Detection and molecular characterisation of Pyrenopeziza brassicae isolates resistant to methyl benzimidazole carbamates

BACKGROUND Methyl benzimidazole carbamate (MBC) fungicides are used to control the oilseed rape pathogen Pyrenopeziza brassicae. Resistance to MBCs has been reported in P. brassicae, but the molecular mechanism(s) associated with reductions in sensitivity have not been verified in this species. Elucidation of the genetic changes responsible for resistance, hypothesised to be target-site mutations in β-tubulin, will enable resistance diagnostics and thereby inform resistance management strategies. RESULTS P. brassicae isolates were classified as sensitive, moderately resistant or resistant to MBCs. Crossing P. brassicae isolates of different MBC sensitivities indicated that resistance was conferred by a single gene. The MBC-target encoding gene β-tubulin was cloned and sequenced. Reduced MBC sensitivity of field isolates correlated with β-tubulin amino acid substitutions L240F and E198A. The highest level of MBC resistance was measured for isolates carrying E198A. Negative cross-resistance between MBCs and the fungicides diethofencarb and zoxamide was only measured in E198A isolates. PCR-RFLP was used to screen isolates for the presence of L240F and E198A. The substitutions E198G and F200Y were also detected in DNA samples from P. brassicae populations after cloning and sequencing of PCR products. The frequencies of L240F and E198A in different P. brassicae populations were quantified by pyrosequencing. There were no differences in the frequencies of these alleles between P. brassicae populations sampled from different locations or after fungicide treatment regimes. CONCLUSIONS The molecular mechanisms affecting sensitivity to MBCs in P. brassicae have been identified. Pyrosequencing assays are a powerful tool for quantifying fungicide-resistant alleles in pathogen populations.

Alterations in predicted regulatory and coding regions of the sterol 14α-demethylase gene (CYP51) confer decreased azole sensitivity in the oilseed rape pathogen Pyrenopeziza brassicae

The incidence and severity of light leaf spot epidemics caused by the ascomycete fungus Pyrenopeziza brassicae on UK oilseed rape crops is increasing. The disease is currently controlled by a combination of host resistance, cultural practices and fungicide applications. We report decreases in sensitivities of modern UK P. brassicae isolates to the azole (imidazole and triazole) class of fungicides. By cloning and sequencing the P. brassicae CYP51 (PbCYP51) gene, encoding the azole target sterol 14α-demethylase, we identified two non-synonymous mutations encoding substitutions G460S and S508T associated with reduced azole sensitivity. We confirmed the impact of the encoded PbCYP51 changes on azole sensitivity and protein activity by heterologous expression in a Saccharomyces cerevisiae mutant YUG37::erg11 carrying a controllable promoter of native CYP51 expression. In addition, we identified insertions in the predicted regulatory regions of PbCYP51 in isolates with reduced azole sensitivity. The presence of these insertions was associated with enhanced transcription of PbCYP51 in response to sub-inhibitory concentrations of the azole fungicide tebuconazole. Genetic analysis of in vitro crosses of sensitive and resistant isolates confirmed the impact of PbCYP51 alterations in coding and regulatory sequences on a reduced sensitivity phenotype, as well as identifying a second major gene at another locus contributing to resistance in some isolates. The least sensitive field isolates carry combinations of upstream insertions and non-synonymous mutations, suggesting PbCYP51 evolution is on-going and the progressive decline in azole sensitivity of UK P. brassicae populations will continue. The implications for the future control of light leaf spot are discussed.

Flutuação populacional e distribuição vertical de Brevicoryne brassicae (L.) (Hemiptera: Aphididae) em couve

O conhecimento da dinâmica populacional e da distribuição vertical de insetos pragas em plantas hospedeiras é fundamental para o desenvolvimento de programas de manejo integrado de pragas. No presente trabalho efetuou-se um levantamento populacional de formas ápteras do pulgão Brevicoryne brassicae (L.), visando determinar a época de maior densidade populacional e a distribuição vertical em plantas de couve, (Brassica oleracea L. var. acephala DC.), cultivadas em Jaboticabal, SP. O estudo foi realizado durante as safras de brássicas de 1998 e 1999, efetuando-se correção da acidez do solo por meio de aplicação de calcário apenas no campo utilizado em 1998. A amostragem dos pulgões foi feita visualmente em folhas classificadas em três categorias: apical, mediana e basal. Nas duas safras estudadas, a infestação de B. brassicae na couve atingiu a maior densidade populacional em setembro, diminuindo rapidamente a seguir. Nos dois campos não se observou a mesma distribuição de B. brassicae em folhas apicais, medianas e basais. Os fatores que podem ter contribuído para as diferenças observadas no padrão de distribuição do pulgão devem estar relacionados com a precipitação pluvial e o calcário magnesiano.

Impacto de inimigos naturais e de fatores meteorológicos sobre uma população de Brevicoryne brassicae (L.) (Hemiptera: Aphididae) em couve

Neste estudo, visou-se avaliar o impacto de inimigos naturais e de fatores meteorológicos na população do pulgão Brevicoryne brassicae (L.), na cultura da couve, usando-se correlação simples e análise de regressão múltipla com seleção de variáveis pelo método stepwise. A amostragem de B. brassicae foi realizada por procura visual e dos inimigos naturais através de armadilhas de sucção e de solo. Formas ápteras de B. brassicae começaram a infestar a couve em julho, atingindo pico populacional em setembro. Os fatores que apresentaram correlação significativa com a população de B. brassicae, no período que abrangeu todo o levantamento populacional, foram Diaeretiella rapae (Mc'Intosh), aranhas presentes no solo, precipitação pluviométrica e umidade relativa, sugerindo que tais fatores tiveram função importante na mortalidade do pulgão. No período de maior crescimento e declínio populacional de B. brassicae, aranhas presentes no solo mostraram-se como o fator de mortalidade mais significativo relacionado com a variação da densidade populacional do pulgão.

Tabelas de Vida de Fertilidade de Brevicoryne brassicae (L.) (Hemiptera: Aphididae) em Condições de Campo

Estudos relacionados com tabelas de vida são fundamentais para o entendimento da dinâmica populacional de insetos. Neste trabalho, a espécie Brevicoryne brassicae (L.) foi estudada durante a primavera, verão, outono e inverno por meio de tabelas de vida de fertilidade, visando-se avaliar a influência da temperatura sobre sua dinâmica populacional. Para a condução dos experimentos, os pulgões foram mantidos em pequenas gaiolas fixadas em folhas de couve, Brassica oleracea L. var. acephala DC. Os parâmetros das tabelas de vida, estimados na escala de tempo em graus-dia, evidenciaram que B. brassicae apresentou maior sobrevivência nas condiç ões térmicas de outono e inverno, o mesmo ocorrendo com sua fecundidade quando as fêmeas foram submetidas às temperaturas da primavera. As elevadas temperaturas registradas no verão influenciaram adversamente a dinâmica populacional de B. brassicae, pois afetaram negativamente seu desenvolvimento, sobrevivência, longevidade e reprodução.

Exigências térmicas de Brevicoryne brassicae e previsão de picos populacionais

O objetivo deste trabalho foi determinar as exigências térmicas do pulgão-da-couve, Brevicoryne brassicae L., Hemiptera: Aphididae, em condições de laboratório e campo, e prever a ocorrência de picos populacionais de adultos, por meio de um modelo de graus-dia. em laboratório, os experimentos foram conduzidos em câmaras climatizadas reguladas a 15, 20, 25, 27 e 30ºC, obtendo-se o limite térmico inferior de desenvolvimento (Tb = 4,5ºC) e a constante térmica (K = 176,1 graus-dia). Na determinação das exigências térmicas sob condições de campo, realizaram-se seis experimentos, a partir dos quais obteve-se o tempo médio de desenvolvimento de ninfas e a temperatura média ambiental. Os resultados estimados de Tb e K foram 3,5ºC e 180,0 graus-dia, respectivamente. Os resultados de Tb e K obtidos em laboratório possibilitam prever com maior precisão a ocorrência de adultos de B. brassicae do que os resultados de Tb e K determinados a partir de experimentos em campo.

Flutua_̧tiao populacional de formas aladas de Brevicoryne brassicae (L.) (Hemiptera: Aphididae)

Studies related with the flight activity of aphids captured with traps can be useful to predict the appearance of alate forms in the field. It is also useful to understand the population dynamics of those insects. This work was carried out at the Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, State of São Paulo, during the period from July 1997 to December 1999, aiming to determine the population curve of alate Brevicoryne brassicae (L.) in the region of Jaboticabal and the influence meteorological factors plays on it. The population survey was carried out in four places, and the alate aphids were sampled by yellow water traps. The influence of air temperature, relative humidity, rainfall and sunshine brightness was verified using stepwise regression. The first captures of alate B. brassicae in the traps began at the end of June. In the region of Jaboticabal, the population curve of alate B. brassicae showed the highest frequency of flights during September. The appearance of alate forms in kale fields at initial stage of development was favored by maximum and minimum temperatures of 26.4°C and 13.5°C, respectively; relative humidity of 75.1%, and reduced rainfall.

Dinâmica populacional de Myzus persicae (Sulzer, 1776), Brevicoryne brassicae (Linnaeus, 1758) e Lipaphis erysimi (Kaltenbach, 1843) (Hemiptera: Aphididae) na região de Jaboticabal, SP

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Die Kropfkrankheit (Plasmodiophora) des Kohls und ihre Bekämpfung

Von Dr. R. Laubert

Actividad tóxica del aceite esencial de laurel y del cineol sobre Brevicoryne brassicae L. en repollo

El objetivo del presente trabajo fue estudiar la actividad tóxica del aceite esencial de laurel (Laurus nobilis L.) y del cineol, monoterpeno cíclico considerado un aleloquímico puro, sobre Brevicoryne brassicae L. en repollo (Brassica oleracea var. capitata L.). Las concentraciones de aceite esencial utilizadas fueron: 1; 1,5; 2 y 3%, y para cineol: 0,5; 1,5 y 2,5%, ambas formuladas en solución acuosa con 2% de oleato de polietilenglicol como emulsionante. Se utilizaron dos técnicas de aplicación: papeles impregnados y pulverización directa. A las 24 horas del tratamiento se evaluó el porcentaje de mortalidad. Los resultados se analizaron por ANOVA de dos vías y Test de Tukey. Se encontraron diferencias significativas para los productos evaluados en todas las concentraciones ensayadas. Las técnicas de aplicación no dieron diferencias significativas. La mayor mortalidad correspondió a 52% para el aceite esencial de laurel y 27,5% para cineol a las mayores concentraciones en ambos casos. Se concluye que los productos ensayados podrían ser una herramienta para el Manejo Integrado de Plagas para control de áfidos en cultivos hortícolas.

Nectria brassicae; Hypocreaceae

Nectria brassicae Ellis & Sacc. in Sacc.

Arabidopsis MYC transcription factors are the target of hormonal salicylic acid/jasmonic acid cross talk in response to Pieris brassicae egg extract.

Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) plants recognize insect eggs and activate the salicylic acid (SA) pathway. As a consequence, expression of defense genes regulated by the jasmonic acid (JA) pathway is suppressed and larval performance is enhanced. Cross talk between defense signaling pathways is common in plant-pathogen interactions, but the molecular mechanism mediating this phenomenon is poorly understood. Here, we demonstrate that egg-induced SA/JA antagonism works independently of the APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR (AP2/ERF) transcription factor ORA59, which controls the ERF branch of the JA pathway. In addition, treatment with egg extract did not enhance expression or stability of JASMONATE ZIM-domain transcriptional repressors, and SA/JA cross talk did not involve JASMONATE ASSOCIATED MYC2-LIKEs, which are negative regulators of the JA pathway. Investigating the stability of MYC2, MYC3, and MYC4, three basic helix-loop-helix transcription factors that additively control jasmonate-related defense responses, we found that egg extract treatment strongly diminished MYC protein levels in an SA-dependent manner. Furthermore, we identified WRKY75 as a novel and essential factor controlling SA/JA cross talk. These data indicate that insect eggs target the MYC branch of the JA pathway and uncover an unexpected modulation of SA/JA antagonism depending on the biological context in which the SA pathway is activated.

Field Evaluation of a Competitive Lateral-flow Assay for Detection of Alternaria brassicae in Vegetable Brassica Crops

On-site detection of inoculum of polycyclic plant pathogens could potentially contribute to management of disease outbreaks. A 6-min, in-field competitive immunochromatographic lateral flow device (CLFD) assay was developed for detection of Alternaria brassicae (the cause of dark leaf spot in brassica crops) in air sampled above the crop canopy. Visual recording of the test result by eye provides a detection threshold of approximately 50 dark leaf spot conidia. Assessment using a portable reader improved test sensitivity. In combination with a weather-driven infection model, CLFD assays were evaluated as part of an in-field risk assessment to identify periods when brassica crops were at risk from A. brassicae infection. The weather-driven model overpredicted A. brassicae infection. An automated 7-day multivial cyclone air sampler combined with a daily in-field CLFD assay detected A. brassicae conidia air samples from above the crops. Integration of information from an in-field detection system (CLFD) with weather-driven mathematical models predicting pathogen infection have the potential for use within disease management systems.

Kymmenen teollisesti merkittävän puulajin kuoriuutteiden mahdollisuudet tuholaistorjunnassa

Metsäteollisuudesta kertyy vuosittain suuria määriä ylijäämämateriaalia, kuten puun kuorta ja oksia.Ylimääräinen aines käytetään pääasiassa energiantuotantoon, mutta uusia soveltamismahdollisuuksia kaivataan. Kuoren on havaittu olevan potentiaalinen lähde monille bioaktiivisille yhdisteille, joille olisi käyttöä esimerkiksi lääke- ja kemianteollisuudessa sekä maa-, metsä- ja puutarhatuotannon tuholaistorjunnassa. Tutkimus on osa Euroopan Unionin rahoittamaa ForestSpeCs-projektia, jonka tarkoituksena on selvittää metsäteollisuuden ylijäämämateriaalien vaihtoehtoisia käyttötapoja. Valittujen kymmenen teollisesti merkittävän pohjoisen puulajin (Abies nephrolepis, Betula pendula, Larix decidua, L. gmelinii, L. sibirica, Picea abies, P. ajanensis, P. pumila, Pinus sylvestris, Populus tremula) kuoresta uutettujen aineiden soveltuvuutta syönninestoaineeksi testattiin kaaliperhosen (Pieris brassicae L.) ja krysanteemiyökkösen (Spodoptera littoralis Boisduval) toukilla sekä osittain sinappikuoriaisella (Phaedon cochloreae Fabricius) ja idänlehtikuoriaisella (Agelastica alni L.). Uutteet valmistettiin yhteistyössä projektin ryhmien avulla tai itsenäisesti erilaisin menetelmin. Testaukset tehtiin laboratorio-oloissa käyttäen lehtikiekkojen valintabiotestiä sekä karkeilla uutteilla että niistä erotelluilla yksittäisillä yhdisteillä. Tehdyistä mittauksista laskettiin syönninestoindeksit (FDI). Tulosten perusteella lähes kaikki testatut uutteet vaikuttivat ainakin jossain määrin kohdehyönteisen syöntikäyttäytymiseen. Hieman yli puolet kaaliperhosella testatuista 46 uutteesta aiheuttivat yli 50 % syönnineston eli kaaliperhonen suosi kontrollilehtiä uutteella käsiteltyjä todennäköisemmin. Krysanteemiyökkösellä yli 50 %:n syönnineston aiheuttivat vain seitsemän testatuista 56 uutteesta. Lisäksi kolme uutetta lisäsi käsiteltyjen kiekkojen syöntiä merkittävästi. Idänlehtikuoriaistoukat ja -aikuiset karttoivat erityisesti abietiinihapolla käsiteltyjä lehtiä. Sinappikuoriaisella testatut uutteet toimivat myös lupaavasti. Testattujen puulajien kuoresta on mahdollista uuttaa biologisesti aktiivisia yhdisteitä, mutta tuholaistorjunnan kannalta oikeiden pitoisuuksien ja tehokkaiden uuttomenetelmien löytäminen vaatii jatkotutkimuksia. Kuoren sisältämien yhdisteiden laatu ja määrä vaihtelevat monien tekijöiden, kuten ympäristön ja genetiikan vaikutuksesta. Hyönteisten sietokyky vaihtelee myös paljon lajeittain ja yksilöidenkin välillä on eroja. Uutteista valmistettavia torjunta-aineita olisi kuitenkin mahdollista sisällyttää esimerkiksi integroituun torjuntaan muiden menetelmien rinnalle tulevaisuudessa.

Permanent Genetic Resources added to Molecular Ecology Resources Database 1 August 2010-30 September 2010

This article documents the addition of 229 microsatellite marker loci to the Molecular Ecology Resources Database. Loci were developed for the following species: Acacia auriculiformis x Acacia mangium hybrid, Alabama argillacea, Anoplopoma fimbria, Aplochiton zebra, Brevicoryne brassicae, Bruguiera gymnorhiza, Bucorvus leadbeateri, Delphacodes detecta, Tumidagena minuta, Dictyostelium giganteum, Echinogammarus berilloni, Epimedium sagittatum, Fraxinus excelsior, Labeo chrysophekadion, Oncorhynchus clarki lewisi, Paratrechina longicornis, Phaeocystis antarctica, Pinus roxburghii and Potamilus capax. These loci were cross-tested on the following species: Acacia peregrinalis, Acacia crassicarpa, Bruguiera cylindrica, Delphacodes detecta, Tumidagena minuta, Dictyostelium macrocephalum, Dictyostelium discoideum, Dictyostelium purpureum, Dictyostelium mucoroides, Dictyostelium rosarium, Polysphondylium pallidum, Epimedium brevicornum, Epimedium koreanum, Epimedium pubescens, Epimedium wushanese and Fraxinus angustifolia.