O emprego de uma força de segurança de natureza militar nas missões de paz

The conflicts currently taking place around the world demand that the international intervention fits the intensity and extent of the threat. This is particularly important in post-conflict scenarios, leading to a greater participation of the Security Forces in those scenarios, in order to foster lasting peace, enforce the order and improve law enforcement services in those regions. The transition from armed conflict to peacekeeping may entail high risk situations and greater instability periods, so-called “intermediate situations”. Accordingly, in the face of persisting high volatility, a robust response is still required post-conflict. Therefore, it is appropriate to deploy Security Forces with military nature and status, the gendarmeries, which have training and response capabilities similar to Armed Forces in peacekeeping operations. Their double facet as police and military forces enables them to perform police duties in high risk and unsafe environments. In light of these features, the Portuguese gendarmerie, Guarda Nacional Republicana (GNR), is able to carry out tasks in these scenarios, which it has been doing through individual operatives or larger units. This dissertation focuses on the use of Security Forces of military nature in peacekeeping missions, in particular the Portuguese GNR, relying mostly on the inductive approach and using literature research, document analysis, interviews and statistics. After a brief description of international peacekeeping missions, we describe the contribution of Security Forces of a military nature in such operations. Then we introduce and analyse the GNR, focusing on its deployment in different kinds of peacekeeping operations, from its first participation in 1995 until today. We also report some reactions to the performance of GNR. Finally, we discuss whether there is indeed a unique role for this type of forces in international peacekeeping missions.

Políticas de prevenção rodoviária: um caso de geo-referenciação

Com a evolução cultural, económica e tecnológica das sociedades, os hábitos de mobilidade sofreram mudanças que possibilitaram melhorias na forma e nos tempos de deslocação. No início, o automóvel era um objeto de luxo mas rapidamente esse paradigma se alterou, sendo hoje um bem essencial. Esta alteração teve como consequência o surgimento de problemas de sinistralidade. As elevadas taxas de mortalidade originadas pelos elevados índices de sinistralidade atingiram níveis insustentáveis para as sociedades modernas. Numa tentativa de alterar o rumo dos acontecimentos, têm surgido inúmeros planos para minimizar as suas consequências. Assim, Governo Civil de Lisboa, no âmbito das suas competências de atuação, na área da Prevenção e Segurança Rodoviária, desenvolveu um projeto de georeferenciação da sinistralidade ocorrida no distrito de Lisboa, para o ano de 2007, englobando os sinistros onde estivessem envolvidas vitimas mortais e/ou feridos graves. O projeto foi realizado, tendo por base o sistema de informação alfanumérico (Boletim Estatístico de Acidentes Rodoviários - BEAV) disponibilizado pela Autoridade Nacional de Segurança Rodoviária e que é preenchido “in loco” pelas forças de segurança (PSP e GNR). Nestes boletins a componente geográfica já está prevista, contudo no seu tratamento não lhe é dada a devida importância, ficando estes campos, muitas vezes incompletos, mal preenchidos ou vazios. Este trabalho valorizou o aspeto geográfico, tendo sido marcados sobre ortofotomapas os locais onde ocorreu o sinistro. Associou-se depois a cada um, a informação alfanumérica que o caracteriza e uma componente de fotografia do local. O resultado final foi a produção de um relatório, contendo estes aspetos em sumários individuais, que foi distribuído aos 16 municípios do Distrito de Lisboa e a outras entidades interessadas. Foi igualmente disponibilizado um ficheiro KML para a plataforma GoogleEarth com os sinistros, alguma informação respeitante aos mesmos e integradas as fotografias do local. Este conjunto de informação, está em ficheiros compatíveis para aparelhos de GPS, no site oficial do Governo Civil de Lisboa. O projeto pretende disponibilizar à comunidade civil, informação georreferenciada do local do sinistro, alertando e sensibilizando as populações para o problema da sinistralidade.

Free-standing multilayered membranes based on graphene and natural polymers for biomedical applications

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Biomateriais, Reabilitação e Biomecânica)

Videovigilância nos espaços públicos e criminalidade contra o Património: Santuário de Fátima

Dissertação de mestrado em Crime, Diferença e Desigualdade

Performances et défaillances du sujet cérébral : regard anthropologique sur la plasticité cérébrale, les neurosciences et la clinique de la dégénérescence cognitive

Introduction 1.1 Le sujet cérébral, rencontre entre le biologique et le social L'objectif de ce travail est d'éclairer une des voies par lesquelles le phénomène anthropologique de l'individualité prend corps au sein de l'environnement contemporain. L'individualisme est compris comme les divers processus par lesquels la détermination du sujet tend à s'autonomiser des appartenances préconstituées. Il est la forme sociologique qui gouverne la façon contemporaine de faire société depuis l'avènement de la «modernité ». Le choix de l'angle de la cérébralité pour aborder la question de recherche repose sur le postulat qu'une des particularités culturelles de la figure du sujet individuel contemporain est la tendance à attribuer aux mécanismes cérébraux le rôle déterminant dans la constitution de la subjectivité du sujet. Dès lors, si aujourd'hui, penser le cerveau c'est penser l'humain, il s'agit d'un phénomène anthropologique qui demande à être explicité. Il m'appartient de démontrer que le champ des neurosciences se profile comme révélateur privilégié pour observer comment penser l'individualité concorde avec l'établissement de vérités relatives au cérébral' . Faire l'anthropologie du proche et de l'actuel a ses intérêts mais comporte aussi des risques. La perte de ce qui faisait le moteur de la recherche anthropologique -l'altérité donnée des sujets de son observation - a été compensée par l'émergence de nouveaux objets de travail et par des reconfigurations des rapports que l'anthropologue entretient avec son terrain. Le renouvellement du cadre de réflexion opéré par l'anthropologie au cours du siècle écoulé suit les transformations des pratiques sociales, culturelles et économiques qui s'opèrent au niveau mondial. L'échelle désormais planétaire de la circulation des acteurs sociaux et des objets de savoir a forcé la discipline à revoir la grille de lecture qui a longtemps opposé sociétés traditionnelles à sociétés modernes. La prise de conscience de la caducité du grand partage a engagé les anthropologues à s'intéresser à des phénomènes en rapport avec des problèmes rencontrés au sein de leur propre collectif et, dans le même mouvement, les a amenée à repenser les articulations entre le global et le local, le particulier et l'universel. Le bouleversement heuristique généré par ce repositionnement n'est toutefois pas exempt de nouvelles difficultés pour la recherche ethnographique. En se posant le défi d'étudier des traits culturels propres à sa société d'appartenance, l'anthropologie s'ouvre à des terrains enquête sur la façon dont, dans le monde occidental, le constat toujours plus pesant de la discordance entre les phénomènes de vieillissement cognitif et l'allongement de l'espérance de vie est traité. Dans une démarche ethnographique, il s'agit de voir quelles sont les logiques d'action et les pratiques sociales développées en réponse à ces inadéquations. La thématique impose une navigation entre des domaines théoriques spécialisés et des champs d'activités possédant chacun leurs cadres de référence. Une telle entreprise suppose une multiplication des systèmes de référence devant être pris en compte. Toutes les disciplines approchées au cours de ce travail abondent en métaphores utiles à la mise en ordre de leur pensée et à la description de leurs objets de travail. Toutefois, faire résonner entre elles les différentes «cultures épistémiques » (Knorr-Cetina, 1999) pour mieux faire apparaître la trame sociale qui constitue leur arrière-fond équivaut souvent à forcer le trait. Le sens des mots varie selon leurs champs d'application et l'exercice de la mise en résonance peut s'avérer périlleux. Je me suis efforcée tout au long de ces pages de préciser de quel point de vue les énoncés considérés sont formulés. L'analyse anthropologique étant guidée par la recherche des points de liaison entre les différents registres, la démarche est forcément limitée dans le niveau d'approfondissement auquel elle peut tendre. Elle risque de décevoir les lecteurs experts dans les domaines soumis à la grille de lecture de cette discipline, non familiers avec les concepts anthropologiques. Il est probable qu'un certain flou subsiste dans la façon dont ces énoncés sont décris par rapport au traitement dont ils sont l'objet dans leurs disciplines respectives. Si on perd de vue la préoccupation centrale de l'anthropologie, consistant à éclairer le système de valeurs commun sous-tendant les pratiques sociales observées, la lecture d'un tel travail risque effectivement de rater son but. En revanche, en acceptant d'emblée de se prêter à un décentrement par rapport à son modèle disciplinaire, le lecteur doit pouvoir appréhender des aspects intéressant ses propres pratiques. S'intéresser à ce qui relie les savoirs et les pratiques au sein d'un monde commun, voilà un programme heuristique qui va à l'encontre de la logique de spécialisation.

Le rôle des études universitaires et de la nature de la procédure sur les opinions envers les politiques de discrimination positive

RésuméCette thèse s'intéresse à l'impact du niveau d'éducation sur les attitudes envers les mesures de discrimination positive en faveur de la promotion professionnelle des femmes. La littérature consacrée à cette relation présente des résultats inconsistants : certains travaux ne montrent que l'éducation n'a pas d'effet sur l'accueil réservé aux mesures positives, tandis que d'autres suggèrent que cette relation pourrait être influencée par la nature des mesures positives. Nos attentes s'appuient sur les thèses de l'effet libérateur et de l'effet reproducteur de l'éducation. Les études réalisées dans le cadre de cette thèse, menées auprès de cadres, d'employés et d'étudiants résidant en Suisse et en Albanie, mettent en évidence un lien négatif entre le nombre d'années d'études et l'acceptation des mesures positives. Toutefois, cet effet apparaît essentiellement dans le cas de la mesure favorisant l'appartenance groupale des candidates par rapport à leurs caractéristiques personnelles, et non pas dans le cas de la mesure s'appuyant sur les compétences et le mérite des candidates. Nos études mettent en évidence les mécanismes qui génèrent ces opinions : l'orientation à la dominance sociale, l'adhésion aux principes méritocratiques, la reconnaissance de la discrimination subie par les femmes et le sentiment de menace généré par la mise en place des mesures de discrimination positive. Ces études examinent également la perception plus ou moins stéréotypée des bénéficiaires des mesures positives et de leur vulnérabilité aux conduites d'auto-handicap. Dans l'ensemble, les résultats corroborent davantage la thèse de l'effet reproducteur de l'éducation que celle de l'effet libérateur de l'éducation.

Identification and characterization of novel molecular mechanisms involved in initiation and progression of myelination

Schwann cells synthesize a large amount of membrane that form a specialized structure called myelin that surrounds axons and facilitate the transmission of electrical signal along neurons in peripheral nervous system (PNS). Previous studies demonstrated that both Schwann cell differentiation and de-differentiation (in the situation of a nerve injury or demyelinating disease) are regulated by cell-intrinsic regulators including several transcription factors. In particular, the de-differentiation of mature Schwann cells is driven by the activation of multiple negative regulators of myelination including Sox2, c-Jun, Notch and Pax3, all usually expressed in immature Schwann cells and suppressed at the onset of myelination. In order to identify new regulators of myelination involved in the development of the PNS, we analyzed the gene-expression profiling data from developing PNS and from three models of demyelinating neuropathies. This analysis led to the identification of Sox4, a member of the Sox family of transcription factors, as a potential candidate. To characterize the molecular function of Sox4 in PNS, we generated two transgenic lines of mice, which overexpress Sox4 specifically in Schwann cells. Detailed analysis of these mice showed that the overexpression of Sox4 in Schwann cells causes a delay in progression of myelination between post-natal day 2 (P2) and P5. Our in vitro analysis suggested that Sox4 cDNA can be overexpressed while the protein translation is tightly regulated. Interestingly, we observed that Sox4 protein is stabilized in nerves of the CMT4C mouse, a model of the human neuropathy. We therefore crossed Sox4 transgenic mice with CMT4C mice and we observed that Sox4 overexpression exacerbated the neuropathy phenotype in these mice. While recognized as being crucial for the normal function of both neurons and myelinating glial cells, the processes that regulate the beginning of myelination and the nature of the neuro-glial cross-talk remains mostly unknown. In order to gain insight into the molecular pathways involved in the interactions between neurons and associated glial cells, we developed a neuron-glia co-culture system based on microfluidic chambers and successfully induced myelination in this system by ascorbic acid. Importantly, we observed that in addition to acting on Schwann cells, ascorbic acid also modulate neuronal/axonal NRG1/ErbB2-B3 signalling. The experimental setting used in our study thus allowed us to discover a novel phenomena of propagation for myelination in vitro. The further characterization of this event brought us to identify other compounds able to induce myelination: ADAMs secretases inhibitor GM6001 and cyclic-AMP. The results generated during my thesis project are therefore not only important for the advancement of our understanding of how the PNS works, but may also potentially help to develop new therapies aiming at improvement of PNS myelination under disease conditions. - Les cellules de Schwann synthétisent une grande quantité de membrane formant une structure spécialisée appelée myéline qui entoure les axones et facilite la transmission du signal électrique le long des neurones du système nerveux périphérique (SNP). Des études antérieures ont démontré que la différenciation et la dédifférenciation des cellules de Schwann (dans la situation d'une lésion nerveuse ou d'une maladie démyélinisante) sont régulées par des régulateurs cellulaires intrinsèques, incluant plusieurs facteurs de transcription. En particulier, la dédifférenciation des cellules de Schwann matures est contrôlée par l'activation de plusieurs régulateurs négatifs de la myélinisation dont Sox2, c-Jun, Notch et Pax3, tous habituellement exprimés dans des cellules de Schwann immatures et supprimés au début de la myélinisation. Afin d'identifier de nouveaux régulateurs de myélinisation impliqués dans le développement du SNP, nous avons analysé le profil d'expression génique durant le développement du SNP ainsi que dans trois modèles de neuropathies démyélinisantes. Cette analyse a mené à l'identification de Sox4, un membre de la famille des facteurs de transcription Sox, comme étant un candidat potentiel. Dans le but de caractériser la fonction moléculaire de Sox4 dans le SNP, nous avons généré deux lignées transgéniques de souris qui surexpriment Sox4 spécifiquement dans les cellules de Schwann. L'analyse détaillée de ces souris a montré que la surexpression de Sox4 dans les cellules de Schwann provoque un retard dans la progression de la myélinisation entre le jour postnatal 2 (P2) et P5. Notre analyse in vitro a suggéré que l'ADNc de Sox4 peut être surexprimé alors que la traduction des protéines est quand à elle étroitement régulée. De façon intéressante, nous avons observé que la protéine Sox4 est stabilisée dans les nerfs des souris CMT4C, un modèle de neuropathie humaine. Nous avons donc croisé les souris transgéniques Sox4 avec des souris CMT4C et avons observé que la surexpression de Sox4 exacerbe le phénotype de neuropathie chez ces souris. Bien que reconnus comme étant cruciaux pour le fonctionnement normal des neurones et des cellules gliales myélinisantes, les processus qui régulent le début de la myélinisation ainsi que la nature des interactions neurone-glie restent largement méconnus. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans les interactions entre les neurones et les cellules gliales leur étant associés, nous avons développé un système de co-culture neurone-glie basé sur des chambres microfluidiques et y avons induit avec succès la myélinisation avec de l'acide ascorbique. Étonnamment, nous avons remarqué que, en plus d'agir sur les cellules de Schwann, l'acide ascorbique module également la voie de signalisation neuronale/axonale NRG1/ErbB2-B3. Le protocole expérimental utilisé dans notre étude a ainsi permis de découvrir un nouveau phénomène de propagation de la myélinisation in vitro. La caractérisation plus poussée de ce phénomène nous a menés à identifier d'autres composés capables d'induire la myélinisation: L'inhibiteur de sécrétases ADAMs GM6001 et l'AMP cyclique. Les résultats obtenus au cours de mon projet de thèse ne sont donc pas seulement importants pour l'avancement de notre compréhension sur la façon dont le SNP fonctionne, mais peuvent aussi potentiellement aider à développer de nouvelles thérapies visant à l'amélioration de la myélinisation du SNP dans des conditions pathologiques.

Détectabilité extra-fovéale sur des images anatomiques

Contexte¦- Les métastases hépatiques hypovasculaires sont parfois difficile à détecter car très polymorphiques et fréquemment irrégulières. Leurs contrastes sur CT scan hépatique sont souvent faibles.¦- Lors d'un diagnostic, le radiologue ne fixe pas sa vision fovéale sur chaque pixel de l'image. Les expériences de psychophysique avec eye-tracker montrent en effet que le radiologue se concentre sur quelques points spécifiques de l'image appelés fixations. Dans ce travail, nous nous intéresserons aux capacités de détection de l'oeil lorsque l'observateur effectue une saccade entre deux points de fixation. Plus particulièrement, nous nous intéresserons à caractériser les capacités de l'oeil à détecter les signaux se trouvant en dehors de sa vision fovéale, dans ce qu'on appelle, la vision périphérique.¦Objectifs¦- Caractériser l'effet de l'excentricité de la vision sur la détectabilité des contrastes dans le cas de métastases hépatiques hypovasculaires.¦- Récolter des données expérimentales en vue de créer un modèle mathématique qui permettra, à terme, de qualifier le système d'imagerie.¦- → objectifs du TM en soit :¦o prendre en main l'eyetracker¦o traduire une problématique médicale en une expérience scientifique reproductible, quantifiable et qualifiable.¦Méthode¦Nous effectuons une expérience 2AFC (2 Alternative Forced-Choice experiment) afin d'estimer la détectabilité du signal. Pour cela, nous forcerons l'observateur à maintenir son point de fixation à un endroit défini et vérifié par l'eye-tracker. La position del'excentricité du signal tumoral généré sur une coupe de CT hépatique sera le paramètre varié. L'observateur se verra présenté tour à tour deux coupes de CT hépatique, l'une comportant le signal tumoral standardisé et l'autre ne comportant pas le signal. L'observateur devra déterminer quelle image contient la pathologie avec la plus grande probabilité.¦- Cette expérience est un modèle simplifié de la réalité. En effet, le radiologue ne fixe pas un seul point lors de sa recherche mais effectue un "scanpath". Une seconde expérience, dite en free search sera effectuée dans la mesure du temps à disposition. Lors de cette expérience, le signal standardisé sera connu de l'observateur et il n'y aura plus de point de fixation forcée. L'eyetracker suivra le scanpath effectué par l'oeil de l'observateur lors de la recherche du signal sur une coupe de CT scan hépatique. L'intérêt de cette expérience réside dans l'observation de la corrélation entre les saccades et la découverte du signal. Elle permet aussi de vérifier les résultats obtenus lors de la première expérience.¦Résultats escomptés¦- Exp1 : Quantifier l'importance de l'excentricité en radiologie et aider à améliorer la performance de recherche.¦- Exp 2 : tester la validité des résultats obtenus par la première expérience.¦Plus value escomptée¦- Récolte de données pour créer un modèle mathématique capable de déterminer la qualité de l'image radiologique.¦- Possibilité d'extension à la recherche dans les trois dimensions du CT scan hépatique.

The role of the Estrogen-Responsive B box protein in skin morphogenesis, wound repair and skin disease

SUMMARY: EBBP is a poorly characterized member of the RBCC/TRIM family (RING finger B-box coiled-coilltripartite motif). It is ubiquitously expressed, but particularly high levels are found in keratinocytes. There is evidence that EBBP is involved in inflammatory processes, since it can interact with pro-interleukin-1 ß (prolL-1 ß) in human macrophages and keratinocytes, and its downregulation results in reduced secretion of IL-1 ß. IL-1ß activation and secretion requires the proteolytic cleavage of prolL-1ß by caspase-1, which in turn is actìvated by a protein complex called the inflammasome. As it has been demonstrated that EBBP can bind two different proteins of the inflammasome (NALP-1 and caspase 1), we assumed that EBBP plays a role in the regulation of inflammation and that the inflammasome, which has as yet only been described in ínflammatory cells, may also exist in keratinocytes. Indeed, I could show in my thesis that the inflammasome components are expressed in human keratinócytes at the RNA and protein level and also in vivo in human epidermis. After irradiation with a physiological dose of UVB, keratinocytes activated prolL-1ß and secreted prolL-1 a, IL-1 ß, prolL-18 and inflammasome proteins, although all these proteins lack a classical signal peptide. The secretion was dependent on caspase-1 activity, but not on de novo protein synthesis. Knock-down of NALP1 and -3, caspase-1 and -5, EBBP and Asc strongly reduced the secretion of IL-1 ß, demonstrating that also in keratinocytes inflammasome proteins are directly involved in maturation of this cytokine. These results demonstrate for the first time the presence of an active inflammasome in non-professional immune cells. Moreover, they show that UV irradiation is a stimulus for inflammasome activation in keratinocytes. For the analysis of the ín vivo functions of EBBP, transgenic mice overexpressing EBBP in the epidermis were generated. To examine the influence of EBBP overexpression on inflammatory processes, we subjected the mice to different challenges, which induce inflammation. Wound-healing, UVB irradiation and delayed hypersensitivity were tested, but we did not observe any phenotype in the K14-EBBP mice. Besides, a conditional ebbp knockout mouse has been obtained, which will allow to determine the effects of EBBP gene deletion in different tissues and organs. RESUME: EBBP est un membre encore mal connu de la famille des RBCC/TRIM (RING finger B-box coiled-coil/tripartite motif). Il est exprimé de manière ubiquitaire, et en particulier dans les kératinocytes. EBBP étant capable d'interagir avec la prointerleukine-1 ß (prolL-1 ß) dans les macrophages et les kératinocytes humains et de réguler la sécrétion de l'IL-1 ß, il est très probable que cette protéine est impliquée dans l'inflammation. L'activation et la sécrétion de l'IL-1 ß requièrent le clivage protéolytique de son précurseur prolL-1ß par la caspase-1, qui est elle-même activée par un complexe protéique appelé l'inflammasome. Comme il a été démontré qu'EBBP peut lier deux protéines de l'inflammasome (NALP-1 et caspase-1), nous avons émis l'hypothèse qu'EBBP joue un rôle dans la régulation de l'inflammation et que l'inflammasome, jusqu'ici décrit exclusivement dans des cellules inflammatoires, existe dans les kératinocytes. En effet, j'ai pu montrer dans ma thèse que les composants de l'inflammasome sont exprimés dans les kératinocytes humains ainsi que in vivo dans l'épiderme humain. Après irradiation avec une dose, physiologique d'UVB, les kératinocytes activent la prolL-1 ß et sécrètent la prolL-1a, l'IL-1 ß, la prolL-18 et des protéines de l'inflammasome, bien que toutes ces protéines soient dépourvues de peptide signal. La sécrétion dépend de la caspase-1 mais pas de la synthèse protéique de novo. Le knock-down de NALP-1 et -3, des caspase-1 et -5, d'EBBP et d'Asc réduit de manière marquée la sécrétion d'IL-1 ß, démontrant que dans les kératinocytes également, les protéines de l'inflammasome sont impliquées directement dans la maturation de cette cytokine. Ces résultats démontrent pour la première fois la présence d'un inflammasome actif dans des cellules immunitaires non professionnelles. De plus, ils montrent que l'irradiation aux UV est un stimulus pour l'activation de l'inflammasome dans les kératinocytes. Pour l'analyse des fonctions d'EBBP in vivo, nous avons généré des souris transgéniques qui surexpriment EBBP dans l'épiderme. En vue d'examiner l'influence de la surexpression d'EBBP sur le processus inflammatoire, nous avons soumis ces souris à differents modèles d'inflammation. Nous avons testé cicatrisation, UVB et hypersensibilité retardée, mais n'avons pas observé de phénotype chez les souris transgéniques. En parallèle, nous avons également généré des souris knock-out pour ebbp qui devraient nous permettre de déterminer les effets de la suppression d'EBBP dans différents tissus et organes.

The role of Pten in the Hematopoietic System and the Hematopoietic Stem Cells

Résumé Identification, localisation et activation des cellules souches hématopoiétiques dormantes in vivo Les cellules souches somatiques sont présentes dans la majorité des tissus régénératifs comme la peau, l'épithélium intestinal et le système hématopoiétique. A partir d'une seule cellule, elles ont les capacités de produire d'autres cellules souches du même type (auto-renouvellement) et d'engendrer un ensemble défini de cellules progénitrices différenciées qui vont maintenir ou réparer leur tissu hôte. Les cellules souches adultes les mieux caractérisées sont les cellules souches hématopoiétiques (HSC), localisées dans la moelle osseuse. Un des buts de mon travail de doctorat était de caractériser plus en profondeur la localisation des HSCs endogènes in vivo. Pour ce faire, la technique "label retaining assay", se basant sur la division peu fréquentes et sur la dormance des cellules souches, a été utilisée. Après un marquage des souris avec du BrdU (analogue à l'ADN) suivi d'une longue période sans BrdU, les cellules ayant incorporés le marquage ("label retaining cells" LCRs) ont pu être identifiées dans la moelle osseuse. Ces cellules LCRs étaient enrichies 300 fois en cellules de phenotype HSC et, en utilisant de la cytofluorométrie, il a pu être montré qu'environ 15% de toutes les HSCs d'une souris restent dormantes durant plusieures semaines. Ces HSCs dormantes à long terme ne sont probablement pas impliquées dans la maintenance de 'hématopoièse. Par contre, on assiste à l'activation rapide de ces HSCs dormantes lors d'une blessure, comme une ablation myéloide. Elles re-entrent alors en cycle cellulaire et sont essentielles pour une génération rapide des cellules progénitrices et matures qui vont remplacer les cellules perdues. De plus, la détection des LCRs, combinée avec l'utilisation du marqueur de HSCs c-kit, peut être utilisée pour la localisation des HSCs dormantes présentes dans la paroi endostéale de la cavité osseuse. De manière surprenante, les LCRs c-kit+ ont surtout étés trouvées isolées en cellule unique, suggérant que le micro-environement spécifique entourant et maintenant les HSCs, appelé niche, pourrait être très réduit et abriter une seule HSC par niche. Rôles complexes du gène supresseur de tumeur Pten dans le système hématopoiétique La phosphatase PTEN disparaît dans certains cancers héréditaires ou sporadiques humains, comme les gliomes, les cancers de l'utérus ou du sein. Pten inhibe la voie de signalisation de la PI3-kinase et joue un rôle clé dans l'apoptose, la croissance, la prolifération et la migration cellulaire. Notre but était d'étudier le rôle de Pten dans les HSC normale et durant la formation de leucémies. Pour ce faire, nous avons généré un modèle murin dans lequel le gène Pten peut être supprimé dans les cellules hématopoiétiques, incluant les HSCs. Ceci a été possible en croissant l'allèle conditionnelle ptenflox soit avec le transgène MxCre inductible par l'interféron α soit avec le transgène Scl-CreERt inductible par le tamoxifen. Ceci permet la conversion de l'allèle ptenflox en l'allèle nul PtenΔ dans les HSCs et les autres types cellulaires hématopoiétiques. Les souris mutantes Pten développent une splénomégalie massive causée par une expansion dramatiques de toutes les cellules myéloides. De manière interessante, alors que le nombre de HSCs dans la moelle osseuse diminue progressivement, le nombre des HSCs dans la rate augmente de manière proportionnelle. Etrangement, les analyses de cycle cellulaire ont montrés que Pten n'avait que peu ou pas d'effet sur la dormance des HSCs ou sur leur autorenouvellement. En revanche, une augmentation massive du niveau de la cytokine de mobilisation G-CSF a été détéctée dans le serum sanguin, suggérant que la suppression de Pten stimulerait la mobilisation et la migration des HSC de la moelle osseuse vers la rate. Finallement, la transplantation de moelle osseuse délétée en Pten dans des souris immuno-déficientes montre que Pten fonctionnerait comme un suppresseur de tumeur dans le système hématopoiétique car son absence entraîne la formation rapide de leucémies lymphocytaires. Summary Identification, localization and activation of dormant hematopoietic stun cells in vivo Somatic stem cells are present in most self-renewing tissues including the skin, the intestinal epithelium and the hematopoietic system. On a single cell basis they have the capacity to produce more stem cells of the same phenotype (self-renewal) and to give rise to a defined set of mature differentiated progeny, responsible for the maintenance or repair of the host tissue. The best characterized adult stem cell is the hematopoietic stem cell (HSC) located in the bone marrow. One goal of my thesis work was to further characterize the location of endogenous HSCs in vivo. To do this, a technique called "label retaining assay» was used which takes advantage of the fact that stem cells (including HSCs) divide very infrequently and can be dormant for months. After labeling mice with the DNA analogue BrdU followed by a long BrdU free "chase", BrdU "label retaining cells" (CRCs) could be identified in the bone marrow. These CRCs were 300-fold enriched for phenotypic HSCs and by using flow cytometry analysis it could be shown that about 15% of all HSCs in the mouse are dormant for many weeks. Our results suggest that these long-term dormant HSCs are unlikely to be involved in homeostatic maintenance. However they are rapidly activated and reenter the cell cycle in response to injury signals such as myeloid ablation. In addition, detection of LRCs in combination with the HSC marker c-Kit could be used to locate engrafted dormant HSCs close to the endosteal lining of the bone marrow cavities. Most surprisingly, c-Kit+LRCs were found predominantly as single cells suggesting that the specific stem cell maintaining microenvironment, called niche, has limited space and may house only single HSCs. Complex roles of the tumor suppressor gene Pten in the hematopoietic system. The phosphatase PTEN is lost in hereditary and sporadic forms of human cancers, including gliomas, endometrial and breast cancers. Pten inhibits the PI3-kina.se pathway and plays a key role in apoptosis, cell growth, proliferation and migration. Our aim was to study the role of Pten in normal HSCs and during leukemia formation. To do this, we generated a mouse model in which the Pten gene can be deleted in hematopoietic cells including HSCs. This was achieved by crossing the conditional ptenflox allele with either the interferona inducible MxCre or the tamoxifen inducible Scl-CreERT transgene. This allowed the conversion of the ptenflox allele into a pterr' null allele in HSCs and other hematopoietic cell types. As a result Pten mutant mice developed massive splenomegaly due to a dramatic expansion of all myeloid cells. Interestingly, while the number of bone marrow HSCs progressively decreased, the number of HSCs in the spleen increased to a similar extent. Unexpectedly, extensive cell cycle analysis showed that Pten had little or no effect on HSC dormancy or HSC self-renewal. Instead, dramatically increased levels of the mobilizing cytokine G-CSF were detected in the blood serum suggesting that loss-of Pten stimulates mobilization and migration of HSC from the BM to the spleen. Finally, transplantation of Pten deficient BM cells into immuno-compromised mice showed that Pten can function as a tumor suppressor in the hematopoietic system and that its absence leads to the rapid formation of T cell leukemia.

Recombinant " Physcomitrella patens " as a sensitive tool to study heat sensing and heat-shock signal transduction in plants

SUMMARY When exposed to heat stress, plants display a particular set of cellular and molecular responses, such as chaperones expression, which are highly conserved in all organisms. In chapter 1, I studied the ability of heat shock genes to become transiently and abundantly induced under various temperature regimes. To this aim, I designed a highly sensitive heat-shock dependent conditional gene expression system in the moss Physcomitrella patens, using the soybean heatinducible promoter (hsp17.3B). Heat-induced expression of various reporter genes was over three orders of magnitude, in tight correlation with the intensity and duration of the heat treatments. By performing repeated heating/cooling cycles, a massive accumulation of recombinant proteins was obtained. Interestingly, the hsp17.3B promoter was also activated by specific organic chemicals. Thus, in chapter 2, I took advantage of the extreme sensitivity of this promoter to small temperature variations to further address the role of various natural and organic chemicals and develop a plant based-bioassay that can serve as an early warning indicator of toxicity by pollutants and heavy metals. A screen of several organic pollutants from textile and paper industry showed that chlorophenols as well as sulfonated anthraquinones elicited a heat shock like response at noninducing temperatures. Their effects were synergistically amplified by mild elevated temperatures. In contrast to standard methods of pollutant detection, this plant-based biosensor allowed to monitor early stress-responses, in correlation with long-term toxic effect, and to attribute effective toxicity thresholds for pollutants, in a context of varying environmental cues. In chapter 3, I deepened the study of the primary mechanism by which plants sense mild temperature variations and trigger a cellular signal leading to the heat shock response. In addition to the above described heat-inducible reporter line, I generated a P. patens transgenic line to measure, in vivo, variations of cytosolic calcium during heat treatment, and another line to monitor the role of protein unfolding in heat-shock sensing and signalling. The heat shock signalling pathway was found to be triggered by the plasma membrane, where temperature up shift specifically induced the transient opening of a putative high afimity calcium channel. The calcium influx triggered a signalling cascade leading to the activation of the heat shock genes, independently on the presence of misfolded proteins in the cytoplasm. These results strongly suggest that changes in the fluidity of the plasma membrane are the primary trigger of the heatshocksignalling pathway in plants. The present thesis contributes to the understanding of the basic mechanism by which plants perceive and respond to heat and chemical stresses. This may contribute to developing appropriate better strategies to enhance plant productivity under the increasingly stressful environment of global warming. RÉSUME Les plantes exposées à des températures élevées déclenchent rapidement des réponses cellulaires qui conduisent à l'induction de gènes codant pour les heat shock proteins (HSPs). En fonction de la durée d'exposition et de la vitesse à laquelle la température augmente, les HSPs sont fortement et transitoirement induites. Dans le premier chapitre, cette caractéristique aété utilisée pour développer un système inductible d'expression de gènes dans la mousse Physcomitrella patens. En utilisant plusieurs gènes rapporteurs, j'ai montré que le promoteur du gène hsp17.3B du Soja est activé d'une manière. homogène dans tous les tissus de la mousse proportionnellement à l'intensité du heat shock physiologique appliqué. Un très fort taux de protéines recombinantes peut ainsi être produit en réalisant plusieurs cycles induction/recovery. De plus, ce promoteur peut également être activé par des composés organiques, tels que les composés anti-inflammatoires, ce qui constitue une bonne alternative à l'induction par la chaleur. Les HSPs sont induites pour remédier aux dommages cellulaires qui surviennent. Étant donné que le promoteur hsp17.3B est très sensible à des petites augmentations de température ainsi qu'à des composés chimiques, j'ai utilisé les lignées développées dans le chapitre 1 pour identifier des polluants qui déclenchent une réaction de défense impliquant les HSPs. Après un criblage de plusieurs composés, les chlorophénols et les antraquinones sulfonés ont été identifiés comme étant activateurs du promoteur de stress. La détection de leurs effets a été réalisée seulement après quelques heures d'exposition et corrèle parfaitement avec les effets toxiques détectés après de longues périodes d'exposition. Les produits identifiés montrent aussi un effet synergique avec la température, ce qui fait du biosensor développé dans ce chapitre un bon outil pour révéler les effets réels des polluants dans un environnement où les stress chimiques sont combinés aux stress abiotiques. Le troisième chapitre est consacré à l'étude des mécanismes précoces qui permettent aux plantes de percevoir la chaleur et ainsi de déclencher une cascade de signalisation spécifique qui aboutit à l'induction des gènes HSPs. J'ai généré deux nouvelles lignées afin de mesurer en temps réel les changements de concentrations du calcium cytosolique ainsi que l'état de dénaturation des protéines au cours du heat shock. Quand la fluidité de la membrane augmente après élévation de la température, elle semble induire l'ouverture d'un canal qui permet de faire entrer le calcium dans les cellules. Ce dernier initie une cascade de signalisation qui finit par activer la transcription des gènes HSPs indépendamment de la dénaturation de protéines cytoplasmiques. Les résultats présentés dans ce chapitre montrent que la perception de la chaleur se fait essentiellement au niveau de la membrane plasmique qui joue un rôle majeur dans la régulation des gènes HSPs. L'élucidation des mécanismes par lesquels les plantes perçoivent les signaux environnementaux est d'une grande utilité pour le développement de nouvelles stratégies afin d'améliorer la productivité des plantes soumises à des conditions extrêmes. La présente thèse contribue à décortiquer la voie de signalisation impliquée dans la réponse à la chaleur.

Maturation protéolytique et sécrétion de la rénine: importance fonctionnelle de la pro-région

RÉSUMÉ Le système rénine-angiotensine joue un rôle prépondérant dans la régulation de la pression sanguine et de la balance des sels ainsi que dans d'autres processus physiologiques et pathologiques. Lorsque la pression sanguine est trop basse, les cellules juxtaglomérulaires sécrètent la rénine, qui clivera l'angiotensinogène circulant (sécrété majoritairement par le foie) pour libérer l'angiotensine I, qui sera alors transformée en angiotensine II par l'enzyme de conversion de l'angiotensine. Ce système est régulé au niveau de la sécrétion de la rénine par le rein. La rénine est une enzyme de type protéase aspartique. Elle est produite sous la forme d'un précurseur inactif de haut poids moléculaire appelé prorénine, qui peut être transformé en rénine active. Si le rôle de la prorégion de la rénine n'est pas encore connu, plusieurs études ont montré qu'elle pourrait être un auto-inhibiteur. Des travaux menés sur d'autres enzymes protéolytique ont mis en évidence un rôle de chaperon de leurs prorégions. Dans la circulation, la prorénine est majoritaire (90%) et la rénine active ne représente que 10% de la rénine circulante. L'enzyme qui transforme, in vivo, la prorénine en rénine active n'est pas connue. De même, l'endroit précis du clivage n'est pas élucidé. Dans ce travail, nous avons généré plusieurs mutants de la prorénine et les avons exprimés dans deux types cellulaires : les CV1 (modèle constitutif) et AtT-20 (modèle régulé). Nous avons montré que la prorégion joue un rôle important aussi bien dans l'acquisition de l'activité enzymatique que dans la sécrétion de la rénine, mais fonctionne différemment d'un type cellulaire à l'autre. Nous avons montré pour la première fois que la prorégion interagit de façon intermoléculaire à l'intérieur de la cellule. Les expériences de complémentation montre que l'interaction favorable de la rénine avec la prorégion dépend de la taille de cette dernière : prorénine (383 acides aminés) > pro62 (62 acides aminés) > pro43 (43 acides aminés). Par ailleurs nos résultats montrent qu'une faible partie de la rénine est dirigée vers la voie de sécrétion régulée classique tandis que la majorité est dirigée vers les lysosomes. Ceci suggère qu'une internalisation de la rénine circulante via le récepteur mannose-6-phosphate est possible. Cette dernière concernerait essentiellement la prorénine (dont les taux circulants sont 10 fois plus élevés que la rénine active). La suite de ce travail porterait sur la confirmation de cette hypothèse et l'identification de son possible rôle physiologique. SUMMARY The renin-angiotensin system is critical for the control of blood pressure and salt balance and other physiological and pathological processes. When blood pressure is too low, renin is secreted by the juxtaglomerular cells. It will cleave the N-terminus of circulating angiotensinogen (mostly secreted by the liver) to angiotensin-1, which is then transformed in angiotensin-II by the angiotensin-converting-enzyme (ACE). This system is regulated at the level of renin release. Renin, an aspartyl protease, is produced from a larger precursor (called prorenin) which is matured into active renin. Although the role of the renin proregion remains unknown, it has been reported that it could act as an autoinhibitor. Works on other proteolytic enzymes showed that their prorégion can act as chaperones. prorenin is the major circulating form of renin, while active renin represents only 10%. The enzyme which transforms, in vivo, the prorenin into active renin is unknown and the exact cleavage site remains to be elucidated. In this study, we generated some prorenin mutants, which were expressed in CV1 cells (constitutive pathway model) or AtT-20 cells (regulated pathway model). We showed that the proregion plays a pivotal role in the enzymatic activity and secretion of renin in a different manner in the two cell types. For the first time, it has been demonstrated that the proregion acts in an intermolecular way into the cell. Complementation assays showed that interaction between renin and proregion depends on the size of the proregion: prorenin (383 amino acids) > pro62 (62 amino acids) > pro43 (43 amino acids). Furthermore, our results showed that only a small amount of the cellular renin pool is targeted to the "canonical" regulated pathway and that the remaining is targeted to the lysosomes. Those results suggest a possible internalizátion of the circulating renin through the mannose-6-phosphate receptor pathway. This would mostly concern the prorenin (whose levels are ten times higher than active renin). Further studies would confirm or infirm this hypothesis and elucidate a potential physiological role.

Study of conformational changes of ASIC1a by voltage-clamp fluorometry

Le fonctionnement du système nerveux est sensible aux variations de la concentration d'acide. Une acidification des tissus peut se produire pendant une activité neuronale intense ou dans des situations physiopathologiques telles que l'inflammation ou les lésions cérébrales. Les canaux ioniques sensibles à l'acide (ASIC) sont activés par acidification et jouent un rôle important dans la détection des changements d'acide. Les ASICs contribuent à la dégénérescence neuronale après une lésion cérébrale, puisque leur inhibition limite la lésion neuronale. L'acidification induite par une inflammation du tissu nerveux conduit à des stimuli de douleur, qui sont détectés par ces canaux. En effet, les toxines qui bloquent spécifiquement les ASICs montrent des effets analgésiques dans des modèles animaux. La structure 3D d'ASIC peut être comparée à une main qui tient une boule entre son pouce et le doigt. Les différents domaines d'ASIC sont appelés doigt, pouce, jointure, boule-ß et paume. Les domaines transmembranaires représentent le poignet de cette main. Mon projet de thèse vise à décrire les mouvements survenant sur ce canal pendant son activité. A cet effet, j'ai utilisé une technique combinée qui permet la mesure des mouvements en temps réel durant l'activité du canal. J'ai montré les réarrangements des domaines extracellulaires pendant l'activité ASIC. Ces mouvements sont transmis au pore du canal, ou ils contrôlent sa fermeture et ouverture. La direction de ces mouvements a été évaluée pour les domaines doigt et jointure, et nous avons montré qu'ils s'éloignent de la boule-ß lors de l'acidification. J'ai également été en mesure de décrire les mouvements qui se produisent dans la poche acidique, une zone qui est considérée comme importante, car elle représente le site de liaison de certaines toxines de venin qui agissent sur les ASICs. J'ai ainsi pu montrer que les domaines doigt et le pouce qui forment la poche acidique se rapprochent l'un de l'autre pendant l'activation du canal. Ces résultats sont en accord avec des observations précédentes réalisées sur les ASICs par d'autres chercheurs. Enfin, cette analyse approfondie permet d'améliorer les connaissances sur le contrôle de l'activité ASIC; de plus, les mécanismes trouvés ici sont probablement partagés entre les canaux de la famille à laquelle appartiennent les ASICs. -- Les acid-sensing ion channels (ASICs) sont des canaux sodiques ouverts par les protons et principalement exprimés dans le système nerveux. Ils sont impliqués dans la détection des protons dans de nombreux états physiologiques et pathologiques comme l'ischémie et la perception de la douleur. La structure cristalline de l'isoforme ASIC1 de poulet a été déterminée dans l'état désensibilisé et ouvert. Les études fonctionnelles indiquent que la protonation des résidus clés dans la boucle extracellulaire déclenche des changements de conformation conduisant à l'ouverture du canal. Cependant, les mécanismes moléculaires qui relient la protonation à l'ouverture et la fermeture du canal n'ont pas encore été clarifiés. Dans cette étude, nous avons utilisé la voltage-clamp fluorimétrie (VCF) pour révéler les mouvements de l'activité associée qui se produisent dans les différents domaines de l'ASICla. Les fluorophores positionnés dans le pouce, la paume, le doigt, l'articulation et dans les domaines de l'entrée du pore extracellulaire ont montré des signaux de VCF liés à des changements de conformation au cours de l'activité du canal. La synchronisation des changements de fluorescence indique une séquence complexe de mouvements en fonction du pH. La cinétique de la fluorescence et des signaux de courant ont été comparés les uns aux autres afin de déterminer si le mouvement détecté par le signal de fluorescence correspond à une transition fonctionnelle définie du canal. Certains des résidus testés se sont révélés être étroitement liés à la désensibilisation du canal ou au rétablissement après la désensibilisation. En outre, nous avons trouvé qu'un tryptophane endogène de la boule-ß diminue le signal de fluorescence des sondes positionnées dans les domaines doigt et jointure. L'augmentation observée de ces signaux indique que ces domaines s'éloignent à une distance à partir de la boucle de la boule-ß. Sur la base de ce principe, nous avons généré des paires Trp-Cys « quencher», dans lequel le Cys est utilisé comme site d'ancrage pour attacher le fluorophore. Ensuite, nous avons évalué les changements de conformation qui se produisent au niveau de la poche acide, une zone importante pour la fonction et la régulation d'ASIC. Les signaux de fluorescence indiquent un mouvement de l'hélice supérieure du pouce vers le doigt et une rotation de la boule-ß dans le sens horaire. L'analyse de la cinétique indique que les mouvements des sous-domaines qui composent la poche acide se produisent pendant la désensibilisation du canal. Mon projet de doctorat représente la première analyse approfondie des changements conformationnels dépendants de l'activité des ASICs et fournit des informations sur les mécanismes de contrôle de l'activité du canal qui sont probablement partagés avec d'autres canaux proches.

Characterization of root apoplastic barriers in Arabidopsis thaliana

In vascular plants, the best-known feature of a differentiated endodermal cell is the "Casparian Strip" (CS). This structure refers to a highly localized cell wall impregnation in the transversal and anticlinal walls of the cell, which surrounds the cell like a belt/ring and is tightly coordinated with respect to neighboring cells. Analogous to tight junctions in animal epithelia, CS in plants act as a diffusion barrier that controls the movement of water and ions from soil into the stele. Since its first description by Robert Caspary in 1865 there have been many attempts to identify the chemical nature of the cell wall deposition in CS. Suberin, lignin, or both have been claimed to be the important components of CS in a series of different species. However, the exact chemical composition of CS has remained enigmatic. This controversy was due to the confusion and lack of knowledge regarding the precise measurement of three developmental stages of the endodermis. The CS represent only the primary stage of endodermal differentiation, which is followed by the deposition of suberin lamellae all around the cellular surface of endodermal cells (secondary developmental stage). Therefore, chemical analysis of whole roots, or even of isolated endodermal tissues, will always find both of the polymers present. It was crucial to clarify this point because this will guide our efforts to understand which cell wall biosynthetic component becomes localized in order to form the CS. The main aim of my work was to find out the major components of (early) CS, as well as their spatial and temporal development, physiological roles and relationship to barrier formation. Employing the knowledge and tools that have been accumulated over the last few years in the model plant Arabidopsis thaliana, various histological and chemical assays were used in this study. A particular feature of my work was to completely degrade, or inhibit formation of lignin and suberin biopolymers by biochemical, classical genetic and molecular approaches and to investigate its effect on CS formation and the establishment of a functional diffusion barrier. Strikingly, interference with monolignol biosynthesis abrogates CS formation and delays the formation of function diffusion barrier. In contrast, transgenic plants devoid of any detectable suberin still develop a functional CS. The combination of all these assays clearly demonstrates that the early CS polymer is made from monolignol (lignin monomers) and is composed of lignin. By contrast, suberin is formed much later as a secondary wall during development of endodermis. These early CS are functionally sufficient to block extracellular diffusion and suberin does not play important role in the establishment of early endodermal diffusion barrier. Moreover, suberin biosynthetic machinery is not present at the time of CS formation. Our study finally concludes the long-standing debate about the chemical nature of CS and opens the door to a new approach in lignin research, specifically for the identification of the components of the CS biosynthetic pathway that mediates the localized deposition of cell walls. I also made some efforts to understand the patterning and differentiation of endodermal passage cells in young roots. In the literature, passage cells are defined as a non- suberized xylem pole associated endodermal cells. Since these cells only contain the CS but not the suberin lamellae, it has been assumed that these cells may offer a continued low-resistance pathway for water and minerals into the stele. Thus far, no genes have been found to be expressed specifically in passage cells. In order to understand the patterning, differentiation, and physiological role of passage it would be crucial to identify some genes that are exclusively expressed in these cells. In order to identify such genes, I first generated fluorescent marker lines of stele-expressed transporters that have been reported to be expressed in the passage cells. My aim was to first highlight the passage cells in a non-specific way. In order to find passage cell specific genes I then adapted a two-component system based on previously published methods for gene expression profiling of individual cell types. This approach will allow us to target only the passage cells and then to study gene expression specifically in this cell type. Taken together, this preparatory work will provide an entry point to understand the formation and role of endodermal passage cells. - Chez les plantes vasculaires, la caractéristique la plus commune des cellules différentiées de l'endoderme est la présence de cadres de Caspary. Cette structure correspond à une imprégnation localisée des parties transversales et anticlinales de la paroi cellulaire. Cela donne naissance, autour de la cellule, à un anneau/cadre qui est coordonné par rapport aux cellules voisines. De manière analogue aux jonctions serrées des épithéliums chez les animaux, les cadres de Caspary agissent chez les plantes comme barrière de diffusion, contrôlant le mouvement de l'eau et des ions à travers la racine entre le sol et la stèle. Depuis leur première description par Robert Caspary en 1865, beaucoup de tentatives ont eu pour but de définir la nature chimique de ces cadres de Caspary. Après l'étude de différentes espèces végétales, à la fois la subérine, la lignine ou les deux ont été revendiquées comme étant des composants importants de ces cadres. Malgré tout, leur nature chimique exacte est restée longtemps énigmatique. Cette controverse provient de la confusion et du manque de connaissance concernant la détermination précise des trois stades de développement de l'endoderme. Les cadres de Caspary représentent uniquement le stade primaire de différentiation de l'endoderme. Celui-ci est suivi par le second stade de différentiation, la déposition de lamelles de subérine tout autour de la cellule endodermal. De ce fait, l'analyse chimique de racines entières ou de cellules d'endoderme isolées ne permet pas de séparer les stades de différentiation primaire et secondaire et aboutit donc à la présence des deux polymères. Il est également crucial de clarifier ce point dans le but de connaître quelle machinerie cellulaire localisée à la paroi cellulaire permet l'élaboration des cadres de Caspary. En utilisant les connaissances et les outils accumulés récemment grâce à la plante modèle Arabidopsis thaliana, divers techniques histologiques et chimiques ont été utilisées dans cette étude. Un point particulier de mon travail a été de dégrader ou d'inhiber complètement la formation de lignine ou de subérine en utilisant des approches de génétique classique ou moléculaire. Le but étant d'observer l'effet de l'absence d'un de ces deux polymères sur la formation des cadres de Caspary et l'établissement d'une barrière de diffusion fonctionnelle. De manière frappante, le fait d'interférer avec la voie de biosynthèse de monolignol (monomères de lignine) abolit la formation des cadres de Caspary et retarde l'élaboration d'une barrière de diffusion fonctionnelle. Par contre, des plantes transgéniques dépourvues d'une quantité détectable de subérine sont quant à elles toujours capables de développer des cadres de Caspary fonctionnels. Mises en commun, ces expériences démontrent que le polymère formant les cadres de Caspary dans la partie jeune de la racine est fait de monolignol, et que de ce fait il s'agit de lignine. La subérine, quant à elle, est formée bien plus tard durant le développement de l'endoderme, de plus il s'agit d'une modification de la paroi secondaire. Ces cadres de Caspary précoces faits de lignine suffisent donc à bloquer la diffusion extracellulaire, contrairement à la subérine. De plus, la machinerie de biosynthèse de la subérine n'est pas encore présente au moment de la formation des cadres de Caspary. Notre étude permet donc de mettre un terme au long débat concernant la nature chimique des cadres de Caspary. De plus, elle ouvre la porte à de nouvelles approches dans la recherche sur la lignine, plus particulièrement pour identifier des composants permettant la déposition localisée de ce polymère dans la paroi cellulaire. J'ai aussi fais des efforts pour mettre en évidence la formation ainsi que le rôle des cellules de passage dans les jeunes racines. Dans la littérature, les cellules de passage sont définies comme de la cellule endodermal faisant face aux pôles xylèmes et dont la paroi n'est pas subérisée. Du fait que ces cellules contiennent uniquement des cadres de Caspary et pas de lamelle de subérine, il a été supposé qu'elles ne devraient offrir que peu de résistance au passage de l'eau et des nutriments entre le sol et la stèle. Le rôle de ces cellules de passage est toujours loin d'être clair, de plus aucun gène s'exprimant spécifiquement dans ces cellules n'a été découvert à ce jour. De manière à identifier de tels gènes, j'ai tout d'abord généré des marqueurs fluorescents pour des transporteurs exprimés dans la stèle mais dont l'expression avait également été signalée dans l'endoderme, uniquement dans les cellules de passage. J'ai ensuite développé un système à deux composants basé sur des méthodes déjà publiées, visant principalement à étudier le profil d'expression génique dans un type cellulaire donné. En recoupant les gènes exprimés spécifiquement dans l'endoderme à ceux exprimés dans la stèle et les cellules de passage, il nous sera possible d'identifier le transriptome spécifique de ces cellules. Pris dans leur ensemble, ces résultats devraient donner un bon point d'entrée dans la définition et la compréhension des cellules de passage.

Redox dysregulation in schizophrenia : implication for oligodendrocyte maturation and structural connectivity

Schizophrenia, which results from an interaction between gene and environmental factors, is a psychiatric disorder characterized by reality distortion. The clinical symptoms, which are generally diagnosed in late adolescence or early adulthood, partly derive from altered brain connectivity especially in prefrontal cortex. Disruption of neuronal networks implies oligodendrocyte and myelin abnormalities in schizophrenia pathophysiology. The mechanisms of these impairments are still unclear. Converging evidences indicate a role of redox dysregulation, generated by an imbalance between pro-oxidants and antioxidant defense mechanisms, in the development of schizophrenia pathophysiology. In particular, genetic and biochemical data indicate impaired synthesis of glutathione, the main cellular antioxidant and redox regulator. As oligodendrocyte maturation is dependent on redox state, we evaluated whether abnormal redox control could contribute to oligodendrocyte and myelin impairments in schizophrenia. We found that glutathione in prefrontal cortex of early psychosis patients and control subjects positively correlated with white matter integrity. We then further explored the interplay between glutathione and myelin using a translational approach. Our data showed that in mice with genetically impaired glutathione synthesis, oligodendrocyte late maturation as well as myelination was delayed in the anterior cingulate cortex. Specifically, oligodendrocyte number and myelin levels were lowered at peripubertal age, coincident in time with the peak of myelin- related gene expression during normal brain development. These data suggest that early adolescence is a vulnerable developmental period during which an adequate redox control is required for oligodendrocyte maturation and active myelination process. Consistently, oxidative stress mediated by psychosocial stress also delayed myelination in peripubertal mice. At cellular levels, impaired glutathione synthesis altered oligodendrocyte development at several levels. Using oligodendrocyte progenitor cells cultures, our data showed that glutathione deficiency was associated with (i) cell cycle arrest and a reduction in oligodendrocyte proliferation, and (ii) an impairment in oligodendrocyte maturation. Abnormal oligodendrocyte proliferation was mediated by upregulation of Fyn kinase activity. Consistently, under oxidative stress conditions, we observed abnormal regulation of Fyn kinase in fibroblasts of patients deficient in glutathione synthesis. Together, our data support that a redox dysregulation due to glutathione deficit could underlie myelination impairment in schizophrenia, possibly mediated by dysregulated Fyn pathway. Better characterization of Fyn mechanisms would pave the way towards new drug targets. -- La schizophrénie est une maladie psychiatrique qui se définit par une distorsion de la perception de la réalité. Les symptômes cliniques sont généralement diagnostiqués durant l'adolescence ou au début de l'âge adulte et proviennent de troubles de la connectivité, principalement au niveau du cortex préfrontal. Les dysfonctionnements des réseaux neuronaux impliquent des anomalies au niveau des oligodendrocytes et de la myéline dans la pathophysiologie de la schizophrénie. Les mécanismes responsables des ces altérations restent encore mal compris. Dans le développement de la schizophrénie, des évidences mettent en avant un rôle de la dérégulation rédox, traduit par un déséquilibre entre facteurs pro-oxydants et défenses antioxydantes. Des données génétiques et biochimiques indiquent notamment un défaut de la synthèse du glutathion, le principal antioxydant et rédox régulateur des cellules. Etant donné que la maturation des oligodendrocytes est dépendante de l'état rédox, nous avons regardé si une dérégulation rédox contribue aux anomalies de la myéline dans le cadre de la schizophrénie. Dans le cortex préfrontal des sujets contrôles et des patients en phase précoce de psychose, nous avons montré que le glutathion était positivement associé à l'intégrité de matière blanche. Afin d'explorer plus en détail la relation entre le glutathion et la myéline, nous avons mené une étude translationnelle. Nos résultats ont montré que des souris ayant un déficit de la synthèse du glutathion présentaient un retard dans les processus de maturation des oligodendrocytes et de la myélinisation dans le cortex cingulaire antérieure. Plus précisément, le nombre d'oligodendrocytes et le taux de myéline étaient uniquement diminués durant la période péripubertaire. Cette même période correspond au pic de l'expression des gènes en lien avec la myéline. Ces données soulignent le fait que l'adolescence est une période du développement particulièrement sensible durant laquelle un contrôle adéquat de l'état rédox est nécessaire aux processus de maturation des oligodendrocytes et de myélinisation. Ceci est en accord avec la diminution de myéline observée suite à un stress oxydatif généré par un stress psychosocial. Au niveau cellulaire, un déficit du glutathion affecte le développement des oligodendrocytes à différents stades. En effet, dans des cultures de progéniteurs d'oligodendrocytes, nos résultats montrent qu'une réduction du taux de glutathion était associée à (i) un arrêt du cycle cellulaire ainsi qu'une diminution de la prolifération des oligodendrocytes, et à (ii) des dysfonctionnements de la maturation des oligodendrocytes. Par ailleurs, au niveau moléculaire, les perturbations de la prolifération étaient générées par une augmentation de l'activité de la kinase Fyn. Ceci est en accord avec la dérégulation de Fyn observée dans les fibroblastes de patients ayant une déficience en synthèse du glutathion en condition de stress oxydatif. Les résultats de cette thèse soulignent qu'une dérégulation rédox induite par un déficit en glutathion peut contribuer aux anomalies des oligodendrocytes et de la myéline via le dysfonctionnement des voies de signalisation Fyn. Une recherche plus avancée de l'implication de Fyn dans la maladie pourrait ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques.