Mechanism of infection and colonization of Rhipicephalus sanguineus eggs by Mertarhizium anisopliae as revealed by scanning eletron microscopy and histopathology

O presente trabalho teve como objetivo verificar a forma de penetração do fungo Metarhizium anisopliae em ovos do carrapato Rhipicephalus sanguineus, assim como as lesões infringidas no interior do ovo. A aderência e penetração do fungo foram estudadas por meio da microscopia eletrônica de varredura e a ação do fungo nos tecidos internos avaliada em secções histológicas convencionais. Para observação destes eventos, realizaram-se infecções experimentais em 11 grupos de ovos do R. sanguineus contendo 25 mg cada. Os ovos foram banhados durante 3 minutos, sob agitação manual, em suspensão com concentração de 10(8) conídios/mL. Nos grupos controle o banho foi realizado apenas no veículo da suspensão. Os ovos foram processados para análise histopatológica e microscopia eletrônica de varredura nos seguintes tempos após a infecção: 1 e 18h, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, nove e onze dias. Observou-se grande germinação de conídios em 67% dos ovos 18h após a inoculação e o fungo penetrou em 92,6% dos ovos 5 dias após a infecção. A extrusão do patógeno ocorreu em 87% dos ovos 7 dias após a infecção, chegando a 100% no 9º dia. Nas análises histopatológicas não foram observadas lesões dignas de nota, porem deve-se ressaltar que houve significativa redução (53,9%) na eclosão a partir dos ovos infectados.

Sensibilidade de fungos entomopatogênicos a agroquímicos usados no manejo da cana-de-açúcar

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Colonização e lesão em fêmeas ingurgitadas do carrapato Rhipicephalus sanguineus causadas pelo fungo Metarhizium anisopliae

O presente trabalho teve como objetivo verificar a forma de penetração do fungo Metarhizium anisopliae [METSCH. (SOROKIN, 1883)] em carrapatos da espécie Rhipicephalus sanguineus (LATREILLE, 1806), assim como as lesões infringidas nos tecidos internos do ácaro. A forma de aderência e penetração do fungo foi estudada através da microscopia eletrônica de varredura e a ação do fungo nos tecidos internos avaliada em secções histológicas convencionais. Para observação destes eventos, realizaram-se infecções experimentais em 11 grupos de fêmeas ingurgitadas do carrapato R. sanguineus contendo 12 fêmeas ingurgitadas cada. Para tal, as fêmeas ingurgitadas foram banhadas durante 3 minutos, sob agitação manual, em suspensão com concentração 108 conídios/mL. No caso dos grupos controle o banho foi realizado apenas no veículo da suspensão. Os carrapatos foram processados para histopatologia e microscopia eletrônica em diversos tempos após a infecção, a saber: 1 e 18h, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, nove e onze dias. Observou-se que a maior parte dos conídios germinou em até 18h após a inoculação e que o fungo penetrou no ácaro através do tegumento 48h após a infecção. Após a penetração, o fungo invadiu o corpo do hospedeiro promovendo uma colonização difusa, sem preferência aparente por tecidos específicos. Dentre as lesões nos tecidos internos do ácaro, ressalta-se o rompimento da parede intestinal e vazamento do conteúdo para a hemocele. A morte do hospedeiro ocorreu entre 96 e 120h pós-infecção, e a esporulação do patógeno sobre o cadáver do ácaro iniciou-se em torno de 120 a 144h pós-infecção. Espera-se, com este trabalho, contribuir para o desenvolvimento e viabilização de técnicas de controle biológico dos carrapatos por fungos como alternativa ao uso de acaricidas.

Patogenicidade de isolados de Beauveria bassiana para ovos, larvas e ninfas ingurgitadas de Rhipicephalus sanguineus

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Eventos externos e internos da infecção de larvas e ninfas de Rhipicephalus sanguineus por Metarhizium anisopliae

Examinaram-se a adesão, a germinação, a penetração e a colonização de larvas e ninfas de Rhipicephalus sanguineus por Metarhizium anisopliae, assim como as lesões infringidas pelo fungo nas respectivas fases do ciclo de vida do ácaro. Realizaram-se infecções experimentais em 11 grupos contendo 250 larvas e 11 grupos contendo 75 ninfas de R. sanguineus, por meio de banho, durante três minutos sob agitação manual, em suspensão contendo 10(8) conídios/ml do fungo. Nos grupos-controles, o banho foi realizado usando o veículo da suspensão. Larvas e ninfas foram processadas para um estudo histopatológico e de microscopia eletrônica de varredura nos seguintes tempos após a infecção: uma e 18 horas, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, nove e 11 dias. A germinação dos conídios ocorreu em até 18 horas pós-inoculação, e o fungo penetrou nas larvas e ninfas através do tegumento, dois e três dias após a infecção, respectivamente. Após penetração, o fungo invadiu o corpo das larvas e ninfas, promovendo uma colonização difusa, sem preferência aparente por tecidos específicos. Lesões significativas não foram observadas. A morte das larvas e ninfas ocorreu no terceiro e quarto dias pós-infecção, e a esporulação do patógeno sobre o cadáver foi iniciada no sexto dia pós-infecção.

Patogenicidade de isolados de três fungos entomopatogênicos a soldados de Atta sexdens sexdens (Linnaeus, 1758) (Hymenoptera : Formicidae)

As formigas cortadeiras atacam diversas culturas agrícolas, pastagens e os reflorestamentos, atuando sobre muitas espécies vegetais. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a patogenicidade dos fungos Beauveria bassiana (isolados AM 9 e JAB 06), Metarhizium anisopliae (isolados E 9 e AL) e Paecilomyces farinosus (isolados CG 189 e CG 195) a soldados de Atta sexdens sexdens, em condições de laboratório. Após a coleta em formigueiro isento de produtos fitossanitários, exemplares de soldados foram cuidadosamente separados em grupos de oito indivíduos e, a seguir, banhados em suspensões contendo 1,0 x 10(6), 1,0 x 10(7), 1,0 x 10(8) e 1,0 x 10(9) conídios/mL de cada isolado. em seguida, cada grupo de formigas foi transferido para unidades de câmara úmida e mantido, sem alimentação, a 27 ± 1 ºC. A mortalidade foi verificada diariamente. Os três fungos se mostraram eficientes patógenos, pois provocaram alta mortalidade, matando mais que 80% dos soldados nos quatro primeiros dias após a inoculação. Os melhores isolados foram JAB 06 e AL, na concentração de 1,0 x 10(9) con./mL. Os isolados JAB 06, AL, CG 195 apresentaram maior capacidade de esporular nos cadáveres das formigas e os tempos letais decresceram com o aumento da concentração de conídios usada.

Dinâmica populacional do psilídeo-de-concha Glycaspis brimblecombei (Moore, 1964) (Hemiptera: Psyllidae) e de seu parasitóide Psyllaephagus bliteus (Hymenoptera: Encyrtidae) em floresta de Eucalyptus camaldulensis

O psilídeo-de-concha, Glycaspis brimblecombei, é uma praga exótica específica de Eucalyptus, que causa desfolha, secamento de ponteiros e ramos, podendo levar as árvores à morte. O parasitóide Psyllaephagus bliteus é indicado como principal agente no controle biológico desta praga. Portanto, o monitoramento adequado de as ambas espécies por um método eficiente de amostragem facilitaria o manejo para uma futura tomada de decisão. Devido à falta de informações referentes ao seu comportamento em plantações extensivas de eucalipto no Brasil, este trabalho teve como objetivo estudar as populações de G. brimblecombei e de P. bliteus em florestas de Eucalyptus camaldulensis, utilizando armadilhas amarelas para determinação de sua flutuação populacional e correlacionado-as com variáveis meteorológicas (temperatura e precipitação). A determinação da flutuação populacional (53 pontos amostrais) foi realizada em talhão de 19ha com E. camaldulensis em Luíz Antônio, SP, em 10avaliações quinzenais, entre janeiro e junho de 2005. As populações de ambas as espécies apresentaram correlação inversamente proporcional em função da temperatura e não há correlação com a precipitação no período avaliado.

Avaliação da esporulação de Bionectria ochroleuca em diferentes meios de culturas

The biological control of the plants diseases, caused by fungi, is carried out using others organisms (predator, parasite or pathogen). Among the possible agents of biocontrol, a fungus has been highlighting as promising and it is known as Clonostachys rosea, asexual form of Bionectria ochroleuca. For that, it is necessary the in vitro production of spores of this fungus. In this study were tested several culture media to select those with better conidia production. The study was conducted at Plant Protection Division, in the Plant Production Department, FCA - UNESP, Botucatu campus, São Paulo state, Brazil. We used the isolated CCR64 (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)-CNPMA). The means of crops were: BDA; Oats-Agar; Mazeina-Agar; Rice-Agar; V8-5%; V8-10%; V8-20%; TJ-5 %; TJ-10, TJ-20%. The sporulation of the fungus in different culture media was estimated at 8 days after of the incubation. The data were analyzed using method of comparing averages, using the Tukey test, at 5% probability, and the data processed, using (X + 1) 0.5 transformation. All culture media tested were able to produce conidia. It was found that the best culture media for production of conidia of Bionectria ochroleuca is the TJ-5%, followed by TJ-20%, with an sporulation average of 3,5 x 106 conidia / ml.

Caracterização da Estrutura Espacial do Psilídeo-de-concha Glycaspis brimblecombei (Hemiptera: Psyllidae) e de seu Parasitóide Psyllaephagus bliteus (Hymenoptera: Encyrtidae) em Floresta de Eucalyptus camaldulensis

Os psilídeos são um grupo de pragas amplamente distribuídas, causando perdas consideráveis em sistemas agrícolas e florestais. A recente descoberta da ocorrência do psilídeo-de-concha Glycaspis brimblecombei Moore (Hemiptera: Psyllidae), no Brasil tornou-se um problema de grande importância, por ser específico de Eucalyptus. O parasitóide Psyllaephagus bliteus Riek (Hymenoptera: Encyrtidae) é indicado como principal agente no controle biológico desta praga. Portanto, para o monitoramento adequado de ambas espécies é necessário um método eficiente de amostragem. Devido a falta de informações referentes ao seu comportamento em plantações extensivas de eucalipto, realizou-se este trabalho, para verificar a distribuição espacial de G. brimblecombei e de seu parasitóide P. bliteus, através de armadilhas adesivas em floresta de E. camaldulensis. Para determinação da distribuição espacial foram utilizadas 53 armadilhas amarelas distribuídas uniformemente no talhão, formando uma grade amostral espaçadas de 50 x 36 m, à altura aproximada de 1,80 m do solo. Cada armadilha foi presa com auxílio de um arame plastificado em um fio estendido entre duas árvores em um talhão de 19 ha com E. camaldulensis em Luiz Antônio, SP. Foram realizadas dez avaliações, entre janeiro e junho de 2005. Após a coleta as armadilhas foram levadas ao laboratório para ser feita à triagem e contagem do número total de adultos de G. brimblecombei e de P. bliteus, nas duas faces das armadilhas. Concluiu-se que as populações de ambas espécies apresentaram distribuição espacial agregada, no período avaliado.

Patogenicidade de Verticillium lecanii ao pulgão-do-pinus

Avaliou-se a patogenicidade do isolado IBCB 473 de Verticillium lecanii no pulgão-do-pinus Cinara atlantica (Hemiptera, Aphididae), inseto-praga em plantios de Pinus spp. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com cinco repetições por tratamento e cada repetição constituída de uma placa de Petri (9 cm de diâmetro) contendo 10 ninfas. Foram testadas suspensões de inóculo nas concentrações de 1,0 ' 10(6); 0,5 ' 10(7); 1,0 ' 10(7); 0,5 ' 10(8); e 1,0 ' 10(8) conídios/mL, pulverizando-se 1 mL sobre as ninfas. Como tratamento-testemunha, utilizou-se água esterilizada. As placas de Petri foram mantidas em câmara climatizada a 25 ± 1 °C, 70 ± 10% de UR e fotofase de 12 horas. As avaliações foram realizadas diariamente, anotando-se a mortalidade dos indivíduos de cada tratamento. A dose mais eficiente foi de 1,0 x 10(8) conídios/mL, causando mortalidade de 86,0% após cinco dias da pulverização. Os valores de TL50 das concentrações utilizadas foram de 5,82; 5,24; 4,60; 4,34; e 3,83 dias, respectivamente.

Application technology for the entomopathogenic nematodes Heterorhabditis indica and Steinernema sp. (Rhabditida: Heterorhabditidae and Steinernematidae) to control Spodoptera frugiperda (Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) in corn

O efeito de diversas tecnologias de aplicação foi avaliado sobre a concentração, viabilidade e eficácia dos juvenis infectantes dos nematóides Heterorhabditis indica Poinar, Karunakar & David (IBCB-n5) e Steinernema sp. (IBCB-n6) no controle da lagarta-do-cartucho Spodoptera frugiperda Smith na cultura do milho. Para o controle da lagarta-do-cartucho no terceiro estádio em placas de Petri foram necessários 280 juvenis infectantes de Steinernema sp., enquanto que 400 juvenis infectantes de H. indica controlaram apenas 75% das lagartas. Podem-se pulverizar os entomopatógenos, sem que haja perda significativa na sua concentração e viabilidade, com equipamentos que forneçam carga elétrica à calda, ponta centrífuga e pontas hidráulicas. Entretanto, o emprego de pulverizadores com pontas que requerem elementos filtrantes com malha igual a 100 resultou em decréscimo na concentração de juvenis infectantes de H. indica e Steinernema sp., de 28% e 53%, respectivamente. Os tensoativos organosiliconado e etoxilados não afetaram a viabilidade dos juvenis infectantes de Steinernema sp. Nos experimentos de pulverização em plantas de milho (V6) com Steinernema sp., doses equivalentes a até 288 milhões de juvenis infectantes por hectare, diluídos em volume de calda de até 800 L ha-1 com 0,01 % do tensoativo etoxilado, ou nesse volume seguido de exposição a chuva artificial (lâmina de água de 6 mm), não foram suficientes para o controle de S. frugiperda em casa-de-vegetação.

Pressurização da calda de pulverização na viabilidade de microrganismos entomopatogênicos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Novo registro de Trichospilus diatraeae Cherian & Margabandhu, 1942 (Hymenoptera: Eulophidae), como parasitóide de Spodoptera cosmioides Walker, 1858 (Lepidoptera: Noctuidae) no Brasil

Spodoptera cosmioides (Lepidoptera: Noctuidae)é uma espécie polífaga e alimenta-se de grande número de plantas cultivadas e espontâneas. No Brasil, as culturas do abacaxi, algodoeiro, arroz, berinjela, cebola, eucalipto, pimentão e tomateiro, entre outras hortaliças, são consideradas hospedeiras da praga. Entretanto, apesar da ampla gama de hospedeiros, sua ocorrência como praga é relatada relacionada a desequilíbrios provocados pelo uso excessivo de inseticidas de amplo espectro, o que vem causando a resistência da praga a inseticidas. Devido a essa complexidade, métodos alternativos de controle têm sido propostos, por exemplo, o controle biológico através da utilização de parasitóides. Trichospilus diatraeae (Hymenptera: Eulophidae) é um parasitóide gregário pupal preferencialmente de espécies da ordem Lepidoptera. Este é o primeiro relato de T. diatraeae parasitando pupas de S. cosmioides, parasitóide que oferece novas perspectivas para os programas de controle biológico.

Composição da artropodofauna entomófoga associada a diferentes genótipos de sorgo granífero no cerrado do Sudeste do Brasil

Espécies de artrópodos entomófagos foram coletadas e identificadas nos genótipos sorgo AF-28, IAC-83/75-5-1-6, TX-2536, BR-300, IPA-201 e SAR, no Município de Selvíria, MS. Foram conduzidos três experimentos em campo, com os genótipos sendo semeados em 03/1988, 10/1988 e 02/1989, respectivamente. Para contagem dos artrópodos entomófagos, no início do florescimento foram marcadas 560 panículas por genótipo. Após esse momento, diariamente e durante 14 dias seguidos, foram coletadas 40 panículas por genótipo (10 por parcela). Nas coletas foram utilizados sacos plásticos com 10 litros de capacidade para envolver as panículas e capturar os artrópodos presentes. As panículas coletadas foram levadas para o Laboratório de Entomologia da Faculdade de Engenharia/UNESP, Campus de Ilha Solteira, SP, para separação, contagem e identificação dos artrópodos. Nas panículas provenientes da semeadura da seca coletou-se, em média, maior número de artrópodos entomófagos em relação à semeadura das águas. Dos artrópodos entomófagos coletados, as aranhas apresentaram maior número de espécies e, desses, a tecelã Alpaida veniliae (Keys.), a aranha corredora noturna Cheiracanthium inclusum (Blackwall), e a caçadora de emboscada, Misumenops pallidus (Keys.), foram as mais abundantes. O genótipo de sorgo IPA-201 comportou-se como o mais atrativo ao percevejo Orius sp. e à tesourinha Doru lineare (Eschs.), enquanto que o IAC-83/75-5-1-6 foi medianamente atrativo a D. lineare. As aranhas foram coletadas em maior número nos genótipos BR-300 e SART.

Estratégias de Produção in vitro de Bioinseticida Viral: influências do Isolado, da Cinética e do Modo de operação

Societal concerns about environmental sustainability has lead to the development of ecologically-friendly alternatives to chemical insecticides for crop protection. One such alternative is biological pest control. In particular, baculoviruses are well suited as insect biopesticides due to their narrow host specificity and relative ease of propagation. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent employed for the soybean pest, Anticarsia gemmatalis. This baculovirus biopesticide is currently produced using caterpillars, but increasing market demand for the product has encouraged the development of an in vitro manufacturing process, which can be scaled up to much higher virus productivities. In this study, three wild-type AgMNPV isolates (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 and AgMNPV-MP5) and a recombinant form (vAgEGT-LacZ) were characterised in terms of occlusion body (OB) production and infection kinetics, to enable future optimisation of the in vitro production process. These viruses were propagated using a Spodoptera frugiperda (IPLB-SF21) insect cell line grown in shaker-flask batch cultures. Among the virus isolates tested, AgMNPV-MP5 was found to be the best producer, yielding (5.3±0.85)x108 OB/mL after 8 days post infection. The characterisation of vAgEGT-LacZ propagation in suspension cell cultures has not been previously reported in the literature; hence it became the main focus for this thesis. In particular, it was carried out a study on the effect of the multiplicity of infection (MOI) on OB production. Five successive batches were performed getting a final production (8.9±1.42)x1014 occlusion bodies, considering that production is related for a bioreactor with final volume of 10m3. A low MOI associated with a fed-batch process for vAgEGT-LacZ production was found to support a 3-fold higher OB yield when compared to the default batch process (1.8x107 and 5.3x107 OB/mL, respectively). This yield is competitive with regards to the production process.