Multiple independent origins of mitochondrial control region duplications in the order Psittaciformes

mitochondrial genomes are generally thought to be under selection for compactness, due to their small size, consistent gene content, and a lack of introns or intergenic spacers. As more animal mitochondrial genomes are fully sequenced, rearrangements and partial duplications are being identified with increasing frequency, particularly in birds (Class Ayes). In this study, we investigate the evolutionary history of mitochondrial control region states within the avian order Psittaciformes (parrots and cockatoos). To this aim, we reconstructed a comprehensive multi-locus phylogeny of parrots, used PCR of three diagnostic fragments to classify the mitochondrial control region state as single or duplicated, and mapped these states onto the phylogeny. We further sequenced 44 selected species to validate these inferences of control region state. Ancestral state reconstruction using a range of weighting schemes identified six independent origins of mitochondrial control region duplications within Psittaciformes. Analysis of sequence data showed that varying levels of mitochondrial gene and tRNA homology and degradation were present within a given clade exhibiting duplications. Levels of divergence between control regions within an individual varied from 0-10.9% with the differences occurring mainly between 51 and 225 nucleotides 3' of the goose hairpin in domain I. Further investigations into the fates of duplicated mitochondrial genes, the potential costs and benefits of having a second control region, and the complex relationship between evolutionary rates, selection, and time since duplication are needed to fully explain these patterns in the mitochondrial genome. (C) 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.

Global gene expression under nitrogen starvation in Xylella fastidiosa: contribution of the σ54 regulon

Abstract Background Xylella fastidiosa, a Gram-negative fastidious bacterium, grows in the xylem of several plants causing diseases such as citrus variegated chlorosis. As the xylem sap contains low concentrations of amino acids and other compounds, X. fastidiosa needs to cope with nitrogen limitation in its natural habitat. Results In this work, we performed a whole-genome microarray analysis of the X. fastidiosa nitrogen starvation response. A time course experiment (2, 8 and 12 hours) of cultures grown in defined medium under nitrogen starvation revealed many differentially expressed genes, such as those related to transport, nitrogen assimilation, amino acid biosynthesis, transcriptional regulation, and many genes encoding hypothetical proteins. In addition, a decrease in the expression levels of many genes involved in carbon metabolism and energy generation pathways was also observed. Comparison of gene expression profiles between the wild type strain and the rpoN null mutant allowed the identification of genes directly or indirectly induced by nitrogen starvation in a σ54-dependent manner. A more complete picture of the σ54 regulon was achieved by combining the transcriptome data with an in silico search for potential σ54-dependent promoters, using a position weight matrix approach. One of these σ54-predicted binding sites, located upstream of the glnA gene (encoding glutamine synthetase), was validated by primer extension assays, confirming that this gene has a σ54-dependent promoter. Conclusions Together, these results show that nitrogen starvation causes intense changes in the X. fastidiosa transcriptome and some of these differentially expressed genes belong to the σ54 regulon.

Glial cell activity is maintained during prolonged inflammatory challenge in rats

We evaluated the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP), glutamine synthetase (GS), ionized calcium binding adaptor protein-1 (Iba-1), and ferritin in rats after single or repeated lipopolysaccharide (LPS) treatment, which is known to induce endotoxin tolerance and glial activation. Male Wistar rats (200-250 g) received ip injections of LPS (100 µg/kg) or saline for 6 days: 6 saline (N = 5), 5 saline + 1 LPS (N = 6) and 6 LPS (N = 6). After the sixth injection, the rats were perfused and the brains were collected for immunohistochemistry. After a single LPS dose, the number of GFAP-positive cells increased in the hypothalamic arcuate nucleus (ARC; 1 LPS: 35.6 ± 1.4 vs control: 23.1 ± 2.5) and hippocampus (1 LPS: 165.0 ± 3.0 vs control: 137.5 ± 2.5), and interestingly, 6 LPS injections further increased GFAP expression in these regions (ARC = 52.5 ± 4.3; hippocampus = 182.2 ± 4.1). We found a higher GS expression only in the hippocampus of the 6 LPS injections group (56.6 ± 0.8 vs 46.7 ± 1.9). Ferritin-positive cells increased similarly in the hippocampus of rats treated with a single (49.2 ± 1.7 vs 28.1 ± 1.9) or repeated (47.6 ± 1.1 vs 28.1 ± 1.9) LPS dose. Single LPS enhanced Iba-1 in the paraventricular nucleus (PVN: 92.8 ± 4.1 vs 65.2 ± 2.2) and hippocampus (99.4 ± 4.4 vs 73.8 ± 2.1), but had no effect in the retrochiasmatic nucleus (RCA) and ARC. Interestingly, 6 LPS increased the Iba-1 expression in these hypothalamic and hippocampal regions (RCA: 57.8 ± 4.6 vs 36.6 ± 2.2; ARC: 62.4 ± 6.0 vs 37.0 ± 2.2; PVN: 100.7 ± 4.4 vs 65.2 ± 2.2; hippocampus: 123.0 ± 3.8 vs 73.8 ± 2.1). The results suggest that repeated LPS treatment stimulates the expression of glial activation markers, protecting neuronal activity during prolonged inflammatory challenges.

Her2p molecular modeling, mutant analysis and intramitochondrial localization

Bacterial GatCAB amidotransferases are responsible for the transamidation of mischarged glutamyl-tRNA(Gln) into glutaminyl-tRNA(Gln). Mitochondria matrix also has a multienzymatic complex necessary for the transamidation of glutamyl-tRNA(Gln). Gtf1p, Her2p and Pet112p are the constituents of mitochondrial GatFAB amidotransferase complex. Her2p is subunit A of GatFAB complex, while Gtf1p is subunit F, a connector protein between Pet112p (subunit B) and Her2p. Here we evaluate through molecular modeling and amino acid correlation analysis the HER2 protein family. Localization studies indicated that Her2p is predominantly localized in the mitochondrial outer membrane, but it is also located in the mitochondrial matrix where together with Pet112p and Gtf1p constitutes the GatFAB complex. Finally, HER2 random mutagenesis unveiled important residues that provide thermo stability for the complex and are differently suppressed by overexpression of GTF1 or PET112. For instance, her2/ts11 mutant showed its fermentative growth impaired, and poorly rescued by GTF1 indicating that Her2p unknown function in the mitochondria outer membrane affects cell viability.

Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of selenophosphate synthetases from Trypanosoma brucei and Leishmania major

Selenophosphate synthetase (SPS) plays an indispensable role in selenium metabolism, being responsible for catalyzing the activation of selenide with adenosine 5'-triphosphate (ATP) to generate selenophosphate, the essential selenium donor for selenocysteine synthesis. Recombinant full-length Leishmania major SPS (LmSPS2) was recalcitrant to crystallization. Therefore, a limited proteolysis technique was used and a stable N-terminal truncated construct (ΔN-LmSPS2) yielded suitable crystals. The Trypanosoma brucei SPS orthologue (TbSPS2) was crystallized by the microbatch method using paraffin oil. X-ray diffraction data were collected to resolutions of 1.9 Å for ΔN-LmSPS2 and 3.4 Å for TbSPS2.

Recycling of the high valence states of heme proteins by cysteine residues of thimet-oligopeptidase

The peptidolytic enzyme THIMET-oligopeptidase (TOP) is able to act as a reducing agent in the peroxidase cycle of myoglobin (Mb) and horseradish peroxidase (HRP). The TOP-promoted recycling of the high valence states of the peroxidases to the respective resting form was accompanied by a significant decrease in the thiol content of the peptidolytic enzyme. EPR (electron paramagnetic resonance) analysis using DBNBS spin trapping revealed that TOP also prevented the formation of tryptophanyl radical in Mb challenged by H2O2. The oxidation of TOP thiol groups by peroxidases did not promote the inactivating oligomerization observed in the oxidation promoted by the enzyme aging. These findings are discussed towards a possible occurrence of these reactions in cells.

Effect of temperature and food concentration on the relationship between growth and AARS activity in Paracartia grani nauplii

[EN]The in situ activity of the enzymes aminoacyl-tRNA synthetases (AARS) and the growth rates of naupliar stages of the planktonic marine copepod Paracartia grani were measured in the laboratory under different temperature and food concentrations. We assessed the effect of these parameters on growth and protein synthesis rates of P. grani nauplii. Growth and protein synthesis rates of P. grani nauplii depended on temperature and food concentration. AARS activity is valid as index of somatic growth for P. grani nauplii when growth is not limited by food availability. However, the relationship between protein-specific AARS activity and nauplii growth varied according to food availability levels. The degradation of proteins during starvation and/or the ß-oxidation of fatty acids affected the relationship between specific AARS activity and growth rates. The results presented here add to previous studies showing that the AARS activity is a useful tool for estimating somatic growth of this and other key copepod species. Nevertheless, further research is required to elucidate the validity of AARS activity as a universal proxy for growth.

Effect of temperature and food concentration on the relationship between growth

[EN] The in situ activity of the enzymes aminoacyl-tRNA synthetases (AARS) and the growth rates of naupliar stages of the planktonic marine copepod Paracartia grani were measured in the laboratory under different temperature and food concentrations. We assessed the effect of these parameters on growth and protein synthesis rates of P. grani nauplii. Growth and protein synthesis rates of P. grani nauplii depended on temperature and food concentration. AARS activity is valid as an index of somatic growth for P. grani nauplii when growth is not limited by food availability. However, the relationship between protein-specific AARS activity and nauplii growth varied according to food availability levels. The degradation of proteins during starvation and/or the ß-oxidation of fatty acids affected the relationship between specific AARS activity and growth rates. The results presented here add to previous studies showing that the AARS activity is a useful tool for estimating somatic growth of this and other key copepod species. Nevertheless, further research is required to elucidate the validity of AARS activity as a universal proxy for growth.

The use of AARS activity as a proxy for zooplankton and ichthyoplankton growth rates

Programa de doctorado en Oceanografía

Stenodactilina e lanceolina: due nuove potenti “ribosome-inactivating proteins” bicatenarie. Purificazione, caratterizzazione chimico-fisica e studio dei meccanismi citotossici

Two lectins, called lanceolin and stenodactylin, were purified by affinity chromatography on CL Sepharose 6B from the caudices of the Passifloraceae Adenia lanceolata and Adenia stenodactyla, respectively. They are glycoproteins with Mw of 61,243 (lanceolin) and 63,131 daltons (stenodactylin), consisting of an enzymatic A chain linked to a larger B chain with lectin properties, with N-terminal amino acid sequences similar to that of volkensin, the toxic lectin from Adenia volkensii. These two lectins agglutinate red blood cells, inhibit protein synthesis in a cell-free system as well as in whole cells, and depurinate ribosomes and DNA, but not tRNA or poly(A). They are highly toxic to cells, in which they induce apoptosis and strongly inhibit protein synthesis, and to mice, with LD50s 8.16 mg/kg (lanceolin) and 2.76 mg/kg (stenodactylin) at 48 hours after administration. Thus, lanceolin and stenodactylin have all the properties of the toxic type 2 ribosomeinactivating proteins (RIPs). Further experiments were conducted in order to clarify the effects of these RIPs in cells. We investigated the cronological relationship between cytotoxic activity, indirectly evaluated as inhibition of protein synthesis, and loss of cell viability in NB100 cell line. The induction of apoptosis was assessed by determining caspases 3 and 7 levels, which increase 8-16 hours earlier than the beginning of protein synthesis inhibition. This suggest that the arrest of protein synthesis is not a central event in the pathway of cell poisoning by RIPs. The high toxicity and the induction of cell death only by apoptosis and not by necrosis in two muscular cell lines (TE671 and RD/18) suggest that lanceolin and stenodactylin may be potential candidates for experimental chemoablation in strabism and blepharospasm. These results show that lanceolin and stenodactylin are amongst the most potent toxins of plant origin.

Phylogeny and population dynamics in European Reticulitermes and Kalotermes genera (Insecta, Isoptera)

The aim of this thesis is to detect the phylogeny and the population dynamics of the European termites of the genera Reticulitermes and Kalotermes, by the use of different mitochondrial (16S, COI/tRNA/COII, CR) and nuclear (microsatellites and Inter-SINE) molecular markers. In the phylogenetic analyses, the obtained results have well defined the cladogenetic events that generated the nowadays species biodiversity of the genus Reticulitermes, while the analysis of the Kalotermes flavicollis taxon showed the presence of at least four genetic clades, defined on the basis of the geographical distance. The second part of the thesis is centred on the population dynamics of two species: Reticulitermes urbis and Kalotermes flavicollis. The first species, native of the Balkans, is known to be present in some cities of Italy and France. I’ve analyzed the colony genetic structure of the introduced population of Bagnacavallo (RA, Italy), using nine microsatellite loci. The obtained results are in accordance with those obtained from another population in France: this species in fact confirms its invasive and infestation capacities. The analysis of the natural population of K. flavicollis, performed with a combination of mitochondrial (control region) and nuclear (microsatellites and I-SINE) markers, clearly evidenced the presence of two genetic lineages that coexist in the same area. Moreover, results clearly indicate that the cross-breeding is allowed. Finally, the whole results are discussed in a comparative view to better understand the differences in ecology, evolutionary dynamics and colony social structure between these two genera.

Modulation of apoptosis by endogenously produced nitric oxide

Untersuchungen zur Expression der induzierbaren NO-Synthetase (NOS2) belegen eine häufige Expression dieses Enzyms in Tumoren unterschiedlicher Gewebe. Bislang ist jedoch ungeklärt, ob die Expression der NOS2 in Tumorzellen die apoptotische Eliminierung durch zytotoxische T-Zellen beeinflussen kann. In der vorliegenden Arbeit wurden die Folgen einer endogenen NO-Synthese auf die Apoptosesensitivität von HEK293-Zellen untersucht. Um primäre NO-Wirkungen von NO-induzierten, sekundären (kompensatorischen) Veränderungen zu trennen, wurde mit einem induzierbaren Vektorsystem gearbeitet. Die NOS2 wurde zunächst unter der Kontrolle eines Ecdyson-sensitiven Promoters in HEK293-Zellen kloniert. Es konnten regulierbare NOS2-Klone selektiert werden, die nach Ponasteronbehandlung dosisabhängig die NOS2 exprimieren und NO synthetisieren. Die NOS2-Expression wurde durch Western Blot Analyse und Immunfluoreszenzfärbung dargestellt und die NO-Produktion mit Hilfe der Griess-Reaktion gemessen. An den NOS2-induzierten Zellen wurde dann der Einfluss von NO auf die CD95-vermittelte Apoptose analysiert. Es zeigte sich nach Stimulation des CD95-Rezeptors eine deutliche Korrelation der Apoptoserate mit der NOS2-Expression. In Kokulturexperimenten mit Peptid-spezifischen zytotoxischen T-Zellen zeigte sich, dass NO-produzierende Zielzellen effektiver eliminiert werden konnten. Auch nach Behandlung der Zellen mit TRAIL ergab sich eine höhere Apoptoserate in NO-produzierenden Zellen. Die weitere Analyse der durch NO beeinflussten Signalwege ergab eine Beteiligung von ER-Stress-vermittelten Apoptosewegen. Dies zeigte sich an der Hochregulation des ER-Stress-Proteins Grp78 (BiP) nach NOS2-Expression und der Spaltung der am ER-lokalisierten Caspase-4. Darüber hinaus konnte der schnellere Verlust des mitochondrialen Membranpotentials in Abhängigkeit von der NOS2-Expression nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die Wirkung einer dauerhaften NO-Exposition auf die Apoptosesensitivität der Zellen untersucht. Auch ohne zusätzliche CD95-Stimulation induzierte eine kontinuierliche NOS2-Expression nach wenigen Tagen in den EcR293-NOS2-Zellen Apoptose. Diese Dauerbehandlung führte zum nahezu vollständigen Absterben der Kulturen. Einige Zellen überlebten jedoch diese Behandlung und wuchsen zu Zellklonen. Diese NO-resistenten Klone konnten isoliert werden. Sie zeigten eine zusätzliche Resistenz für CD95-vermittelte Apoptosesignale und waren besser vor dem Angriff Peptid-spezifischer CTLs geschützt. Die Apoptoseresistenz blieb auch nach längerer Kultur erhalten und scheint auf NO-induzierter Genotoxizität zu beruhen. Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass allein durch chronische NO-Behandlung eine Selektion apoptoseresistenter Zellen stattfinden kann.

Charakterisierung spezieller pflanzlicher Gamma-Tubulin-Sequenzbereiche und Detektion potentieller Interaktionspartner mittels Yeast-two-Hybrid-System

Mitotische und postmitotische Vorgänge pflanzlicher Zellen basieren auf der Funktion von Mikrotubuli. Es liegen nur wenige gesicherte Erkenntnisse zur Organisation dieser Multifunktionalität vor. Eine zentrale Bedeutung wird bei der Nukleation der Mikrotubuli an MTOCs durch γ-Tubulin zugeschrieben. Deren Zusammenlagerung an MTOCs ist jedoch noch nicht richtig verstanden. Domänen, die an der Proteinoberfläche exponiert werden, könnten in Interaktionen involviert sein. Hier werden im Besonderen der γ-A und γ-B-Peptivmotiv diskutiert. Es wurde das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv des γ-Tubulins hinsichtlich einer Konservierung innerhalb des Pflanzenreiches untersucht. Die beiden Bereiche sind bei den grünen Landpflanzen stark konserviert. Sie divergieren stark zu den einzelligen Grünalgen Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella spec. Es wurden daher in der bestehenden phylogentischen Lücke weitere Organismen hinsichtlich des γ-A und γ-B Peptidmotivs untersucht. Auswahlkriterien der Organismen waren Ein-/Mehrzelligkeit, Besitz/Abwesenheit von Centriolen und Besitz/Abwesenheit von Geißeln. Des weiteren wurde mit verschiedenen γ-Tubulin-Konstrukten um das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv, gewonnen aus Nicotiana tabacum (BY2) mittels Y2H-System nach Interaktionspartnern gesucht. Bei den Sequenzuntersuchungen des γ-A- und γ-B-Peptidmotivs konnte festgestellt werden, dass die Konservierung innerhalb der Streptophytenlinie erfolgt. Interessant erweist sich die Tatsache, dass dieses Motiv bei den Jochalgen, welche ebenfalls den Streptophyten angehören, nur im γ-A-Peptidmotiv auftritt. Es besteht die Möglichkeit, dass die beiden potentiellen Interaktionspartner verschiedene Proteine als Interaktions-partner besitzen. Durch eine Anwendung eines auf dem GAL4-Protein basierenden Y2H-Systems mit vier unterschiedlichen Konstrukten des γ-Tubulin-A/B-Peptidbereichs als Köder-konstrukt und einer cDNA-Bibliothek als Beutekonstrukt, wurden diverse Sequenzen identifiziert. Identifiziert wurden das Poly(A)-Bindeprotein, Glycerin-aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die S-adenosyl-L-methionine-Synthetase, diverse Proteasom-Untereinheiten, eine sekretorische Peroxidase, eine Ascorbat-Peroxidase, die NtPOX1-Peroxidase und verschiedene Peroxidasen aus Nicotiana tabacum, Sequenzen des Chloroplastengenoms, ein Myosin-ähnliches Protein und eine Sequenz auf dem 5. Chromosom des Medicago truncatula-Klons mth2-16f8 und diverse humane Sequenzen der Proteine DKFZp68 und DKFZp77. Die Ergebnisse weisen auf eine komplexe Funktionsweise der unterschiedlichen Komponenten des pflanzlichen Cytoskeletts und des γ-Tubulins hin. Zur Aufklärung müsste dies in Zukunft mittels anderer genetischer, biochemischer oder funktioneller Methoden untersucht werden. Hypothesen über Interaktionen der Cytoskelettkomponenten können wahrscheinlich nicht allein durch die Anwendung des Y2H-Systems aufgeklärt werden.

Regulation der Selenoproteinsynthese durch den Mevalonatweg

Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss des Mevalonatpfads auf die Expression von Selenoproteinen untersucht werden. Im Mevalonatpfad, einem universellen Stoffwechselweg eukaryontischer Zellen, entstehen neben Cholesterol auch verschiedene Isoprenoide, die z.B. für die post-transkriptionelle Modifikation der Selenocystein-tRNA herangezogen werden. Selenocystein ist funktioneller Bestandteil von Selenoproteinen, welche häufig in den Abbau von oxidativem Stress involviert sind. rnDer Mevalonatpfad wird hauptsächlich durch die HMG-CoA-Reduktase (HMGCR) reguliert. Pharmaka vom „Statin“-Typ gelten als wirkungsvolle kompetitive Inhibitoren dieses Enzyms und finden ihren Einsatz bei Patienten zur Behandlung von Hypercholesterolämie, welche eine Grundlage für vaskuläre Krankheiten bildet. Trotz der allgemein guten Verträglichkeit der Statine treten jedoch auch unerwünschte Nebeneffekte, wie Erhöhung der Leberenzyme oder Myopathien auf, deren biochemischer Hintergrund bislang noch im Dunkeln liegt. rnDie in dieser Arbeit durchgeführten Experimente belegen, dass Atorvastatin, Cerivastatin und Lovastatin in klinisch relevanten Dosen die Synthese bestimmter Selenoproteine, wie der Glutathionperoxidase (GPx), in klonalen humanen Hepatocyten post-transkriptionell unterdrücken, wodurch die Zellen anfälliger für oxidativen Stress in Form von Peroxiden werden. Dieser Mechanismus könnte eine Erklärung für die häufig beobachteten abnormen Leberwerte von Statin-behandelten Patienten darstellen.rnEndogenes Cholesterol gilt ebenfalls als potenter Inhibitor der HMGCR. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass Cholesterol in verschiedenen Formen, als Low-Density-Lipoprotein (LDL), als 25-Hydroxycholesterol, und als Methylcyclodextrin-Komplex in unterschiedlichen humanen Zelltypen die Selenoproteinsynthese ebenfalls unterdrücken. Der negative Zusammenhang zwischen Cholesterol und bestimmten Selenoproteinen konnte auch in vivo beobachtet werden. In juvenilen Mäusen konnte gezeigt werden, dass ein Knockout des LDL-Rezeptors sowie auch ein Knockout von Apolipoprotein E zu einer Senkung des Lebercholesterols führte, was in einer Zunahme der GPx in der Leber resultierte.rnDie vorliegenden Daten belegen erstmals einen direkten und funktionellen Zusammenhang zwischen dem Mevalonatpfad und der Selenoproteinsynthese. Unterdrückung dieses Pfades, entweder durch exogene Substanzen wie Statine, oder durch endogene Substanzen wie Cholesterol, hat offenbar zur Folge, dass essentielle Zwischenprodukte für die Modifizierung der Selenocystein-tRNA fehlen, was in einer post-transkriptionellen Verminderung der induzierbaren Selenoproteine resultiert. Dies könnte die biochemische Grundlage für einen Teil der vielfältigen gesundheitlich negativen Auswirkungen schon geringfügig erhöhter Cholesterolspiegel sein.

Functionalization and detection of RNA and its modifications

Unterschiedlich substituierte Reagenzien, basierend auf dem Cumarin Körper, wurden untersucht und Struktur-Funktions-Beziehungsstudien zeigten eine Selektivität für ein natürlich vorkommendes, modifiziertes Nukleosid, 4-Thiouridine (s4U). Im Verlauf dieser Experimente, fiel ein multifunktionales Cumarin, namens PBC, aus mehreren Gründen auf. Neben seiner 2000 fachen Selektivität für s4U gegenüber Uridin, besitzt PBC ein zusätzliches terminales Alkin für Konjugationsreaktionen mit Aziden. Es wurde zusätzlich zur Fluoreszenzmarkierung von small interfering RNA benutzt, deren Fluoreszenz in Zellen beobachtet werden konnte. Mit PBC kommt ein neues chemisches Reagenz zur Detektion von modifizierten Nukleosiden zum bereits vorhandenen Repertoire hinzu.rnDiese Arbeit zeigt zusätzlich eine neue Labelingstrategie, basierend auf einem kleinen, multifunktionalen chemischen Reagenz, welches spezifisch mit Uridinen in RNA reagiert. Dieses Cumarin-basierte Reagenz, namens N3BC, hat den Vorteil (I) post-transkriptionell gegenüber allen möglichen RNAs einsetzbar zu sein, (II) Fluoreszenz zu zeigen und (III) eine weitere funktionelle Gruppe zu besitzen, die in Biokonjugationsreaktionen einsetzbar ist. Die letzteren umfassen z.B. die durch UV ausgelösten crosslinking Experimente mit verwandten Proteinen, sowie die bioorthognale CuAAC Reaktion mit fluoreszenten Alkin-Farbstoffen.rnFür verlässliche Detektion wurden mehrere LC-MS/MS Methoden, zur Identifizierung und Quantifizierung von bis zu 21 Ribonukleosiden und 5 Deoxyribonukleosiden in einem Einzellauf, entwickelt. Zusätzlich wurden diese Methoden in mehreren Studien, hauptsächlich von Methyltransferasen, angewandt. rn