Neuromuscular disuse and atrophy: {\it In vivo\/} magnetic resonance studies of intramuscular lipid metabolism and fluid shift changes

We postulated that neuromuscular disuse results in deleteriously affected tissue-vascular fluid exchange processes and subsequently damages the important oxidative bioenergetic process of intramuscular lipid metabolism. The in-depth research reported in the literature is somewhat limited by the ex vivo nature and sporadic time-course characterization of disuse atrophy and recovery. Thus, an in vivo controlled, localized animal model of disuse atrophy was developed in one of the hindlimbs of laboratory rabbits (employing surgically implanted tetrodotoxin (TTX)-filled mini-osmotic pump-sciatic nerve superfusion system) and tested repeatedly with magnetic resonance (MR) throughout the 2-week period of temporarily induced disuse and during the recovery period (following explantation of the TTX-filled pump) for a period of 3 weeks. Controls consisted of saline/"sham"-implanted rabbit hindlimbs. The validity of this model was established with repeated electrophysiologic nerve conduction testing using a clinically appropriate protocol and percutaneously inserted small needle stimulating and recording electrodes. Evoked responses recorded from proximal (P) and distal (D) sites to the sciatic nerve cuff in the TTX-implanted group revealed significantly decreased (p $<$ 0.001) proximal-to-distal (P/D) amplitude ratios (as much as 50-70% below Baseline/pre-implanted and sham-implanted group values) and significantly increased (p $<$ 0.01) differential latency (PL-DL) values (as much as 1.5 times the pre- and sham-implanted groups). By Day 21 of recovery, observed P/D and PL-DL levels matched Baseline/sham-implemented levels. MRI-determined cross-sectional area (CSA) values of Baseline/pre-implanted, sham- or TTX-implanted, and recovering/explanted and the corresponding contralateral hindlimb tibialis anterior (TA) muscles normalized to tibial bone (TB) CSA (in TA/TB ratios) revealed that there was a significant decline (indicative of atrophic response) from pre- and sham-implanted controls by as much as 20% (p $<$ 0.01) at Day 7 and 50-55% (p $<$ 0.001) at Day 13 of TTX-implantation. In the non-implanted contralaterals, a significant increase (indicative of hypertrophic response) by as much as 10% (p $<$ 0.025) at Day 7 and 27% (p $<$ 0.001) at Day 13 + TTX was found. The induced atrophic/hypertrophic TA muscles were observed to be fully recovered by Day 21 post-explantation as evidenced by image TA/TB ratios. End-point biopsy results from a small group of rabbits revealed comprehensive atrophy of both Type I and Type II fibers, although the heterogeneity of the response supports the use of image-guided, volume-localized proton magnetic resonance spectroscopy (MRS) to noninvasively assess tissue-level metabolic changes. MRS-determined results of a 0.25cc volume of tissue within implanted limb TA muscles under resting/pre-ischemic, ischemic-stressed, and post-ischemic conditions at timepoints during and following disuse atrophy/recovery revealed significantly increased intramuscular spectral lipid levels, as much as 2-3 times (p $<$ 0.01) the Baseline/pre-implanted values at Day 7 and 6-7 times (p $<$ 0.001) at Day 13 + TTX, which approached normal levels (compared to pre- and sham-implanted groups) by Day 21 of post-explanation recovery. (Abstract shortened by UMI.) ^

Emerging metabolic targets in the therapy of hematological malignancies

During the last decade, the development of anticancer therapies has focused on targeting neoplastic-related metabolism. Cancer cells display a variety of changes in their metabolism, which enable them to satisfy the high bioenergetic and biosynthetic demands for rapid cell division. One of the crucial alterations is referred to as the "Warburg effect", which involves a metabolic shift from oxidative phosphorylation towards the less efficient glycolysis, independent of the presence of oxygen. Although there are many examples of solid tumors having altered metabolism with high rates of glucose uptake and glycolysis, it was only recently reported that this phenomenon occurs in hematological malignancies. This review presents evidence that targeting the glycolytic pathway at different levels in hematological malignancies can inhibit cancer cell proliferation by restoring normal metabolic conditions. However, to achieve cancer regression, high concentrations of glycolytic inhibitors are used due to limited solubility and biodistribution, which may result in toxicity. Besides using these inhibitors as monotherapies, combinatorial approaches using standard chemotherapeutic agents could display enhanced efficacy at eradicating malignant cells. The identification of the metabolic enzymes critical for hematological cancer cell proliferation and survival appears to be an interesting new approach for the targeted therapy of hematological malignancies.

Proceedings of the Sixteenth Annual Biochemical Engineering Symposium

This volume represents the proceedings of the Sixteenth Annual Biochemical Engineering Symposium held at Kansas State University on April 26, 1986. Some of the papers describe the progress of ongoing projects, and others contain the results of completed projects. Only brief summaries are given of many of the papers that will be published in full elsewhere. ContentsEnd-Product Inhibition of the Acetone-Butanol Fermentation—Bob Kuhn, Colorado State University Effect of Multiple Substrates in Ethanal Fermentations from Cheese Whey—C.J. Wang, University of Missouri Extraction and Fermentation of Ensiled Sweet Sorghum—Karl Noah, Colorado State University Removal of Nucleic Acids from Bakers' Yeast—Richard M. Cordes, Iowa State University Modeling the Effects of Plasmid Replication and Product Repression on the Growth Rate of Recombinant Bacteria—William E. Bentley, University of Colorado Indirect Estimates of Cell Concentrations in Mass Cultivation of Bacterial Cells—Andrew Fisher, University of Missouri A Mathematical Model for Liquid Recirculation in Airlift Columns—C.H.Lee, Kansas State University Characterization of Imperfect Mixing of Batch Reactors by Two Compartment Model—Peter Sohn, University of Missouri First Order Breakage Model for the Degradation of Pullalan in the Batch Fermentor—Stephen A. Milligan, Kansas State University Synthesis and Nuclear Magnetic Resonance of 13C-Labeled Amylopectin and Maltooligosaccharides—Bernard Y. Tao, Iowa State University Preparation of Fungal Starter Culture in Gas Fluidized Bed Reactor—Pal Mihaltz, Colorado State University Yeast Flocculation and Sedimentation—David Szlag, University of Colorado Protein Enrichment of Extrusion Cooked Corn by Solid Substrate Fermentation—Lucas Alvarez-Martinez, Colorado State University Optimum Design of a Hollow Fiber Mammalian Cell Reactor—Thomas Chresand, Colorado State University Gas Chromatography and Nuclear Magnetic Resonance of Trifluoroacetylated Carbohydrates—Steven T. Summerfelt, Iowa State University Kinetic and Bioenergetic Considerations for Modeling Photosynthetic Microbial P~ocesses in Producing Biomass and Treating Wastewater—H. Y. Lee, Kansas State University Mathematical Modeling and Simulation of Bicarbonate-Limited Photsynthetic Growth in Continuous Culture—Craig Curless, Kansas State University Data Acquisition and Control of a Rotary Drum Solid State Fermentor—Mnasria A. Habib, Colorado State University Biodegradation of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D)—Greg Sinton, Kansas State University

La resistencia especial en el fútbol

La finalidad de esta tesis es establecer un análisis de la metodología de entrenamiento de la resistencia especial en el futbolista. Su objetivo no está vinculado a realizar propuestas prácticas de entrenamiento, sino más bien, se tratará de abordar una posible justificación fisiológico - metabólica, a partir de la relevancia bioenergética de la creatina, en función de la creciente especialización que debe ir adquiriendo el proceso del entrenamiento deportivo a largo plazo, enfocado al logro de altos rendimientos deportivos. A partir del análisis de conceptos terminológicos de referencia, se asienta la idea general de este trabajo, es decir, la estructuración y desarrollo de la resistencia en los deportes de conjunto, como el fútbol. Los pilares de una adecuada planificación son el conocimiento y la aplicación de distintas leyes y principios del entrenamiento deportivo y su relación con los distintos medios y métodos de entrenamiento, como así también, los efectos de adaptación que provocan. Por lo tanto, a partir del análisis de los requerimientos morfológicos - funcionales de las competiciones de elite en fútbol, se pueden elaborar modelos que servirán de base y como objetivo final al cual debe ser orientado el proceso de entrenamiento. Es decir, que un entrenamiento multianual con miras a la formación de futbolistas de elite, debe respetar la especialización creciente de las cargas de entrenamiento, estableciendo una sucesión metodológica adecuada en función de los objetivos de cada etapa. En función de lo expuesto, se realiza un análisis que va desde la resistencia como capacidad física y su metodología de entrenamiento, recorriendo distintos conceptos y manifestaciones, pasando por el análisis de distintas zonas de intensidad o áreas funcionales, y desembocando en la metodología de entrenamiento intermitente de la resistencia o resistencia especial -en los deportes de conjunto-. Y es a partir de todo el análisis precedente que estamos en condiciones de abordar el entrenamiento específico en el fútbol, y más detalladamente la resistencia específica o intermitente que requiere este deporte. El entrenamiento intermitente puede ser considerado como una metodología cuyo énfasis es puesto en modificaciones que se producen a nivel muscular, por sobre factores centrales de rendimiento, presentándose como una variante óptima para el entrenamiento de la resistencia muscular local y específica del futbolista. Básicamente, el entrenamiento intermitente actuaría sobre dos puntos centrales: la mejora del sistema shuttle de la CrP, y sobre la rapidez de entrega de oxígeno al inicio del ejercicio. Aquí aparece la importancia de la suplementación con Cr: que al aumentar las concentraciones del sustrato, y junto con el entrenamiento, que mejora las reacciones enzimáticas implicadas, potenciaría las mejoras buscadas con este tipo de metodología. Queda por determinar cual es el preciso mecanismo de acción por el cual la recuperación de los fosfatos altamente energéticos se produce: si por biogénesis mitocondrial en las fibras reclutadas - generalmente FT -; o mediante el sistema de proteínas transportadoras de Cr - destacando la importancia de las ST - o por algún otro mecanismo no conocido. Su descubrimiento permitiría direccionar más precisamente el entrenamiento deportivo.

La resistencia especial en el fútbol

La finalidad de esta tesis es establecer un análisis de la metodología de entrenamiento de la resistencia especial en el futbolista. Su objetivo no está vinculado a realizar propuestas prácticas de entrenamiento, sino más bien, se tratará de abordar una posible justificación fisiológico - metabólica, a partir de la relevancia bioenergética de la creatina, en función de la creciente especialización que debe ir adquiriendo el proceso del entrenamiento deportivo a largo plazo, enfocado al logro de altos rendimientos deportivos. A partir del análisis de conceptos terminológicos de referencia, se asienta la idea general de este trabajo, es decir, la estructuración y desarrollo de la resistencia en los deportes de conjunto, como el fútbol. Los pilares de una adecuada planificación son el conocimiento y la aplicación de distintas leyes y principios del entrenamiento deportivo y su relación con los distintos medios y métodos de entrenamiento, como así también, los efectos de adaptación que provocan. Por lo tanto, a partir del análisis de los requerimientos morfológicos - funcionales de las competiciones de elite en fútbol, se pueden elaborar modelos que servirán de base y como objetivo final al cual debe ser orientado el proceso de entrenamiento. Es decir, que un entrenamiento multianual con miras a la formación de futbolistas de elite, debe respetar la especialización creciente de las cargas de entrenamiento, estableciendo una sucesión metodológica adecuada en función de los objetivos de cada etapa. En función de lo expuesto, se realiza un análisis que va desde la resistencia como capacidad física y su metodología de entrenamiento, recorriendo distintos conceptos y manifestaciones, pasando por el análisis de distintas zonas de intensidad o áreas funcionales, y desembocando en la metodología de entrenamiento intermitente de la resistencia o resistencia especial -en los deportes de conjunto-. Y es a partir de todo el análisis precedente que estamos en condiciones de abordar el entrenamiento específico en el fútbol, y más detalladamente la resistencia específica o intermitente que requiere este deporte. El entrenamiento intermitente puede ser considerado como una metodología cuyo énfasis es puesto en modificaciones que se producen a nivel muscular, por sobre factores centrales de rendimiento, presentándose como una variante óptima para el entrenamiento de la resistencia muscular local y específica del futbolista. Básicamente, el entrenamiento intermitente actuaría sobre dos puntos centrales: la mejora del sistema shuttle de la CrP, y sobre la rapidez de entrega de oxígeno al inicio del ejercicio. Aquí aparece la importancia de la suplementación con Cr: que al aumentar las concentraciones del sustrato, y junto con el entrenamiento, que mejora las reacciones enzimáticas implicadas, potenciaría las mejoras buscadas con este tipo de metodología. Queda por determinar cual es el preciso mecanismo de acción por el cual la recuperación de los fosfatos altamente energéticos se produce: si por biogénesis mitocondrial en las fibras reclutadas - generalmente FT -; o mediante el sistema de proteínas transportadoras de Cr - destacando la importancia de las ST - o por algún otro mecanismo no conocido. Su descubrimiento permitiría direccionar más precisamente el entrenamiento deportivo.

La resistencia especial en el fútbol

La finalidad de esta tesis es establecer un análisis de la metodología de entrenamiento de la resistencia especial en el futbolista. Su objetivo no está vinculado a realizar propuestas prácticas de entrenamiento, sino más bien, se tratará de abordar una posible justificación fisiológico - metabólica, a partir de la relevancia bioenergética de la creatina, en función de la creciente especialización que debe ir adquiriendo el proceso del entrenamiento deportivo a largo plazo, enfocado al logro de altos rendimientos deportivos. A partir del análisis de conceptos terminológicos de referencia, se asienta la idea general de este trabajo, es decir, la estructuración y desarrollo de la resistencia en los deportes de conjunto, como el fútbol. Los pilares de una adecuada planificación son el conocimiento y la aplicación de distintas leyes y principios del entrenamiento deportivo y su relación con los distintos medios y métodos de entrenamiento, como así también, los efectos de adaptación que provocan. Por lo tanto, a partir del análisis de los requerimientos morfológicos - funcionales de las competiciones de elite en fútbol, se pueden elaborar modelos que servirán de base y como objetivo final al cual debe ser orientado el proceso de entrenamiento. Es decir, que un entrenamiento multianual con miras a la formación de futbolistas de elite, debe respetar la especialización creciente de las cargas de entrenamiento, estableciendo una sucesión metodológica adecuada en función de los objetivos de cada etapa. En función de lo expuesto, se realiza un análisis que va desde la resistencia como capacidad física y su metodología de entrenamiento, recorriendo distintos conceptos y manifestaciones, pasando por el análisis de distintas zonas de intensidad o áreas funcionales, y desembocando en la metodología de entrenamiento intermitente de la resistencia o resistencia especial -en los deportes de conjunto-. Y es a partir de todo el análisis precedente que estamos en condiciones de abordar el entrenamiento específico en el fútbol, y más detalladamente la resistencia específica o intermitente que requiere este deporte. El entrenamiento intermitente puede ser considerado como una metodología cuyo énfasis es puesto en modificaciones que se producen a nivel muscular, por sobre factores centrales de rendimiento, presentándose como una variante óptima para el entrenamiento de la resistencia muscular local y específica del futbolista. Básicamente, el entrenamiento intermitente actuaría sobre dos puntos centrales: la mejora del sistema shuttle de la CrP, y sobre la rapidez de entrega de oxígeno al inicio del ejercicio. Aquí aparece la importancia de la suplementación con Cr: que al aumentar las concentraciones del sustrato, y junto con el entrenamiento, que mejora las reacciones enzimáticas implicadas, potenciaría las mejoras buscadas con este tipo de metodología. Queda por determinar cual es el preciso mecanismo de acción por el cual la recuperación de los fosfatos altamente energéticos se produce: si por biogénesis mitocondrial en las fibras reclutadas - generalmente FT -; o mediante el sistema de proteínas transportadoras de Cr - destacando la importancia de las ST - o por algún otro mecanismo no conocido. Su descubrimiento permitiría direccionar más precisamente el entrenamiento deportivo.

Modelos matemáticos del crecimiento, alimentación y respiración de la trucha arco iris, salmón, tenca, anguila, rodaballo, lenguado, lubina, dorada y seriola. Aplicación al diseño de instalaciones de cultivo

En esta tesis, en su primera parte, se desarrollan modelos matemáticos para tratar de predecir el crecimiento en condiciones normales de cultivo de las siguientes especies: Trucha arco iris (Salmo garidneri), salmón (Salmón salar), tenca (Tinca tinca), anguila (Anguilla anguilla), rodaballo (Scophthalmus maximus), lenguado (Solea solea), lubina (Dicentrarchus labrax), dorada (Sparus aurata) y seriola japonesa (Seriola quinqueradiata). En la segunda parte, en base a postulados fisiológicos, se desarrollan modelos bioenergéticos que tratan de cuantificar la alimentación, crecimiento, respiración, excreción de productos nitrogenados y pérdidas fecales, en función de la tasa de alimentación, para las especies indicadas anteriormente. En la tercera parte se indican posibles utilizaciones de estos modelos para el cálculo del planning de producción, necesidades de agua y necesidades de estanques, para el caso de un cultivo intensivo de estas especies. ABSTRACT In this Doctorate Thesis, the first part is dedicated to the development of mathematical models, in order to estimate the growth, under normal culture conditions, of the following species: Rainbow trout (Salmo gairdneri)/ salmon (Salmo salara, tench (Tinca tinca), eel (Anguilla anguilla), turbot (Scophthalmus maximus), sole (Solea solea), seabass (Dicentrarchus labrax), seabream (Sparus aurata), and yellowtail (Seriola guingueradiata). In the second part, in basis to physiological postulates, bioenergetic models are developed. These models try to quantify the feeding, growth, excretion of nitrogenous and fecal products, according to the feeding rate, for the above mentioned species. In the third part, possible aplications of these models are indicated, including the production planning as well as water pond requirements for an intensive culture of the mentioned species.

Proton transfer from the bulk to the bound ubiquinone QB of the reaction center in chromatophores of Rhodobacter sphaeroides: Retarded conveyance by neutral water

The mechanism of proton transfer from the bulk into the membrane protein interior was studied. The light-induced reduction of a bound ubiquinone molecule QB by the photosynthetic reaction center is accompanied by proton trapping. We used kinetic spectroscopy to measure (i) the electron transfer to QB (at 450 nm), (ii) the electrogenic proton delivery from the surface to the QB site (by electrochromic carotenoid response at 524 nm), and (iii) the disappearance of protons from the bulk solution (by pH indicators). The electron transfer to QB− and the proton-related electrogenesis proceeded with the same time constant of ≈100 μs (at pH 6.2), whereas the alkalinization in the bulk was distinctly delayed (τ ≈ 400 μs). We investigated the latter reaction as a function of the pH indicator concentration, the added pH buffers, and the temperature. The results led us to the following conclusions: (i) proton transfer from the surface-located acidic groups into the QB site followed the reduction of QB without measurable delay; (ii) the reprotonation of these surface groups by pH indicators and hydronium ions was impeded, supposedly, because of their slow diffusion in the surface water layer; and (iii) as a result, the protons were slowly donated by neutral water to refill the proton vacancies at the surface. It is conceivable that the same mechanism accounts for the delayed relaxation of the surface pH changes into the bulk observed previously with bacteriorhodopsin membranes and thylakoids. Concerning the coupling between proton pumps in bioenergetic membranes, our results imply a tendency for the transient confinement of protons at the membrane surface.

High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia

Mitochondria are confronted with low oxygen levels in the microenvironment within tissues; yet, isolated mitochondria are routinely studied under air-saturated conditions that are effectively hyperoxic, increase oxidative stress, and may impair mitochondrial function. Under hypoxia, on the other hand, respiration and ATP supply are restricted. Under these conditions of oxygen limitation, any compromise in the coupling of oxidative phosphorylation to oxygen consumption could accentuate ATP depletion, leading to metabolic failure. To address this issue, we have developed the approach of oxygen-injection microcalorimetry and ADP-injection respirometry for evaluating mitochondrial function at limiting oxygen supply. Whereas phosphorylation efficiency drops during ADP limitation at high oxygen levels, we show here that oxidative phosphorylation is more efficient at low oxygen than at air saturation, as indicated by higher ratios of ADP flux to total oxygen flux at identical submaximal rates of ATP synthesis. At low oxygen, the proton leak and uncoupled respiration are depressed, thus reducing maintenance energy expenditure. This indicates the importance of low intracellular oxygen levels in avoiding oxidative stress and protecting bioenergetic efficiency.

Design and synthesis of constrained azacyclic pyrrolidine analogues of FTY720 as anticancer agents & metal coordination-controlled and bifunctional catalysis toward tertiary β-Ketols

Cette thèse se compose en deux parties: Première Partie: La conception et la synthèse d’analogues pyrrolidiniques, utilisés comme agents anticancéreux, dérivés du FTY720. FTY720 est actuellement commercialisé comme médicament (GilenyaTM) pour le traitement de la sclérose en plaques rémittente-récurrente. Il agit comme immunosuppresseur en raison de son effet sur les récepteurs de la sphingosine-1-phosphate. A fortes doses, FTY720 présente un effet antinéoplasique. Cependant, à de telles doses, un des effets secondaires observé est la bradycardie dû à l’activation des récepteurs S1P1 et S1P3. Ceci limite son potentiel d’utilisation lors de chimiothérapie. Nos précédentes études ont montré que des analogues pyrrolidiniques dérivés du FTY720 présentaient une activité anticancéreuse mais aucune sur les récepteurs S1P1 et S1P3. Nous avons soumis l’idée qu’une étude relation structure-activité (SARs) pourrait nous conduire à la découverte de nouveaux agents anti tumoraux. Ainsi, deux séries de composés pyrrolidiniques (O-arylmethyl substitué et C-arylmethyl substitué) ont pu être envisagés et synthétisés (Chapitre 1). Ces analogues ont montré d’excellentes activités cytotoxiques contre diverses cellules cancéreuses humaines (prostate, colon, sein, pancréas et leucémie), plus particulièrement les analogues actifs qui ne peuvent pas être phosphorylés par SphK, présentent un plus grand potentiel pour le traitement du cancer sans effet secondaire comme la bradycardie. Les études mécanistiques suggèrent que ces analogues de déclencheurs de régulation négative sur les transporteurs de nutriments induisent une crise bioénergétique en affamant les cellules cancéreuses. Afin d’approfondir nos connaissances sur les récepteurs cibles, nous avons conçu et synthétisé des sondes diazirine basées sur le marquage d’affinité aux photons (méthode PAL: Photo-Affinity Labeling) (Chapitre 2). En s’appuyant sur la méthode PAL, il est possible de récolter des informations sur les récepteurs cibles à travers l’analyse LC/MS/MS de la protéine. Ces tests sont en cours et les résultats sont prometteurs. Deuxième partie: Coordination métallique et catalyse di fonctionnelle de dérivés β-hydroxy cétones tertiaires. Les réactions de Barbier et de Grignard sont des méthodes classiques pour former des liaisons carbone-carbone, et généralement utilisées pour la préparation d’alcools secondaires et tertiaires. En vue d’améliorer la réaction de Grignard avec le 1-iodobutane dans les conditions « one-pot » de Barbier, nous avons obtenu comme produit majoritaire la β-hydroxy cétone provenant de l’auto aldolisation de la 5-hexen-2-one, plutôt que le produit attendu d’addition de l’alcool (Chapitre 3). La formation inattendue de la β-hydroxy cétone a également été observée en utilisant d’autres dérivés méthyl cétone. Étonnement dans la réaction intramoléculaire d’une tricétone, connue pour former la cétone Hajos-Parrish, le produit majoritaire est rarement la β-hydroxy cétone présentant la fonction alcool en position axiale. Intrigué par ces résultats et après l’étude systématique des conditions de réaction, nous avons développé deux nouvelles méthodes à travers la synthèse sélective et catalytique de β-hydroxy cétones spécifiques par cyclisation intramoléculaire avec des rendements élevés (Chapitre 4). La réaction peut être catalysée soit par une base adaptée et du bromure de lithium comme additif en passant par un état de transition coordonné au lithium, ou bien soit à l’aide d’un catalyseur TBD di fonctionnel, via un état de transition médiée par une coordination bidenté au TBD. Les mécanismes proposés ont été corroborés par calcul DFT. Ces réactions catalytiques ont également été appliquées à d’autres substrats comme les tricétones et les dicétones. Bien que les efforts préliminaires afin d’obtenir une enantioselectivité se sont révélés sans succès, la synthèse et la recherche de nouveaux catalyseurs chiraux sont en cours.

Design and synthesis of constrained azacyclic pyrrolidine analogues of FTY720 as anticancer agents & metal coordination-controlled and bifunctional catalysis toward tertiary β-Ketols

Cette thèse se compose en deux parties: Première Partie: La conception et la synthèse d’analogues pyrrolidiniques, utilisés comme agents anticancéreux, dérivés du FTY720. FTY720 est actuellement commercialisé comme médicament (GilenyaTM) pour le traitement de la sclérose en plaques rémittente-récurrente. Il agit comme immunosuppresseur en raison de son effet sur les récepteurs de la sphingosine-1-phosphate. A fortes doses, FTY720 présente un effet antinéoplasique. Cependant, à de telles doses, un des effets secondaires observé est la bradycardie dû à l’activation des récepteurs S1P1 et S1P3. Ceci limite son potentiel d’utilisation lors de chimiothérapie. Nos précédentes études ont montré que des analogues pyrrolidiniques dérivés du FTY720 présentaient une activité anticancéreuse mais aucune sur les récepteurs S1P1 et S1P3. Nous avons soumis l’idée qu’une étude relation structure-activité (SARs) pourrait nous conduire à la découverte de nouveaux agents anti tumoraux. Ainsi, deux séries de composés pyrrolidiniques (O-arylmethyl substitué et C-arylmethyl substitué) ont pu être envisagés et synthétisés (Chapitre 1). Ces analogues ont montré d’excellentes activités cytotoxiques contre diverses cellules cancéreuses humaines (prostate, colon, sein, pancréas et leucémie), plus particulièrement les analogues actifs qui ne peuvent pas être phosphorylés par SphK, présentent un plus grand potentiel pour le traitement du cancer sans effet secondaire comme la bradycardie. Les études mécanistiques suggèrent que ces analogues de déclencheurs de régulation négative sur les transporteurs de nutriments induisent une crise bioénergétique en affamant les cellules cancéreuses. Afin d’approfondir nos connaissances sur les récepteurs cibles, nous avons conçu et synthétisé des sondes diazirine basées sur le marquage d’affinité aux photons (méthode PAL: Photo-Affinity Labeling) (Chapitre 2). En s’appuyant sur la méthode PAL, il est possible de récolter des informations sur les récepteurs cibles à travers l’analyse LC/MS/MS de la protéine. Ces tests sont en cours et les résultats sont prometteurs. Deuxième partie: Coordination métallique et catalyse di fonctionnelle de dérivés β-hydroxy cétones tertiaires. Les réactions de Barbier et de Grignard sont des méthodes classiques pour former des liaisons carbone-carbone, et généralement utilisées pour la préparation d’alcools secondaires et tertiaires. En vue d’améliorer la réaction de Grignard avec le 1-iodobutane dans les conditions « one-pot » de Barbier, nous avons obtenu comme produit majoritaire la β-hydroxy cétone provenant de l’auto aldolisation de la 5-hexen-2-one, plutôt que le produit attendu d’addition de l’alcool (Chapitre 3). La formation inattendue de la β-hydroxy cétone a également été observée en utilisant d’autres dérivés méthyl cétone. Étonnement dans la réaction intramoléculaire d’une tricétone, connue pour former la cétone Hajos-Parrish, le produit majoritaire est rarement la β-hydroxy cétone présentant la fonction alcool en position axiale. Intrigué par ces résultats et après l’étude systématique des conditions de réaction, nous avons développé deux nouvelles méthodes à travers la synthèse sélective et catalytique de β-hydroxy cétones spécifiques par cyclisation intramoléculaire avec des rendements élevés (Chapitre 4). La réaction peut être catalysée soit par une base adaptée et du bromure de lithium comme additif en passant par un état de transition coordonné au lithium, ou bien soit à l’aide d’un catalyseur TBD di fonctionnel, via un état de transition médiée par une coordination bidenté au TBD. Les mécanismes proposés ont été corroborés par calcul DFT. Ces réactions catalytiques ont également été appliquées à d’autres substrats comme les tricétones et les dicétones. Bien que les efforts préliminaires afin d’obtenir une enantioselectivité se sont révélés sans succès, la synthèse et la recherche de nouveaux catalyseurs chiraux sont en cours.

Latent and Lytic KSHV Infection Require Host Cell Metabolism

Thesis (Ph.D.)--University of Washington, 2016-06

Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-1 promotes glycolysis in hypoxia

Under conditions of hypoxia, most eukaryotic cells undergo a shift in metabolic strategy, which involves increased flux through the glycolytic pathway. Although this is critical for bioenergetic homeostasis, the underlying mechanisms have remained incompletely understood. Here, we report that the induction of hypoxia-induced glycolysis is retained in cells when gene transcription or protein synthesis are inhibited suggesting the involvement of additional post-translational mechanisms. Post-translational protein modification by the small ubiquitin related modifier-1 (SUMO-1) is induced in hypoxia and mass spectrometric analysis using yeast cells expressing tap-tagged Smt3 (the yeast homolog of mammalian SUMO) revealed hypoxia-dependent modification of a number of key glycolytic enzymes. Overexpression of SUMO-1 in mammalian cancer cells resulted in increased hypoxia-induced glycolysis and resistance to hypoxia-dependent ATP depletion. Supporting this, non-transformed cells also demonstrated increased glucose uptake upon SUMO-1 overexpression. Conversely, cells overexpressing the de-SUMOylating enzyme SENP-2 failed to demonstrate hypoxia-induced glycolysis. SUMO-1 overexpressing cells demonstrated focal clustering of glycolytic enzymes in response to hypoxia leading us to hypothesize a role for SUMOylation in promoting spatial re-organization of the glycolytic pathway. In summary, we hypothesize that SUMO modification of key metabolic enzymes plays an important role in shifting cellular metabolic strategies toward increased flux through the glycolytic pathway during periods of hypoxic stress. © 2011 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

Characterization of L-Serine Deaminase and its Potential Role in the Pathogenicity of Pseudomonas aeruginosa

All pathogens require high energetic influxes to counterattack the host immune system and without this energy bacterial infections are easily cleared. This study is an investigation into one highly bioenergetic pathway in Pseudomonas aeruginosa involving the amino acid L-serine and the enzyme L-serine deaminase (L-SD). P. aeruginosa is an opportunistic pathogen causing infections in patients with compromised immune systems as well as patients with cystic fibrosis. Recent evidence has linked L-SD directly to the pathogenicity of several organisms including but not limited to Campylobacter jejuni, Mycobacterium bovis, Streptococcus pyogenes, and Yersinia pestis. We hypothesized that P. aeruginosa L-SD is likely to be critical for its virulence. Genome sequence analysis revealed the presence of two L-SD homo logs encoded by sdaA and sdaB. We analyzed the ability of P. aeruginosa to utilize serine and the role of SdaA and SdaB in serine deamination by comparing mutant strains of sdaA (PAOsdaA) and sdaB (PAOsdaB) with their isogenic parent P. aeruginosa P AO 1. We demonstrated that P. aeruginosa is unable to use serine as a sole carbon source. However, serine utilization is enhanced in the presence of glycine and this glycine-dependent induction of L-SD activity requires the inducer serine. The amino acid leucine was shown to inhibit L-SD activity from both SdaA and SdaB and the net contribution to L-serine deamination by SdaA and SdaB was ascertained at 34% and 66 %, respectively. These results suggest that P. aeruginosa LSD is quite different from the characterized E. coli L-SD that is glycine-independent but leucine-dependent for activation. Growth mutants able to use serine as a sole carbon source were also isolated and in addition, suicide vectors were constructed which allow for selective mutation of the sdaA and sdaB genes on any P. aeruginosa strain of interest. Future studies with a double mutant will reveal the importance of these genes for pathogenicity.