Bedeutung des Glukosestoffwechsels für die Strahlenempfindlichkeit solider Tumoren

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Stoffwechseluntersuchungen an Experimentaltumoren von humanen Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches mit bekannter Strahlenempfindlichkeit durchzuführen. Die Resultate sollten mit dem Genexpressionsniveau glykolyseassoziierter Transportproteine und Enzyme, der Proteinexpression von LDH-A, der Hypoxie und der Strahlenresistenz der Tumoren korreliert werden. Während die Tumorproben und die Daten zum biologischen Strahlenverhalten und zur Charakterisierung der Hypoxie aus Dresden stammen, wurden alle anderen Untersuchungen in Mainz durchgeführt. Ein wichtiges Merkmal der kooperativen Studie bestand darin, dass erstmals die Strahlenresistenz von Experimentaltumoren systematisch in einem klinischen Fraktionierungsschema untersucht wurde. Die lokale Bestimmung der Gewebskonzentrationen der Metabolite ATP, Glukose und Laktat erfolgte mit dem Verfahren der bildgebenden Biolumineszenz. Die Auswertung der Ergebnisse mit Unterstützung von Bildverarbeitungs-Software wurde weiterentwickelt und in wesentlichen Punkten verbessert. Zur Ermittlung des mRNA-Expressionsniveaus der Glykolyseenzyme PFK-L und LDH-A sowie des Glukosetransporters GLUT1 diente die real time RT-PCR-Methode. Ein Kernpunkt des methodischen Teils der vorliegenden Arbeit bildeten die Validierung und Etablierung dieses Verfahrens. Durch die Anwendung dieser Technik war es möglich, eine relative Quantifizierung des Expressionslevels durchzuführen. Die Western Blot-Analyse lieferte Aussagen über den Proteingehalt von LDH-A. Dabei kam ein neues Auswerteverfahren durch Anwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper zum Einsatz. Die Ergebnisse zeigten erstmals einen direkten Zusammenhang zwischen dem Laktatgehalt von Tumoren und deren Strahlenresistenz. Es wurde im Vergleich zu früheren klinischen Untersuchungen eine Einstufung in Hoch- und Niedriglaktattumoren vorgenommen und eine signifikante Korrelation innerhalb der Hochlaktattumoren zwischen dem Laktatgehalt und der über Pimonidazol quantifizierten hypoxischen Fraktion festgestellt. Während die PCR Unterschiede in den drei untersuchten Genen auf transkriptioneller Ebene zwischen den sieben untersuchten Tumorlinien erkennen ließ, waren die Western Blot-Ergebnisse nahezu gleich. Da auch die Western Blot-Analysen keine Übereinstimmungen mit dem Laktatgehalt zeigten, kann auch der reine Proteingehalt keine Rolle als aktivitätsbestimmende Größe der Glykolyse spielen. Vielmehr scheinen Aktivierungs- und posttranslationale Prozesse oder auch eine Kombination mehrerer Faktoren eine Rolle zu spielen. Letztlich deuten die Befunde darauf hin, dass die glykolytische Aktivität der untersuchten Tumoren nicht über Transkription und Proteinexpression reguliert wird. Der Zusammenhang zwischen dem Laktatgehalt und der Strahlenresistenz der Tumoren kann von großer klinischer Bedeutung sein, da ein klinisch relevantes Fraktionierungsschema bei der Bestrahlung angewandt wurde. Unsere Ergebnisse bestätigen die Arbeitshypothese, dass ein hoher glykolytischer Flux mit einer hohen Umsatzrate an Metaboliten mit Radikalfängerfunktion, wie Pyruvat, einhergeht, die den Tumoren eine Radioresistenz verleihen. Der Laktatgehalt von Biopsien als Marker für die Strahlenresistenz könnte in Zukunft zu einer der Radiotherapie vorangehenden Patientenselektion herangezogen werden, um die Therapie- und insbesondere Dosisplanung in der Onkologie zu unterstützen.

Expressions- und Funktionsanalysen von "Tetraspan Vesicle Membrane Proteins" in Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind ubiquitäre Komponenten von Transportvesikeln. Bei den Säugetieren unterscheidet man drei Familien, die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins). Ihre Funktion ist weitgehend unbekannt, es wird jedoch vermutet, dass sie eine Rolle bei der Vesikelbildung und der Vesikelrezirkulierung spielen. In Caenorhabditis elegans existiert von jeder Familie jeweils nur ein einziges Polypeptid: für die Physine Synaptophysin (SPH-1), für die Gyrine Synaptogyrin (SNG-1) und für die SCAMPs SCAMP (SCM-1). Ziel der Arbeit war es die Verteilung der C. elegans TVPs zu untersuchen und ihre Funktion unter besonderer Berücksichtigung der vesikelvermittelten synaptischen Kopplung zu bestimmen. Wenn die C. elegans TVPs in humanen Epithelzellen synthetisiert werden, lokalisieren sie in zytoplasmatischen Vesikeln. In Kotransfektionsexperimenten wurde gezeigt, dass sie größtenteils in den gleichen Strukturen enthalten sind. In C. elegans synthetisierte TVP-Reporterkonstrukte können in unterschiedlichen Geweben nachgewiesen werden. Dabei ist SNG-1 fast ausschließlich in Neuronen zu finden. SPH-1 und SCM-1 hingegen weisen komplexe und teilweise überlappende Verteilungsmuster auf. Während für SPH-1 eine starke Fluoreszenz im Pharynx, auf der apikalen Seite der Darmzellen oberhalb des sog. terminal webs und in adluminalen Regionen von exkretorischen Geweben gefunden wurde, war SCM-1 stark in der Muskulatur und den Coelomozyten vertreten. Die Expression von SCM-1 in Pharynx und Darm war deutlich schwächer. Die C. elegans TVPs werden früh in der Entwicklung ab der Gastrulation (SPH-1 und SCM-1) bzw. ab der Neurulation im sog. Komma-Stadium (SNG-1) produziert. Um die Funktion der TVPs in C. elegans zu untersuchen, wurden TVP-Mutanten analysiert. Durch Kombination aller drei TVP-Gen-Mutanten wurden TVP-Dreifachmutanten generiert. Diese wiesen keinen offensichtlichen Defekt im Bewegungsmuster auf, entwickelten sich normal und bildeten ein normales Nervensystem aus. Auch auf unterschiedliche chemische und physikalische Reize in sensorischen Tests reagierten die TVP-Dreifachmutanten in gleicher Weise wie Wildtyptiere. Ebenso zeigen die TVP-Dreifachmutanten elektrophysiologisch unter normalen Bedingungen keine anormalen Reaktionsmuster. In ultrastrukturellen Untersuchungen wurde lediglich eine signifikant erhöhte Anzahl Clathrin-ummantelter Vesikel in cholinergen Synapsen gefunden. Erst unter Stressbedingungen, hervorgerufen durch den GABA-Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ), wiesen sowohl die TVP-Dreifach- als auch die TVP-Einzelmutanten eine deutlich erhöhte Krampfbereitschaft auf. Zusammengenommen zeigen die Analysen, dass TVPs zwar für grundlegende neuronale Prozesse nicht notwendig sind, dass sie aber auf der anderen Seite vermutlich an alternativen redundanten Wegen der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind.

Hypersonic elastic excitations in soft mesoscopic structures

This dissertation is devoted to the experimental exploration of the propagation of elastic waves in soft mesoscopic structures with submicrometer dimensions. A strong motivation of this work is the large technological relevance and the fundamental importance of the subject. Elastic waves are accompanied by time-dependent fluctuations of local stress and strain fields in the medium. As such, the propagation phase velocities are intimately related to the elastic moduli. Knowledge of the elastic wave propagation directly provides information about the mechanical properties of the probed mesoscopic structures, which are not readily accessible experimentally. On the other hand, elastic waves, when propagating in an inhomogeneous medium with spatial inhomogeneities comparable to their wavelength, exhibit rather rich behavior, including the appearance of novel physical phenomena, such as phononic bandgap formation. So far, the experimental work has been restricted to macroscopic structures, which limit wave propagation below the KHz range. It was anticipated that an experimental approach capable of probing the interplay of the wave propagation with the controlled mesoscopic structures would contribute to deeper insights into the fundamental problem of elastic wave propagation in inhomogeneous systems. The mesoscopic nature of the structures to be studied precludes the use of traditional methods, such as sound transmission, for the study of elastic wave propagation. In this work, an optical method utilizing the inelastic scattering of photons by GHz frequency thermally excited elastic waves, known as Brillouin light scattering spectroscopy (BLS), was employed. Two important classes of soft structures were investigated: thin films and colloidal crystals. For the former, the main interest was the effect of the one-dimensional (1D) confinement on the wave propagation due to the presence of the free-surface or interface of the layer and the utilization of these waves to extract relevant material parameters. For the second system, the primary interest was the interaction of the elastic wave and the strong scattering medium with local resonance units in a three-dimensional (3D) periodic arrangement.

Die Rolle Prolin-reicher Sequenzmotive des Core-Proteins in der Morphogenese des Hepatitis-B Virus

Diese Arbeit hatte zum Ziel, den Ausschleusungsmechanismus des Hepatitis-B Virus zu beleuchten. Es ist bisher unbekannt, wie das virale Nukleokapsid umhüllt und das reife Virion aus der Leberzelle freigesetzt wird. Bei einigen RNA-Viren, beispielsweise HIV-1, Ebola oder RSV, vermitteln so genannte Late-Domänen im viralen Kapsid- oder Matrix-Protein die Knospung der Viren an intrazellulären Membranen oder der Plasmamembran. Da das HBV-Core-Protein ähnliche Sequenzen trägt, wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft, welche Rolle diese im viralen Replikationszyklus spielen. Meine Ergebnisse zeigen, dass die beiden Prolin-reichen Sequenzen PPAY (129-132) und PPNAP (134-138), die retroviralen Late-Domänen ähneln, für die HBV-Morphogenese essentiell sind. Mutationen einzelner Aminosäuren innerhalb dieser Motive führen zu Phänotypen mit verändertem Kapsid-, Nukleokapsid- und Virus-Bildungs-Vermögen. Insbesondere sind die Aminosäure Tyrosin 132 des Motivs PPAY und die Prolinreste 134 und 135 des Motivs PPNAP erforderlich, da diese schon für die Bildung der Kapside unentbehrlich sind. Charakteristisch für beide Motive sind auch die hier gezeigten Interaktionen mit speziellen Wirtszellfaktoren, deren physiologische Funktion es ist, zelluläre Proteine in den endosomalen Sortierungsprozess einzuschleusen. Im Vordergrund stehen hier die E3 Ub-Ligase Nedd4, welche Proteine mit Ub konjugiert und diese so signifikant für die Einschleusung in das endosomale System markiert, und Tsg101, das als zentrale Komponente des ESCRT-I-Komplexes für die Erkennung von ubiquitinierten Proteinen zuständig ist und diese dadurch in die ESCRT-Kaskade des multivesikulären Endosoms einführt. Für die genannten Interaktionen ist das Motiv PPAY und hier wieder speziell das Tyrosin 132 des HBV-Core-Proteins für die Wechselwirkung mit Nedd4 notwendig. Hingegen vermittelt die L-Domänen-ähnliche Sequenz PPNAP die Assoziation von Core mit Tsg101, wobei die beiden Prolinreste 134 und 135 und auch das Asparagin 136 für die Interaktion essentiell sind. Sowohl Nedd4 als auch Tsg101 wirken im Zusammenhang mit Ubiquitin, weshalb eine Ubiquitinierung von Core, trotz bislang negativer Nachweise, wahrscheinlich ist. Zugunsten dieser Annahme spricht auch mein Nachweis, dass der Lysinrest an Position 96 des Core-Proteins, als potentieller Ub-Akzeptor, gerade in späten Schritten eine essentielle Rolle spielt. Weiterhin klärungsbedürftig ist auch die Frage, ob Core direkt mit Tsg101 und Nedd4 interagiert, oder ob andere Faktoren dazwischen geschaltet sind. Auch könnte mit Hilfe von siRNA-vermittelten Depletionsversuchen die physiologische Relevanz der Tsg101/Core-und Nedd4/Core-Interaktion weiterführend untersucht werden. Zudem zeigen meine Arbeiten, dass Core mit intrazellulären Membranen assoziiert, weshalb es interessant wäre, zu untersuchen, ob es sich hierbei um Membranen des endosomalen Systems handelt, an denen die finalen Schritte der Virus-Morphogenese stattfinden könnten.

Aktivierung von Hämocyanin zur Tyrosinase

Ziel der Arbeit war die enzymatische Aktivierung von Cheliceraten-Hämocyanin zur Erforschung ihrer Phenoloxidase-Aktivität. Hierzu wurden zwei Hämocyanine in vergleichenden Untersuchungen herangezogen: Das bekannte 24-mer aus der Spinne Eurypelma californicum und das ebenfalls 24-mere Hämocyanin des Skorpions Pandinus imperator, dessen Struktur hier aufgeklärt wurde. Elektronenmikroskopisch und in der dynamischer Lichtstreuung sind sich beide Hämocyanine sehr ähnlich und sedimentieren bei analytischer Ultrazentrifugation ebenfalls in gleicher Weise (Sedimentationskoeffizient von 37 S (S20, W)). Durch Dissoziation im alkalischen Milieu gewinnt man bis zu zwölf Untereinheiten, von denen sich neun immunologisch unterscheiden lassen. Das absorptionsspektroskopische Verhalten von P. imperator- und E. californicum-Hämocyanin sowie Sekundärstrukturanalyse mittels CD-Spektroskopie ist nahezu identisch. Die Stabilität des Hämocyanins gegenüber Temperatur und Denaturierungsmitteln wurde mit Circulardichroismus- und Fluoreszenzspektroskopie sowie durch die enzymatische Aktivität untersucht. Erstmals konnten die Hämocyanine von P. imperator und E. californicum nicht nur zu einer stabilen Diphenoloxidase umgewandelt werden, sondern auch eine Monophenolhydroxylase-Aktivität induziert und reguliert werden. Für letztere Aktivität ist dabei die Präsenz von Tris- oder Hepes-Puffer wesentlich. Während sich die Monophenolhydroxylase-Aktivität nur auf Ebene der oligomeren Zustände beobachten lässt, erkennt man bei den isolierten Untereinheiten-Typen lediglich eine Diphenoloxidase-Aktivität. Bei dem Spinnen-Hämocyanin zeigen die Untereinheiten bc die stärkste katalytische Aktivität auf, bei P. imperator-Hämocyanin findet man drei bis vier Untereinheiten, die enzymatisch aktiv sind. Die Aktivierung mit SDS liefert den Hinweis, dass die Quartärstruktur in eine andere Konformation gebracht und nicht durch SDS denaturiert wird. Zugabe von Mg2+ reguliert die Phenoloxidase-Aktivität und verschiebt bei P. imperator-Hämocyanin die enzymatische Aktivität zugunsten der Diphenoloxidase. Mit keiner der zur Verfügung stehenden Methoden konnte jedoch ein Konformationsübergang eindeutig nachgewiesen werden. Die Stabilität scheint durch die niedrigen SDS-Konzentrationen nicht beeinträchtigt zu werden. Die sehr lange “Verzögerungsphase“ bei der Monophenolhydroxylase-Aktivität konnte durch Zugabe von katalytischem Diphenol drastisch verkürzt werden, was ein Hinweis auf die echte Tyrosinase-Aktivität des aktivierten Hämocyanins ist. Ein in vivo-Aktivator konnte bis jetzt noch nicht gefunden werden. Trotzdem scheinen die Hämocyanine in der Immunologie von Cheliceraten eine bedeutende Rolle zu spielen, indem sie die Rolle der Tyrosinasen / Phenoloxidasen beziehungsweise Catecholoxidasen übernehmen, die bei Cheliceraten nicht vorkommen. Weitere Möglichkeiten des Cheliceraten-Immunsystems, eindringende Fremdorganismen abzuwehren, wurden untersucht. Das Fehlen einer ´echten` Phenoloxidase-Aktivität bei den Cheliceraten, mit der Fähigkeit, sowohl mono- als auch diphenolische Substrate umzusetzen, stützt die Hypothese, dass aktiviertes Hämocyanin in vivo an die Stelle der Phenoloxidase tritt.

Inverse problems in classical and quantum physics

The subject of this thesis is in the area of Applied Mathematics known as Inverse Problems. Inverse problems are those where a set of measured data is analysed in order to get as much information as possible on a model which is assumed to represent a system in the real world. We study two inverse problems in the fields of classical and quantum physics: QCD condensates from tau-decay data and the inverse conductivity problem. Despite a concentrated effort by physicists extending over many years, an understanding of QCD from first principles continues to be elusive. Fortunately, data continues to appear which provide a rather direct probe of the inner workings of the strong interactions. We use a functional method which allows us to extract within rather general assumptions phenomenological parameters of QCD (the condensates) from a comparison of the time-like experimental data with asymptotic space-like results from theory. The price to be paid for the generality of assumptions is relatively large errors in the values of the extracted parameters. Although we do not claim that our method is superior to other approaches, we hope that our results lend additional confidence to the numerical results obtained with the help of methods based on QCD sum rules. EIT is a technology developed to image the electrical conductivity distribution of a conductive medium. The technique works by performing simultaneous measurements of direct or alternating electric currents and voltages on the boundary of an object. These are the data used by an image reconstruction algorithm to determine the electrical conductivity distribution within the object. In this thesis, two approaches of EIT image reconstruction are proposed. The first is based on reformulating the inverse problem in terms of integral equations. This method uses only a single set of measurements for the reconstruction. The second approach is an algorithm based on linearisation which uses more then one set of measurements. A promising result is that one can qualitatively reconstruct the conductivity inside the cross-section of a human chest. Even though the human volunteer is neither two-dimensional nor circular, such reconstructions can be useful in medical applications: monitoring for lung problems such as accumulating fluid or a collapsed lung and noninvasive monitoring of heart function and blood flow.

Tensid- und Interpolyelektrolytkomplexe semiflexibler Polyelektrolyte

Hochgeladene semiflexible kationische und anionische Polyelektrolyte wurden mit niedermolekularen Tensiden zu Polyelektrolyt-Tensid-Komplexen (PETK) umgesetzt und in organischen Lösungsmitteln mit Streumethoden und Rasterkraftmikroskopie charakterisiert. Die synthetisierten PETK wurden anschließend, mit dem Ziel einer strukturkontrollierten Komplexbildung, für die Bildung von Interpolyelektrolytkomplexen (IPEK) in organischen Lösungsmitteln verwendet und anhand ihres Komplexbildungsverhaltens mit wässrigen Systemen verglichen. Die Umsetzung von zylindrischen Polymerbürsten mit Poly(styrolsulfonat)-, bzw. Poly(2-vinylpyridinium)-Seitenketten mit entgegengesetzt geladenen Tensiden verlief, trotz einer Graftingdichte von eins, quantitativ. Mit Streumethoden konnte gezeigt werden, dass die gebildeten PETK in Lösung als molekulare Zylinder vorliegen. Die Synthese von pUC19-DNA-Tensidkomplexen (DNA-TK), die sich in Alkoholen gut lösen, ist nur in stark basischer Lösung gelungen. Während der Charakterisierung der DNA-TK mit Streumethoden zeigte sich eine starke Abhängigkeit des Trägheitsradius von dem Verhältnis DNA-/Salz+. Die Bildung von IPEK aus hochgeladenen Polyelektrolyt-Bürsten bzw. PETK-Bürsten wurde an verschiedenen Beispielen in Wasser und DMF durchgeführt und mit Streumethoden verfolgt. Alle Systeme zeigten ein zu der IPEK-Bildung von linearen Polyelektrolyten analoges Komplexbildungsverhalten. Bei der Komplexierung von Poly(styrolsulfonat)-Bürsten-Tensidkomplexen mit kommerziellen Polyamidoamin-G5-Dendrimeren (PAMAM) oder Poly(ethylenoxid) modifizierten Poly(ethylenimin)-Bürsten hingegen wurden über den gesamten Gewichtsbruchbereich mit Streumethoden und AFM zylindrische Aggregate gefunden, die den Dimensionen der Poly(styrolsulfonat)-Bürsten-Tensidkomplexe entsprechen. Durch statistische Höhenanalyse der AFM-Bilder wurde ein linearer Zusammenhang zwischen der Komplexhöhe und dem Gewichtsbruch an PAMAM, bzw. PEI-PEO gefunden, der auf die Zunahme der Molmasse der Komplexe durch Wachstum entlang des Zylinderdurchmessers hindeutet. Die Bildung von Aggregaten, mit mehr als einem Polyanion, wurde nicht beobachtet.

Synthese und Charakterisierung einer Hydrogelmatrix für die Multianalyt-Sensorik

Gegenstand und Ziel der vorliegenden Arbeit war die Synthese und Charakterisierung einer Hydrogelmatrix, welche für die Herstellung eines vielseitig verwendbaren Sensors, der mehrere Analyten (Proteine, DNA etc.) in hoher Verdünnung (c0 < 50 fM) aus kleinsten Probenmengen (Volumina <20 nl) schnell (t < 1 min) und parallel nachweisen kann, Verwendung finden soll. Der Fokus der Arbeit lag dabei in der Synthese und Charakterisierung von Copolymeren als Hydrogelmatrix, welche geeignetes temperaturabhängiges Verhalten zeigen. Die Copolymere wurden in eine dreidimensionale Netzwerkstruktur überführt und auf einer Goldoberfläche kovalent angebunden, um Delamination zu vermeiden und die Untersuchung mittels Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR) und Optischer Wellenleiter-Spektroskopie (OWS) zu erlauben. Weiterhin wurde das temperaturabhängige Verhalten der Polymernetzwerke in Wasser mittels optischen Messungen (SPR/OWS) untersucht, um Erkenntnisse über die Quell- und Kollabiereigenschaften des Hydrogels zu gewinnen. Um temperaturschaltbare Hydrogele herzustellen, wurden auf N-Isopropylacrylamid (NIPAAm) basierende Polymere synthetisiert. Es wurde sowohl die für Hydrogele übliche Methode der freien radikalischen Vernetzungspolymerisation in Wasser, wie eine neue, auf Benzophenoneinheiten basierende Syntheseroute, welche die freie radikalische Polymerisation in organischem Medium nutzt, verwendet. Die synthetisierten Polymere sind Copolymere aus N‑Isopropylacrylamid (NIPAAm) und 4-Methacryloyloxybenzophenon (MABP). NIPAAm ist dabei für das temperaturschaltbare Verhalten der Gele verantwortlich und MABP dient als Photovernetzer. Weitere Copolymere, die neben den genannten Monomeren noch andere Funktionen, wie z.B. ionische Gruppen oder Aktivesterfunktionen enthalten, wurden ebenfalls synthetisiert. Das temperaturabhängige Quellverhalten in Bezug auf die chemische Zusammensetzung wurde mit der Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR) und Optischen Wellenleiter-Spektroskopie (OWS) untersucht. Es zeigte sich, dass die Anwesenheit von Salz im Hydrogel (Natriumacrylat als Monomer, P4S) Inhomogenität, in Form eines Brechungsindexgradienten senkrecht zur Substratoberfläche, hervorruft. Dies ist nicht der Fall, wenn statt des Salzes die Säure (Methacrylsäure als Monomer, P4A) verwendet wird. Durch die Inhomogenität lassen sich die Filme mit dem Natriummethacrylat nicht mehr mit dem, üblicherweise zur Auswertung genutzten, Kastenmodell beschreiben. Die Anwendung der Wentzel-Kramers-Brillouin-Näherung (WKB) auf die Messdaten führt hingegen zu dem gewünschten Ergebnis. Man findet ein kastenähnliches Brechungsindexprofil für das Hydrogel mit der Säure (P4A) und ein Gradientenprofil für das Gel mit dem Salz (P4S). Letzteres ist nicht nur hydrophiler und insgesamt stärker gequollen, sondern ragt auch weiter in die überstehende Wasserphase hinein. Anhand eines säurehaltigen Hydrogels (P8A) konnte der quellungshemmende Einfluss von hohen Salzkonzentrationen gezeigt werden. Weiterhin wurde während des Quellvorgangs eine gewisse Anisotropie gefunden, die aber im vollständig gequollenen und vollständig kollabierten Zustand nicht mehr vorliegt. Anhand eines Hydrogels ohne ionisierbare Gruppen (P9) wurde die Reversibilität des Quell- und Kollabiervorgangs gezeigt. Bei einem Vergleich zwischen einem säurehaltigen Hydrogel (P8A, Quellgrad von 7,3) und einem ohne ionisierbare Gruppen (P9, Quellgrad von 6,1), hat die Anwesenheit der 8 mol% Säuregruppen eine leichte Verstärkung der Quellung um den Faktor 1,2 bewirkt. Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen (AFM) an diesen beiden Hydrogelen im getrockneten Zustand, haben gezeigt, dass nach dem Quellen, Kollabieren und Trocknen bei beiden Gelen Porenstrukturen sehr unterschiedlicher Ausmaße vorliegen.

Untersuchung von Morphologie, Enzymverteilungen und Transportdynamik des Golgi-Apparates lebender Säugerzellen mittels hochauflösender MMM-4Pi-Mikroskopie in zwei Farben

Seit der Entdeckung des Golgi-Apparates im Jahre 1898 wurden seine Struktur, seine enzymatische Zusammensetzung und die Dynamik des in ihm stattfindenden Proteintransports intensiv untersucht. Dennoch blieben bis heute wesentliche Fragen zu seiner Funktionsweise unbeantwortet. So existieren nach wie vor mehrer konkurrierende Modelle zur Organisation der hoch komplexen räumlichen Verteilung seiner Enzyme sowie zum grundlegenden Mechanismus des Intra-Golgi Transports. Die Beantwortung dieser und weiterer Fragen ist für das Verständnis des Golgi-Apparates essentiell, aber aus methodischen Gründen höchst schwierig, da es bisher nicht möglich war die Struktur und Dynamik des Golgi-Apparates lebender Zellen mit der hierfür notwendigen Auflösung und Geschwindigkeit zu untersuchen. Bis heute gibt es für die funktionsmorphologischen Untersuchungen des Golgi-Apparates lebender Zellen keine echte Alternative zur Fernfeld- Fluoreszenzmikroskopie. Das MMM-4Pi-Mikroskop ermöglicht als erstes Fluoreszenzmikroskop, aufgrund seiner Auflösung von ~200 nm in der Fokalebene und 100-150 nm entlang der optischen Achse, die Untersuchung der Subkompartimente des Golgi-Apparates und kann, aufgrund seiner hohen Aufnahmegeschwindigkeit von 0.5 Hz, die Dynamik des Intra-Golgi Transports zeitlich auflösen. Ziel dieser Arbeit war es daher, den Golgi-Apparate lebender Zellen in zwei Farben sowie mit einer bisher nicht möglichen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu untersuchen. Um die Leistungsfähigkeit der dreidimensionalen Bildgebung dieser Methode zu überprüfen, wurde erstmals der Golgi-Apparat fixierter Säugerzellen korrelativ mit dem Transmissionselektronenmikroskop und dem MMM-4Pi-Mikroskop aufgenommen. Die rekonstruierten Strukturen korrelierten in allen drei Raumrichtungen zu über 80%, was die Validität beider Methoden eindrucksvoll unter Beweis stellt. Zudem konnten mit dem MMM-4Pi-Mikroskop Aussackungen von Golgi-Cisternen aufgelöst werden, was die Eignung dieser Methode zur strukturellen Analyse der Subkompartimente des Golgi-Apparates unterstreicht. Des Weiteren wurde, in einer Reihe zweifarbiger Aufnahmeserien, die Verteilung dreier Golgi-Enzyme in lebenden Säugerzellen untersucht, und ihre mittlere relative Distanz bestimmt. Ihre aus der Literatur bekannten Lokalisationen konnten in zwei Fällen bestätigt (GalT, MannII) und in einem Fall korrigiert werden (2-OST). Im Gegensatz zu der konfokal bestimmten Cis-/Mid-Lokalisation von 2-OST zeigen die Ergebnisse der hoch aufgelösten Distanzanalyse deutlich, dass eine Mid-/Trans-Lokalisation vorliegt. Dieses Ergebnis wurde elektronenmikroskopisch überprüft und bestätigt. Da die räumliche Anordnung der Golgi-Enzyme die Reihenfolge ihrer Akitvität wiederspiegelt, ist eine möglichst präzise Bestimmung ihrer Konzentrationsverteilungen essentiell, um die Funktion des Golgi-Apparates zu verstehen. Insbesondere zeigt dieses Resultat, dass die Bestimmung der Lokalisation von Golgi-Enzymen über konfokale Kolokalisationsstudien zu falschen Ergebnissen führen kann. Die Kombination hoher räumlicher Auflösung mit einer schnellen Datenaufnahme erlaubte die Analyse der Transportdynamik innerhalb des Golgi-Apparates von Säugerzellen. In mehreren Zeitserien zweifarbiger Aufnahmen wurde der Transport des Frachtproteins VSVG relativ zum Trans-Golgi-Marker GalT untersucht. Dabei zeigte sich, dass das Trans-Golgi-Kompartiment in einigen Fällen durch eine deutliche Formänderung auf die Ankunft eines VSVG-Transportpulses reagierte und sich insgesamt wesentlich dynamischer verhielt als der Transportpuls selbst. Diese Beobachtung bestätigt tendenziell Transportmodelle, die den Golgi-Apparat nicht als statisches, sondern als dynamisches, aktiv am Transport beteiligtes Organell beschreiben. Die hier vorgestellten Experimente stellen die ersten Untersuchungen zur Verteilung von Golgi-Enzymen sowie zur Transportdynamik des Golgi-Apparates lebender Zellen mit einer dreidimensionalen Auflösung im Bereich von 100-200 nm dar. Wie am Beispiel von 2 OST gezeigt, ist es mit dem MMM-4Pi-Mikroskop allgemein möglich, die Lokalisation von Golgi-Enzymen wesentlich präziser als bisher zu bestimmen. Bei der Untersuchung dynamischer Prozesse ist in naher Zukunft eine Steigerung der Leistungsfähigkeit der Methode zu erwarten. Zum einen werden CCD-Kameras mit kürzeren Auslesezeiten und einer elektronischen Verstärkung des Signals die Datenaufnahme weiter beschleunigen. Zum anderen könnte durch die Entwicklung eines parallelisierten Mikroskops mit Einphotonen-Anregung das Bleichen konsekutiver Aufnahmen verringert werden, wodurch längere Aufnahmeserien möglich sein werden.

Conditional and transgenic mouse models as tools to study the role of TGFbeta, BMP signaling in skeletal development

Die TGFbeta/BMP Signaltransduktionskaskade ist wichtig für viele Entwicklungsprozesse fast aller embryonaler sowie extraembryonaler Gewebe und sie ist ebenso essentiell bei der Aufrechterhaltung der Homöostase im adulten Organismus. In vielen Mausmodellen und Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass Liganden dieses Signalweges in verschiedene Stadien der Knorpel- und Knochenentwicklung involviert sind. BMPs sind beispielsweise maßgeblich an der frühen Kondensation und Bildung des Knorpels und später an Proliferation und Hypertrophie der Chondrozyten beteiligt. BMPs können ektopisch Knochenbildung auslösen und das Expressionsmuster der Liganden und spezifischen Rezeptoren in der Wachstumsfuge lässt auf eine wichtige Rolle der BMPs in der Wachstumsfuge schließen. Der gezielte knock out der BMP-Rezeptoren Bmpr1a und Bmpr1b in proliferierenden Chondrozyten führt zur Ausbildung einer generellen Chondrodysplasie. Smad1, Smad5 und Smad8 sind die Mediatoren der BMP-Signalkaskade. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Funktion der Smad1- und Smad5-Proteine in der Wachstumsfuge untersucht werden. Hierzu wurden konditionale Smad1-knock out-Mäuse mit einer transgenen Mauslinie gekreuzt, die die Cre-Rekombinase spezifisch in proliferierenden Chondrozyten exprimiert. Diese Mäuse wurden mit und ohne heterozygotem Smad5-Hintergrund charakterisiert. Bei einem knock out von Smad1 allein konnte ein leichte Verkürzung der Wachstumsfuge beobachtet werden, wobei prähypertrophe und hypertrophe Zone gleichermaßen betroffen waren. Dieser Phänotyp war verstärkt in Mäusen mit zusätzlichem heterozygotem Smad5-Hintergrund. Eine Verringerung der Proliferationsrate konnte zusammen mit einer verminderten Ihh-Expression nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte anhand von Röntgenaufnahmen eine Dysorganisation der nasalen Region und ein fehlendes nasales Septum beobachtet werden. Produktion und Mineralisation der extrazellulären Matrix waren nicht beeinträchtigt. Um die Rolle der BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden während der endochondralen Ossifikation zu vergleichen, wurden transgene Mäuse generiert, in denen die TGFbeta-Signalkaskade spezifisch in proliferierenden Chondrozyten gestört war. Zwei Mauslinien, die ähnliche Phänotypen zeigten, wurden untersucht. Esl1 ist ein TGFbeta-bindendes Protein, von dem man annimmt, dass es die TGFbeta-Signalkaskade inhibieren kann. Esl1-knock out-Mäuse sind kleiner als Wildtypmäuse und die Überexpression von Esl1 in proliferierenden Chondrozyten führt zu einer Verlängerung der Wachstumsfuge und einer verstärkten Proliferationsrate. Knorpelmarker, wie Col2a1 und Sox9 sind in diesen Mäusen herunterreguliert, während Col10a1 und Ihh als Marker für die hypertrophe und prähypertrophe Zone herunterreguliert waren. Dies führt zu der Annahme, dass mehr Zellen in die terminale Differenzierung eintreten. Bei transgenen Mäusen, in denen ein dominant-negativer (dn) TGFbeta-Rezeptor in proliferierenden Chondrozyten überexprimiert wurde, konnte eine verlängerte prähypertrophe Zone, eine erhöhte Ihh-Expression, sowie eine verstärkte Proliferationsrate beobachtet werden. Zusätzlich konnte in homozygoten Tieren ein craniofacialer Phänotyp beschrieben werden, der zu Problemen bei der Nahrungsaufnahme und damit zu einer starken Wachstumsbeeinträchtigung führte. Die BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden haben möglicherweise antagonistische Effekte in der Wachstumsfuge. Während der Ausfall von BMP in proliferierenden Chondrozyten aufgrund einer gesunkenen Proliferationsrate zu einer Verkürzung der Wachstumsfuge führte, kann man in Mäusen mit einer Störung der TGFbeta-Signalkaskade eine verstärkte Proliferation in einer daher verlängerten Wachstumsfuge beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Generation einer transgenen Mauslinie, die die Cre-Rekombinase spezifisch in hypertrophen Chondrozyten exprimiert. Promoterstudien mit transgenen Mäusen weisen darauf hin, dass ein putatives AP1-Element, etwa 4 kb vor dem ersten Exon des Col10a1 gelegen, wichtig für die spezifische Expression in hypertrophen Chondrozyten ist. Ein Konstrukt, dass vier Kopien dieses Elements und den basalen Promoter enthält, wurde benutzt, um die Cre-Rekombinase spezifisch zu exprimieren. Diese Mauslinie befindet sich in der Testphase und erste Daten deuten auf eine spezifische Expression der Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrozyten hin.

Schaderreger im Wurzelraum von Reben (Vitis spp.) - Vorkommen, Wirkung, Interaktionen - und Möglichkeiten zu deren Kontrolle durch Maßnahmen des Integrated Pest Management (IPM)

Ziel der Untersuchungen war es, das Vorkommen, die Wirkungen und die Interaktionen bodenbürtiger Vitis-Pathogene in Pfropfrebenbeständen zu untersuchen und die Möglichkeiten ihrer Kontrolle im Rahmen des Integrated Pest Managements zu eruieren. Ein Schwerpunkt lag dabei bei den in Zusammenhang mit einem Befall der Rebstöcke durch D. vitifoliae stehenden Wuchsdepressionen und Absterbeerscheinungen. Hintergrund dieser Untersuchungen war die Hypothese, dass sich die Böden von Rebanlagen mit und ohne Wuchsdepressionen und Absterbeerscheinungen der Reben aufgrund ihrer pathogen- bzw. krankheitssuppressiven Eigenschaften unterscheiden. Andererseits wurde untersucht, ob die die Wurzeln besiedelnde Reblaus selbst durch den entomopathogenen Pilz M. anisopliae biologisch kontrolliert werden kann. Im Verlauf dieser Untersuchungen wurde im Wurzelsystem der Reben ein bis dahin unbekannter obligater Parasit aus der Gruppe der Plasmodiophorales identifiziert, der der Gattung Sorosphaera zugewiesen werden konnte. Dies gab Anlass zur morphologischen und ökologischen Untersuchung dieses neuen Organismus, der dann in der Folge als Sorosphaera viticola Kirchmair, Neuhauser, Huber beschrieben wurde. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die krankheits- bzw. pathogenkonduktiven und -suppressiven Eigenschaften der Böden dafür verantwortlich sind, ob es in einer Rebanlage zu Ausfallerscheinungen kommt oder nicht, wobei ein direkter Zusammenhang mit der Bewirtschaftung der Flächen, namentlich der Versorgung der Böden mit organischer Substanz hergestellt werden konnte.

Der Einfluss von TGF-beta1 auf regulatorische T-Zellen in einem murinen Modell für Asthma

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von regulatorischen T-Zellen (Treg) auf die Pathogenese des Asthmas in einem murinen Modell zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Co-Expression von TGF-ß1 und IL-10 auf Treg notwendig ist, um im Tiermodell vor einer Atemwegs-Hyperreagibilität (AHR) zu schützen. Natürliche Treg konnten keinen Schutz vermitteln. Weiterhin wurde gezeigt, dass der Schutz vor AHR durch TGF-ß1 über Empfänger T-Zellen vermittelt wird. Dabei reichte die alleinige Anwesenheit von TGF-ß1 nicht aus, vielmehr musste das Zytokin von Treg exprimiert werden. Ein Einfluss von TGF-ß1 überexprimierenden Treg auf die peribronchiale Entzündung konnte nicht festgestellt werden, wohingegen adoptiver Transfer von natürlichen Treg die Eosinophilen Anzahl in der Bronchiallavage signifikant verringern konnte. Dabei korrelierte die Eosinophilie mit den IL-5 Spiegeln in der Bronchiallavage. In dieser Arbeit konnte also eine Entkopplung der Mechanismen von AHR und Entzündung festgestellt werden. Die weitere Aufklärung der Mechanismen der Suppression der AHR durch TGF-ß1 und IL-10 produzierende Treg könnte daher die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze bei Atemwegserkrankungen ermöglichen.

In vitro generation and characterization of acute myeloid leukemia-reactive CD8 + cytotoxic T-lymphocyte clones from healthy donors

Donor-derived CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) eliminating host leukemic cells mediate curative graft-versus-leukemia (GVL) reactions after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The leukemia-reactive CTLs recognize hematopoiesis-restricted or broadly expressed minor histocompatibility and leukemia-associated peptide antigens that are presented by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on recipient cells. The development of allogeneic CTL therapy in acute myeloid leukemia (AML) is hampered by the poor efficiency of current techniques for generating leukemia-reactive CTLs from unprimed healthy donors in vitro. In this work, a novel allogeneic mini-mixed lymphocyte/leukemia culture (mini-MLLC) approach was established by stimulating CD8+ T cells isolated from peripheral blood of healthy donors at comparably low numbers (i.e. 10e4/well) with HLA class I-matched primary AML blasts in 96-well microtiter plates. Before culture, CD8+ T cells were immunomagnetically separated into CD62L(high)+ and CD62L(low)+/neg subsets enriched for naive/central memory and effector memory cells, respectively. The application of 96-well microtiter plates aimed at creating multiple different responder-stimulator cell compositions in order to provide for the growth of leukemia-reactive CTLs optimized culture conditions by chance. The culture medium was supplemented with interleukin (IL)-7, IL-12, and IL-15. On day 14, IL-12 was replaced by IL-2. In eight different related and unrelated donor/AML pairs with complete HLA class I match, numerous CTL populations were isolated that specifically lysed myeloid leukemias in association with various HLA-A, -B, or -C alleles. These CTLs recognized neither lymphoblastoid B cell lines of donor and patient origin nor primary B cell leukemias expressing the corresponding HLA restriction element. CTLs expressed T cell receptors of single V-beta chain families, indicating their clonality. The vast majority of CTL clones were obtained from mini-MLLCs initiated with CD8+ CD62L(high)+ cells. Using antigen-specific stimulation, multiple CTL populations were amplified to 10e8-10e10 cells within six to eight weeks. The capability of mini-MLLC derived AML-reactive CTL clones to inhibit the engraftment of human primary AML blasts was investigated in the immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common γ-chain deficient (NOD/SCID IL2Rγnull) mouse model. The leukemic engraftment in NOD/SCID IL2Rγnull was specifically prevented if inoculated AML blasts had been pre-incubated in vitro with AML-reactive CTLs, but not with anti-melanoma control CTLs. These results demonstrate that myeloid leukemia-specific CTL clones capable of preventing AML engraftment in mice can be rapidly isolated from CD8+ CD62L(high)+ T cells of healthy donors in vitro. The efficient generation and expansion of these CTLs by the newly established mini-MLLC approach opens the door for several potential applications. First, CTLs can be used within T cell-driven antigen identification strategies to extend the panel of molecularly defined AML antigens that are recognizable by T cells of healthy donors. Second, because these CTLs can be isolated from the stem cell donor by mini-MLLC prior to transplantation, they could be infused into AML patients as a part of the stem cell allograft, or early after transplantation when the leukemia burden is low. The capability of these T cells to expand and function in vivo might require the simultaneous administration of AML-reactive CD4+ T cells generated by a similar in vitro strategy or, less complex, the co-transfer of CD8-depleted donor lymphocytes. To prepare clinical testing, the mini-MLLC approach should now be translated into a protocol that is compatible with good manufacturing practice guidelines.

Analyse der Transmembran-Agrin-abhängigen Signalkaskade in auswachsenden Axonen des zentralen Nervensystems

Die Entdeckung einer Transmembranform des Proteoglykans Agrin führte zu der Hypothese, dass TM-Agrin ein Rezeptor oder Korezeptor mit signaltransduzierenden Eigenschaften sein könnte. Die durch Antikörper simulierte Ligandenbindung an TM-Agrin resultiert in der Bildung von zahlreichen Ausläufern sowohl auf ZNS als auch auf PNS Axonen und Dendriten und unterstützt diese Hypothese. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen führt die Überexpression von TM-Agrin in ZNS Neuronen ebenfalls zur Bildung von zahlreichen Ausläufern, wohingegen die Unterdrückung der TM-Agrin Expression durch siRNA die Anzahl der Ausläufer stark reduziert. Der Mechanismus der durch TM-Agrin induzierten Bildung von Ausläufern ist jedoch unbekannt. Ziel der Dissertation war es deshalb, die durch TM-Agrin induzierte Signalkaskade zu untersuchen. Mit Hilfe von biochemischen, immunozytochemischen und pharmakologischen Unter-suchungen konnte gezeigt werden, dass sich TM-Agrin auf auswachsenden Axonen und nach Überexpression in nicht-neuronalen Zellen in lipid rafts anreichert und das lipid rafts sowohl für die Bildung als auch für die Aufrechterhaltung der Ausläufer notwendig sind. Die durch polyklonale Antikörper induzierte Bildung von Ausläufern kann sowohl durch die Inhibierung der Src-Kinase Fyn, welche in lipid rafts lokalisiert ist, als auch der 44/42 MAPK gehemmt werden. Zudem führt die Aggregation von TM-Agrin durch polyklonale Antikörper zu einer erhöhten Aktivität der Fyn- und 44/42 MAP-Kinase. Im Gegensatz dazu hat eine Inhibierung der PI3-Kinase keine Auswirkungen auf die Bildung der Ausläufer. Der intrazelluläre, sekundäre Botenstoff cGMP, nicht aber cAMP, fördert die Bildung von Ausläufern. Die konzentrationsabhängige Blockierung des Coxsackie-Adenovirus-Rezeptors (CAR) führt zu einer Hemmung der Ausläuferbildung. Ferner interagiert CAR im Zentralnervensystem während der Phase des aktiven axonalen Wachstums mit TM-Agrin und induziert nach Überexpression in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen die Bildung von Ausläufern. In der vorliegenden Arbeit konnten somit Teilabschnitte der durch TM-Agrin induzierten Signalkaskade entschlüsselt werden.

Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP)

Das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verhältnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die über den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist für das Überleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. Störungen der Calcium-Homöostase sind ein bekanntes Phänomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von überexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgelöst. Dies führt zur Induktion der sogenannten „unfolded protein response“ (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. Für APP-überexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erhöhte intrazelluläre Calcium Konzentration nachgewiesen werden. Über die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-überexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellulären Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle gänzlich unterdrückt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kanälen (SOCC) eine signifikante Unterdrückung der beobachteten erhöhten intrazellulären Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-überexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verläuft in einer UPR-unabhängigen Reaktion über die Aktivierung von SOCC’s, einer erhöhten Aufnahme von extrazellulärem Calcium und durch erhöhte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPPα-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodomäne von APP, die über die Aktivität der α-Sekretase prozessiert wird und anschließend extrazellulär abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen für Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Schäden, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu schützen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPPα-vermittelten Protektion konnte über die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPPα-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPPα-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch höherer Effizienz APP-überexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu schützen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-überexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erhöhung der sAPPα Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fettsäuren wirken sich positiv auf die Membranfluidität von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen Aβ Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin schützte die Omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-überexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz für die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein könnte.