermiogenèse des mammifères, l’utilisation d’un modèle d’étude basé sur la sporulation de la levure à fission Schizosaccharomyces pombe a été proposée comme modèle comparatif de la spermatogenèse murine. À la suite de la synchronisation de la méiose de la souche S. pombe pat1-114, des analyses d’électrophorèse en champ pulsé (PFGE) et de qTUNEL ont permis de déterminer la présence de cassures bicaténaires transitoires de l’ADN lors de la maturation post-méiotique des ascospores nouvellement formés (t>7h). Des analyses par immunobuvardages dirigés contre le variant d’histones H2AS129p suggère la présence d’un remodelage chromatinien postméiotique dix heures suivant l’induction de la méiose, corroborant le modèle murin. Enfin, des analyses protéomiques couplées à l’analyse par spectrométrie de masse ont permis de proposer l’endonucléase Pnu1 comme candidat potentiellement responsable des cassures bicaténaires transitoires dans l’ADN des ascospores en maturation. En somme, bien que le processus de maturation des spores soit encore bien méconnu, quelques parallèles peuvent être tracés entre la maturation des ascospores de la levure à fission et la spermiogenèse des eucaryotes supérieurs. En identifiant un modèle simple du remodelage chromatinien au niveau de la spermiogenèse animale, on s’assurerait ainsi d’un outil beaucoup plus malléable et versatile pour l’étude fondamentale des événements survenant lors de la spermiogenèse humaine.

Étude de la réparation des lésions induites par les UVs dans les extrémités chromosomiques de la levure Saccharomyces cerevisiae

Résumé : Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées qui assurent la stabilité du génome en protégeant les extrémités chromosomiques. Afin d’empêcher des activités indésirables, la réparation des dommages à l’ADN doit être convenablement régulée au niveau des télomères. Pourtant, il existe peu d’études de la réparation des dommages induits par les ultraviolets (UVs) dans un contexte télomérique. Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER pour « Nucleotide Excision Repair ») permet d’éliminer les photoproduits. La NER est un mécanisme très bien conservé de la levure à l’humain. Elle est divisée en deux sous voies : une réparation globale du génome (GG-NER) et une réparation couplée à la transcription (TC-NER) plus rapide et plus efficace. Dans notre modèle d’étude, la levure Saccharomyces cerevisiae, une forme compactée de la chromatine nommée plus fréquemment « hétérochromatine » a été décrite. Cette structure particulière est présente entre autres, au niveau des régions sous-télomériques des extrémités chromosomiques. La formation de cette chromatine particulière implique quatre protéines nommées Sir (« Silent Information Regulator »). Elle présente différentes marques épigénétiques dont l’effet est de réprimer la transcription. L’accès aux dommages par la machinerie de réparation est-il limité par cette chromatine compacte ? Nous avons donc étudié la réparation des lésions induites par les UVs dans différentes régions associées aux télomères, en absence ou en présence de protéines Sir. Nos données ont démontré une modulation de la NER par la chromatine, dépendante des nucléosomes stabilisés par les Sir, dans les régions sous-télomériques. La NER était moins efficace dans les extrémités chromosomiques que dans les régions plus proches du centromère. Cet effet était dépendant du complexe YKu de la coiffe télomérique, mais pas dépendant des protéines Sir. La transcription télomériques pourrait aider la réparation des photoproduits, par l’intermédiaire de la sous-voie de TC-NER, prévenant ainsi la formation de mutations dans les extrémités chromosomiques. Des ARN non codants nommés TERRA sont produits mais leur rôle n’est pas encore clair. Par nos analyses, nous avons confirmé que la transcription des TERRA faciliterait la NER dans les différentes régions sous-télomériques.

Implication des protéines MCM dans la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN

Les protéines MCM (minichromosome maintenance) forment un complexe hétérohexamérique composé des protéines MCM2 à MCM7 qui possède une activité hélicase nécessaire lors de la réplication de l’ADN. Ce complexe est la cible des protéines ATM et ATR, kinases responsables de l’initiation de la réponse cellulaires aux dommages à l’ADN, pour permettre l’arrêt de la réplication lors de la détection de cassure double brin. De plus, les MCM permettent le remodelage de la chromatine par leur activité hélicase mais aussi par leur association avec une chaperone d’histone la protéine ASF1. Toutefois, la majorité des complexes MCM ne co-localisent pas avec les origines de réplication. De plus, la quantité des protéines MCM dans la cellule est nettement supérieure à la quantité requise lors de la réplication. Ces deux faits laissent présager que ce complexe hélicase pourrait jouer un second rôle. Des études effectuées au laboratoire ont démontré une augmentation de la fixation à la chromatine des protéines MCM suite au traitement avec l’étoposide, un inhibiteur de la topoisomérase II qui cause des cassures double brin. L’étude des interactions de la protéine MCM2 par spectrométrie de masse ainsi que par immunobuvardage ont démontré une augmentation de l’interaction entre la protéine MCM2 et ASF1 suite aux dommages. Ceci suggère que les protéines MCM pourraient être impliquées dans les mécanismes de réparation de l’ADN. La nature de l’interaction entre la protéine MCM2 et ASF1 a été déterminée in vitro par des immunobuvardages de type Far western et des Dot blot avec des mutants de la protéine MCM2. Des cellules U2OS-Flp-in ont été utilisées pour générer des lignées stables exprimants les protéines MCM2 à MCM7 avec une étiquette GFP ou fusionnées avec une biotine-ligase (BirA). Les cellules ont été cultivées dans du milieu SILAC et des immunoprécipitations ont été effectuées sur des cellules contrôles (R0K0), des cellules qui expriment MCM-GFP ou BirA (R6K4) non-traitées et des cellules qui expriment MCM-GFP ou BirA traitées à l’étoposide (R10K8). Les immunoprécipitations ont été analysés au spectromètre de masse pour déterminer la modulation des interactions avant et après dommages à l’ADN. Les études d’interactions in vitro ont permis d’identifier que l’interaction entre la protéine MCM2 et ASF1 se situe entre les acides aminés 81-162 sur la protéine MCM2. L’approche de spectrométrie de masse a permis d’identifier plusieurs protéines liant le complexe MCM qui sont impliquées non seulement dans la réplication de l’ADN mais aussi dans le remodelage de la chromatine. De plus, certains de ces nouveaux partenaires augmentent leur interaction avec le complexe suite à l’induction de dommages. Ces résultats suggèrent que les protéines MCM jouent un rôle dans la réorganisation de la chromatine dans les mécanismes de réparation de l’ADN.

La régulation de la transcription dans les cellules cancéreuses

La chromatine eucaryote, contenant l’ADN et de nombreuses protéines de liaison, subit une compaction dynamique et fonctionnelle à de multiples échelles, nécessaire pour la régulation de nombreux processus biologiques comme l’expression génique. Afin de définir et maintenir les fonctions cellulaires, les protéines de la régulation transcriptionnelle et de la régulation de la structure chromatinienne agissent de concert pour orchestrer les programmes d’expression génique des cellules. Les facteurs de transcription opèrent de manière combinée et hiérarchique au niveau de nombreux éléments régulateurs, dont le fonctionnement est complexe et intégré, capables de générer de larges boucles topologiques pour réguler spécifiquement un promoteur cible à un moment précis. Le co-activateur transcriptionnel Mediator sert de centre d’interprétation, en connectant physiquement les régulateurs de la transcription à la machinerie transcriptionnelle, pour générer une réponse calibrée. Le complexe de maintenance de la structure des chromosomes, Cohesin, est impliqué dans la formation et la stabilisation des connexions génomiques à l’échelle de nombreuses structures chromatiniennes tri-dimensionnelles dont la caractérisation fonctionnelle commence à être explorée. Ensemble, les facteurs de transcription, Mediator et Cohesin contrôlent l’expression des programmes responsables du maintien de l’identité cellulaire. Les cellules cancéreuses présentent de nombreuses dérégulations au niveau transcriptionnel, et donc un programme d’expression aberrant. Nous avons démontré que les mécanismes de régulation qui contrôlent les cellules cancéreuses sont conservés, et proposons une stratégie qui permette de révéler les facteurs clefs dans la progression tumorale. Nous avons appliqué cette stratégie à la problématique de la résistance endocrinienne dans la progression du cancer du sein hormono-dépendant. Les résultats obtenus suggèrent que le complexe transcriptionnel AP-1 pourrait être impliqué dans l’acquisition et/ou le maintien de la résistance, en réponse aux pressions de sélection induites par les traitements hormonaux. Nous proposons une adaptation progressive et agressive des cellules cancéreuses par re-hiérarchisation des facteurs clefs qui contrôlent sa croissance.

Rôle du facteur de transcription HNF1α dans la promotion du diabète par l’intermédiaire d’hormones intestinales

HNF1α (hepatocyte nuclear factor-1α) est un facteur de transcription exprimé dans le foie, le pancréas, les reins, l’estomac, l’intestin grêle et le côlon. Il a été démontré que des mutations du gène codant pour cette protéine sont associées à un diabète non insulinodépendant MODY3. De plus, les souris déficientes pour l’expression de Hnf1α souffrent d’hyperglycémie. Ces animaux mutants semblent produire de l’insuline mais présentent cependant une altération de la sécrétion de cette hormone au niveau du pancréas. Dans une précédente étude, nous avons démontré que certains marqueurs de cellules entéroendocrines impliqués dans l’homéostasie du glucose étaient modulés chez les animaux mutants comparativement aux animaux contrôles notamment la ghréline, le Gip, la somatostatine. Notre hypothèse de recherche est que la perte de Hnf1α conditionne la promotion du diabète par l’intermédiaire d’hormones intestinales. Nous avons observé, chez les animaux mutants, une augmentation de l’expression du transcrit, du nombre de cellules positives ainsi que des taux plasmatiques de ghréline. Cette hormone étant reliée à l’homéostasie du glucose, nous avons suivi les variations de la glycémie et des taux d’insuline chez nos animaux. Nous avons observé une hyperglycémie accompagnée d’une diminution des taux d’insuline chez nos animaux mutants. Ces souris présentent une prise alimentaire augmentée, une polyurie et une polydipsie élevées, symptômes connus du diabète. Le traitement de 6 jours sur les souris Hnf1α[indice supérieur -/-] avec un antagoniste commercial du récepteur à la ghréline GHSR1a, le (D-Lys3)-GHRP-6 de BACHEM®, montre un rétablissement de la glycémie proche des valeurs normales, de même qu’une augmentation significative des taux d’insuline plasmatiques des souris traitées, une diminution de la polyurie, de la polydipsie et de la glycosurie. Les souris mutantes traitées avec cet antagoniste voient leur tolérance au glucose améliorée même en cas de choc glycémique. Nous avons, enfin, documenté la régulation possible de Hnf1α vis-à-vis du gène codant pour la ghréline. Des infections lentivirales, réalisées sur des cellules MIN6 avec un shARN dirigé contre le transcrit Hnf1α, montrent une augmentation des taux d’expression du transcrit ghréline. Nous avons également mis en évidence l’interaction physique entre Hnf1α et le promoteur ghréline en plusieurs sites par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine. L’ensemble de ces résultats suggère que la perte de Hnf1α chez la souris joue un rôle dans la promotion de l’hyperglycémie par l’intermédiaire d’une dérégulation de la production de ghréline.

Sexual dysfunction among young men : prevalence and associated factors

Les dysfonctions sexuelles représentent une préoccupation importante et parfois mésestimée dans la population masculine générale. L'éjaculation précoce et les dysfonctions érectiles faisant partie des dysfonctions sexuelles les plus fréquentes, nous avons choisi, dans le présent article, de nous concentrer sur ces deux aspects. Selon plusieurs études, la prévalence d'éjaculation précoce se situe entre 17 et 30%. Les associations décrites avec l'éjaculation précoce concernent le stress, la dépression et un jeune âge (<25 ans). La prévalence de dysfonction érectile, quant à elle, oscille entre 2 et plus de 80% dépendant principalement de l'âge. Beaucoup d'autres facteurs associés ont été décrits dans la littérature, tels que le diabète, les pathologies cardiovasculaires ou neurologiques, les médicaments, l'obésité ou l'inactivité physique. Tous ces facteurs étant plus fréquents au sein de populations vieillissantes, nous disposons de peu d'études concernant la dysfonction érectile chez de jeunes hommes. Notre étude propose donc d'évaluer la prévalence d'éjaculation précoce et de dysfonction érectile chez une population de jeunes hommes et d'étudier les associations possibles avec les consommations de substances, l'index de masse corporelle (IMC), l'activité physique ou la santé mentale. Chaque homme suisse entre 18 et 25 ans est appelé à participer à 2 journées de recrutement militaire. De septembre 2010 à mai 2011, les jeunes hommes recrutés à Lausanne et à Zürich (N= 9761) ont été invités à participer à l'étude C-SURF (Cohort Study on Substance Use Risk Factors). 5276 d'entre eux acceptèrent de répondre au questionnaire complet, et 73% (N=3886) le firent de manière effective. Le but de notre recherche étant d'étudier les dysfonctions sexuelles, nous nous sommes concentrés sur les participants sexuellement actifs (N=2507) et les avons divisés en 2 groupes, selon qu'ils présentaient ou non la dysfonction étudiée. Pour chaque dysfonction (éjaculation précoce et dysfonction érectile), nous avons utilisé une analyse bivariée afin de comparer les deux groupes (avec ou sans trouble) quant à d'éventuels facteurs associés. A cause de la nature transversale de l'étude, nous ne pouvions pas postuler de lien de cause à effet entre ces facteurs et les dysfonctions sexuelles, raison pour laquelle nous avons choisi d'utiliser des modèles log-linéaires pour mettre en exergue les associations significatives. Nos résultats montrent une prévalence d'éjaculation précoce de 11.4% avec comme associations principales la consommation de tabac et de drogues illégales (autres que le cannabis). La prévalence des dysfonctions érectiles est quant à elle proche du 30% et s'associe principalement avec l'usage de médicaments, ainsi qu'avec la santé physique et la santé mentale. Un jeune homme suisse sur trois souffre ainsi d'au moins une dysfonction sexuelle. Beaucoup de facteurs compromettants pour la santé y sont possiblement associés, raison pour laquelle les professionnels de la santé devraient saisir chaque occasion pour parler de sexualité avec leurs jeunes patients de sexe masculin.

CTCF-T, a paralogue of CTCF, directs sequence specific DNA methylation of the imprinting control region of Igf2/H19

SUMMARY Genomic imprinting is an epigenetic mechanism of transcriptional regulation that ensures restriction of expression of a subset of mammalian genes to a single parental allele. The best studied example of imprinted gene regulation is the Igf2/H19 locus, which is also the most commonly altered by loss of imprinting (LOT) in cancer. LOT is associated with numerous hereditary diseases and several childhood, and adult cancers. Differential expression of reciprocal H19 and 1gf2 alleles in somatic cells depends on the methylation status of the imprinting control region (ICR) which regulates binding of CTCF, an ubiquitously expressed 11-zinc finger protein that binds specifically to non-methylated maternal ICR and thereby attenuates expression of Igf2, while it does not bind to methylated paternal ICR, which enables Igf2 expression. Initial ICR methylation occurs during gametogenesis by an as yet unknown mechanism. The accepted hypothesis is that the event of differential maternal and paternal DNA methylation depends on germ-line specific proteins. Our Laboratory identified a novel 11-zinc-finger protein CTCF-T (also known as CTCFL and BORIS) that is uniquely expressed in the male germ-line and is highly homologous within its zinc-finger region with CTCF. The amino-acid sequences flanking the zinc-finger regions of CTCF and CTCF-T have widely diverged, suggesting that though they could bind to the same DNA targets (ICRs) they are likely to have different functions. Interestingly, expression of CTCF-T and CTCF is mutually exclusive; CTCF-T-positive (CTCF-negative) cells occur in the stage of spermatogenesis that coincides with epigenetic reprogramming, including de novo DNA methylation. In our study we demonstrate the role that CTCF-T plays in genomic imprinting. Here we show that CTCF-T binds in vivo to the ICRs of Igf2/H19 and Dlk/Gt12 imprinted genes. In addition, we identified two novel proteins interacting with CTCF-T: a protein arginine methyltransferase PRMT7 and an arginine-rich histone H2A variant that we named trH2A. These interactions were confirmed and show that the two proteins interact with the amino-teiminal region of CTCF-T. Additionally, we show interaction of the amino- terminal region of CTCF-T with histones H1, H2A and H3. These results suggest that CTCF-T is a sequence-specific DNA (ICR) binding protein that associates with histones and recruits PRMT7. Interestingly, PRMT7 has a histone-methyltransferase activity. It has been shown that histone methylation can mark chromatin regions thereby directing DNA-methylation; thus, our hypothesis is that the CTCF-T protein-scaffold directs PRMT7 to methylate histone(s) assembled on ICRs, which marks chromatin for the recruitment of the de novo DNA methyltransferases to methylate DNA. To test this hypothesis, we developed an in vivo DNA-methylation assay using Xenopus laevis' oocytes, where H19 ICR and different expression cDNAs, including CTCF-T, PRMT7 and the de novo DNA methyltransferases (Dnmt3a, Dnmt3b and Dnmt3L) are microinjected into the nucleus. The methylation status of CpGs within the H19 ICR was analysed 48 or 72 hours after injection. Here we demonstrate that CpGs in the ICR are methylated in the presence of both CTCF-T and PRMT7, while control oocytes injected only with ICR did not show any methylation. Additionally, we showed for the first time that Dnmt3L is crucial for the establishment of the imprinting marks on H19 ICR. Moreover, we confirmed that Dnmt3a and Dnmt3b activities are complementary. Our data indicate that all three Dnmt3s are important for efficient de novo DNA methylation. In conclusion, we propose a mechanism for the establishment of de novo imprinting marks during spermatogenesis: the CTCF-T/PRMT7 protein complex directs histone methylation leading to sequence-specific de novo DNA methylation of H19 ICR. RESUME L'empreinte génomique parentale est un mécanisme épigénétique de régulation transcriptionelle qui se traduit par une expression différentielle des deux allèles de certains gènes, en fonction de leur origine parentale. L'exemple le mieux caractérisé de gènes soumis à l'empreinte génomique parentale est le locus Igf2/H19, qui est aussi le plus fréquemment altéré par relaxation d'empreinte (en anglais: loss of imprinting, LOI) dans les cancers. Cette relaxation d'empreinte est aussi associée à de nombreuses maladies héréditaires, ainsi qu'à de nombreux cancers chez l'enfant et l'adulte. Dans les cellules somatiques, les différences d'expression des allèles réciproques H19 et Ig12 est sous le contrôle d'une région ICR (Imprinting Control Region). La méthylation de cette région ICR régule l'ancrage de la protéine à douze doigts de zinc CTCF, qui se lie spécifiquement à l'ICR maternel non-méthylé, atténuant ainsi l'expression de Igf2, alors qu'elle ne s'ancre pas à l'ICR paternel méthyle. Le mécanisme qui accompagne la méthylation initiale de la région ICR durant la gamétogenèse n'a toujours pas été élucidé. L'hypothèse actuelle propose que la différence de méthylation entre l'ADN maternel et paternel résulte de l'expression de protéines propres aux zones germinales. Notre laboratoire a récemment identifié une nouvelle protéine à douze doigts de zinc, CTCF-T (aussi dénommée CTCFL et BORRIS), qui est exprimée uniquement dans les cellules germinales mâles, dont la partie à douze doigts de zinc est fortement homologue à la protéine CTCF. La séquence d'acides aminés de part et d'autre de cette région est quant à elle très divergente, ce qui implique que CTCF-T se lie sans doute au même ADN cible que CTCF, mais possède des fonctions différentes. De plus, l'expression de CTCF-T et de CTCF s'oppose mutuellement; l'expression de la protéine CTCF-T (cellules CTCF-T positives, CTCF negatives) qui a lieu pendant la spermatogenèse coïncide avec la reprogrammation épigénétique, notamment la méthylation de novo de l'ADN. La présente étude démontre le rôle essentiel joué par la protéine CTCF-T dans l'acquisition de l'empreinte génomique parentale. Nous montrons ici que CTCF-T s'associe in vivo avec les régions ICR des loci Igf2/H19 et Dlk/Gt12. Nous avons également identifié deux nouvelles protéines qui interagissent avec CTCF-T : une protéine arginine méthyl transférase PRMT7, et un variant de l'histone H2A, riche en arginine, que nous avons dénommé trH2A. Ces interactions ont été analysées plus en détail, et confinnent que ces deux protéines s'associent avec la région N-terminale de CTCF-T. Aussi, nous présentons une interaction de la région N-terminale de CTCF-T avec les histones H1, H2, et H3. Ces résultats suggèrent que CTCF-T est une protéine qui se lie spécifiquement aux régions ICR, qui s'associe avec différents histones et qui recrute PRMT7. PRMT7 possède une activité méthyl-tansférase envers les histones. Il a été montré que la méthylation des histones marque certains endroits de la chromatine, dirigeant ainsi la méthylation de l'ADN. Notre hypothèse est donc la suivante : la protéine CTCF-T sert de base qui dirige la méthylation des histones par PRMT7 dans les régions ICR, ce qui contribue à marquer la chromatine pour le recrutement de nouvelles méthyl transférases pour méthyler l'ADN. Afin de valider cette hypothèse, nous avons développé un système de méthylation de l'ADN in vivo, dans des oeufs de Xenopus laevis, dans le noyau desquels nous avons mico-injecté la région ICR du locus H19, ainsi que différents vecteurs d'expression pour CTCF-T, PRMT7, et les de novo méthyl transférases (Dnmt3a, Dnmt3b et Dnmt3L). Les CpGs méthyles de la région ICR du locus H19 ont été analysé 48 et 72 heures après l'injection. Cette technique nous a permis de démontrer que les CpGs de la région ICR sont méthyles en présence de CTCF-T et de PRMT7, tandis que les contrôles injectés seulement avec la région ICR ne présentent aucun signe de méthylation. De plus, nous démontrons pour la première fois que la protéine méthyl transférase Dnmt3L est déterminant pour l'établissement de l'empreinte génomique parentale au niveau de la région ICR du locus H19. Aussi, nous confirmons que les activités méthyl transférases de Dnmt3a et Dnmt3b sont complémentaires. Nos données indiquent que les trois protéines Dnmt3 sont impliquées dans la méthylation de l'ADN. En conclusion, nous proposons un mécanisme responsable de la mise en place de nouvelles empreintes génomiques pendant la spermatogenèse : le complexe protéique CTCF-T/PRMT7 dirige la méthylation des histones aboutissant à la méthylation de novo de l'ADN au locus H19.

Design and analysis of ChIP-Seq experiments for nuclear factor I DNA-binding proteins

SUMMARY : Eukaryotic DNA interacts with the nuclear proteins using non-covalent ionic interactions. Proteins can recognize specific nucleotide sequences based on the sterical interactions with the DNA and these specific protein-DNA interactions are the basis for many nuclear processes, e.g. gene transcription, chromosomal replication, and recombination. New technology termed ChIP-Seq has been recently developed for the analysis of protein-DNA interactions on a whole genome scale and it is based on immunoprecipitation of chromatin and high-throughput DNA sequencing procedure. ChIP-Seq is a novel technique with a great potential to replace older techniques for mapping of protein-DNA interactions. In this thesis, we bring some new insights into the ChIP-Seq data analysis. First, we point out to some common and so far unknown artifacts of the method. Sequence tag distribution in the genome does not follow uniform distribution and we have found extreme hot-spots of tag accumulation over specific loci in the human and mouse genomes. These artifactual sequence tags accumulations will create false peaks in every ChIP-Seq dataset and we propose different filtering methods to reduce the number of false positives. Next, we propose random sampling as a powerful analytical tool in the ChIP-Seq data analysis that could be used to infer biological knowledge from the massive ChIP-Seq datasets. We created unbiased random sampling algorithm and we used this methodology to reveal some of the important biological properties of Nuclear Factor I DNA binding proteins. Finally, by analyzing the ChIP-Seq data in detail, we revealed that Nuclear Factor I transcription factors mainly act as activators of transcription, and that they are associated with specific chromatin modifications that are markers of open chromatin. We speculate that NFI factors only interact with the DNA wrapped around the nucleosome. We also found multiple loci that indicate possible chromatin barrier activity of NFI proteins, which could suggest the use of NFI binding sequences as chromatin insulators in biotechnology applications. RESUME : L'ADN des eucaryotes interagit avec les protéines nucléaires par des interactions noncovalentes ioniques. Les protéines peuvent reconnaître les séquences nucléotidiques spécifiques basées sur l'interaction stérique avec l'ADN, et des interactions spécifiques contrôlent de nombreux processus nucléaire, p.ex. transcription du gène, la réplication chromosomique, et la recombinaison. Une nouvelle technologie appelée ChIP-Seq a été récemment développée pour l'analyse des interactions protéine-ADN à l'échelle du génome entier et cette approche est basée sur l'immuno-précipitation de la chromatine et sur la procédure de séquençage de l'ADN à haut débit. La nouvelle approche ChIP-Seq a donc un fort potentiel pour remplacer les anciennes techniques de cartographie des interactions protéine-ADN. Dans cette thèse, nous apportons de nouvelles perspectives dans l'analyse des données ChIP-Seq. Tout d'abord, nous avons identifié des artefacts très communs associés à cette méthode qui étaient jusqu'à présent insoupçonnés. La distribution des séquences dans le génome ne suit pas une distribution uniforme et nous avons constaté des positions extrêmes d'accumulation de séquence à des régions spécifiques, des génomes humains et de la souris. Ces accumulations des séquences artéfactuelles créera de faux pics dans toutes les données ChIP-Seq, et nous proposons différentes méthodes de filtrage pour réduire le nombre de faux positifs. Ensuite, nous proposons un nouvel échantillonnage aléatoire comme un outil puissant d'analyse des données ChIP-Seq, ce qui pourraient augmenter l'acquisition de connaissances biologiques à partir des données ChIP-Seq. Nous avons créé un algorithme d'échantillonnage aléatoire et nous avons utilisé cette méthode pour révéler certaines des propriétés biologiques importantes de protéines liant à l'ADN nommés Facteur Nucléaire I (NFI). Enfin, en analysant en détail les données de ChIP-Seq pour la famille de facteurs de transcription nommés Facteur Nucléaire I, nous avons révélé que ces protéines agissent principalement comme des activateurs de transcription, et qu'elles sont associées à des modifications de la chromatine spécifiques qui sont des marqueurs de la chromatine ouverte. Nous pensons que lés facteurs NFI interagir uniquement avec l'ADN enroulé autour du nucléosome. Nous avons également constaté plusieurs régions génomiques qui indiquent une éventuelle activité de barrière chromatinienne des protéines NFI, ce qui pourrait suggérer l'utilisation de séquences de liaison NFI comme séquences isolatrices dans des applications de la biotechnologie.

Recombinant " Physcomitrella patens " as a sensitive tool to study heat sensing and heat-shock signal transduction in plants

SUMMARY When exposed to heat stress, plants display a particular set of cellular and molecular responses, such as chaperones expression, which are highly conserved in all organisms. In chapter 1, I studied the ability of heat shock genes to become transiently and abundantly induced under various temperature regimes. To this aim, I designed a highly sensitive heat-shock dependent conditional gene expression system in the moss Physcomitrella patens, using the soybean heatinducible promoter (hsp17.3B). Heat-induced expression of various reporter genes was over three orders of magnitude, in tight correlation with the intensity and duration of the heat treatments. By performing repeated heating/cooling cycles, a massive accumulation of recombinant proteins was obtained. Interestingly, the hsp17.3B promoter was also activated by specific organic chemicals. Thus, in chapter 2, I took advantage of the extreme sensitivity of this promoter to small temperature variations to further address the role of various natural and organic chemicals and develop a plant based-bioassay that can serve as an early warning indicator of toxicity by pollutants and heavy metals. A screen of several organic pollutants from textile and paper industry showed that chlorophenols as well as sulfonated anthraquinones elicited a heat shock like response at noninducing temperatures. Their effects were synergistically amplified by mild elevated temperatures. In contrast to standard methods of pollutant detection, this plant-based biosensor allowed to monitor early stress-responses, in correlation with long-term toxic effect, and to attribute effective toxicity thresholds for pollutants, in a context of varying environmental cues. In chapter 3, I deepened the study of the primary mechanism by which plants sense mild temperature variations and trigger a cellular signal leading to the heat shock response. In addition to the above described heat-inducible reporter line, I generated a P. patens transgenic line to measure, in vivo, variations of cytosolic calcium during heat treatment, and another line to monitor the role of protein unfolding in heat-shock sensing and signalling. The heat shock signalling pathway was found to be triggered by the plasma membrane, where temperature up shift specifically induced the transient opening of a putative high afimity calcium channel. The calcium influx triggered a signalling cascade leading to the activation of the heat shock genes, independently on the presence of misfolded proteins in the cytoplasm. These results strongly suggest that changes in the fluidity of the plasma membrane are the primary trigger of the heatshocksignalling pathway in plants. The present thesis contributes to the understanding of the basic mechanism by which plants perceive and respond to heat and chemical stresses. This may contribute to developing appropriate better strategies to enhance plant productivity under the increasingly stressful environment of global warming. RÉSUME Les plantes exposées à des températures élevées déclenchent rapidement des réponses cellulaires qui conduisent à l'induction de gènes codant pour les heat shock proteins (HSPs). En fonction de la durée d'exposition et de la vitesse à laquelle la température augmente, les HSPs sont fortement et transitoirement induites. Dans le premier chapitre, cette caractéristique aété utilisée pour développer un système inductible d'expression de gènes dans la mousse Physcomitrella patens. En utilisant plusieurs gènes rapporteurs, j'ai montré que le promoteur du gène hsp17.3B du Soja est activé d'une manière. homogène dans tous les tissus de la mousse proportionnellement à l'intensité du heat shock physiologique appliqué. Un très fort taux de protéines recombinantes peut ainsi être produit en réalisant plusieurs cycles induction/recovery. De plus, ce promoteur peut également être activé par des composés organiques, tels que les composés anti-inflammatoires, ce qui constitue une bonne alternative à l'induction par la chaleur. Les HSPs sont induites pour remédier aux dommages cellulaires qui surviennent. Étant donné que le promoteur hsp17.3B est très sensible à des petites augmentations de température ainsi qu'à des composés chimiques, j'ai utilisé les lignées développées dans le chapitre 1 pour identifier des polluants qui déclenchent une réaction de défense impliquant les HSPs. Après un criblage de plusieurs composés, les chlorophénols et les antraquinones sulfonés ont été identifiés comme étant activateurs du promoteur de stress. La détection de leurs effets a été réalisée seulement après quelques heures d'exposition et corrèle parfaitement avec les effets toxiques détectés après de longues périodes d'exposition. Les produits identifiés montrent aussi un effet synergique avec la température, ce qui fait du biosensor développé dans ce chapitre un bon outil pour révéler les effets réels des polluants dans un environnement où les stress chimiques sont combinés aux stress abiotiques. Le troisième chapitre est consacré à l'étude des mécanismes précoces qui permettent aux plantes de percevoir la chaleur et ainsi de déclencher une cascade de signalisation spécifique qui aboutit à l'induction des gènes HSPs. J'ai généré deux nouvelles lignées afin de mesurer en temps réel les changements de concentrations du calcium cytosolique ainsi que l'état de dénaturation des protéines au cours du heat shock. Quand la fluidité de la membrane augmente après élévation de la température, elle semble induire l'ouverture d'un canal qui permet de faire entrer le calcium dans les cellules. Ce dernier initie une cascade de signalisation qui finit par activer la transcription des gènes HSPs indépendamment de la dénaturation de protéines cytoplasmiques. Les résultats présentés dans ce chapitre montrent que la perception de la chaleur se fait essentiellement au niveau de la membrane plasmique qui joue un rôle majeur dans la régulation des gènes HSPs. L'élucidation des mécanismes par lesquels les plantes perçoivent les signaux environnementaux est d'une grande utilité pour le développement de nouvelles stratégies afin d'améliorer la productivité des plantes soumises à des conditions extrêmes. La présente thèse contribue à décortiquer la voie de signalisation impliquée dans la réponse à la chaleur.

Regulation of the Gac/Rsm pathway in "Pseudomonas fluorescens" CHA0

SUMMARY : Two-component systems are key mediators implicated in the response of numerous bacteria to a wide range of signals and stimuli. The two-component system comprised of the sensor kinase GacS and the response regulator GacA is broadly distributed among γ-proteobacteria bacteria and fulfils diverse functions such as regulation of carbon storage and expression of virulence. In Pseudomonas fluorescens, a soil bacterium which protects plants from root-pathogenic fungi and nematodes, the GacS/GacA two-component system has been shown to be essential for the production of secondary metabolites and exoenzymes required for the biocontrol activity of the bacterium. The regulatory cascade initiated by GacS/GacA consists of two translational repressor proteins, RsmA and RsmE, as well as three GacAcontrolled small regulatory RNAs RsmX, RsmY and RsmZ, which titrate RsmA and RsmE to allow the expression of biocontrol factors. Genetic analysis revealed that two additional sensor kinases termed RetS and Lads were involved as negative and positive control elements, respectively, in the Gac/Rsm pathway in P. fluoresens CHAO. Furthermore, it could be proposed that RetS and Lads interact with GacS, thereby modulating the expression of antibiotic compounds and hydrogen cyanide, as well as the rpoS gene encoding the stress and stationary phase sigma factor σ. Temperature was found to be an important environmental cue that influences the Gac/Rsm network. Indeed, the production of antibiotic compounds and hydrogen cyanide was reduced at 35°C, by comparison with the production at 30°C. RetS was identified to be involved in this temperature control. The small RNA RsmY was confirmed to be positively regulated by GacA and RsmA/RsmE. Two essential regions were identified in the rsmY promoter by mutational analysis, the upstream activating sequence (UAS) and the linker sequence. Although direct experimental evidence is still missing, several observations suggest that GacA may bind to the UAS, whereas the linker region would be recognized by intermediate RsmA/RsmEdependent repressors and/or activators. In conclusion, this work has revealed new elements contributing to the function of the signal transduction mechanisms in the Gac/Rsm pathway. RESUME : Les systèmes ä deux composants sont des mécanismes d'une importance notoire que beaucoup de bactéries utilisent pour faire face et répondre aux stimuli environnementaux. Le système à deux composants comprenant le senseur GacS et le régulateur de réponse GacA est très répandu chez les γ-protéobactéries et remplit des fonctions aussi diverses que la régulation du stockage de carbone ou l'expression de la virulence. Chez Pseudomonas fluorescens CHAO, une bactérie du sol qui protège les racines des plantes contre des attaques de champignons et nématodes pathogènes, le système à deux composants GacS/GacA est essentiel à la production de métabolites secondaires et d'exoenzymes requis pour l'activité de biocontrôle de la bactérie. La cascade régulatrice initiée pas GacS/GacA fait intervenir deux protéines répresseur de traduction, RsmA et RsmE, ainsi que trois petits ARNs RsmX, RsmY et RsmZ, dont la production est contrôlée par GacA. Ces petits ARNs ont pour rôle de contrecarrer l'action des protéines répressseur de la traduction, ce qui permet l'expression de facteurs de biocontrôle. Des analyses génétiques ont révélé la présence de deux senseurs supplémentaires, appelés Rets et Lads, qui interviennent dans la cascade Gac/Rsm de P. fluorescens. L'impact de ces senseurs est, respectivement, négatif et positif. Ces interactions ont apparenunent lieu au niveau de GacS et permettent une modulation de l'expression des antibiotiques et de l'acide cyanhydrique, ainsi que du gène rpoS codant pour le facteur sigma du stress. La température s'est révélée être un facteur environnemental important qui influence la cascade Gac/Rsm. Il s'avère en effet que la production d'antibiotiques ainsi que d'acide cyanhydrique est moins importante à 35°C qu'à 30°C. L'implication du senseur Rets dans ce contrôle par la température a pu être démontrée. La régulation positive du petit ARN RsmY par GacA et RsmA/RsmE a pu être confirmée; par le biais d'une analyse mutationelle, deux régions essentielles ont pu être mises en évidence dans la région promotrice de rsmY. Malgré le manque de preuves expérimentales directes, certains indices suggèrent que GacA puisse directement se fixer sur une des deux régions (appelée UAS), tandis que la deuxième région (appelée linker) serait plutôt reconnue par des facteurs intermédiaires (activateurs ou répresseurs) dépendant de RsmA/RsmE. En conclusion, ce travail a dévoilé de nouveaux éléments permettant d'éclairer les mécanismes de transduction des signaux dans la cascade Gac/Rsm.

The role of CTCFL/BORIS in Meiosis

The complexity of mammalian genome organization demands a complex interplay of DNA and proteins to orchestrate proper gene regulation. CTCF, a highly conserved, ubiquitously expressed protein has been postulated as a primary organizer of genome architecture because of its roles in transcriptional activation/repression, insulation and imprinting. Diverse regulatory functions are exerted through genome wide binding via a central eleven zinc finger DNA binding domain and an array of diverse protein-protein interactions through N- and C- terminal domains. CTCFL has been identified as a paralog of CTCF expressed only in spermatogenic cells of the testis. CTCF and CTCFL have a highly homologous DNA-binding domain, while the flanking amino acid sequences exhibit no significant similarity. Genome- wide mapping of CTCF binding sites has been carried out in many cell types, but no data exist for CTCFL apart from a few identified loci. The lack of high quality antibodies prompted us to generate an endogenously flag-tagged CTCFL mouse model using BAC recombination. IHC staining using anti-flag antibodies confirmed CTCFL localization to type Β spermatogonia and preleptotene spermatocytes and a mutually exclusive pattern of expression with CTCF. ChIP followed by high-throughput sequencing identified 10,382 binding sites showing 70% overlap but representing only 20% of CTCF sites. Consensus sequence analysis identified a significantly longer binding motif with prominently less ambiguity of base calling at every position. The significant difference between CTCF and CTCFL genomic binding patterns proposes that their binding to DNA is differentially regulated. Analysis of CTCFL binding to methylated regions on a genome wide scale identified approximately 1,000 loci. Methylation-independent binding of CTCFL might be at least one of the mechanisms that ensures distinct binding patterns of CTCF and CTCFL since CTCF binding is methylation- sensitive. Co-localization of CTCF with cohesin has been well established and analysis of CTCFL and SMC3 overlap identified around 3,300 binding sites from which two related but distinct consensus sequence motifs were derived. Because virtually all data for cohesin binding originate from mitotically proliferating cells, the anticipated overlap is expected to be considerably higher in meiotic cells. Meiosis-specific cohesin subunit Rec8 is specific for spermatocytes and 6 out of the 12 identified binding sites are also bound by CTCFL. In conclusion, this was the first genome-wide mapping of CTCFL binding sites in spermatocytes, the only cell type where CTCF is not expressed. CTCFL has a unique binding site repertoire distinct from CTCF, binds to methylated sequences and shows a significant overlap with cohesin binding sites. Future efforts will be oriented towards deciphering the role CTCFL plays in conversion of chromatin structure and function from mitotic to meiotic chromosomes. - La complexité de l'organisation du génome des mammifères exige une interaction particulière entre ADN et protéines pour orchestrer une régulation appropriée de l'expression des gènes. CTCFL, une protéine ubiquitaire très conservée, serait le principal organisateur de l'architecture du génome de par son rôle dans l'activation / la répression de la transcription, la protection et la localisation des gènes. Diverses régulations sont opérées, d'une part au travers d'interactions à différents endroits du génome par le biais d'un domaine protéique central de liaison à l'ADN à onze doigts de zinc, et d'autre part par des interactions protéine-protéine variées au niveau de leur domaine N- et C-terminal. CTCFL a été identifié comme un paralogue de CTCF exprimé uniquement dans les cellules spermatiques du testicule. CTCFL et CTCF ont un domaine de liaison à l'ADN très homologue, tandis que les séquences d'acides aminés situées de part et d'autre de ce domaine ne présentent aucune similitude. Une cartographie générale des sites de liaison au CTCF a été réalisée pour de nombreux types cellulaires, mais il n'existe aucune donnée pour CTCFL à l'exception de l'identification de quelques loci. L'absence d'anticorps de bonne qualité nous a conduit à générer un modèle murin portant un CTCFL endogène taggué grâce à un procédé de recombinaison BAC. Une coloration IHC à l'aide d'anticorps anti-FLAG a confirmé la présence de CTCFL au niveau des spermatogonies de type Β et des spermatocytes au stade préleptotène, et une distribution mutuellement exclusive avec CTCF. Une méthode de Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) suivie d'un séquençage à haut débit a permis d'identifier 10.382 sites de liaison montrant 70% d'homologie mais ne représentant que 20% des sites CTCF. L'analyse de la séquence consensus révèle un motif de fixation à l'ADN nettement plus long et qui comporte bien moins de bases aléatoires à chaque position nucléotidique. La différence significative entre les séquences génomiques des sites de liaison au CTCF et CTCFL suggère que leur fixation à l'ADN est régulée différemment. Appliquée à l'échelle du génome, l'étude de l'interaction de CTCFL avec des régions méthylées de l'ADN a permis d'identifier environ 1.000 loci. Contrairement à CTCFL, la liaison de CTCF dépend de l'état de méthylation de l'ADN ; cette modification épigénétique constitue donc au moins un des mécanismes de régulation expliquant une localisation de CTCF et CTCFL à des sites distincts du génome. La co- localisation de CTCF avec la cohésine étant établie, l'analyse de la superposition des séquences de CTCFL avec la sous-unité SMC3 identifie environ 3.300 sites de liaison parmi lesquels deux mêmes motifs consensus distincts par leur séquence sont mis en évidence. La presque quasi-totalité des données sur la cohésine ayant été établie à partir de cellules en prolifération mitotique, il est probable que la similitude au sein des séquences consensus soit encore plus grande dans le cas des cellules en méiose. La sous-unité Rec8 de la cohésine propre à l'état de méiose est spécifiquement exprimée dans les spermatocytes. Or 6 des 12 sites de liaison identifiés sont également utilisés par CTCFL. Pour conclure, ce travail constitue la première cartographie à l'échelle du génome des sites de liaison de CTCFL dans les spermatocytes, seul type cellulaire où CTCFL n'est pas exprimé. CTCFL possède un répertoire unique de sites de fixation à l'ADN distinct de CTCF, se lie à des séquences méthylées et présente un nombre important de sites de liaison communs avec la cohésine. Les perspectives futures sont d'élucider le rôle de CTCFL dans le remodelage de la structure de la chromatine et de définir sa fonction dans le processus de méiose.

Regulation of HCF-1 function via proteolytic maturation and HCF-1 subunit interaction

Abstract : Host-Cell Factor 1 (HCF-1) was first discovered in the study of the herpes simplex virus (HSV) infection. HCF-1 is one of the two cellular proteins that compose the VP16-induced complex, a key activator of HSV lytic infection. lncleed, when HSV infects human cells, it is able to enter two modes of infection: lytic or latent. The V`P16-induced complex promotes the lytic mode and in so doing the virus targets important cellular regulatory proteins, such as HCF-1, to manipulate the status of the infected cell. Indeed, HCF-1 regulates human cell proliferation and the cell cycle at different steps. In human, HCF-1 is unusual in that it undergoes a process of proteolytic maturation that results from cleavages at six centrally located 26 amino acid repeats called HCF-1pro repeats. This generates a heterodimeric complex of stably associated amino- (HCF-1n) and carboxy- (HCF-1c) terminal subunits. The absence of the HCF-1 N or HCF-1; subunit leads predominantly to either G1 or M phase defects, respectively. We have hypothesized that HCF-1 forms a heterodimeric complex to permit communication between the two subunits of HCF-1 involved in regulating different phases of the cell cycle. Indeed, there is evidence for such inter-subunit communication because a point mutation called P134S in the HCF-1N subunit in the temperature-sensitive hamster cell line tsBN67 causes, addition to G1- phase defects associated with the HCF-1n subunit, M-phase defects similar to the defects seen upon loss of HCF-1 function. Furthermore, inhibition of the proteolytic maturation of HCF-1 by deletion of the six HCF-1pro repeats (HCF-1Aimo) also leads to M-phase defects, specifically cytokinesis defects leading to binucleation, indicating that there is loss of HCF-15 function in the absence of HCF-1 maturation. I demonstrate that individual point mutations in each of the six HCF-1pro repeats that prevent HCF-1 proteolytic maturation also lead to binucleation; however, this defect can be latgely rescued by the presence of just one HCF-1pRO sequence in I-ICF»1. These results argue that processing itself is important for the HCF-1g function. In fact, until now, the hypothesis was that the proteolytic processing per se is more important for HCF-1C function than the proteolytic processing region. But I show that processing per se is not sufticient to rescue multinucleation, but that the HCF-lpm sequence itself is crucial. This discovery leads to the conclusion that the I-ICF-1pRO repeats have an additional function important for HCF-le function. From the studies of others, one potential function of the HCF-lrxo tepeats is as a binding site for O-link NAcetyl glycosamine tansferase (OGT) to glycosylate an HCF-1n-sunbunit region called the Basic region. This new function suggests the Basic region of HCF-1n is also implicated in the communication between the two subunits. This inter-subunit communication was analyzed in more detail with the studies of the Pl34S mutation and the residues 382-450 region of HCF-l that when removed prevents HCF-l subunit association. I demonstrate that the point mutation also leads to a binucleation defect in Hela cells as well as in the tsBN67 cells. In addition, the effect of this mutation on the regulation of HCF-1c activity seems to interfere with that of the HCF-lpgg repeats because the sum of the deletion of the proteolytic processing region and the point mutation surprisingly leads to re-establishment of correct cytokinesis. The study of the 382-450 HCF-lN region also yielded surprising results. This region important for the association of the two subunits is also important for both HCF-1c function in M phase and G1 phase progression. Thus, I have discovered two main functions of this region: its role in the regulation of HCF-lc function in M phase and its involvement in the regulation of G1/S phase ?- an HCF-1n function. These results support the importance of inter-subunit communication in HCF-1 functions. My research illuminates the understanding of the interaction of the two subunits by showing that the whole HCF-1n subunit is involved in the inter-subunit communication in order to regulate HCF-1c function. For this work, I was concentrated on the study of cytokinesis; the first phenotype showing the role of HCF-1c in the M phase. Then, I extended the study of the M phase with analysis of steps earlier to cytokinesis. Because some defects in the chromosome segregation was already described in the absence of HCF-1, I decided to continue the study of M phase by checking effects on the chromosome segregation. I showed that the HCF-1n subunit and HCF-1pro repeats are both important for this key step of M phase. I show that the binucleation phenotype resulting from deletion or mutation in HCF-1pro repeats, Pl34S point mutation or the lack of the region 382-450 are correlated with micronuclei, and chromosome segregation and alignment defects. This suggests that HCF«lç already regulates M phase during an early step and could be involved in the complex regulation of chromosome segregation. Because one of the major roles of HCF-1 is to be a transcription regulator, I also checked the capacity of HCF-1 to bind to the chromatin in my different cell lines. All my recombinant proteins can bind the chromatin, except for, as previously described, the HCF-1 with the P134S point mutation, This suggests that the binding of HCF-1 to the chromatin is not dependant to the Basic and proteolytic regions but more to the Kelch domain. Thus, if the function of HCF-ig in M phase is dependant to its chromatin association, the intercommunication and the proteolytic region are not involved in the ability to bind to the chromatin but more to bind to the right place of the chromatin or to be associated with the co-factors. Résumé : L'étude de l'infection par le virus Herpes Simplex (HSV) a permis la découverte de la protéine HCF-1 (Host-Cell Factor). HCF-1 est une des protéines cellulaires qui font partie du complexe induit par VP16 ; ce complexe est la clef pour l'activation de la phase lytique de HSV. Afin de manipuler les cellules infectées, le complexe induit pas le VPIG devrait donc cibler les protéines importantes pour la régulation cellulaire, telles que la protéine HCF-1. Cette dernière s'avère donc être un senseur pour la cellule et devrait également jouer un rôle de régulation lors des différentes phases du cycle cellulaire. Chez l'humain, HCF-1 a la particularité de devoir passer par une phase de maturation pour devenir active. Lors de cette maturation, la protéine subit une coupure protéolytique au niveau de six répétitions composées de 26 acides aminés, appelé HCF-1pro repeats. Cette coupure engendre la formation d'un complexe formé de deux sous-unités, HCF-1n et HCF-1c, associées l'une à l'autre de façon stable. Enlever la sous-unité HCF-IN ou C entraîne respectivement des défauts dans la phase G1 et M. Nous pensons donc que HCF-1 forme un complexe hétérodimérique afin de permettre la communication entre les molécules impliquées dans la régulation des différentes phases du cycle cellulaire. Cette hypothèse est déduite suite à deux études: l'une réalisée sur la lignée cellulaire tsBN67 et l'autre portant sur l'inhibition de la maturation protéolytique. La lignée cellulaire tsBN67, sensible à la température, porte la mutation Pl 345 dans la sous-unité HCF-1n. Cette mutation, en plus d'occasionner des défauts dans la phase G1 (défauts liés à la sous-unité HCF-1N), a aussi pour conséquence d'entrainer des défauts dans la phase M, défauts similaires à ceux dus a la perte de la sous-unité HCF-1c. Quant à la maturation protéolytique, l'absence de la région de la protéolyse provoque la binucléation, défaut lié à la cytokinèse, indiquant la perte de la fonction de la sous-unité HCF-1c. Au cours de ma thèse, j'ai démontré que des mutations dans les HCF-1=no repeats, qui bloquent la protéolyse, engendrent la binucléation ; cependant ce défaut peut être corrigé pas l'ajout d'un HCF-1pro repeat dans un HCF-1 ne contenant pas la région protéolytique. Ces résultats soutiennent l'idée que la région protéolytique est importante pour le bon fonctionnement de HCF-1c. En réalité jusqu'a maintenant on supposait que le mécanisme de coupure était plus important que la région impliquée pour la régulation de la fonction de HCF-1;. Mais mon étude montre que la protéolyse n'est pas suffisante pour éviter la binucléation ; en effet, les HCF-1pro repeats semblent jouer le rôle essentiel dans le cycle cellulaire. Cette découverte conduit à la conclusion que les HCF-1pro repeats ont sûrement une fonction autre qui serait cruciale pour la foncton de HCF-1c. Une des fonctions possibles est d'être le site de liaison de l'O-linked N-acetylglucosamine transférase (OGT) qui glycosylerait la région Basique de HCF-1n. Cette nouvelle fonction suggère que la région Basique est aussi impliquée dans la communication entre les deux sous- unités. L'intercommunication entre les deux sous-unités ai été d'ailleurs analysée plus en détail dans mon travail à travers l'étude de la mutation Pl34S et de la région 382-450, essentielle pour l'association des deux sous»unités. J'ai ainsi démontré que la mutation P134S entraînait aussi des défauts dans la cytokinése dans la lignée cellulaire Hela, de plus, son influence sur HCF-1c semble interférer avec celle de la région protéolytique. En effet, la superposition de ces deux modifications dans HCF-1 conduit au rétablissement d'une cytokinése correcte. Concernant la région 382 à 450, les résultats ont été assez surprenants, la perte de cette région provoque l'arrêt du cycle en G1 et la binucléation, ce qui tend à prouver son importance pour le bon fonctionnement de HCF-1n et de HCF-1c. Cette découverte appuie par conséquent l'hypotl1èse d'une intercommunicatzion entre les deux sous-unités mettant en jeu les différentes régions de HCF-1n. Grâce à mes recherches, j'ai pu améliorer la compréhension de l'interaction des deux sous-unités de HCF-1 en montrant que toutes les régions de HCF-1n sont engagées dans un processus d'intercommunication, dont le but est de réguler l'action de HCF-1c. J'ai également mis en évidence une nouvelle étape de la maturation de HCF-1 qui représente une phase importante pour l'activation de la fonction de HCF-1c. Afin de mettre à jour cette découverte, je me suis concentrée sur l'étude de l'impact de ces régions au niveau de la cytokinése qui fut le premier phénotype démontrant le rôle de HCF-1c dans la phase M. A ce jour, nous savons que HCF-1c joue un rôle dans la cytokinèse, nous ne connaissons pas encore sa fonction précise. Dans le but de cerner plus précisément cette fonction, j'ai investigué des étapes ultérieures ai la cytokinèse. Des défauts dans la ségrégation des chromosomes avaient déjà été observés, ai donc continué l'étude en prouvant que HCF-1n et les HCF-1pro repeats sont aussi importants pour le bon fonctionnement de cette étape clef également régulée par HCF-1c. J' ai aussi montré que la région 382-450 et la mutation P134S sont associées à un taux élevé de micronoyaux, de défauts dans la ségrégation des chromosomes. L'une des fonctions principales de HCF-1 étant la régulation de la transcription, j'ai aussi contrôlé la capacité de HCF-1 à se lier à la chromatine après insertion de mutations ou délétions dans HCF-1n et dans la région protéolytique. Or, à l'exception des HCF-1 contenant la mutation P134S, la sous-unité HCF-1c des HCF-1 tronquées se lie correctement à la chromatine. Cette constatation suggère que la liaison entre HCF-1c et chromatine n'est pas dépendante de la région Basique ou Protéolytique mais peut-être vraisemblablement de la région Kelch. Donc si le rôle de HCF-1c est dépendant de sa capacité â activer la transcription, l'intercommunication entre les deux sous-unités et la région protéolytique joueraient un rôle important non pas dans son habileté à se lier à la chromatine, mais dans la capacité de HCF-1 à s'associer aux co-facteurs ou à se placer sur les bonnes régions du génome.