Studio della trasduzione del Segnale Nucleare Inositide-Dipendente: identificazione di eEF1A2 come nuovo Fosfosubstrato di PKC βI

Introduction Phospholipase Cb1 (PLC-β1) is a key player in the regulation of nuclear inositol lipid signaling and of a wide range of cellular functions, such as proliferation and differentiation (1,2,3). PLCb1 signaling depends on the cleavage of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and the formation of the second messengers diacylglycerol and Inositol tris-phosphate which activate canonical protein kinase C (cPKC) isoforms. Here we describe a proteomic approach to find out a potential effector of nuclear PLC-b1 dependent signaling during insulin stimulated myogenic differentiation. Methods Nuclear lysates obtained from insulin induced C2C12 myoblasts were immunoprecipitated with anti-phospho-substrate cPKC antibody. Proteins, stained with Comassie blue, were excised, digested and subsequently analysed in LC-MS/MS. For peptide sequence searching, the mass spectra were processed and analyzed using the Mascot MS/MS ion search program with the NCBI database. Western blotting, GST-pull down and co-immunoprecipitation were performed to study the interaction between eEF1A2 and cPKCs. Site direct mutagenesis was performed to confirm the phosphorylated motif recognized by the antibody. Immunofluorescence analysis, GFP-tagged eEF1A2 vector and subcellular fractionation were performed to study nuclear localization and relative distribution of eEF1A2. Results We have previously shown that PLC-β1 is greatly increased at the nuclear level during insulin-induced myoblasts differentiation and that this nuclear localization is essential for induction of differentiation. Thus, nuclear proteins of insulin stimulated C2C12 myoblasts, were immunoprecipitated with an anti-phospho-substrate cPKC antibody. After Electrophoretic gel separation of proteins immunoprecipitated, several molecules were identified by LC-MS/MS. Among these most relevant and unexpected was eukaryotic elongation factor 1 alpha 2 (eEF1A2). We found that eEF1A2 is phosphorylated by PKCb1 and that these two molecules coimmunolocalized at the nucleolar level. eEF1A2 could be phosphorylated in many sites among which both threonine and serine residues. By site direct mutagenesis we demonstrated that it is the serine residue of the motif recognized by the antibody that is specifically phosphorylated by PKCb1. The silencing of PLCb1 gives rise to a reduction of expression and phosphorylation levels of eEF1A2 indicating this molecule as a target of nuclear PLCb1 regulatory network during myoblasts differentiation.

Comportamento al fuoco di travi in c.a. rinforzate esternamente a flessione e taglio

Tesi riguardo la fase preliminare di una campagna sperimentale su elementi rinforzati a flessione e taglio con fibra di basalto e malta e successivamente testati al fuoco. Comprende una parte relativa al comportamento dei comositi allle alte temperature e una sul problema della delaminazione alle alte temperature. Sono inoltre condotte simulazione numeriche relativamente al problema dell trasmissione del calore all'interno della sezione, con particolare attenzione alla modellazione dell'intuemescente. Sono stati eseguite prove di pull-out sui rinforzi e una serie di prove a compressione a caldo sulla malta d'incollaggio.

Hybrid foundations for offshore wind turbines

Nowadays offshore wind turbines represents a valid answer for energy production but with an increasing in costs mainly due to foundation technology required. Hybrid foundations composed by suction caissons over which is welded a tower supporting the nacelle and the blades allows a strong costs reduction. Here a monopod configuration is studied in a sandy soil in a 10 m water depth. Bearing capacity, sliding resistance and pull-out resistance are evaluated. In a second part the installation process occurring in four steps is analysed. considering also the effect of stress enhancement due to frictional forces opposing to penetration growing at skirt sides both inside and outside. In a three dimensional finite element model using Straus7 the soil non-linearity is considered in an approximate way through an iterative procedure using the Yokota empirical decay curves.

Donor-Akzeptor-substituierte Oligo(phenylenethinylen)e und Oligo(thienylenethinylen)e

Die Dissertation beschäftigt sich mit der Synthese und den Eigenschaftsuntersuchungen von Oligo(phenylenethinylen)en (OPEs) und Oligo(thienylenethinylen)en (OTEs) mit terminaler Donor-Akzeptor-Substitution. Die Darstellung der Oligomerenreihen erfolgt über ein „Baukastensystem“ bestehend aus Start,- Synthese, - und dem jeweiligen Endbaustein. Die zentrale Synthesereaktion zum Aufbau der Push-Pull-Systeme ist eine moderne und effektive Pd-katalysierte Reaktion, die Sonogashira-Hagihara-Kupplung. Für die dialkylaminosubstituierten OPE-Systeme konnten die Cyano,- Formyl,- Nitro –und Dicyanovinylgruppe als Akzeptoren eingeführt werden. In der dodecylsulfanylsubstituierten OTE-Serie wurde als Akzeptor die Nitrogruppe verwendet, während in der methoxysubstituierten OTE-Reihe die Formyl,- Nitro –und Dicyanovinylgruppe als Akzeptoren eingeführt wurde. Alle Reihen konnten mittels 1H-, 13C-, IR-, MS- und UV/Vis-Spektroskopie vollständig charakterisiert werden. Die Lage des langwelligen Absorptionsmaximums zeigt eine starke Abhängigkeit von der Donor- und Akzeptorstärke der Substituenten sowie von der Länge des konjugierten Pie-Systems. Für beide Pie-Systeme ergibt sich bei hinreichend starker Donor- und Akzeptorsubstitution eine ungewöhnliche hypsochrome Verschiebung der langwelligen Absorptionsmaxima. Mit Hilfe der semiempirischen Quantenmechanik wird ein Modell vorgestellt, das die ungewöhnlichen spektroskopischen Eigenschaften der OPEs und OTEs erklären und vorhersagen kann. Mittels elektrooptischer Absorptionsmessungen ( EOAM ), EFISHG-Messungen sowie der Frequenzverdreifachungsspektroskopie ( THG ) werden die NLO-Eigenschaften in Abhängigkeit von der Konjugationslänge der nitrosubstituierten OPE-Serie bestimmt.

Conjugated semiconducting organic materials for electronic applications

Since conjugated polymers, i.e. polymers with spatially extended pi-bonding system have offered unique physical properties, unobtainable for conventional polymers, significant research efforts directed to better understanding of their chemistry, physics and engineering have been undertaken in the past two and half decades. In this thesis we discuss the synthesis, characterisation and investigation of conjugated semiconducting organic materials for electronic applications. Owing to the versatile properties of metal-organic hybrid materials, there is significant promise that these materials can find use in optical or electronic devices in the future. In addressing this issue, the synthesis of bisthiazol-2-yl-amine (BTA) based polymers is attempted and their metallation is investigated. The focus of this work has been to examine whether the introduction of coordinating metal ions onto the polymer backbone can enhance the conductivity of the material. These studies can provide a basis for understanding the photophysical properties of metal-organic polymers based on BTA. In their neutral (undoped) form conjugated polymers are semiconductors and can be used as active components of plastics electronics such as polymer light-emitting diodes, polymer lasers, photovoltaic cells, field-effect transistors, etc. Toward this goal, it is an objective of the study to synthesize and characterize new classes of luminescent polymeric materials based on anthracene and phenanthrene moieties. A series of materials based on polyphenylenes and poly(phenyleneethynylene)s with 9,10-anthrylene subunits are not only presented but the synthesis and characterization of step-ladder and ladder poly(p-phenylene-alt-anthrylene)s containing 9,10-anthrylene building groups within the main chain are also explored. In a separate work, a series of soluble poly-2,7- and 3,6-phenanthrylenes are synthesized. This can enable us to do a systematic investigation into the optical and electronic properties of PPP-like versus PPV-like. Besides, the self-organization of 3,6-linked macrocyclic triphenanthrylene has been investigated by 2D wide-angle X-ray scattering experiments performed on extruded filaments in solution and in the bulk. Additionally, from the concept that donor-acceptor materials can induce efficient electron transfer, the covalent incorporation of perylene tetracarboxydiimide (PDI) into one block of a poly(2,7-carbazole) (PCz)-based diblock copolymer and 2,5-pyrrole based on push-pull type material are achieved respectively.

Foliation boudinage

In this thesis foliation boudinage and related structures have been studied based on field observations and numerical modeling. Foliation boudinage occurs in foliated rocks independent of lithology contrast. The developing structures are called ‘Foliation boudinage structures (FBSs)’ and show evidence for both ductile and brittle deformation. They are recognized in rocks by perturbations in monotonous foliation adjacent to a central discontinuity, mostly filled with vein material. Foliation boudinage structures have been studied in the Çine Massif in SW-Turkey and the Furka Pass-Urseren Zone in central Switzerland. Four common types have been distinguished in the field, named after vein geometries in their boudin necks in sections normal to the boudin axis: lozenge-, crescent-, X- and double crescent- type FBSs. Lozengetype FBSs are symmetric and characterized by lozenge-shaped veins in their boudin neck with two cusps facing opposite sides. A symmetrical pair of flanking folds occurs on the two sides of the vein. Crescent-type FBSs are asymmetric with a single smoothly curved vein in the boudin neck, with vein contacts facing to one side. X- and double crescent- type FBSs are asymmetric. The geometry of the neck veins resembles that of cuspate-lobate structures. The geometry of flanking structures is related to the shape of the veins. The veins are mostly filled with massive quartz in large single crystals, commonly associated with tourmaline, feldspar and biotite and in some cases with chlorite. The dominance of large facetted single quartz crystals and spherulitic chlorite in the veins suggest that the minerals grew into open fluidfilled space. FLAC experiments show that fracture propagation during ductile deformation strongly influences the geometry of developing veins. The cusps of the veins are better developed in the case of propagating fractures. The shape of the boudin neck veins in foliation boudinage depends on the initial orientation and shape of the fracture, the propagation behaviour of the fracture, the geometry of bulk flow, and the stage at which mineral filling takes place. A two dimensional discrete element model was used to study the progressive development of foliation boudinage structures and the behavior of visco-elastic material deformed under pure shear conditions. Discrete elements are defined by particles that are connected by visco-elastic springs. Springs can break. A number of simulations was Abstract vii performed to investigate the effect of material properties (Young’s modulus, viscosity and breaking strength) and anisotropy on the developing structures. The models show the development of boudinage in single layers, multilayers and in anisotropic materials with random mica distribution. During progressive deformation different types of fractures develop from mode I, mode II to the combination of both. Voids develop along extension fractures, at intersections of conjugate shear fractures and in small pull-apart structures along shear fractures. These patterns look similar to the natural examples. Fractures are more localized in the models where the elastic constants are low and the competence contrast is high between the layers. They propagate through layers where the constants are high and the competence contrast is relatively low. Flow localize around these fractures and voids. The patterns similar to symmetric boudinage structures and extensional neck veins (e.g. lozenge type) more commonly develop in the models with lower elastic constants and anisotropy. The patterns similar to asymmetric foliation boudinage structures (e.g. X-type) develop associated with shear fractures in the models where elastic constants and anisotropy of the materials are relatively high. In these models boudin neck veins form commonly at pull-aparts along the shear fractures and at the intersection of fractures.

Effetto dell'addizione di fibre corte di carbonio su microstruttura e proprietà di materiali a base di ZrB2

Il lavoro di tesi, svolto presso l’Istituto di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ceramici (ISTEC-CNR, Faenza, RA), ha affrontato la produzione e la caratterizzazione di ceramici a base di boruro di zirconio (ZrB2) con lo scopo di valutare l’efficacia delle fibre corte di carbonio come potenziale rinforzo. Il boruro di zirconio appartiene a una famiglia di materiali noti come UHTC (Ultra-High Temperature Ceramics) caratterizzati da elevato punto di fusione e in grado di mantenere la resistenza meccanica e operare con limitata ossidazione a temperature superiori ai 2000°C. Il principale ostacolo nella produzione dei materiali a base di ZrB2 è il processo di sintesi, infatti, a causa della loro elevata temperatura di fusione, per ottenere un materiale completamente denso è necessario utilizzare processi a temperatura e pressione elevati (T > 2000°C e P > 30 MPa), condizioni che vanno ad influenzare la microstruttura della matrice e delle fibre e di conseguenza le proprietà meccaniche del materiale. L’aggiunta di additivi di sinterizzazione idonei permette di ottenere materiali perfettamente densi anche a temperature e pressioni inferiori. Tuttavia lo ZrB2 non viene ampiamente utilizzato per applicazioni strutturali a causa della sua fragilità, per far fronte alla sua bassa tenacità il materiale viene spesso rinforzato con una fase allungata (whiskers o fibre). È già oggetto di studi l’utilizzo di fibre corte e whiskers di SiC per tenacizzare lo ZrB2, tuttavia la forte interfaccia che viene a crearsi tra fibra e matrice, che non permette il pull-out delle fibre, ci porta a credere che una fibra che non tenda a reagire con la matrice, presentando un’interfaccia più debole, possa portare ad una tenacizzazione più efficace. Per questo scopo sono stati realizzati mediante pressatura a caldo due materiali rinforzati con fibre corte di carbonio: ZrB2 + 5% vol MoSi2 + 8% vol fibre di carbonio e [ZrB2 + 2 % peso C] + 8% vol fibre di carbonio, indicati rispettivamente con Z5M_Cf e Z2C_Cf. Sono stati analizzati e discussi diversi aspetti del materiale rinforzato tra cui: il comportamento di densificazione durante la pressatura a caldo, l’evoluzione della microstruttura della matrice, la distribuzione e la morfologia delle fibre, l’influenza del rinforzo sulle proprietà meccaniche di durezza e tenacità e sulla resistenza all’ossidazione. L’elaborato è strutturato come segue: inizialmente sono state introdotte le caratteristiche generali dei ceramici avanzati tra cui le proprietà, la produzione e le applicazioni; successivamente è stata approfondita la descrizione dei materiali a base di boruro di zirconio, in particolare i processi produttivi e l’influenza degli additivi di sinterizzazione sulla densificazione e sulle proprietà; ci si è poi concentrati sull’effetto di una seconda fase allungata per il rinforzo del composito. Per quanto riguarda la parte sperimentale vengono descritte le principali fasi della preparazione e caratterizzazione dei materiali: le materie prime, disperse in un solvente, sono state miscelate mediante ball-milling, successivamente è stato evaporato il solvente e la polvere ottenuta è stata formata mediante pressatura uniassiale. I campioni, dopo essere stati sinterizzati mediante pressatura uniassiale a caldo, sono stati tagliati e lucidati a specchio per poter osservare la microstruttura. Quest’ultima è stata analizzata al SEM per studiare l’effetto dell’additivo di sinterizzazione (MoSi2 e carbonio) e l’interfaccia tra matrice e fase rinforzante. Per approfondire l’effetto del rinforzo sulle proprietà meccaniche sono state misurate la durezza e la tenacità del composito; infine è stata valutata la resistenza all’ossidazione mediante prove in aria a 1200°C e 1500°C. L’addizione di MoSi2 ha favorito la densificazione a 1800°C mediante formazione di una fase liquida transiente, tuttavia il materiale è caratterizzato da una porosità residua di ~ 7% vol. L’addizione del carbonio ha favorito la densificazione completa a 1900°C grazie alla reazione dall’additivo con gli ossidi superficiali dello ZrB2. La microstruttura delle matrici è piuttosto fine, con una dimensione media dei grani di ~ 2 μm per entrambi i materiali. Nel caso del materiale con Z5M_Cf sono presenti nella matrice particelle di SiC e fasi MoB derivanti dalla reazione dell’additivo con le fibre e con la matrice; invece nel materiale Z2C_Cf sono presenti grani di carbonio allungati tra i bordi grano, residui delle reazioni di densificazione. In entrambi i materiali le fibre sono distribuite omogeneamente e la loro interfaccia con la matrice è fortemente reattiva. Nel caso del materiale Z5M_Cf si è formata una struttura core-shell con lo strato più esterno formato da SiC, formato dalla reazione tra il siliciuro e la fibra di C. Nel caso del materiale Z2C_Cf non si forma una vera e propria interfaccia, ma la fibra risulta fortemente consumata per via dell’alta temperatura di sinterizzazione. I valori di durezza Vickers dei materiali Z5M_Cf e Z2C_Cf sono rispettivamente 11 GPa e 14 GPa, valori inferiori rispetto al valore di riferimento di 23 GPa dello ZrB2, ma giustificati dalla presenza di una fase meno dura: le fibre di carbonio e, nel caso di Z5M_Cf, anche della porosità residua. I valori di tenacità dei materiali Z5M_Cf e Z2C_Cf, misurati con il metodo dell’indentazione, sono rispettivamente 3.06 MPa·m0.5 e 3.19 MPa·m0.5. L’osservazione, per entrambi i materiali, del fenomeno di pull-out della fibra, sulla superficie di frattura, e della deviazione del percorso della cricca, all’interno della fibra di carbonio, lasciano supporre che siano attivi questi meccanismi tenacizzanti a contributo positivo, unitamente al contributo negativo legato allo stress residuo. La resistenza all’ossidazione dei due materiali è confrontabile a 1200°C, mentre dopo esposizione a 1500°C il materiale Z5M_Cf risulta più resistente rispetto al materiale Z2C_Cf grazie alla formazione di uno strato di SiO2 protettivo, che inibisce la diffusione dell’ossigeno all’interno della matrice. Successivamente, sono stati considerati metodi per migliorare la densità finale del materiale e abbassare ulteriormente la temperatura di sinterizzazione in modo da minimizzare la degenerazione della fibra. Da ricerca bibliografica è stato identificato il siliciuro di tantalio (TaSi2) come potenziale candidato. Pertanto è stato prodotto un terzo materiale a base di ZrB2 + Cf contenente una maggiore quantità di siliciuro (10% vol TaSi2) che ha portato ad una densità relativa del 96% a 1750°C. Questo studio ha permesso di approcciare per la prima volta le problematiche legate all’introduzione delle fibre di carbonio nella matrice di ZrB2. Investigazioni future saranno mirate alla termodinamica delle reazioni che hanno luogo in sinterizzazione per poter analizzare in maniera più sistematica la reattività delle fibre nei confronti della matrice e degli additivi. Inoltre riuscendo ad ottenere un materiale completamente denso e con fibre di carbonio poco reagite si potrà valutare la reale efficacia delle fibre di carbonio come possibili fasi tenacizzanti.

Pollen-placement and pollen-portioning in diverse Salvia-species

This dissertation addresses the staminal lever mechanism of the genus Salvia. Various hypotheses referring to its purpose and function are tested and elucidated. The first hypothesis maintains that the lever is a mechanical selection mechanism which excludes weak pollinators from the flower. This hypothesis is refuted and the respective results of force measurements and morphological investigations are presented, statistically evaluated and discussed. The force measurements and morphological investigations were conducted on the staminal levers and flowers of 8 bee pollinated (melittophilous) and 6 bird pollinated (ornithophilous) species. For comparison a ninth melittophilous species that lacks the staminal lever was investigated. In this species the force measurements were conducted on floral structures that were suspected to hinder a flower visitor. The hypotheses, which state that the staminal lever is a tool for pollen portioning and reduces the risk of pollen loss as well as hybridisation due to its ability to perform a repeatable, accurate and species-specific pollen placement on a wide range of diverse pollinators, are confirmed. Investigations with respect to pollen portioning were carried out on 13 sages. The lever mechanism can be released several times in a row, while the pollen sacs leave a dosed pollen portion on a well defined spot on the pollinator‘s body. Pollen placement was investigated for 12 sages. In sympatric sages, lever length and the area of pollen placement are of particular interest. A shared pollinator bears species-specific areas of pollen placement for different sages. The accurate pollen placement ensures an efficient pollination. However, the question of the functionality of the lever mechanism can not be answered with absolute certainty. The lever‘s backswing is not caused by the adaxial lever arm; the adaxial lever arm is too light and too short to be an adequate counterweight to the abaxial lever arm. Therefore, the adaxial lever arm can not pull the abaxial lever arm to return it to its neutral position. But there are indications of a cellular mainspring in the filament. According to the current state of knowledge, this is the most plausible explanation for the lever's backswing, but further histological investigations on the joint of the lever mechanism are necessary to confirm this assumption.

Charakterisierung redundanter Kerntransportsignale des minoren Kapsidproteins L2 humaner Papillomviren

Das minore Kapsidprotein L2 humaner Papillomviren wird im Laufe des HPV-Lebenszyklus zweimal in den Zellkern importiert und akkumuliert dort an den Nukleären Domänen 10 (ND10). Der erste Kernimport erfolgt in der frühen Phase der Infektion zusammen mit der Virus-DNA. Für den Zusammenbau von Virionen wird neu synthetisiertes L2-Protein ein weiteres Mal in den Kern transportiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Domäne von L2 identifiziert werden, die für den Kernimport von HPV16 L2 absolut notwendig ist. Dabei gelang es diesen Bereich auf 25 Aminosäuren einzuengen. Sowohl während der frühen Phase der Infektion als auch während der Morphogenese scheint die zentrale, basische Aminosäureregion 291-315 (mNLS) hauptverantwortlich für die Interaktion mit Kernimportrezeptoren zu sein. Möglicherweise leisten dabei flankierende Sequenzen einen Beitrag zur Stabilisierung der notwendigen Konformation. Des Weiteren gelang die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Funktionalität des mNLS essentiell sind. Hierbei handelt es sich um ein zentrales Arginin-Motiv, bestehend aus vier dicht beieinander liegenden Argininen, dessen Mutation den Kernimport von L2 während Infektion und Morphogenese verhindert. Untersuchungen mit HPV16 und HPV18 L2-Proteinen verdeutlichten, dass es möglicherweise ein universelles Motiv zu sein scheint und in verschiedenen HPV-Typen konserviert ist. Flankiert wird dieses Arginin-Motiv von konservierten Serinen und Threoninen. Wie die Analyse von Punktmutationen zeigte, sind diese Aminosäuren für den Kernimport von L2 ohne Bedeutung. Interessanterweise verhinderte aber die Mutation TS295/6A die Kolokalisation von L2 mit ND10 im Zellkern. L2wt rekrutiert den transkriptionellen Regulator Daxx. Auch diese Funktion ging bei der Mutante TS295/6A verloren. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die ND10-Lokalisationsdomäne (AS 390-420) in L2 sondern auch weitere Aminosäuren oder Domänen für die Assoziation mit ND10 und die Rekrutierung von Daxx verantwortlich sein könnten. Auf der Suche nach zellulären Faktoren, die eine Rolle im mNLS-vermittelten Kernimport spielen, wurde zunächst die Bedeutung von Hsc70 untersucht. Während der Morphogenese maskiert Hsc70 den C-Terminus von L2 und verhindert damit unerwünschte Interaktionen mit Mikrotubuli im Zytoplasma. Es existieren aber weitere noch unbekannte Hsc70-Bindedomänen in L2, die möglicherweise den Kernimport ebenfalls beeinflussen können. Wie die Untersuchungen deutlich machten, ist der zentrale, basische Bereich von L2 aber nicht mit Hsc70 assoziiert und der mNLS-vermittelte Kernimport findet unabhängig von Hsc70 statt. In einem siRNA-Screen wurde anschließend die Rolle von Karyopherinen während der Infektion untersucht. Sowohl Kapß2-siRNA als auch Kapß3-siRNA waren in der Lage unabhängig voneinander die Infektion von HPV16-Pseudovirionen zu reduzieren. Für beide Karyopherine konnte in der Vergangenheit in vitro die Interaktion mit HPV16 L2 nachgewiesen werden. Das L2-Protein ist das einzige virale Protein, das während der Infektion die Virus-DNA in den Kern begleitet (Day et al., 2004). Demzufolge ist es auch das einzige virale Protein, das mit Importinen während der Infektion interagiert. Möglicherweise sind also beide Karyopherine in der Lage sein L2 während der Infektion in den Kern zu importieren. Abschließend wurden Präzipitationsversuche durchgeführt, die zur Identifizierung möglicher Bindungspartner des mNLS führen sollten. In diesen Versuchen konnte eine erhöhte Bindungsaffiniät zu den beiden Importinen Kapß1 und Kapß2 festgestellt werden. Möglicherweise ist das L2-Protein mit seiner mNLS in der Lage mehrere Importrezeptoren zu binden und für den Kernimport zu nutzen. Eines dieser Importine ist Kapß2. Dieser Importrezeptor scheint sowohl bei der Infektion als auch während der Morphogenese den Kernimport von L2 durch die Bindung an das mNLS zu vermitteln.

Charakterisierung zellulärer Interaktionspartner des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das große L-Hüllprotein (L) des Hepatitis B - Virus. L bildet eine ungewöhnliche duale Topologie in der ER-Membran aus, welche auch im reifen Viruspartikel erhalten bleibt. In einem partiellen, posttranslationalen Reifungsprozess wird die sogenannte PräS-Region von der zytosolischen Seite der Membran aus in das ER-Lumen transloziert. Aufgrund seiner dualen Topologie und der damit verbundenen Multifunktionalität übernimmt L eine Schlüsselfunktion im viralen Lebenszyklus. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag deshalb darin, neue zelluläre Interaktionspartner des L-Hüllproteins zu identifizieren. Ihre Analyse sollte helfen, das Zusammenspiel des Virus mit der Wirtszelle besser zu verstehen. Hierfür wurde das Split - Ubiquitin Hefe - Zwei - Hybrid System eingesetzt, das die Interaktionsanalyse von Membranproteinen und Membran-assoziierten Proteinen ermöglicht. Zwei der neu identifizierten Interaktionspartner, der v-SNARE Bet1 und Sec24A, die Cargo-bindende Untereinheit des CoPII-vermittelten vesikulären Transports, wurden weitergehend im humanen Zellkultursystem untersucht. Sowohl für Bet1 als auch für Sec24A konnte die Interaktion mit dem L-Hüllprotein bestätigt und der Bindungsbereich eingegrenzt werden. Die Depletion des endogenen Bet1 reduzierte die Freisetzung L-haltiger, nicht aber S-haltiger subviraler Partikel (SVP) deutlich. Im Gegensatz zu Bet1 interagierte Sec24A auch mit dem mittleren M- und kleinen S-Hüllprotein von HBV. Die Inhibition des CoPII-vermittelten vesikulären Transportweges durch kombinierte Depletion der vier Sec24 Isoformen blockierte die Freisetzung sowohl L- als auch S-haltiger SVP. Dies bedeutet, dass die HBV - Hüllproteine das ER CoPII-vermittelt verlassen, wobei sie aktiv Kontakt zur Cargo-bindenden Untereinheit Sec24A aufnehmen. Der effiziente Export der Hüllproteine aus dem ER ist für die Virusmorphogenese und somit für den HBV - Lebenszyklus essentiell. rnEin weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit basierte auf der Interaktion des L-Hüllproteins mit dem ER-luminalen Chaperon BiP. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob BiP, ähnlich wie das zytosolische Chaperon Hsc70, an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt ist. Hierfür wurde BiP durch die ektopische Expression seiner Ko-Chaperone BAP und ERdj4 in seiner Substrat-bindenen Kapazität manipuliert. ERdj4, ein Mitglied der Hsp40 - Proteinfamilie, stimuliert die ATPase-Aktivität von BiP, was die Substratbindung stabilisiert. Der Nukleotid - Austauschfaktor BAP hingegen vermittelt die Auflösung des BiP - Substrat - Komplexes. Die Auswirkung der veränderten in vivo-Aktivität von BiP auf die posttranslationale PräS-Translokation wurde mit Proteaseschutz - Versuchen untersucht. Die ektopische Expression des positiven als auch des negativen Regulators von BiP resultierte in einer drastischen Reduktion der posttranslationalen PräS-Translokation. Ein vergleichbarer Effekt wurde nach Manipulation des BiP ATPase - Zyklus durch Depletion der zellulären ATP - Konzentration beobachtet. Dies spricht dafür, dass das ER-luminale Chaperon BiP, zusammen mit Hsc70, eine zentrale Rolle in der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins spielt. rnZwei weitere Proteine, Sec62 und Sec63, die sich für die posttranslationale Translokation in der Hefe als essentiell erwiesen haben, wurden in die Analyse der dualen Topologie des L-Hüllproteins einbezogen. Interessanterweise konnte eine rein luminale Ausrichtung der PräS-Region nach kombinierter Depletion des endogenen Sec62 und Sec63 beobachtet werden. Dies deutet an, dass sowohl Sec62 als auch Sec63 an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt sind. In Analogie zur Posttranslokation der Hefe könnte Sec62 als Translokon-assoziierter Rezeptor für Substrate der Posttranslokation, und damit der PräS-Region, dienen. Sec63 könnte mit seiner J-Domäne BiP zum Translokon rekrutieren und daraufhin dessen Substrat-bindende Aktivität stimulieren. BiP würde dann, einer molekularen Ratsche gleich, die PräS-Region durch wiederholtes Binden und Freisetzen aktiv in das ER-Lumen hereinziehen, bis eine stabile duale Topologie des L-Hüllproteins ausgebildet ist. Die Bedeutung von Sec62 und Sec63 für den HBV - Lebenszyklus wird dadurch untermauert, dass sowohl die ektopische Expression als auch die Depletion des endogenen Sec63 die Freisetzung L-haltiger SVP deutlich reduziert. rn

Entwicklung eines ökotouristischen Nutzungskonzeptes für den ehemaligen Militärstandort Hjerkinn Skytefelt im Nationalpark Dovrefjell-Sunndalsfjella in Mittel-Norwegen

Der Ökotourismus hat sich in den letzten Jahren zu einer Tourismussparte entwickelt, die nicht nur immer mehr Interessenten unter den Nutzern findet, sondern auch vielfältige Forschungsmöglichkeiten eröffnet.rnAus interdisziplinärer Betrachtungsweise kann man sowohl in den Gebieten der Biologie, der Wirtschaft, der Geographie, aber auch der Politik forschend tätig werden. rnDa der Tourismus in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung gerade für Länder mit weitestgehend intakten Naturressourcen erlangt hat, stellt sich die Frage inwieweit die Wirtschaft eines Landes auf diese Einnahmequelle angewiesen ist und ob nicht die ökologischen Belange immer weiter in den Hintergrund treten.rnAus diesem Ansatz heraus erfolgte zunächst eine qualitative und quantitative Bestandsaufnahme, die ein klares Bild vom derzeitigen Zustand in der Region ermöglicht. Darüber hinaus werden im Rahmen der Untersuchungen Zukunftsperspektiven aufgezeigt. Diese sollen verdeutlichen, inwieweit man steuernd in solche dynamischen Entwicklungsprozesse eingreifen kann oder soll.rnDie Schwerpunkte dieser Arbeit liegen in dem Bereich der Befragung von Touristen und in der Ausarbeitung eines digitalen Geländemodells zur späteren Nutzung in einem aufzubauenden Nationalpark-Infozentrum. Auf der Grundlage dieser Untersuchungen wurde ein touristisches Nutzungskonzept entwickelt und auf seine ökologischen Umsetzungschancen hin untersucht. Der Aspekt des Ökotourismus wird einleitend erörtert und definiert. Anschließend werden die Potenziale der norwegischen Tourismuswirtschaft untersucht. Die Befragungsergebnisse sowohl der norwegischen Besucher als auch der ausländischen Touristen werden in verschiedenen Korrelationen näher untersucht.rnEin gesonderter Bereich der Untersuchungen gilt dem Problemfeld des Wildcampings in Norwegen. Die dramatischen Entwicklungen der letzten Jahre rufen immer mehr Aktivisten auf den Plan. Da die Deutschen die größte Besuchergruppe darstellen, wurden innerhalb der Jahre 2003 bis 2006 Einzelinterviews geführt, um einen Überblick über das Übernachtungsverhalten der Deutschen in Norwegen gewinnen zu können. In den vergangenen 10 Jahren sind die deutschen Besucherzahlen in Norwegen leicht rückläufig, während die der Niederländer kontinuierlich steigen.rnAuf diesen Ergebnissen basierend wurden problemzentrierte Interviews mit Wohnmobilreisenden, der größten Gruppe der Individualreisenden, durchgeführt. rnMehr als 600.000 Nächte pro Jahr verbrachten die deutschen Wohnmobilreisenden außerhalb der Campingplätze, was ökologische und ökonomische Auswirkungen hat und nicht mehr mit dem in Norwegen geltenden „Allemansrett“, dem Jedermannsrecht, vereinbar ist. rnGerade die Touristen, die mit dem Wohnmobil reisen, können nur schwer mit anderen Reisenden verglichen werden, da sie mit einer völlig anderen Reiseauffassung mehr oder weniger autark unterwegs sind. Dabei legen sie besonders große Distanzen zurück und haben sich zum Ziel gesetzt, möglichst viel in kurzer Zeit zu sehen und zu erleben. Für alle Touristengruppen wurde untersucht, auf welchem Weg die Informationen für die geplante Reise beschafft wurden. Der Reiseführer ist der hauptsächliche Informationslieferant und ist teilweise für das Verhalten der Urlauber mitverantwortlich. Es konnte festgestellt werden, dass das Image des Landes und die Reisemotive das Reiseverhalten und die Wahrnehmung determinieren. Eine Untersuchung der so genannten Pull- und Push-Faktoren ergab, dass die nahezu noch unberührte Natur, die raue Landschaft sowie Ruhe und Erholung die entscheidenden Pull-Faktoren für Norwegenreisende sind. Dabei überprägt das Image Norwegens als „wildes Naturland“ die Wahrnehmung für verschiedene Problembereiche, die in Norwegen, wie auch in vielen anderen Ländern Europas, durchaus vorhanden sind. rnProblemfelder, wie Landschaftsausbeutung, Wildcamping, reduziertes Konsumverhalten und damit einhergehende rückläufige Besucherzahlen, können aber durch innovative Tourismuskonzepte und neue Reiseformen abgebaut werden. Hierbei sind Medien, wie Reiseführer, Internet und Reisemagazine, in die Pflicht zu nehmen.

Fiber-reinforced ceramics for thermostructural applications, produced by polymer impregnation pyrolysis

Several CFCC (Continuous Fiber Composite Ceramics) production processes were tested, concluding that PIP (Polymer Impregnation, or Infiltration, Pyrolysis) and CBC (Chemically Bonded Ceramics) based procedures have interesting potential applications in the construction and transportation fields, thanks to low costs to get potentially useful thermomechanical performances. Among the different processes considered during the Doctorate (from the synthesis of new preceramic polymers, to the PIP production of SiC / SiC composites) the more promising results came from the PIP process with poly-siloxanes on basalt fabrics preforms. Low processing time and costs, together with fairly good thermomechanical properties were demonstrated, even after only one or two PIP steps in nitrogen flow. In alternative, pyrolysis in vacuum was also tested, a procedure still not discussed in literature, but which could originate an interesting reduction of production costs, with only a moderate detrimental effect on the mechanical properties. The resulting CFCC is a basalt / SiCO composite that can be applied for continuous operation up to 600°C, also in oxidant environment, as TG and XRD demonstrated. The failure upon loading is generally pseudo-plastic, being interlaminar delamination the most probable rupture mechanism. . The strength depends on several different factors (microstructure, polymer curing and subsequent ceramic phase evolution, fiber pull-out, fiber strength, fiber percentage) and can only be optimized empirically. In order to be open minded in selecting the best technology, also CBC (Chemically Bonded Ceramics) matrixes were considered during this Doctorate, making some preliminary investigations on fire-resistant phosphate cements. Our results on a commercial product evidenced some interesting thermomechanical capabilities, even after thermal treatments. However the experiments showed also phase change and possible cracking and deformations even on slow drying (at 130°C) and easy rehydration upon exposure to environmental humidity.

On the car sequencing problem: analysis and solution methods

This work deals with the car sequencing (CS) problem, a combinatorial optimization problem for sequencing mixed-model assembly lines. The aim is to find a production sequence for different variants of a common base product, such that work overload of the respective line operators is avoided or minimized. The variants are distinguished by certain options (e.g., sun roof yes/no) and, therefore, require different processing times at the stations of the line. CS introduces a so-called sequencing rule H:N for each option, which restricts the occurrence of this option to at most H in any N consecutive variants. It seeks for a sequence that leads to no or a minimum number of sequencing rule violations. In this work, CS’ suitability for workload-oriented sequencing is analyzed. Therefore, its solution quality is compared in experiments to the related mixed-model sequencing problem. A new sequencing rule generation approach as well as a new lower bound for the problem are presented. Different exact and heuristic solution methods for CS are developed and their efficiency is shown in experiments. Furthermore, CS is adjusted and applied to a resequencing problem with pull-off tables.

A new method for continuous quality control of nsm cfrp systems

In the last decade the near-surface mounted (NSM) strengthening technique using carbon fibre reinforced polymers (CFRP) has been increasingly used to improve the load carrying capacity of concrete members. Compared to externally bonded reinforcement (EBR), the NSM system presents considerable advantages. This technique consists in the insertion of carbon fibre reinforced polymer laminate strips into pre-cut slits opened in the concrete cover of the elements to be strengthened. CFRP reinforcement is bonded to concrete with an appropriate groove filler, typically epoxy adhesive or cement grout. Up to now, research efforts have been mainly focused on several structural aspects, such as: bond behaviour, flexural and/or shear strengthening effectiveness, and energy dissipation capacity of beam-column joints. In such research works, as well as in field applications, the most widespread adhesives that are used to bond reinforcements to concrete are epoxy resins. It is largely accepted that the performance of the whole application of NSM systems strongly depends on the mechanical properties of the epoxy resins, for which proper curing conditions must be assured. Therefore, the existence of non-destructive methods that allow monitoring the curing process of epoxy resins in the NSM CFRP system is desirable, in view of obtaining continuous information that can provide indication in regard to the effectiveness of curing and the expectable bond behaviour of CFRP/adhesive/concrete systems. The experimental research was developed at the Laboratory of the Structural Division of the Civil Engineering Department of the University of Minho in Guimar\~aes, Portugal (LEST). The main objective was to develop and propose a new method for continuous quality control of the curing of epoxy resins applied in NSM CFRP strengthening systems. This objective is pursued through the adaptation of an existing technique, termed EMM-ARM (Elasticity Modulus Monitoring through Ambient Response Method) that has been developed for monitoring the early stiffness evolution of cement-based materials. The experimental program was composed of two parts: (i) direct pull-out tests on concrete specimens strengthened with NSM CFRP laminate strips were conducted to assess the evolution of bond behaviour between CFRP and concrete since early ages; and, (ii) EMM-ARM tests were carried out for monitoring the progressive stiffness development of the structural adhesive used in CFRP applications. In order to verify the capability of the proposed method for evaluating the elastic modulus of the epoxy, static E-Modulus was determined through tension tests. The results of the two series of tests were then combined and compared to evaluate the possibility of implementation of a new method for the continuous monitoring and quality control of NSM CFRP applications.

Untersuchungen zur Funktion multipler DnaJ-Proteine in dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803

Sowohl in Synechocystis sp. PCC 6803 als auch in anderen Cyanobakterien konnten multiple DnaJ-Proteine nachgewiesen werden, deren Funktion jedoch noch weitestgehend unverstanden ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktionen der multiplen DnaJ-Proteine von Synechocystis sp. charakterisiert. Das DnaJ-Protein, Sll0897 gehört aufgrund seiner Domänenstruktur zu den Typ I-Proteinen, Slr0093 und Sll1933 zu den Typ II-Proteinen und Sll0909, Sll1011, Sll1384 und Sll1666 zu den Typ III DnaJ-Proteinen. Durch Komplementationsstudien des E. coli ΔdnaJ-Stammes OD259 konnte eine Komplementation des Wachstumsdefekts bei höheren Temperaturen durch die Proteine Slr0093 und Sll0897 gezeigt werden. In Synechocystis war eine komplette Disruption von sll1933 nicht möglich, weshalb das Protein Sll1933 unter normalen Wachstumsbedingungen essentiell ist. Doppelte Insertionmutationen waren lediglich bei der Kombination der Gene sll0909 und sll1384 möglich. Untersuchungen des Wachstumsverhaltens der dnaJ-Disruptions-stämme unter Hitze- und Kältestressbedingungen zeigten, dass das Protein Sll0897 eine wichtige Funktion bei der Stressantwort in Synechocystis besitzt und unter Hitzestressbedingungen essentiell ist. Eine vollständige Deletion des Gens sll0897 war Synechocystis sp. bereits unter normalen Wachstumsbedingungen nicht möglich. Bei den für ein Wachstum mindestens notwendigen Domänen des Sll0897 handelt es sich um die charakteristische J-Domäne und die Glycin-Phenylalanin-reiche Domäne. Unter Hitzestressbedingungen ist das Volllängen-Protein Sll0897 für ein Wachstum essentiell. rnNeben den in vivo Wachstumsexperimenten wurde eine Methode zur heterologen Expression der sieben DnaJ-Proteine in E. coli und einer nativen Reinigung von Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666 etabliert. Untersuchungen zur Thermostabilität der gereinigten Proteine zeigten für das Slr0093 und Sll1666 einen reversiblen Prozess, wodurch sie auch nach dem Hitzestress noch als Faltungshelfer fungieren können. Bei den Proteinen Sll0897 und Sll0909 ist der Prozess jedoch nicht reversibel, so dass sie nach Hitzestresseinwirkung neu synthetisiert oder durch Chaperoneinwirkung korrekt gefaltet werden müssen. Die Affinitäts-„Pull-Down“ Analysen lieferten keine klaren Hinweise auf die DnaK-Interaktionspartner der Proteine Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666, weshalb weitere Untersuchungen notwendig sind. Mit Hilfe der Gelfiltrationsanalysen konnten die errechneten molaren Massen der Proteine Slr0093 und Sll1666 bestätigt und beide Proteine in einer monomeren Form nachgewiesen werden. Die DnaJ-Proteine Sll0897 und Sll0909 konnten in zwei oligomeren Zuständen detektiert werden. Analysen der ATPase-Aktivität des DnaK2-Proteins alleine und des DnaK2-Proteins zusammen mit den DnaJ-Proteinen Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666 zeigten eine Steigerung der ATP-Hydrolyserate bei der Interaktion von DnaK und DnaJ, wobei Sll0897 die größte Steigerung der ATPase-Aktivität des DnaK2 induzierte.