Targeting anticancer therapy : clinical and preclinical approaches

AbstractCancer treatment has shifted from cytotoxic and nonspecific chemotherapy to chronic treatment with targeted molecular therapies. These new classes of drugs directed against cancer-specific molecules and signaling pathways, act at a particular level of the tumor cell development. However, in both types of therapeutic approaches (standard cytotoxic chemotherapy and targeted signal transduction inhibitions), toxicity and side effects can occur. The aim of this thesis was to investigate various approaches to improve the activity and tolerability of cancer treatment, in a clinical setting, a) by molecular targeting through the use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs), whose dosage can be adapted to each patient according to plasma levels, and, b) in a preclinical model, by tissue targeting with locoregional administration of cytotoxic chemotherapy to increase drug exposure in the target tissue while reducing systemic toxicity of the treatment.A comprehensive program for the Therapeutic Drug Monitoring (TDM) of the new class of targeted anticancer drugs of TKIs in patient's blood has been therefore initiated comprising the setting up, validation and clinical application of a multiplex assay by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry of TKIs in plasma from cancer patients. Information on drugs exposure may be clinically useful for an optimal follow-up of patients' anticancer treatment, especially in case of less than optimal clinical response, occurrence of adverse drug reaction effects and the numerous risks of drug-drug interactions. In this context, better knowledge of the potential drug interactions between TKIs and widely prescribed co- medications is of critical importance for clinicians, to improve their daily care of cancer patients. For one of the first TKI imatinib, TDM interpretation is nowadays based on total plasma concentrations but, only the unbound (free) form is likely to enter cell to exert its pharmacological action. Pharmacokinetic analysis of the total and free plasma level of imatinib measured simultaneously in patients have allowed to refine and validate a population pharmacokinetic model integrating factors influencing in patients the exposure of pharmacological active species. The equation developed from this model may be used for extrapolating free imatinib plasma concentration based on the total plasma levels that are currently measured in TDM from patients. Finally, the specific influence of Pglycoprotein on the intracellular disposition of TKIs has been studies in cell systems using the siRNA silencing approach.Another approach to enhance the selectivity of anticancer treatment may be achieved by the loco-regional administration of a cytostatic agent to the target organ while sparing non- affected tissues. Isolated lung perfusion (ILP) was designed for the treatment of loco-regional malignancies of the lung but clinical results have been so far disappointing. It has been shown in a preclinical model in rats that ILP with the cytotoxic agent doxorubicin alone allows a high drug uptake in lung tissue, and a low systemic toxicity, but was characterized by a high spatial tissular heterogeneity in drug exposure and doxorubicin uptake in tumor was comparatively smaller than in normal lung tissue. Photodynamic therapy (PDT) is a new approach for the treatment of superficial tumors, and implies the application of a sensitizer activated by a laser light at a specific wavelength, that disrupts endothelial barrier of tumor vessels to increase locally the distribution of cytostatics into the tumor tissue. PDT pre-treatment before intravenous administration of liposomal doxorubicin was indeed shown to selectively increase drug uptake in tumors in a rat model of sarcoma tumors to the lung.RésuméLe traitement de certains cancers s'est progressivement transformé et est passé de la chimiothérapie, cytotoxique et non spécifique, au traitement chronique des patients avec des thérapies moléculaires ciblées. Ces médicaments ont une action ciblée en interférant à un niveau spécifique du développement de la cellule tumorale. Dans les deux types d'approches thérapeutiques (chimiothérapie cytotoxique et traitements ciblés), on est confronté à la présence de toxicité et aux effets secondaires du traitement anticancéreux. Le but de cette thèse a donc été d'étudier diverses approches visant à améliorer l'efficacité et la tolérabilité du traitement anticancéreux, a) dans le cadre d'une recherche clinique, par le ciblage moléculaire grâce aux inhibiteurs de tyrosines kinases (TKIs) dont la posologie est adaptée à chaque patient, et b) dans un modèle préclinique, par le ciblage tissulaire grâce à l'administration locorégionale de chimiothérapie cytotoxique, afin d'augmenter l'exposition dans le tissu cible et de réduire la toxicité systémique du traitement.Un programme de recherche sur le suivi thérapeutique (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) des inhibiteurs de tyrosine kinases a été ainsi mis en place et a impliqué le développement, la validation et l'application clinique d'une méthode multiplex par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem des TKIs chez les patients souffrant de cancer. L'information fournie par le TDM sur l'exposition des patients aux traitements ciblés est cliniquement utile et est susceptible d'optimiser la dose administrée, notamment dans les cas où la réponse clinique au traitement des patients est sous-optimale, en présence d'effets secondaires du traitement ciblé, ou lorsque des risques d'interactions médicamenteuses sont suspectés. Dans ce contexte, l'étude des interactions entre les TKIs et les co-médications couramment associées est utile pour les cliniciens en charge d'améliorer au jour le jour la prise en charge du traitement anticancéreux. Pour le premier TKI imatinib, l'interprétation TDM est actuellement basée sur la mesure des concentrations plasmatiques totales alors que seule la fraction libre (médicament non lié aux protéines plasmatiques circulantes) est susceptible de pénétrer dans la cellule pour exercer son action pharmacologique. L'analyse pharmacocinétique des taux plasmatiques totaux et libres d'imatinib mesurés simultanément chez les patients a permis d'affiner et de valider un modèle de pharmacocinétique de population qui intègre les facteurs influençant l'exposition à la fraction de médicament pharmacologiquement active. L'équation développée à partir de ce modèle permet d'extrapoler les concentrations libres d'imatinib à partir des concentrations plasmatiques totales qui sont actuellement mesurées lors du TDM des patients. Finalement, l'influence de la P-glycoprotéine sur la disposition cellulaire des TKIs a été étudiée dans un modèle cellulaire utilisant l'approche par la technologie du siRNA permettant de bloquer sélectivement l'expression du gène de cette protéine d'efflux des médicaments.Une autre approche pour augmenter la sélectivité du traitement anticancéreux consiste en une administration loco-régionale d'un agent cytostatique directement au sein de l'organe cible tout en préservant les tissus sains. La perfusion isolée du poumon (ILP) a été conçue pour le traitement loco-régional des cancers affectant les tissus pulmonaires mais les résultats cliniques ont été jusqu'à ce jour décevants. Dans des modèles précliniques chez le rat, il a pu être démontré que l'ILP avec la doxorubicine, un agent cytotoxique, administré seul, permet une exposition élevée au niveau du tissu pulmonaire, et une faible toxicité systémique. Toutefois, cette technique est caractérisée par une importante variabilité de la distribution dans les tissus pulmonaires et une pénétration du médicament au sein de la tumeur comparativement plus faible que dans les tissus sains.La thérapie photodynamique (PDT) est une nouvelle approche pour le traitement des tumeurs superficielles, qui consiste en l'application d'un agent sensibilisateur activé par une lumière laser de longueur d'onde spécifique, qui perturbe l'intégrité physiologique de la barrière endothéliale des vaisseaux alimentant la tumeur et permet d'augmenter localement la pénétration des agents cytostatiques.Nos études ont montré qu'un pré-traitement par PDT permet d'augmenter sélectivement l'absorption de doxorubicine dans les tumeurs lors d'administration i.v. de doxorubicine liposomale dans un modèle de sarcome de poumons de rongeurs.Résumé large publicDepuis une dizaine d'année, le traitement de certains cancers s'est progressivement transformé et les patients qui devaient jusqu'alors subir des chimiothérapies, toxiques et non spécifiques, peuvent maintenant bénéficier de traitements chroniques avec des thérapies ciblées. Avec les deux types d'approches thérapeutiques, on reste cependant confronté à la toxicité et aux effets secondaires du traitement.Le but de cette thèse a été d'étudier chez les patients et dans des modèles précliniques les diverses approches visant à améliorer l'activité et la tolérance des traitements à travers un meilleur ciblage de la thérapie anticancéreuse. Cet effort de recherche nous a conduits à nous intéresser à l'optimisation du traitement par les inhibiteurs de tyrosines kinases (TKIs), une nouvelle génération d'agents anticancéreux ciblés agissant sélectivement sur les cellules tumorales, en particulier chez les patients souffrant de leucémie myéloïde chronique et de tumeurs stromales gastro-intestinales. L'activité clinique ainsi que la toxicité de ces TKIs paraissent dépendre non pas de la dose de médicament administrée, mais de la quantité de médicaments circulant dans le sang auxquelles les tumeurs cancéreuses sont exposées et qui varient beaucoup d'un patient à l'autre. A cet effet, nous avons développé une méthode par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse pour mesurer chez les patients les taux de médicaments de la classe des TKIs dans la perspective de piloter le traitement par une approche de suivi thérapeutique (Therapeutic Drug Monitoring, TDM). Le TDM repose sur la mesure de la quantité de médicament dans le sang d'un patient dans le but d'adapter individuellement la posologie la plus appropriée: des quantités insuffisantes de médicament dans le sang peuvent conduire à un échec thérapeutique alors qu'un taux sanguin excessif peut entraîner des manifestations toxiques.Dans une seconde partie préclinique, nous nous sommes concentrés sur l'optimisation de la chimiothérapie loco-régionale dans un modèle de sarcome du poumon chez le rat, afin d'augmenter l'exposition dans la tumeur tout en réduisant la toxicité dans les tissus non affectés.La perfusion isolée du poumon (ILP) permet d'administrer un médicament anticancéreux cytotoxique comme la doxorubicine, sélectivement au niveau le tissu pulmonaire où sont généralement localisées les métastases de sarcome. L'administration par ILP de doxorubicine, toxique pour le coeur, a permis une forte accumulation des médicaments dans le poumon, tout en épargnant le coeur. Il a été malheureusement constaté que la doxorubicine ne pénètre que faiblement dans la tumeur sarcomateuse, témoignant des réponses cliniques décevantes observées avec cette approche en clinique. Nous avons ainsi étudié l'impact sur la pénétration tumorale de l'association d'une chimiothérapie cytotoxique avec la thérapie photodynamique (PDT) qui consiste en l'irradiation spécifique du tissu-cible cancéreux, après l'administration d'un agent photosensibilisateur. Dans ce modèle animal, nous avons observé qu'un traitement par PDT permet effectivement d'augmenter de façon sélective l'accumulation de doxorubicine dans les tumeurs lors d'administration intraveineuse de médicament.

The use of proteomics to identify markers associated with metastasis in "Leishmania Viannia" species the role of tryparedoxin peroxidase

RESUME En Amérique Centrale et en Amérique du Sud, la leishmaniose cutanéo-muqueuse (LCM) est provoquée par le protozoaire Leishmania du sous-genre Viannia dont font partie L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis et L. (V.) guyanensis. Dans la LCM, après guérison apparente de la lésion primitive, des lésions secondaires peuvent apparaître dues à la migration de l'infection à partir du site d'inoculation vers les muqueuses de l'ororhino-pharynx. Ce type de dissémination, communément appelé métastase, peut se produire plusieurs années après la guérison de la lésion cutanée initiale, et est un facteur majeur contribuant à la morbidité associée à la LCM. L'expression reproductible de l'activité métastatique au sein de populations discrètes de leishmanies chez le hamster fournit un modèle expérimental permettant d'étudier le degré de virulence du parasite. Nous avons utilisé des clones de L. (V.) guyanensis présentant des phénotypes stables allant d'un caractère hautement métastatique (M+) à non-métastatique (M-) comme outils pour mettre en évidence des facteurs spécifiques liés à la métastase chez les leishmanies du Nouveau Monde. Des analyses protéomiques comparatives utilisant l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide couplée à de la spectrométrie de masse ont permis l'identification de plusieurs formes de la tryparedoxine peroxidase (TXNPx) en tant que polypeptides associés au phénotype métastatique. TXNPx, une enzyme de la famille des peroxiredoxines (Prxs), protéines antioxydantes, fonctionne comme la dernière peroxydase d'une cascade d'oxydoréductases qui réduit le peroxyde d'hydrogène aux dépens de NADPH. Toutes les Prxs sont caractérisées par un (1-Cys Prx) ou par deux résidus cystéines (2-Cys Prx), respectivement placés dans un environnement structurel conservé de la protéine et sont centrales dans la réaction catalytique. Des immuno-empreintes (« immunoblotting ») ont révélé que TXNPx est présente sous forme dimérique dans les promastigotes (M+) alors que dans les promastigotes, (M-) TXNPx est présente sous forme monomérique et dimérique. Cette caractéristique spécifique de dimérisation pourrait expliquer les différentes activités enzymatiques observées entre les deux promastigotes (M+) et (M-) en présence de peroxyde d'hydrogène ainsi que leur différence de survie et de charge parasitaire à l'intérieur des macrophages. Par conséquent, le processus métastatique pourrait être lié à la capacité du parasite à échapper efficacement aux défenses microbicides de la cellule hôte. ABSTRACT In South and Central America, protozoan parasites of the Leishmania Viannia subgenus including L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis and L. (V). panamensis cause mucocutaneous leishmaniasis (MCL). In MCL, after apparent cure of the primary lesion, secondary lesions may appear in the nasopharyngeal tissues of the infected host due to dissemination of the infection from the inoculation site. This type of dissemination, known as metastasis, can occur several years after healing of the original cutaneous lesion, and is a major contributory factor to the morbidity associated with MCL. The reproducible expression of metastasis by discrete populations of Leishmania parasites in hamsters provides an experimental model to examine the expression of parasite virulence. We used laboratory clones of L. (V.) guyanensis with stable phenotypes ranging from highly metastatic (M+) to non-metastatic (M-) as tools for the discovery of specific factors associated with metastasis in New World Leishmania species. Comparative proteome analyses via 2D-electrophoresis (2-DE) coupled with mass spectrometry (MS) enabled the identification of various isoforms of tryparedoxin peroxidase (TXNPx) as polypeptides associated with the metastatic phenotype. TXNPx, an enzyme related to the antioxidant peroxiredoxin family (Prx) functions as the terminal peroxidase of a redox cascade that reduces hydroperoxides by NADPH. All Prxs are characterized by one (1-Cys Prx) or two cysteine residue(s) (2-Cys Prx), respectively, located in a conserved structural environment of the protein which are central for the catalytic reaction. Immunoblotting analysis revealed that, under non-reducing denaturing conditions, TXNPx is present in dimeric forms in (M+) promastigotes, whereas in (M-) promastigotes, both monomeric and dimeric forms are found. This specific dimerization feature may explain the different enzymatic activities of both (M+) and (M-) promastigote parasites in the presence of H2O2 and their difference in survival and parasite load inside macrophages. Therefore, the metastatic process could be related to the ability of the parasite to efficiently evade the microbicidal effect of the host cell.

Pharmacokinetic and pharmacogenetic factors influencing plasma and cellular antiretroviral drug disposition

Abstract: The improvement in antiretroviral drug therapy has transformed HIV infection into a chronic disease. However, treatment failure and drug toxicity are frequent. Inadequate response to treatment is clearly multifactorial and, therefore, dosage individualisation based on demographic factors, genetic markers and measurement of cellular and plasma drug level may enhance both drug efficacy and tolerability. At present, antiretroviral drugs levels are monitored in plasma, whereas only drugs penetrating into cells are able to exert an antiviral activity, suggesting that cellular drug determination may more confidently reflect drug exposure at the site of pharmacological action. The overall objective of this thesis is to provide a better understanding of the Pharmacokinetic and pharmacogenetic factors influencing the plasma and cellular disposition of antiretroviral drugs. To that endeavour, analytical methods for the measurements of plasma and cellular drug levels have been developed and validated using liquid chromatography methods coupled with ultraviolet and tandem mass spectrometry detection, respectively. Correlations between plasma and cellular exposures were assessed during observational and experimental studies. Cytochrome (CYP) 2B6, efflux transporters (ABCB1, ABCC1, ABCC2 and ABCG2) and orosomucoid (ORM) polymorphisms were determined and were related to plasma and cellular exposures, as well as toxicity of antiretroviral drugs. A Pharmacokinetic population model was developed to characterise inter- and intra-patient variability of atazanavir pharmacokinetics, and to identify covariates influencing drug disposition. In that context, a Pharmacokinetic interaction study between atazanavir and lopinavir, both boosted with ritonavir, has beén conducted to assess the safety and pharmacokinetics of this boosted double-protease inhibitors regimen. Well to moderately-correlated cellular and plasma drug levels are .observed or protease inhibitors, whereas for efavirenz and nevirapine these correlations are weak. Cellular exposure, and CYP2B6 genotype (516G>T) are predictors of efavirenz neuropsychological toxicity. Nevirapine plasma exposure is also influenced by CYPZB6 polymorphism. Nelfinavir cellular exposure appears to be significantly associated only with ABCB1 genotype (3435C>T and intron 26 + 80T>C). Indinavir and lopinavir clearance and lopinavir cellular/plasma exposure ratio are influenced by the concentration of the variant S of ORM, suggesting-a specific binding of these drugs to this variant. Nelfinavir and efavirenz are not influenced by ORM concentration and phenotype. The Pharmacokinetic parameters of atazanavir are adequately described by our population model. The atazanavir-lopinavir interaction study indicates no influence on plasma and cellular atazanavir pharmacokinetics, while limited decrease in lopinavir concentrations was observed after atazanavir addition. The residual variability unexplained by the considered variables suggests that other covariates either uncontrolled at present or remaining to be identified, such as genetic and environmental factors influence antiretroviral drug pharmacokinetics, with substantial impact on treatment efficacy and tolerability. In that context, a comprehensive approach taking into account drug pharmacokinetics and patient genetic background is expected to contribute to increase treatment success, and to reduce the occurrence of adverse drug reactions by stratifying patients in an individualised antiretroviral therapy approach. Résumé Facteurs pharmacocinétiques et pharmacogénétiques influençant l'exposition plasmatique et cellulaire des antirétroviraux Les progrès de la thérapie antirétrovirale ont transformé l'infection par le VIH d'une affection mortelle à une maladie chronique. En dépit de ce succès, l'échec thérapeutique et la toxicité médicamenteuse restent fréquents. Une réponse inadéquate au traitement est clairement multifactorielle et une individualisation de la posologie des médicaments qui se baserait sur les facteurs démographiques et génétiques des patients et sur les taux sanguins des médicaments pourrait améliorer à la fois l'efficacité et la tolérance de la thérapie. Par ailleurs, seules les concentrations plasmatiques sont actuellement considérées pour le suivi thérapeutique des médicaments, alors que les taux cellulaires pourraient mieux refléter l'activité de ses médicaments qui agissent au niveau intracellulaire. L'objectif global de cette thèse était de mieux comprendre les facteurs pharmacocinétiques et pharmacocénétiques influençant l'exposition plasmatique et cellulaire des médicaments antirétroviraux. A cet effet, des méthodes pour quantifier les concentrations plasmatiques et cellulaires des antirétroviraux ont été développées et validées en utilisant la chromatographie liquide couplée à la détection ultraviolette et la spectrométrie de masse en tandem, respectivement. La corrélation entre l'exposition cellulaire et plasmatique de ces médicaments a été étudiée lors d'études observationnelles et expérimentales. Les polymorphismes du cytochrome (CYP) 2B6, ainsi que des transporteurs d'efflux (ABCB1, ABCC1, ABCC2 et ABCG2) et de l'orosomucoïde (ORM) ont été déterminés et corrélés avec l'exposition plasmatique et cellulaire des antirétroviraux, ainsi qu'à leur toxicité. Un modèle de pharmacocinétique de population a été établi afin de caractériser la variabilité inter- et intra-individuelle de l'atazanavir, et d'identifier les covariables pouvant influencer le devenir de ce médicament. Dans ce contexte, une étude d'interaction entre l'atazanavir et le lopinavir a été effectuée afin de déterminer la sécurité et le profil pharmacocinétique de ce régime thérapeutique. Des corrélations modérées à bonnes ont été observées entre les taux cellulaires et plasmatiques des inhibiteurs de protéase, alors que pour l'efavirenz et la névirapine ces corrélations sont faibles. L'exposition cellulaire, ainsi que le génotype du CYP2B6 (516G>T) sont des indices de la toxicité neuropsychologique de l'efavirenz. L'exposition plasmatique de la névirapine est également influencée par le polymorphisme du CYPZB6. L'exposition cellulaire du nelfinavir est significativement associée au génotype du ABCB1 (3435C>T et intron 26 + 80T>C). La clairance de l'indinavir et du lopinavir, ainsi que le rapport entre exposition cellulaire et plasmatique du lopinavir sont influencés par la concentration du variant S de l'ORM, suggérant une liaison spécifique de ces médicaments à ce variant. La clairance du nelfinavir et de l'efavirenz n'est pas influencée ni par la concentration ni par le phénotype de l'ORM. Les paramètres pharmacocinétiques de l'atazanavir ont été décrits de façon adéquate par le modèle de population proposé. De plus, le lopinavir n'influence pas les concentrations plasmatiques et cellulaires de l'atazanavir; alors que celui-ci conduit à une baisse limitée des taux de lopinavir. L'importante variabilité pharmacocinétique des antirétroviraux suggère que d'autres facteurs génétiques et environnementaux -qui restent encore à découvrir- influencent également leur disponibilité. Dans un proche futur, une prise en charge qui tienne. compte de la pharmacocinétique des médicaments et des caractéristiques génétiques du patient devrait permettre d'individualiser le traitement, contribuant certainement à une amélioration de la réponse thérapeutique et à une diminution de la toxicité. Résumé grand public Facteurs pharmacocinétiques et pharmacogénétiques influençant l'exposition plasmatique et cellulaire des antirétroviraux Les progrès effectués dans le traitement de l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine acquise (VIH), ont permis de transformer une maladie avec un pronostic sombre, en une maladie chronique traitable avec des médicaments de plus en plus efficaces. Malgré ce succès, de nombreux patients ne répondent pas de façon optimale à leur traitement et/ou souffrent d'effets indésirables médicamenteux entraînant fréquemment une modification de leur thérapie. Actuellement, le suivi de la réponse au traitement s'effectue par la mesure chez les patients de la quantité de virus et du nombre des cellules immunitaires dans le sang, ainsi que par la concentration sanguine des médicaments administrés. Cependant, comme le virus se réplique à l'intérieur de la cellule, la mesure des concentrations médicamenteuses au niveau intracellulaire pourrait mieux refléter l'activité pharmacologique au site d'action. De plus, il a été possible de mettre en évidence la grande variabilité des concentrations plasmatiques de médicaments chez des patients prenant pourtant la même dose de médicament. Comme cette variabilité est notamment due à des facteurs génétiques qui sont susceptibles d'influencer la réponse au traitement antirétroviral, des analyses génétiques ont été également effectuées chez ces patients. Cette thèse a eu pour objectif de mieux comprendre les facteurs pharmacologiques et génétiques influençant l'activité et la toxicité des médicaments antirétroviraux afin de réduire la variabilité de la réponse thérapeutique. A cet effet, une méthode de dosage permettant la quantification des médicaments anti-HIV au niveau intracellulaire a été développée. Par ailleurs, nos études ont également porté .sur les variations génétiques influençant la quantité et l'activité des protéines impliquées dans le métabolisme et dans le transport des médicaments antirétroviraux. Enfin, les conséquences de ces variations sur la réponse clinique et la toxicité du traitement ont été évaluées. Nos études ont mis en évidence des associations significatives entre les variations génétiques considérées et la concentration sanguine, cellulaire et la toxicité de quelques médicaments antirétroviraux. La complémentarité des connaissances pharmacologiques, génétiques et virales pourrait aboutir à une stratégie globale permettant d'individualiser le traitement et la dose administrée, en fonction des caractéristiques propres de chaque patient. Cette approche pourrait contribuer à une optimisation du traitement antirétroviral dans la perspective d'une meilleure- efficacité thérapeutique à long terme et d'une diminution des effets indésirables rencontrés.

Identification and quantification techniques in mass spectrometry-based proteomics

Résumé La protéomique basée sur la spectrométrie de masse est l'étude du proteome l'ensemble des protéines exprimées au sein d'une cellule, d'un tissu ou d'un organisme - par cette technique. Les protéines sont coupées à l'aide d'enzymes en plus petits morceaux -les peptides -, et, séparées par différentes techniques. Les différentes fractions contenant quelques centaines de peptides sont ensuite analysées dans un spectromètre de masse. La masse des peptides est enregistrée et chaque peptide est séquentiellement fragmenté pour en obtenir sa séquence. L'information de masse et séquence est ensuite comparée à une base de données de protéines afin d'identifier la protéine d'origine. Dans une première partie, la thèse décrit le développement de méthodes d'identification. Elle montre l'importance de l'enrichissement de protéines comme moyen d'accès à des protéines de moyenne à faible abondance dans le lait humain. Elle utilise des injections répétées pour augmenter la couverture en protéines et la confiance dans l'identification. L'impacte de nouvelle version de base de données sur la liste des protéines identifiées est aussi démontré. De plus, elle utilise avec succès la spectrométrie de masse comme alternative aux anticorps, pour valider la présence de 34 constructions de protéines pathogéniques du staphylocoque doré exprimées dans une souche de lactocoque. Dans une deuxième partie, la thèse décrit le développement de méthodes de quantification. Elle expose de nouvelles approches de marquage des terminus des protéines aux isotopes stables et décrit la première méthode de marquage des groupements carboxyliques au niveau protéine à l'aide de réactifs composé de carbone 13. De plus, une nouvelle méthode, appelée ANIBAL, marquant tous les groupements amines et carboxyliques au niveau de la protéine, est exposée. Summary Mass spectrometry-based proteomics is the study of the proteome -the set of all expressed proteins in a cell, tissue or organism -using mass spectrometry. Proteins are cut into smaller pieces - peptides - using proteolytic enzymes and separated using different separation techniques. The different fractions containing several hundreds of peptides are than analyzed by mass spectrometry. The mass of the peptides entering the instrument are recorded and each peptide is sequentially fragmented to obtain its amino acid sequence. Each peptide sequence with its corresponding mass is then searched against a protein database to identify the protein to which it belongs. This thesis presents new method developments in this field. In a first part, the thesis describes development of identification methods. It shows the importance of protein enrichment methods to gain access to medium-to-low abundant proteins in a human milk sample. It uses repeated injection to increase protein coverage and confidence in identification and demonstrates the impact of new database releases on protein identification lists. In addition, it successfully uses mass spectrometry as an alternative to antibody-based assays to validate the presence of 34 different recombinant constructs of Staphylococcus aureus pathogenic proteins expressed in a Lactococcus lactis strain. In a second part, development of quantification methods is described. It shows new stable isotope labeling approaches based on N- and C-terminus labeling of proteins and describes the first method of labeling of carboxylic groups at the protein level using 13C stable isotopes. In addition, a new quantitative approach called ANIBAL is explained that labels all amino and carboxylic groups at the protein level.

Haemodialysis acutely reduces the plasma levels of ADMA without reversing impaired NO-dependent vasodilation

Rapport de synthèse : Introduction: la prévalence de l'insuffisance rénale chronique (IRC) augmente et malgré les traitements de remplacement rénal telle que la transplantation ou la dialyse, la mortalité chez des patients atteints d'une IRC reste très élevée. Les maladies cardiovasculaires sont la cause principale de mortalité chez ces patients, et le risque de décès dú à une complication cardiovasculaire est chez eux accru de 10 à 20 fois par rapport à la population générale. Méme si les facteurs de risque cardiovasculaires «traditionnels », principalement l'hypertension artérielle et le diabète sont très prévalents chez les patients avec IRC, ils sont insuffisants pour expliquer l'excès de mortalité cardiovasculaire. D'autres facteurs de risques « nontraditionnels » comme l'accumulation du diméthylarginine asymétrique (ADMA), un inhibiteur endogène de la synthase d'oxyde d'azote (NO), semblent aussi être importants. Chez les patients avec IRC, des taux élevés d'ADMA sont un puissant facteur prédictif indépendant de la mortalité cardiovasculaire. Il a également été démontré chez des souris que l'ADMA peut étre une cause directe de dysfonction endothéliale. Cette dernière joue un rôle primordial dans le développement de l'athérosclérose, cause principale des complications cardiovasculaires. Le but du présent travail est de tester l'hypothèse qu'une réduction du taux d'ADMA après une séance unique d'hémodialyse améliore la dysfonction endothéliale. Méthodes: la dysfonction endothéliale peut être évaluée dans les microvaisseaux de la péan de façon non invasive par fluxmétrie laser Doppler. La vasodilatation cutanée induite par un échauffement local de 34° à 41 °C (hyperémie thermique) est connue pour être dépendante de la production endothéliale de NO et a été utilisée dans plusieurs études cliniques pour évaluer la dysfonction endothéliale. Nous avons recruté 24 patients traités par hémodialyse chronique et également 24 sujets contrôles du même âge et sexe. Chez les patients dialysés, l'hyperémie thermique est mesuré une fois directement avant une séance d'hémodialyse, et une fois directement après une autre séance, toutes deux distantes de 2 à 7 jours. En même temps, les taux plasmatiques d'ADMA sont mesurés par la méthode de spectrométrie de masse en tandem. Chez les sujets contrôle, l'hyperémie thermique est également mesurée à deux reprises, à un intervalle de 2 à 7 jours comme chez les patients dialysés et les taux d'ADMA sont déterminés qu'une seule fois. Résultats: chez les patients dialysés, les réactions d'hyperémie thermique étaient superposables avant et après dialyse, mais moindre que chez les sujets contrôles. Par contre, les taux d'ADMA étaient plus élevés avant qu'après dialysé. Les taux d'ADMA après dialyse étaient similaires aux taux chez les sujets contrôles. Conclusion: cette étude montre que la vasodilatation dépendante de la production endothéliale de NO dans la microcirculation cutanée n'est pas influencée par les taux plasmatiques d'ADMA chez les patients dialysés. Ces résultats suggèrent que d'autres mécanismes sont responsables de la dysfonction endothéliale chez ces patients. Ceci met en question le concept que l'accumulation d'ADMA est un facteur causal du risque cardiovasculaire élevé et suggère que l'ADMA est juste un marqueur du milieu très athérogénique causé par l'IRC.

PROTEOMICS OF OXIDATIVE LESIONS OCCURRING DURING TRANSFUSION-PURPOSED STORAGE OF ERYTHROCYTE CONCENTRATES

Erythrocyte concentrates (ECs) are the major labile blood product being transfused worldwide, aiming at curing anemia of diverse origins. In Switzerland, ECs are stored at 4 °C up to 42 days in saline-adenine-glucose-mannitol (SAGM). Such storage induces cellular lesions, altering red blood cells (RBCs) metabolism, protein content and rheological properties. A hot debate exists regarding the impact of the storage lesions, thus the age of ECs on transfusion-related clinical adverse outcomes. Several studies tend to show that poorer outcomes occur in patients receiving older blood products. However, no clear association was demonstrated up to date. While metabolism and early rheological changes are reversible through transfusion of the blood units, oxidized proteins cannot be repaired, and it is likely such irreversible damages would affect the quality of the blood product and the efficiency of the transfusion. In vivo, RBCs are constantly exposed to oxygen fluxes, and are thus well equipped to deal with oxidative challenges. Moreover, functional 20S proteasome complexes allow for recognition and proteolysis of fairly oxidized protein, and some proteins can be eliminated from RBCs by the release of microvesicles. The present PhD thesis is involved in a global research project which goal is to characterize the effect of processing and storage on the quality of ECs. Assessing protein oxidative damages during RBC storage is of major importance to understand the mechanisms of aging of stored RBCs. To this purpose, redox proteomic-based investigations were conducted here. In a first part, cysteine oxidation and protein carbonylation were addressed via 2D-DIGE and derivatization-driven immunodetection approaches, respectively. Then, the oxidized sub- proteomes were characterized through LC-MS/MS identification of proteins in spots of interest (cysteine oxidation) or affinity-purified carbonylated proteins. Gene ontology annotation allowed classifying targets of oxidation according to their molecular functions. In a third part, the P20S activity was evaluated throughout the storage period of ECs, and its susceptibility to highly oxidized environment was investigated. The potential defensive role of microvesiculation was also addressed through the quantification of eliminated carbonylated proteins. We highlighted distinct protein groups differentially affected by cysteine oxidation, either reversibly or irreversibly. In addition, soluble extracts showed a decrease in carbonylation at the beginning of the storage and membrane extracts revealed increasing carbonylation after 4 weeks of storage. Engaged molecular functions revealed that antioxidant (AO) are rather reversibly oxidized at their cysteine residue(s), but are irreversibly oxidized through carbonylation. In the meantime, the 20S proteasome activity is decreased by around 40 % at the end of the storage period. Incubation of fresh RBCs extracts with exogenous oxidized proteins showed a dose-dependent and protein-dependent inhibitory effect. Finally, we proved that the release of microvesicles allows the elimination of increasing quantities of carbonylated proteins. Taken together, these results revealed an oxidative pathway model of RBCs storage, on which further investigation towards improved storage conditions will be based. -- Les concentrés érythrocytaires (CE) sont le produit sanguin le plus délivré au monde, permettant de traiter différentes formes d'anémies. En Suisse, les CE sont stocké à 4 °C pendant 42 jours dans une solution saline d'adénine, glucose et mannitol (SAGM). Une telle conservation induit des lésions de stockage qui altèrent le métabolisme, les protéines et les propriétés rhéologique du globule rouge (GR). Un débat important concerne l'impact du temps de stockage des CE sur les risques de réaction transfusionnelles, certaines études tentant de démontrer que des transfusions de sang vieux réduiraient l'espérance de vie des patients. Cependant, aucune association concrète n'a été prouvée à ce jour. Alors que les modifications du métabolisme et changement précoces des propriétés rhéologiques sont réversibles suite à la transfusion du CE, les protéines oxydées ne peuvent être réparées, et il est probable que de telles lésions affectent la qualité et l'efficacité des produits sanguins. In vivo, les GR sont constamment exposés à l'oxygène, et sont donc bien équipés pour résister aux lésions oxydatives. De plus, les complexes fonctionnels de proteasome 20S reconnaissent et dégradent les protéines modérément oxydées, et certaines protéines peuvent être éliminées par les microparticules. Cette thèse de doctorat est imbriquée dans un projet de recherche global ayant pour objectif la caractérisation des effets de la préparation et du stockage sur la qualité des GR. Evaluer les dommages oxydatifs du GR pendant le stockage est primordial pour comprendre les mécanismes de vieillissement des produits sanguin. Dans ce but, des recherches orientées redoxomique ont été conduites. Dans une première partie, l'oxydation des cystéines et la carbonylation des protéines sont évaluées par électrophorèse bidimensionnelle différentielle et par immunodétection de protéines dérivatisées. Ensuite, les protéines d'intérêt ainsi que les protéines carbonylées, purifiées par affinité, sont identifiées par spectrométrie de masse en tandem. Les protéines cibles de l'oxydation sont classées selon leur fonction moléculaire. Dans une troisième partie, l'activité protéolytique du protéasome 20S est suivie durant la période de stockage. L'impact du stress oxydant sur cette activité a été évalué en utilisant des protéines exogènes oxydées in vitro. Le potentiel rôle défensif de la microvesiculation a également été étudié par la quantification des protéines carbonylées éliminées. Dans ce travail, nous avons observé que différents groupes de protéines sont affectés par l'oxydation réversible ou irréversible de leurs cystéines. De plus, une diminution de la carbonylation en début de stockage dans les extraits solubles et une augmentation de la carbonylation après 4 semaines dans les extraits membranaires ont été montrées. Les fonctions moléculaires engagées par les protéines altérées montrent que les défenses antioxydantes sont oxydées de façon réversible sur leurs résidus cystéines, mais sont également irréversiblement carbonylées. Pendant ce temps, l'activité protéolytique du protéasome 20S décroit de 40 % en fin de stockage. L'incubation d'extraits de GR en début de stockage avec des protéines oxydées exogènes montre un effet inhibiteur « dose-dépendant » et « protéine-dépendant ». Enfin, les microvésicules s'avèrent éliminer des quantités croissantes de protéines carbonylées. La synthèse de ces résultats permet de modéliser une voie oxydative du stockage des GRs, à partir de laquelle de futures recherches seront menées avec pour but l'amélioration des conditions de stockage.

Therapeutic drug monitoring and metabolites profil analysis of antiviral drugs

The widespread use of combination antiretroviral therapy (ARVs) has considerably improved the prognosis of patients infected with HIV. Conversely, considerable advances have been recently realized for the therapy of hepatitis C infection with the recent advent of potent new anti-HCV drugs that allow an increasing rate HCV infection cure. Despite their overall efficacy, a significant number of patients do not achieve or maintain adequate clinical response, defined as an undetectable viral load for HIV, and a sustained virological response (or cure) in HCV infection. Treatment failure therefore still remains an important issue besides drugs toxicities and viral resistance which is not uncommon in a significant percentage of patients who do not reach adequate virological suppression. The reasons of variability in drug response are multifactorial and apart from viral genetics, other factors such as environmental factors, drug- drug interactions, and imperfect compliance may have profound impact on antiviral drugs' clinical response. The possibility of measuring plasma concentration of antiviral drugs enables to guide antiviral drug therapy and ensure optimal drug exposure. The overall objective of this research was to widen up the current knowledge on pharmacokinetic and pharmacogenetic factors that influence the clinical response and toxicity of current and newly approved antiretroviral and anti-HCV drugs. To that endeavour, analytical methods using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry have been developed and validated for the precise and accurate measurement of new antiretroviral and anti-HCV drugs . These assays have been applied for the TDM of ARVs and anti-HCV in patients infected with either HIV or HCV respectively, and co-infected with HIV- HCV. A pharmacokinetic population model was developed to characterize inter and intra-patient variability of rilpivirine, the latest marketed Non Nucleoside Reverse transcriptase (NNRTI) Inhibitor of HIVand to identify genetic and non genetic covariates influencing rilpivirine exposure. None of the factors investigated so far showed however any influence of RPV clearance. Importantly, we have found that the standard daily dosage regimen (25 mg QD) proposed for rilpivirine results in concentrations below the proposed therapeutic target in about 40% of patients. In these conditions, virologie escape is a potential risk that remains to be further investigated, notably via the TDM approach that can be a useful tool to identify patients who are at risk for being exposed to less than optimal levels of rilpivirine in plasma. Besides the last generation NNRTI rilpivirine, we have studied efavirenz, the major NNRTI clinically used so far. Namely for efavirenz, we aimed at identifying a potential new marker of toxicity that may be incriminated for the neuropsychological sides effects and hence discontinuation of efavirenz therapy. To that endeavour, a comprehensive analysis of phase I and phase II metabolites profiles has been performed in plasma, CSF and in urine from patients under efavirenz therapy. We have found that phase II metabolites of EFV constitute the major species circulating in blood, sometimes exceeding the levels of the parent drug efavirenz. Moreover we have identified a new metabolite of efavirenz in humans, namely the 8-OH-EFV- sulfate which is present at high concentrations in all body compartments from patients under efavirenz therapy. These investigations may open the way to possible alternate phenotypic markers of efavirenz toxicity. Finally, the specific influence of P-glycoprotein on the cellular disposition of a series ARVs (NNRTIs and Pis] has been studies in in vitro cell systems using the siRNA silencing approach. -- Depuis l'introduction de la thérapie antirétrovirale (ARVs) la morbidité et la mortalité liées au VIH ont considérablement diminué. En parallèle le traitement contre le virus de l'hépatite C (VHC) a connu récemment d'énormes progrès avec l'arrivée de nouveaux médicaments puissants, ce qui a permis une augmentation considérable de la guérison de l'infection par le VHC. En dépit de l'efficacité de ces traitements antiviraux, les échecs thérapeutiques ainsi que les effets secondaires des traitements restent un problème important. Une réponse imparfaite ou la toxicité du traitement est certainement multifactorielle. Le suivi thérapeutique des médicaments [Therapeutic Drug Monitoring TDM) à travers la mesure des concentrations plasmatiques constitue une approche importante pour guider le traitement médicamenteux et de s'assurer que les patients sont exposés à des concentrations optimales des médicaments dans le sang, et puissent tirer tout le bénéfice potentiel du traitement. L'objectif global de cette thèse était d'étudier les facteurs pharmacocinétiques et pharmacogénétiques qui influencent l'exposition des médicaments antiviraux (ARVs et anti- VHC) récemment approuvés. A cet effet, des méthodes de quantification des concentrations plasmatiques des médicaments antirétroviraux, anti-VHC ainsi que pour certains métabolites ont été développées et validées en utilisant la Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem. Ces méthodes ont été utilisées pour le TDM des ARVs et pour les agents anti-VHC chez les patients infectés par le VIH, et le VHC, respectivement, mais aussi chez les patients co-infectés par le VIH-VHC. Un modèle de pharmacocinétique de population a été développé pour caractériser la variabilité inter-et intra-patient du médicament rilpivirine, un inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase de VIH et d'identifier les variables génétiques et non génétiques influençant l'exposition au médicament. Aucun des facteurs étudiés n'a montré d'influence notable sur la clairance de la rilpivirine. Toutefois, la concentration résiduelle extrapolée selon le modèle de pharmacocinétique de population qui a été développé, a montré qu'une grande proportion des patients présente des concentrations minimales inférieures à la cible thérapeutique proposée. Dans ce contexte, la relation entre les concentrations minimales et l'échappement virologique nécessite une surveillance étroite des taux sanguins des patients recevant de la rilpivirine. A cet effet, le suivi thérapeutique est un outil important pour l'identification des patients à risque soient sous-exposés à lai rilpivirine. Pour identifier de nouveaux marqueurs de la toxicité qui pourraient induire l'arrêt du traitement, le profil des métabolites de phase I et de phase II a été étudié dans différentes matrices [plasma, LCR et urine) provenant de patients recevant de l'efavirenz. Les métabolites de phase II, qui n'avaient à ce jour jamais été investigués, constituent les principales espèces présentes dans les matrices étudiées. Au cours de ces investigations, un nouveau métabolite 8- OH-EFV-sulfate a été identifié chez l'homme, et ce dernier est. présent à des concentrations importantes. L'influence de certains facteurs pharmacogénétique des patients sur le profil des métabolites a été étudiée et ouvre la voie à de possibles nouveaux marqueurs phénotypiques alternatifs qui pourraient possiblement mieux prédire la toxicité associée au traitement par l'efavirenz. Finalement, nous nous sommes intéressés à étudier dans un modèle in vitro certains facteurs, comme la P-glycoprotéine, qui influencent la disposition cellulaire de certains médicaments antirétroviraux, en utilisant l'approche par la technologie du siRNA permettant de bloquer sélectivement l'expression du gène de cette protéine d'efflux des médicaments. -- Depuis l'introduction de la thérapie antiretrovirale (ARVs] la morbidité et la mortalité liées au VIH ont considérablement diminué. En parallèle le traitement contre le virus de l'hépatite C (VHC) a connu récemment d'énormes progrès avec l'arrivée de nouveaux médicaments puissants, ce qui a permis une augmentation considérable de la guérison de l'infection par le VHC. En dépit de l'efficacité de ces traitements antiviraux, les échecs thérapeutiques ainsi que les effets secondaires des traitements restent un problème important. Il a pu être démontré que la concentration de médicament présente dans l'organisme est corrélée avec l'efficacité clinique pour la plupart des médicaments agissant contre le VIH et contre le VHC. Les médicaments antiviraux sont généralement donnés à une posologie fixe et standardisée, à tous les patients, il existe cependant une importante variabilité entre les concentrations sanguines mesurées chez les individus. Cette variabilité peut être expliquée par plusieurs facteurs démographiques, environnementaux ou génétiques. Dans ce contexte, le suivi des concentrations sanguines (ou Therapeutic Drug Monitoring, TDM) permet de contrôler que les patients soient exposés à des concentrations suffisantes (pour bloquer la réplication du virus dans l'organisme) et éviter des concentrations excessives, ce qui peut entraîner l'apparition d'intolérence au traitement. Le but de ce travail de thèse est d'améliorer la compréhension des facteurs pharmacologiques et génétiques qui peuvent influencer l'efficacité et/ou la toxicité des médicaments antiviraux, dans le but d'améliorer le suivi des patients. A cet effet, des méthodes de dosage très sensibles et ont été mises au point pour permettre de quantifier les médicaments antiviraux dans le sang et dans d'autres liquides biologiques. Ces méthodes de dosage sont maintenant utilisées d'une part dans le cadre de la prise en charge des patients en routine et d'autre part pour diverses études cliniques chez les patients infectés soit par le HIV, le HCV ou bien coinfectés par les deux virus. Une partie de ce travail a été consacrée à l'investigation des différents facteurs démographiques, génétiques et environnementaux qui pourraient l'influencer la réponse clinique à la rilpivirine, un nouveau médicament contre le VIH. Toutefois, parmi tous les facteurs étudiés à ce jour, aucun n'a permis d'expliquer la variabilité de l'exposition à la rilpivirine chez les patients. On a pu cependant observer qu'à la posologie standard recommandée, un pourcentage relativement élevé de patients pourrait présenter des concentrations inférieures à la concentration sanguine minimale actuellement proposée. Il est donc utile de surveiller étroitement les concentrations de rilpivirine chez les patients pour identifier sans délai ceux qui risquent d'être sous-exposés. Dans l'organisme, le médicament subit diverses transformations (métabolisme) par des enzymes, notamment dans le foie, il est transporté dans les cellules et tissus par des protéines qui modulent sa concentration au site de son action pharmacologique. A cet effet, différents composés (métabolites) produits dans l'organisme après l'administration d'efavirenz, un autre médicament anti-VIH, ont été étudiés. En conclusion, nous nous sommes intéressés à la fois aux facteurs pharmacologiques et génétiques des traitements antiviraux, une approche qui s'inscrit dans l'optique d'une stratégie globale de prise en charge du patient. Dans ce contexte, le suivi des concentrations sanguines de médicaments constitue une des facettes du domaine émergent de la Médecine Personnalisée qui vise à maximiser le bénéfice thérapeutique et le profil de tolérance des médicaments antiviraux

Differential phosphoproteomics of fragmenting yeast vacuoles

Many organelles exist in an equilibrium of fragmentation into smaller units and fusion into larger structures, which is coordinated with cell division, the increase in cell mass, and envi¬ronmental conditions. In yeast cells, organelle homeostasis can be studied using the yeast vacuole (lysosome) as a model system. Yeast vacuoles are the main compartment for degrada¬tion of cellular proteins and storage of nutrients, ions and metabolites. Fission and fusion of vacuoles can be induced by hyper- and hypotonic shock in vivo, respectively, and have also been reconstituted in vitro using isolated vacuoles. The conserved serine/threonine kinase TOR (target of rapamycin) is a central nutrient sensor and regulates cell growth and metabolism. In yeast, there are two TOR proteins, Torlp and Tor2p, which are part of larger protein complexes, TORCI and TORC2. Only TORCI is rapamycin-sensitive. Disregulation of TOR signaling is linked to a multitude of diseases in humans, e.g. cancer, neurodegenerative diseases and metabolic syndrome. It has been shown that TORCI localizes to the vacuole membrane, and recent findings of our laboratory demonstrated that TORCI positively regulates vacuole fragmentation. This suggests that the fragmentation machinery should contain target proteins phosphorylated by TORCI. I explored the rapamycin-and fission-dependent vacuolar phosphoproteome during frag¬mentation, using a label-free mass-spectrometry approach. I identified many vacuolar factors whose phosphorylation was downregulated in a TORCI- and fission-dependent manner. Among them were known protein complexes that are functionally linked to fission or fusion, like the HOPS, VTC and FAB1 complexes. Hence, TORCI-dependent phosphorylations might positively regulate vacuole fission. Several candidates were chosen for detailed microscopic analysis of in vivo vacuole frag-mentation, using deletion mutants. I was able to identify novel factors not previously linked to fission phenotypes, e.g. the SEA complex, Pib2, and several vacuolar amino acid transporters. Transport of neutral and basic amino acids across the membrane seems to control vacuole fission, possibly via TORCI. I analyzed vacuolar fluxes of amino acids in wildtype yeast cells and found evidence for a selective vacuolar export of basic amino acids upon hyperosmotic stress. This leads me to propose a model where vacuolar export of amino acids is necessary to reshape the organelle under salt stress. - Le nombre et la taille de certaines organelles peut être déterminé par un équilibre entre la fragmentation qui produit des unités plus petites et la fusion qui génère des structures plus larges. Cet équilibre est coordonné avec la division cellulaire, l'augmentation de la masse cellulaire, et les conditions environnementales. Dans des cellules de levure, l'homéostasie des organelles peut être étudié à l'aide d'un système modèle, la vacuole de levure (lysosome). Les vacuoles constituent le principal compartiment de la dégradation des protéines et de stockage des nutriments, des ions et des métabolites. La fragmentation et la fusion des vacuoles peuvent être respectivement induites par un traitement hyper- ou hypo-tonique dans les cellules vivantes. Ces processus ont également été reconstitués in vitro en utilisant des vacuoles isolées. La sérine/thréonine kinase conservée TOR (target of rapamycin/cible de la rapamycine) est un senseur de nutriments majeur qui régule la croissance cellulaire et le métabolisme. Chez la levure, il existe deux protéines TOR, Torlp et Tor2p, qui sont les constituants de plus grands complexes de protéines, TORCI et TORC2. TORCI est spécifiquement inhibé par la rapamycine. Une dysrégulation de la signalisation de TOR est liée à une multitude de maladies chez l'homme comme le cancer, les maladies neurodégénératives et le syndrome métabolique. Il a été montré que TORCI se localise à la membrane vacuolaire et les découvertes récentes de notre laboratoire ont montré que TORCI régule positivement la fragmentation de la vacuole. Ceci suggère que le mécanisme de fragmentation doit être contrôlé par la phosphorylation de certaines protéines cibles de TORCI. J'ai exploré le phosphoprotéome vacuolaire lors de la fragmentation, en présence ou absence de rapamycine et dans des conditions provoquant la fragmentation des organelles. La méthode choisie pour réaliser la première partie de ce projet a été la spectrométrie de masse différentielle sans marquage. J'ai ainsi identifié plusieurs facteurs vacuolaires dont la phosphorylation est régulée d'une manière dépendante de TORCI et de la fragmentation. Parmi ces facteurs, des complexes protéiques connus qui sont fonctionnellement liées à fragmentation ou la fusion, comme les complexes HOPS, VTC et FAB1 ont été mis en évidence. Par conséquent, la phosphorylation dépendante de TORCI peut réguler positivement la fragmentation des vacuoles. Plusieurs candidats ont été choisis pour une analyse microscopique détaillée de la fragmentation vacuolaire in vivo en utilisant des mutants de délétion. J'ai été en mesure d'identifier de nouveaux facteurs qui n'avaient pas été encore associés à des phénotypes de fragmentation tels que les complexes SEA, Pib2p, ainsi que plusieurs transporteurs vacuolaires d'acides aminés. Le transport des acides aminés à travers la membrane semble contrôler la fragmentation de la vacuole. Puisque ces transporteurs sont phosphorylés par TORCI, ces résultats semblent confirmer la

Role of Staphylococcus aureus surface proteins in experimental endocarditis

Résumé Le staphylocoque doré est un pathogène responsable d'une grande variété de maladies chez l'être humain. Il est extrêmement bien équipé de facteurs de virulence, dont les adhésines. Jusqu'à présent, 21 protéines liant des composants de tissus de l'hôte ("microbial surface components reacting with adherence matrix molecules, MSCRAMM") ont été identifiées, par exemple le "clumping factor" A (CIfA) ou la "fibronectin-binding protein" A (FnBPA). Néanmoins, pour la plupart de ces protéines, leur rôle dans la pathogénie des infections à staphylocoque doré reste à être élucidé. Le but de cette thèse est de contribuer à ce processus. Premièrement, les "MSCRAMM" CIfA, CIfB, FnBPA, FnBPB, Cna, SpA, Pls, SdrC, SdrD, SdrE, SasD, SasE, SasF, SasG, Sasl, SasJ et SasK ont été exprimés dans une bactérie substitut, Lactococcus lactis, et testés pour leurs propriétés adhésives et leur pathogénicité dans un modèle d'endocardite expérimentale (voir chapitre 1). Cette technique a préalablement été utilisée avec succès et a l'avantage d'éviter le contexte complexe des redondances et systèmes de régulations propres au staphylocoque doré. Les résultats montrent que, de tous les facteurs de virulence testés, seuls CIfA et FnBPA sont d'importance primordiale dans le développement d'endocardite expérimentale. En ce qui concerne l'internalisation dans les cellules endothéliales, seulement FnPBA et FnBPB en sont capables. En outre, l'adhérence à chacun des ligands testés (fibrinogène, fibronectine, kératine, élastine, collagène, et les caillots de fibrine et plaquettes) est très spécifique et est médiée par une ou plusieures adhésines provenant du staphylocoque doré. Par conséquence, ces protéines pourraient représenter des cibles potentielles pour de futures thérapies anti-adhésives contre le staphylocoque doré. Deuxièmement, l'expression des facteurs de virulence décrits dans le chapitre 1 par les souches recombinantes de lactocoques a été vérifiée par une nouvelle méthode utilisant la spectrométrie de masse (voir chapitre 2). L'expression de toutes ces protéines par les souches recombinantes a pu être confirmée. Cette méthode pourrait être de grande valeur dans la vérification de la présence de protéines quelconques dans toutes sortes d'applications. Troisièmement, deux facteurs de virulence du staphylocoque, CIfA et une forme tronquée de FnBPA, ont été exprimés de façon simultanée dans une souche recombinante de lactocoque (voir chapitre 3}. Contrairement à une souche exprimant la FnBPA entière, une souche exprimant la forme tronquée de FnPBA, qui ne contient plus le domaine capable de lier le fibrinogène, perd complètement sa capacité d'infecter dans le modèle d'endocardite expérimentale. Par contre, il est montré que, en cas de complémentation de la forme tronquée de FnPBA avec le domaine de liaison au fibrinogène de CIfA dans la souche double recombinante, le phénotype intégral de FnBPA est récupéré. En conséquence, les facteurs de virulence sont capables de coopérer dans le but de la pathogénie des infections à staphylocoque doré. Summary Staphylococcus aureus is a human pathogen causing a wide variety of disease. It is extremely well equipped with both secreted and surface-attached virulence factors, which can act as adhesins to host tissues. In total, twenty-one microbial surface components reacting with adherence matrix molecules (MSCRAMMs) have been identified, so far. These include well-characterized adhesins such as clumping factor A (CIfA) or fibronectin-binding protein A (FnBPA). However, for most of them their potential role in the pathogenesis of staphylococcal infections remains to be elucidated. This has been attempted in this thesis work. Firstly, the staphylococcal MSCRAMMs CIfA, CIfB, FnBPA, FnBPB, Cna, SpA, Pls, SdrC, SdrD, SdrE, SasD, SasE, SasF, SasG, Sasl, SasJ, and SasK have been expressed in a surrogate bacterium, Lactococcus lactis, and tested for their in vitro adherence properties and their pathogenicity in the rat model of experimental endocarditis (see chapter 1). This model has successfully been used previously, and has the advantage of bypassing the complex S. aureus background of redundancies and differential regulation. Here, it is shown that of the seventeen tested potential virulence factors, only CIfA and FnBPA are critical for the pathogenesis of experimental endocarditis in rats, while internalization into bovine endothelial cells is mediated exclusively by FnBPA and FnBPB. In addition, the adherence to specific host ligands (fibrinogen, fibronectin, keratin, elastin, collagen, and fibrin-platelet clots) is highly specific and mediated by one or few staphylococcal adhesins, respectively. Thus, these surface proteins may represent potential targets for an anti-adhesive strategy against S. aureus infections. Secondly, the expression of the staphylococcal proteins by L. lactis recombinants described in chapter 1 was tested by a novel method using mass spectrometry (see chapter 2). The expression of all the staphylococcal proteins by the respective recombinant lactococcal strain could be confirmed. This method may prove to be of great value in the confirmation of the presence of any given protein in various experimental settings. Thirdly, two staphylococcal virulence factors, CIfA and a truncated form of FnBPA, were expressed simultaneously in one recombinant lactococcal strain (see chapter 3). In contrast to a recombinant strain expressing full-length FnPBA, a recombinant strain expressing a truncated FnPBA, lacking the domain capable of binding fibrinogen, completely lost infectivity in experimental endocarditis. However, it is shown that the complementation of the truncated form of FnBPA with the fibrinogenbinding domain of CIfA in a double recombinant strain results in the recovery of the complete phenotype of full-length FnBPA. Thus, virulence factors can cooperate in the pathogenesis of staphylococcal infections.

Pharmacogenetic Study on Antidementia Drugs

Differences in efficacy and safety of drugs among patients are a recognized problem in pharmacotherapy. The reasons are multifactorial and, therefore, the choice of a drug and its dosage for a particular patient based on different clinical and genetic factors is suggested to improve the clinical outcome. Four drugs are currently used for the treatment of Alzheimer's disease: three acetylcholinesterase inhibitors (donepezil, galantamine, rivastigmine) and the N-methyl-D-aspartate-antagonist memantine. For these drugs, a high interindividual variability in plasma levels was observed, which might influence the response to treatment. The main objective of this thesis was to provide a better understanding of clinical and genetic factors affecting the plasma levels of antidementia drugs. Furthermore, the relationship between plasma levels, genetic variations and side effects was assessed. For this purpose, a pharmacogenetic study was conducted including 300 patients from a naturalistic clinical setting. Analytical methods for the simultaneous measurement of antidementia drugs in plasma have been developed and validated using liquid chromatography methods coupled with mass spectrometry detection. Presently, these methods are used in the therapeutic drug monitoring service of our laboratory. The routine use of therapeutic drug monitoring for antidementia drugs cannot yet be recommended with the available data, but it may be beneficial for some patients in special clinical cases such as insufficient treatment response, side effects or drug interactions. Donepezil and galantamine are extensively metabolized by the liver enzymes cytochromes P450 (CYP) 2D6 and 3A and are substrates of the drug transporter P-glycoprotein. The relationship of variations in genes affecting the activity of these metabolic enzymes and drug transporter (CYP2D6, CYP3A, POR, NR1I2, ABCB1) with donepezil and galantamine plasma levels was investigated. The CYP2D6 genotype appeared to be the major genetic factor involved in the pharmacokinetics of these two drugs. Thus, CYP2D6 poor metabolizers demonstrated significantly higher drug plasma levels than extensive metabolizers. Additionally, in the donepezil study population, the frequency of side effects was significantly increased in poor metabolizers. Lower donepezil plasma levels were observed in ultra rapid metabolizers, which might expose those patients to the risk of non-response. Memantine is mainly eliminated unchanged by the kidney, with implication of tubular secretion by renal transporters. A population pharmacokinetic model was developed to quantify the effects of clinical factors and genetic variations in renal cation transporters (SLC22A1/2/5, SLC47A1, ABCB1), and nuclear receptors (NR1I2, NR1I3, PPARG) involved in transporter expression, on memantine plasma levels. In addition to the renal function and gender, a genetic variation in the nuclear receptor Pregnane-X-Receptor (NR1I2) significantly affected memantine elimination. These findings suggest that an individualized therapy approach for antidementia drugs, taking into account clinical characteristics and genetic background of a patient, might increase efficacy and safety of the treatment. - Les différences interindividuelles dans l'efficacité et la tolérance des médicaments sont un problème connu en pharmacothérapie. Les raisons sont multiples, et le choix du médicament et de la dose, basé sur des facteurs cliniques et génétiques spécifiques au patient, peut contribuer à améliorer la réponse clinique. Quatre médicaments sont couramment utilisés dans le traitement de la maladie d'Alzheimer : trois inhibiteurs de l'acétylcholinestérase (donépézil, galantamine, rivastigmine) et un antagoniste du récepteur N-méthyl-D-aspartate, la mémantine. Une forte variabilité interindividuelle dans les taux plasmatiques de ces quatre composés a été observée, ce qui pourrait influencer la réponse au traitement. L'objectif principal de ce travail de thèse est de mieux comprendre les facteurs cliniques et génétiques influençant les taux des médicaments pro-cognitifs. En outre, des associations entre les taux, la variabilité génétique et les effets secondaires ont été recherchées. Dans ce but, 300 patients sous traitement avec un médicament pro-cognitif ont été recrutés pour une étude pharmacogénétique. Des méthodes de dosage simultané de médicaments pro-cognitifs par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ont été développées et validées. Ces méthodes sont actuellement utilisées dans le service de suivi thérapeutique de notre unité. Malgré le fait qu'un suivi des taux sanguins des pro-cognitifs ne puisse pas encore être recommandé en routine, un dosage peut être utile dans des cas cliniques spécifiques, comme une réponse insuffisante, une intolérance ou une interaction médicamenteuse. Le donépézil et la galantamine sont fortement métabolisés par les cytochromes P450 (CYP) 2D6 et 3A, et sont également substrats du transporteur P-glycoprotéine. Les associations entre les polymorphismes génétiques de ces enzymes, cofacteur, récepteur nucléaire et transporteur (CYP2D6, CYP3A, POR, NR1I2, ABCB1) et les taux de donépézil et de galantamine ont été étudiées. Le génotype du CYP2D6 a été montré comme le facteur génétique majeur impliqué dans la pharmacocinétique de ces deux médicaments. Ainsi, les métaboliseurs déficients du CYP2D6 ont démontré des taux plasmatiques significativement plus élevés comparé aux bons métaboliseurs. De plus, dans la population traitée avec le donépézil, la fréquence des effets secondaires était plus élevée chez les métaboliseurs déficients. Des taux plasmatiques bas ont été mesurés chez les métaboliseurs ultra-rapides traités avec le donépézil, ce qui pourrait être un facteur de risque à une non-réponse au traitement. La mémantine est principalement éliminée sous forme inchangée par les reins, et partiellement par sécrétion tubulaire grâce à des transporteurs rénaux. Un modèle de cinétique de population a été développé pour quantifier les effets des différents facteurs cliniques et de la variabilité génétique des transporteurs rénaux (SLC22A1/2/5, SLC47A1, ABCB1) et des récepteurs nucléaires (NR1I2, NR1I3, PPARG, impliqués dans l'expression des transporteurs) sur les taux plasmatiques de mémantine. En plus de la fonction rénale et du genre, une variation génétique dans le récepteur nucléaire Pregnane-X-Receptor (NR1I2) a montré une influence significative sur l'élimination de la mémantine. Ces résultats suggèrent qu'une approche thérapeutique individualisée, prenant en compte des facteurs cliniques et génétiques du patient, pourrait améliorer l'efficacité et la sécurité du traitement pro-cognitif.

Veille bibliographique sur la surveillance biologique de l'exposition aux produits chimiques au poste de travail : l'expérience d'un réseau francophone multidisciplinaire

Une veille bibliographique est organisée depuis 2005 sur la surveillance biologique aux produits chimiques en milieu de travail (SBEPC MT). Elle a été mise en place par le réseau francophone multidisciplinaire, composé de l'INRS (France), l'IRSST (Québec) et l'UCL (Belgique). Cet article dresse le bilan de l'information récoltée et analysée, de 2009 à 2012, au travers de 435 articles sélectionnés. Plusieurs thèmes d'intérêt ou d'actualités font l'objet d'une analyse plus approfondie, dont notamment les pesticides, les hydrocarbures aromatiques, le benzène, le mangannèse, la variabilité biologique, les dosages cutanés et frottis de surface, les dosages dans l'air expiré ou encore la spectrométrie de masse.

Etude des niveaux de concentration d'hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) dans la poussière de bois et des marqueurs biologiques d'effets génotoxiques chez les travailleurs du bois

L'exposition aux poussières de bois est associé à un risque accru d'adénocarcinomes des fosses nasales et des sinus paranasaux (SNC, 'Sinonasal cancer') chez les travailleurs du bois. Les poussières de bois sont ainsi reconnues comme cancérogènes avérés pour l'homme par le Centre international de Recherche sur le Cancer (CIRC). Toutefois, l'agent causal spécifique et le mécanisme sous-jacent relatifs au cancer lié aux poussières de bois demeurent inconnus. Une possible explication est une co-exposition aux poussières de bois et aux Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP), ces derniers étant potentiellement cancérogènes. Dans les faits, les travailleurs du bois sont non seulement exposés aux poussières de bois naturel, mais également à celles générées lors d'opérations effectuées à l'aide de machines (ponceuses, scies électriques, etc.) sur des finitions de bois (bois traités) ou sur des bois composites, tels que le mélaminé et les panneaux de fibres à densité moyenne (MDF, 'Medium Density Fiberboard'). Des HAP peuvent en effet être générés par la chaleur produite par l'utilisation de ces machines sur la surface du bois. Les principaux objectifs de cette thèse sont les suivants: (1) quantifier HAP qui sont présents dans les poussières générées lors de diverses opérations courantes effectuées sur différents bois (2) quantifier l'exposition individuelle aux poussières de bois et aux HAP chez les travailleurs, et (3) évaluer les effets génotoxiques (dommages au niveau de l'ADN et des chromosomes) due à l'exposition aux poussières de bois et aux HAP. Cette thèse est composée par une étude en laboratoire (objectif 1) et par une étude de terrain (objectifs 2 et 3). Pour l'étude en laboratoire, nous avons collecté des poussières de différents type de bois (sapin, MDF, hêtre, sipo, chêne, bois mélaminé) générées au cours de différentes opérations (comme le ponçage et le sciage), et ceci dans une chambre expérimentale et dans des conditions contrôlées. Ensuite, pour l'étude de terrain, nous avons suivi, dans le cadre de leur activité professionnelle, 31 travailleurs de sexe masculin (travailleurs du bois et ébenistes) exposés aux poussières de bois pendant deux jours de travail consécutifs. Nous avons également recruté, comme groupe de contrôle, 19 travailleurs non exposés. Pour effectuer une biosurveillance, nous avons collecté des échantillons de sang et des échantillons de cellules nasales et buccales pour chacun des participants. Ces derniers ont également rempli un questionnaire comprenant des données démographiques, ainsi que sur leur style de vie et sur leur exposition professionnelle. Pour les travailleurs du bois, un échantillonnage individuel de poussière a été effectué sur chaque sujet à l'aide d'une cassette fermée, puis nous avons évalué leur exposition à la poussière de bois et aux HAP, respectivement par mesure gravimétrique et par Chromatographie en phase gazeuse combinée à la spectrométrie de masse. L'évaluation des dommages induits à l'ADN et aux chromosomes (génotoxicité) a été, elle, effectuée à l'aide du test des micronoyaux (MN) sur les cellules nasales et buccales et à l'aide du test des comètes sur les échantillons de sang. Nos résultats montrent dans la poussière de la totalité des 6 types de bois étudiés la présence de HAP (dont certains sont cancérogènes). Des différences notoires dans les concentrations ont été néanmoins constatées en fonction du matériau étudié : les concentrations allant de 0,24 ppm pour la poussière de MDF à 7.95 ppm pour le mélaminé. Nos résultats montrent également que les travailleurs ont été exposés individuellement à de faibles concentrations de HAP (de 37,5 à 119,8 ng m-3) durant les opérations de travail du bois, alors que les concentrations de poussières inhalables étaient relativement élevés (moyenne géométrique de 2,8 mg m-3). En ce qui concerne la génotoxicité, les travailleurs exposés à la poussière de bois présentent une fréquence significativement plus élevée en MN dans les cellules nasales et buccales que les travailleurs du groupe témoin : un odds ratio de 3.1 a été obtenu pour les cellules nasales (IC 95% : de 1.8 à 5.1) et un odds ratio de 1,8 pour les cellules buccales (IC 95% : de 1.3 à 2.4). En outre, le test des comètes a montré que les travailleurs qui ont déclaré être exposés aux poussières de MDF et/ou de mélaminé avaient des dommages à l'ADN significativement plus élevés que les deux travailleurs exposés à la poussière de bois naturel (sapin, épicéa, hêtre, chêne) et que les travailleurs du groupe témoin (p <.01). Enfin, la fréquence des MN dans les cellules nasales et buccales augmentent avec les années d'exposition aux poussières de bois. Par contre, il n'y a pas de relation dose-réponse concernant la génotoxicité due à l'exposition journalière à la poussière et aux HAP. Cette étude montre qu'une exposition aux HAP eu bien lieu lors des opérations de travail du bois. Les travailleurs exposés aux poussières de bois, et donc aux HAP, courent un risque plus élevé (génotoxicité) par rapport au groupe témoin. Étant donné que certains des HAP détectés sont reconnus potentiellement cancérogènes, il est envisageable que les HAP générés au cours du travail sur les matériaux de bois sont un des agents responsables de la génotoxicité de la poussière de bois et du risque élevé de SNC observé chez les travailleurs du secteur. Etant donné la corrélation entre augmentation de la fréquence des MN, le test des micronoyaux dans les cellules nasales et buccales constitue sans conteste un futur outil pour la biosurveillance et pour la détection précoce du risque de SNC chez les travailleurs. - Exposures to wood dust have been associated with an elevated risk of adenocarcinomas of the Dasal cavity and the paranasal sinuses (sinonasal cancer or SNC) among wood workers. Wood dust is recognized as a human carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. However, the specific cancer causative agent(s) and the mechanism(s) behind wood dust related carcinogenesis remains unknown. One possible explanation is a co-exposure to wood dust and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), the latter being carcinogenic. In addition, wood workers are not only exposed to natural wood but also to wood finishes and composite woods such as wood melamine and medium density fiber (MDF) boards during the manipulation with power tools. The heat produced by the use of power tools can cause the generation of PAH from wood materials. The main objectives of the present thesis are to: (1) quantify possible PAH concentrations in wood dust generated during various common woodworking operations using different wood materials; (2) quantify personal wood dust concentrations and PAH exposures among wood workers; and (3) assess genotoxic effects (i.e., DNA and chromosomal damage) of wood dust and PAH exposure in wood workers. This thesis is composed by a laboratory study (objective 1) and a field study (objectives 2 and 3). In the laboratory study we collected wood dust from different wood materials (fir, MDF, beech, mahagany, oak, and wood melamine) generated during different wood operations (e.g., sanding and sawing) in an experimental chamber under controlled conditions. In the following field study, we monitored 31 male wood workers (furniture and construction workers) exposed to wood dust during their professional activity for two consecutive work shifts. Additionally, we recruited 19 non exposed workers as a control group. We collected from each participant blood samples, and nasal and buccal cell samples. They answered a questionnaire including demographic and life-style data and occupational exposure (current and past). Personal wood dust samples were collected using a closed-face cassette. We used gravimetrie analysis to determine the personal wood dust concentrations and capillary gas chromatography - mass spectrometry analysis to determine PAH concentrations. Genotoxicity was assessed with the micronucleus (MN) assay for nasal and buccal cells and with the comet assay for blood samples. Our results show that PAH (some of them carcinogenic) were present in dust from all six wood materials tested, yet at different concentrations depending on the material. The highest concentration was found in dust from wood melamine (7.95 ppm) and the lowest in MDF (0.24 ppm). Our results also show that workers were individually exposed to low concentrations of PAHs (37.5-119.8 ng m"3) during wood working operations, whereas the concentrations of inhalable dust were relatively high (geometric mean 2.8 mg m"3). Concerning the genotoxicity, wood workers had a significantly higher MN frequency in nasal and buccal cells than the workers in the control group (odds ratio for nasal cells 3.1 (95%CI 1.8-5.1) and buccal cells 1.8 (95%CI 1.3-2.4)). Furthermore, the comet assay showed that workers who reported to be exposed to dust from wooden boards (MDF and wood melamine) had significantly higher DNA damage than both the workers exposed to natural woods (fir, spruce, beech, oak) and the workers in the control group (p < 0.01). Finally, MN frequency in nasal and buccal cells increased with increasing years of exposure to wood dust. However, there was no genotoxic dose-response relationship with the per present day wood dust and PAH exposure. This study shows that PAH exposure occurred during wood working operations. Workers exposed to wood dust, and thus to PAH, had a higher risk for genotoxicity compared to the control group. Since some of the detected PAH are potentially carcinogenic, PAH generated from operations on wood materials may be one of the causative agents for the observed increased genotoxicity in wood workers. Since increased genotoxicity is manifested in an increased MN frequency, the MN assay in nasal and buccal cells may become a relevant biomonitoring tool in the future for early detection of SNC risk.

Clic4, a novel protein that sensitizes ß-cells to apoptosis.

Introduction: La préservation et/ou l'expansion de la masse des cellules ß pourraient constituer des approches prometteuses dans le traitement du diabète. L'une des stratégies clés serait de réduire l'apoptose des cellules ß. Le chloride intracellular channel protein 4 (Clic4) est une protéine exprimée de manière ubiquitaire et supposée agir dans de nombreux processus cellulaires tels que le contrôle du cycle cellulaire, la différenciation cellulaire et l'apoptose. Ici, nous avons étudié le rôle de Clic4 dans l'apoptose des cellules ß pancréatiques en utilisant des cellules ßTC-tet et des îlots de Langerhans issus de souris knockout pour Clic4 (ßClic4KO). Résultats: L'expression de l'ARNm et de la protéine Clic4 était augmentée par un traitement aux cytokines dans les cellules ßTC-tet et encore plus fortement dans des îlots isolés de souris. De plus, la sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet diminuait leur sensibilité à l'apoptose induite par les cytokines. La sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet n'affectait pas l'expression des ARNm de Bcl-2 et Bad, mais augmentait leur expression protéique ainsi que la forme phosphorylée de Bad. Les mêmes résultats ont été obtenus sur des îlots isolés de souris contrôles et ßClic4KO. De plus, les îlots issus de souris ßClic4KO présentaient une augmentation de l'expression de la protéine Bcl-xL. Dans le but de déterminer si Clic4 augmentait l'expression de Bcl-2 et Bad via une interaction protéique directe, nous avons immunoprécipité Clic4 à partir de cellules ßTC-tet à l'aide d'anticorps dirigés contre la partie C- ou N-terminale de la protéine, puis nous avons soumis les immunoprécipités à une analyse de spectrométrie de masse. Aucune co- immunoprécipitation avec Bcl-2 ou d'autres protéines de la famille Bcl-2 n'a été détectée. Cependant, de manière intéressante, Clic4 était co-purifié avec plusieurs protéines du protéasome suggérant un rôle de Clic4 dans la dégradation des protéines. Par conséquent, nous avons étudié la demi-vie de Bcl-2 et Bad, et avons observé que la sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet augmentait la demi-vie de ces protéines. De plus, l'expression de l'ARNm et de la protéine Clic4 était également augmentée lors d'un stress du réticulum endoplasmique induit par la thapsigargine dans les cellules ßTC-tet. La sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet ou chez les KO diminuait la sensibilité des cellules ß à l'apoptose induite par la thapsigargine ou l'acide palmitique, respectivement. Conclusion: Ces résultats suggèrent que Clic4 sensibilise les cellules ß à l'apoptose induite par les cytokines ou l'acide palmitique/thapsigargine (stress du réticulum endoplasmique). De plus, la sous-expression de Clic4 améliore la survie des cellules ß en diminuant la dégradation de Bcl-2 et Bcl-xL, et en augmentant le niveau total de Bad phosphorylé, peut-être suite à une interaction de Clic4 avec le protéasome.

Natural aphrodisiacs: studies of commercially-available herbal recipes, and phytochemical investigation of "Erythroxylum vacciniifolium" Mart. (Erythroxylaceae) from Brazil

De tout temps, hommes et femmes ont cherché par tous les moyens à développer, préserver ou recouvrer leurs propres capacités sexuelles mais également à stimuler le désir du partenaire. L?utilisation d?aphrodisiaques naturels a été l?un des recours les plus répandus. De nos jours, la commercialisation de nouvelles "love drugs" de synthèse, e.g. Viagra®, Cialis®, Levitra®, a remis au goût du jour les aphrodisiaques classiques et à relancer la recherche sur des molécules nouvelles. La pratique croissante de l?automédication, le matraquage publicitaire sur les aphrodisiaques naturels, la prolifération sur le marché de compléments alimentaires non contrôlés et l?absence de véritable législation accroissent les risques qui pèsent sur la santé publique. Dans le but d?évaluer les risques potentiels sur le consommateur de produits aphrodisiaques commercialisés, le développement et la validation d?une méthode rapide d?analyse qualitative et quantitative de la yohimbine dans ces préparations du marché sont exposés dans la première partie de ce travail. La yohimbine est un antagoniste ?2-adrénocepteur du système nerveux central et périphérique, elle est employée depuis plus d?un siècle dans le traitement des dysfonctionnements érectiles. Cette méthode analytique utilise la chromatographie liquide couplée à l?ultraviolet et à la spectrométrie de masse (LC-UV-MS) et au total, vingt préparations aphrodisiaques ont été étudiées. La dose journalière de yohimbine mesurée s?est révélée très variable selon les produits puisqu?elle varie de 1.32 à 23.16 mg. La seconde partie de ce travail concerne l?étude phytochimique et pharmacologique d?Erythroxylum vacciniifolium Mart. (Erythroxylaceae), une plante, appelée localement catuaba, utilisée dans la médecine traditionnelle brésilienne comme tonique et aphrodisiaque. Dans un premier temps, l?extrait alcaloïdique a été analysé par chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée soit à un détecteur UV à barrette d?iode (LC-UV-DAD), soit à un spectromètre de masse (LC-MS), ou soit à un spectromètre de résonance magnétique nucléaire (LC-RMN). L?interprétation de ces données spectrales enregistrées en ligne a permis d?obtenir des informations structurales et d?identifier partiellement près de 24 alcaloïdes appartenant à la classe des tropanes et potentiellement originaux. Par des méthodes classiques de chromatographie liquide sur l?extrait alcaloïdique de la plante, dix sept tropanes nouveaux ont ensuite été isolés dont les catuabines et leurs dérivés, et les vaccinines. Tous ces composés sont des tropane-diols ou triols estérifiés par au moins un groupe acide 1-méthyl-1H-pyrrole-2-carboxylique. Un de ces composés a été identifié comme un tropane N-oxyde. Toutes les structures ont été déterminées par spectrométrie de masse haute résolution et spectroscopie RMN multi-dimensionnelle. Parmi les nombreux tests biologiques réalisés sur ces tropanes, seuls les tests de cytotoxicité se sont révélés faiblement positifs pour certains de ces composés.<br/><br/>Throughout the ages, men and women have incessantly pursued every means to increase, preserve or recapture their sexual capacity, or to stimulate the sexual desire of selected individuals. One of the most recurrent methods has been the use of natural aphrodisiacs. Nowadays, the commercialization of new synthetic "love drugs", e.g. Viagra®, Cialis® and Levitra®, has fascinated the public interest and has led to a reassessment of classical aphrodisiacs and to the search for new ones. The practice of self-medication by an increasing number of patients, the incessant aggressive advertising of these herbal aphrodisiacs, the invasion of the medicinal market with uncontrolled dietary supplements and the absence of real directives amplifies the potential health hazards to the community. In order to evaluate the possible risks of commercialized aphrodisiac products on consumer health, the development and validation of a rapid qualitative and quantitative method for the analysis of yohimbine in these products, is reported in the first part of the present work. Yohimbine, a pharmacologically well-characterized ?2-adrenoceptor antagonist with activity in the central and peripheral nervous system, has been used for over a century in the treatment of erectile dysfunction. The analytical method is based on liquid chromatography coupled with ultraviolet and mass spectrometry (LC-UV-MS) and in total, 20 commercially-available aphrodisiac preparations were analyzed. The amount of yohimbine measured and expressed as the maximal dose per day suggested on product labels ranged from 1.32 to 23.16 mg. The second part of this work involved the phytochemical and pharmacological investigation of Erythroxylum vacciniifolium Mart. (Erythroxylaceae), a plant used in Brazilian traditional medicine as an aphrodisiac and tonic, and locally known as catuaba. With the aim of obtaining preliminary structure information on-line, the alkaloid extract was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to diode array UV detection (LC-UVDAD), to mass spectrometry (LC-MS) and to nuclear magnetic resonance spectroscopy (LCNMR). Interpretation of on-line spectroscopic data led to structure elucidation and partial identification of 24 potentially original alkaloids bearing the same tropane skeleton. Seventeen new tropane alkaloids were then isolated from the alkaloid extract of the plant, including catuabines D to I, their derivatives and vaccinines A and B. All compounds were elucidated as tropane-diol or -triol alkaloids esterified by at least one 1-methyl-1H-pyrrole-2-carboxylic acid. One of the isolated compounds was identified as a tropane alkaloid N-oxide. Their structures were determined by high resolution mass spectrometry and multi-dimensional NMR spectroscopy. Among the numerous bioassays undertaken, only the cytotoxicity tests exhibited a weak positive activity of certain compounds.

Etude de la toxicité hépatique de la cocaïne associée à de l'alcool: Effets de l'éthanol sur le métabolisme de la cocaïne dan les hépatocytes de rat en suspension et dans un modèle enzymatique humain

Le but essentiel de notre travail a été d?étudier la capacité du foie, premier organe de métabolisation des xénobiotiques, à dégrader la cocaïne en présence d?éthanol, à l?aide de deux modèles expérimentaux, à savoir un modèle cellulaire (les hépatocytes de rat en suspension) et un modèle acellulaire (modèle reconstitué in vitro à partir d?enzymes purifiées de foie humain). La première partie a pour objectifs de rechercher les voies de métabolisation de la cocaïne qui sont inhibées et / ou stimulées en présence d?éthanol, sur hépatocytes isolés de rat. Dans ce but, une méthode originale permettant de séparer et de quantifier simultanément la cocaïne, le cocaéthylène et huit de leurs métabolites respectifs a été développée par Chromatographie Phase Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse (CPG / SM). Nos résultats préliminaires indiquent que l?éthanol aux trois concentrations testées (20, 40 et 80 mM) n?a aucun effet sur la cinétique de métabolisation de la cocaïne. Notre étude confirme que l?addition d?éthanol à des cellules hépatiques de rat en suspension supplémentées en cocaïne résulte en la formation précoce de benzoylecgonine et de cocaéthylène. L?apparition retardée d?ecgonine méthyl ester démontre l?activation d?une deuxième voie de détoxification. La production tardive d?ecgonine indique une dégradation de la benzoylecgonine et de l?ecgonine méthyl ester. De plus, la voie d?oxydation intervenant dans l?induction du stress oxydant en produisant de la norcocaïne est tardivement stimulée. Enfin, notre étude montre une métabolisation complète de la concentration initiale en éthanol par les hépatocytes de rat en suspension. La deuxième partie a pour but de déterminer s?il existe d?autres enzymes que les carboxylesterases formes 1 et 2 humaines ayant une capacité à métaboliser la cocaïne seule ou associée à de l?éthanol. Pour ce faire, une méthode de micropurification par chromatographie liquide (Smart System®) a été mise au point. Dans le cadre de nos dosages in situ de la cocaïne, du cocaéthylène, de la benzoylecgonine, de l?acide benzoïque et de la lidocaïne, une technique par Chromatographie Liquide Haute Performance couplée à une Détection par Barrette de Diode (CLHP / DBD) et une méthode de dosage de l?éthanol par Chromatographie Phase Gazeuse couplée à une Détection par Ionisation de Flamme équipée d?un injecteur à espace de tête (espace de tête CPG / DIF) ont été développées. La procédure de purification nous a permis de suspecter la présence d?autres enzymes que les carboxylesterases formes 1 et 2 de foie humain impliquées dans le métabolisme de la cocaïne et déjà isolées. A partir d?un modèle enzymatique reconstitué in vitro, nos résultats préliminaires indiquent que d?autres esterases que les formes 1 et 2 de foie humain sont impliquées dans l?élimination de la cocaïne, produisant benzoylecgonine et ecgonine méthyl ester. De plus, nous avons montré que les sensibilités de ces enzymes à l?éthanol sont variables.<br/><br/>The main purpose of our work was to study the ability of the liver, as the first organ to metabolise xenobiotic substances, to degrade cocaine in the presence of ethanol. In order to do this, we used two experimental models, namely a cellular model (rat liver cells in suspension) and an a-cellular model (model reconstructed in vitro from purified human liver enzymes). The purpose of the first part of our study was to look for cocaine metabolising processes which were inhibited and / or stimulated by the presence of ethanol, in isolated rat liver cells. With this aim in mind, an original method for simultaneously separating and quantifying cocaine, cocaethylene and eight of their respective metabolites was developed by Vapour Phase Chromatography coupled with Mass Spectrometry (VPC / MS). Our preliminary results point out that ethanol at three tested concentrations (20, 40 et 80 mM) have no effect on the kinetic of metabolisation of cocaine. Our study confirms that the addition of alcohol to rat liver cells in suspension, supplemented with cocaine, results in the premature formation of ecgonine benzoyl ester and cocaethylene. The delayed appearance of ecgonine methyl ester shows that a second detoxification process is activated. The delayed production of ecgonine indicates a degradation of the ecgonine benzoyl ester and the ecgonine methyl ester. Moreover, the oxidising process which occurs during the induction of the oxidising stress, producing norcocaine, is stimulated at a late stage. Finally, our study shows the complete metabolisation of the initial alcohol concentration by the rat liver cells in suspension. The second part consisted in determining if enzymes other than human carboxylesterases 1 and 2, able to metabolise cocaine on its own or with alcohol, existed. To do this, a micropurification method us ing liquid phase chromatography (Smart System®) was developed. A technique based on High Performance Liquid Chromatography coupled with a Diode Array Detection (HPLC / DAD) in the in situ proportioning of cocaine, cocaethylene, ecgonine benzoyl ester, benzoic acid and lidocaine, and a method for proportioning alcohol by quantifying the head space using Vapour Phase Chromatography coupled with a Flame Ionisation Detection (head space VPC / FID) were used. The purification procedure pointed to the presence of enzymes other than the human liver carboxylesterases, forms 1 and 2, involved in the metabolism of cocaine and already isolated. The preliminary results drawn from an enzymatic model reconstructed in vitro indicate that human liver carboxylesterases, other than forms 1 and 2, are involved in the elimination of cocaine, producing ecgonine benzoyl ester and ecgonine methyl ester. Moreover, we have shown that the sensitivity of these enzymes to alcohol is variable.