The Role of Splicing Factors and Small Nuclear RNAS in Spliceosomal Formation

Protein coding genes are comprised of protein-coding exons and non-protein-coding introns. The process of splicing involves removal of the introns and joining of the exons to form a mature messenger RNA, which subsequently undergoes translation into polypeptide. The spliceosome is a large, RNA/protein assembly of five small nuclear RNAs as well as over 300 proteins, which catalyzes intron removal and exon ligation. The selection of specific exons for inclusion in the mature messenger RNA is spatio-temporally regulated and results in production of an enormous diversity of polypeptides from a single gene locus. This phenomenon, known as alternative splicing, is regulated, in part, by protein splicing factors, which target the spliceosome to exon/intron boundaries. The first part of my dissertation (Chapters II and III) focuses on the discovery and characterization of the 45 kilodalton FK506 binding protein (FKBP45), which I discovered in the silk moth, Bombyx mori, as a U1 small nuclear RNA binding protein. This protein family binds the immunosuppressants FK506 and rapamycin and contains peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity, which converts polypeptides from cis to trans about a proline residue. This is the first time that an FKBP has been identified in the spliceosome. The second section of my dissertation (Chapters IV, V, VI and VII) is an investigation of the potential role of small nuclear RNA sequence variants in the control of splicing. I identified 46 copies of small nuclear RNAs in the 6X whole genome shotgun of the Bombyx mori p50T strain. These variants may play a role in differential binding of specific proteins that mediate alternative splicing. Along these lines, further investigation of U2 snRNA sequence variants in Bombyx mori demonstrated that some U2 snRNAs preferentially assemble into high molecular weight spliceosomal complexes over others. Expression of snRNA variants may represent another mechanism by which the cell is able to fine tune the splicing process.

Characterisation of an ubiquitin binding CUE domain in presenilin-1

The presenilins are the catalytic component of the gamma-secretase protease complex, involved in the regulated intramembrane proteolysis of numerous type-1 transmembrane proteins, including Amyloid precursor protein (APP) and Notch. In addition to their role in the γ-secretase complex the presenilins are involved in a number of γ-secretase independent functions such as calcium homeostasis, apoptosis, inflammation and protein trafficking. Presenilin function is known to be regulated through posttranslational modifications like endoproteolysis, phosphorylation and ubiquitination. Using a bioinformatics and protein sequence analysis approach this lab has identified a putative ubiquitin binding CUE domain in the presenilins. The aim of this project was to characterise the function of the presenilin CUE domains. Firstly, the presenilins are shown to contain a functional ubiquitin-binding CUE domain that preferentially binds to K63-linked polyubiquitin chains. The PS1 CUE domain is shown to be dispensable for PS1 endoproteolysis and γ-secretase mediated cleavage of APP, Notch and IL-1R1. This suggests the PS1 CUE domain is involved in a γ-secretase independent PS1 function. Our hypothesis is that the PS1 CUE domain is involved in regulating PS1’s intermolecular protein-protein interactions or intramolecular PS1:PS1 interactions. Here the PS1 CUE domain is shown to be dispensable for the interaction of PS1 and the K63-linked polyubiquitinated PS1 interacting proteins P75NTR, IL-1R1, TRAF6, TRAF2 and RIP1. To further investigate PS1 CUE domain function a mass spectrometry proteomics based approach is used to identify PS1 CUE domain interacting proteins. This proteomics approach demonstrated that the PS1 CUE domain is not required for PS1 dimerization. Instead a number of proteins thatinteract with the PS1 CUE domain are identified as well as proteins whose interaction with PS1 is downregulated by the presence of the PS1 CUE domain. Bioinformatic analysis of these proteins suggests possible roles for the PS1 CUE domain in regulating cell signalling, ubiquitination or cellular trafficking.

Étude des mécanismes d’extraction lipidique par le peptide mélittine et la protéine BSP1

Les peptides et protéines extracteurs de lipides (PEL) se lient aux membranes lipidiques puis en extraient des lipides en formant de plus petits auto-assemblages, un phénomène qui peut aller jusqu'à la fragmentation des membranes. Dans la nature, cette extraction se produit sur une gamme de cellules et entraîne des conséquences variées, comme la modification de la composition de la membrane et la mort de la cellule. Cette thèse se penche sur l’extraction lipidique, ou fragmentation, induite par le peptide mélittine et la protéine Binder-of-SPerm 1 (BSP1) sur des membranes lipidiques modèles. Pour ce faire, des liposomes de différentes compositions sont préparés et incubés avec la mélittine ou la BSP1. L'association aux membranes est déterminée par la fluorescence intrinsèque des PEL, tandis que l'extraction est caractérisée par une plateforme analytique combinant des tests colorimétriques et des analyses en chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse (LCMS). La mélittine fait partie des peptides antimicrobiens cationiques, un groupe de PEL très répandu chez les organismes vivants. Ces peptides sont intéressants du point du vue médical étant donné leur mode d’action qui vise directement les lipides des membranes. Plusieurs de ceux-ci agissent sur les membranes des bactéries selon le mécanisme dit « en tapis », par lequel ils s’adsorbent à leur surface, forment des pores et ultimement causent leur fragmentation. Dans cette thèse, la mélittine est utilisée comme peptide modèle afin d’étudier le mécanisme par lequel les peptides antimicrobiens cationiques fragmentent les membranes. Les résultats montrent que la fragmentation des membranes de phosphatidylcholines (PC) est réduite par une déméthylation graduelle de leur groupement ammonium. L'analyse du matériel fragmenté révèle que les PC sont préférentiellement extraites des membranes, dû à un enrichissement local en PC autour de la mélittine à l'intérieur de la membrane. De plus, un analogue de la mélittine, dont la majorité des résidus cationiques sont neutralisés, est utilisé pour évaluer le rôle du caractère cationique de la mélittine native. La neutralisation augmente l'affinité du peptide pour les membranes neutres et anioniques, réduit la fragmentation des membranes neutres et augmente la fragmentation des membranes anioniques. Malgré les interactions électrostatiques entre le peptide cationique et les lipides anioniques, aucune spécificité lipidique n'est observée dans l'extraction. La BSP1 est la protéine la plus abondante du liquide séminal bovin et constitue un autre exemple de PEL naturel important. Elle se mélange aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et extrait des lipides de leur membrane, notamment le cholestérol et les phosphatidylcholines. Cette étape cruciale modifie la composition lipidique de la membrane du spermatozoïde, ce qui faciliterait par la suite la fécondation de l’ovule. Cependant, le contact prolongé de la protéine avec les spermatozoïdes endommagerait la semence. Cette thèse cherche donc à approfondir notre compréhension de ce délicat phénomène en étudiant le mécanisme moléculaire par lequel la protéine fragmente les membranes lipidiques. Les résultats des présents travaux permettent de proposer un mécanisme d’extraction lipidique en 3 étapes : 1) L'association à l’interface des membranes; 2) La relocalisation de l’interface vers le cœur lipidique; 3) La fragmentation des membranes. La BSP1 se lie directement à deux PC à l'interface; une quantité suffisante de PC dans les membranes est nécessaire pour permettre l'association et la fragmentation. Cette liaison spécifique ne mène généralement pas à une extraction lipidique sélective. L'impact des insaturations des chaînes lipidiques, de la présence de lysophosphatidylcholines, de phosphatidyléthanolamine, de cholestérol et de lipides anioniques est également évalué. Les présentes observations soulignent la complexe relation entre l'affinité d'un PEL pour une membrane et le niveau de fragmentation qu'il induit. L'importance de la relocalisation des PEL de l'interface vers le cœur hydrophobe des membranes pour permettre leur fragmentation est réitérée. Cette fragmentation semble s'accompagner d'une extraction lipidique préférentielle seulement lorsqu'une séparation de phase est induite au niveau de la membrane, nonobstant les interactions spécifiques PEL-lipide. Les prévalences des structures amphiphiles chez certains PEL, ainsi que de la fragmentation en auto-assemblages discoïdaux sont discutées. Finalement, le rôle des interactions électrostatiques entre les peptides antimicrobiens cationiques et les membranes bactériennes anioniques est nuancé : les résidus chargés diminueraient l'association des peptides aux membranes neutres suite à l'augmentation de leur énergie de solvatation.

Hybrid Diphenylalkyne-Dipeptide Oligomers Induce Multistrand β-Sheet Formation

Functionalized diphenylalkynes provide a template for the presentation of protein-like surfaces composed of multistrand β-sheets. The conformational properties of three-, four-, and seven-stranded systems have been investigated in the solid- and solution-state. This class of molecule may be suitable for the mediation of therapeutically relevant protein-protein interactions.

β-Strand mimetic foldamers rigidified through dipolar repulsion

Many therapeutically relevant protein-protein interactions contain hot-spot regions on secondary structural elements, which contribute disproportionately to binding enthalpy. Mimicry of such α-helical regions has met with considerable success, however the analogous approach for the β-strand has received less attention. Presented herein is a foldamer for strand mimicry in which dipolar repulsion is a central determinant of conformation. Computation as well as solution- and solid-phase data are consistent with an ensemble weighted almost exclusively in favor of the desired conformation.

Low-dose salinomycin induces anti-leukemic responses in AML and MLL

Development of anti-cancer drugs towards clinical application is costly and inefficient. Large screens of drugs, efficacious for non-cancer disease, are currently being used to identify candidates for repurposing based on their anti-cancer properties. Here, we show that low-dose salinomycin, a coccidiostat ionophore previously identified in a breast cancer screen, has anti-leukemic efficacy. AML and MLLr cell lines, primary cells and patient samples were sensitive to submicromolar salinomycin. Most strikingly, colony formation of normal hematopoietic cells was unaffected by salinomycin, demonstrating a lack of hemotoxicity at the effective concentrations. Furthermore, salinomycin treatment of primary cells resulted in loss of leukemia repopulation ability following transplantation, as demonstrated by extended recipient survival compared to controls. Bioinformatic analysis of a 17-gene signature identified and validated in primary MLLr cells, uncovered immunomodulatory pathways, hubs and protein interactions as potential transducers of low dose salinomycin treatment. Additionally, increased protein expression of p62/Sqstm1, encoded for by one of the 17 signature genes, demonstrates a role for salinomycin in aggresome/vesicle formation indicative of an autophagic response.
Together, the data support the efficacy of salinomycin as an anti-leukemic at non-hemotoxic concentrations. Further investigation alone or in combination with other therapies is warranted for future clinical trial.

LAP1 interactome and its functional features throughout spermatogenesis

The lamina-associated polypeptide 1 (LAP1) is a type II transmembrane protein of the inner nuclear membrane encoded by the human gene TOR1AIP1. LAP1 is involved in maintaining the nuclear envelope structure and appears be involved in the positioning of lamins and chromatin. In the nuclear envelope, LAP1 is suggested to exist as a complex with A-type and B-type lamins, torsins and emerin. The presence of such complexes suggests that LAP1 may cooperate functionally with these proteins in tissues where they play a critical role. Therefore, the identification of LAP1 binding partners and the signalling pathways where LAP1 participates, is crucial for a better understanding of LAP1 functions. The work described in this thesis addresses novel human LAP1 associated proteins found through bioinformatic tools. Public databases allowed for the discovery of the LAP1 interactome, which was manually curated, identifying several functionally relevant proteins. Subsequently, the integration of multiple bioinformatic tools established novel functions to LAP1 such as DNA damage response and telomere association. In conjunction, bioinformatic results also reinforced the association of LAP1 with mitosis, and the already identified role of LAP1 in nuclear morphology. Interestingly, this association of LAP1 with the regulation of the nuclear envelope structure and mitosis progression, shares functional elements with spermatogenesis. Therefore, this work additionally described the localization of LAP1 and some of its interactors throughout the spermatogenic cycle, in mouse and human testis. The results established that the activity of LAP1 during the mouse spermatogenic cycle is most evident from stage VIII until the end of spermiogenesis, which is characteristic of manchette development. Concomitantly, some LAP1 interactors studied in this work share a similar localization, namely, PP1γ2, Lamin B1 and Lamin A/C. The results obtained from the study of LAP1 throughout different periods of the male reproductive system attributed potential new biological functions to LAP1. Thereby, this work can be the foundation of future studies regarding LAP1 and the regulation of multiple cellular processes and disease conditions.

Étude des mécanismes d’extraction lipidique par le peptide mélittine et la protéine BSP1

Les peptides et protéines extracteurs de lipides (PEL) se lient aux membranes lipidiques puis en extraient des lipides en formant de plus petits auto-assemblages, un phénomène qui peut aller jusqu'à la fragmentation des membranes. Dans la nature, cette extraction se produit sur une gamme de cellules et entraîne des conséquences variées, comme la modification de la composition de la membrane et la mort de la cellule. Cette thèse se penche sur l’extraction lipidique, ou fragmentation, induite par le peptide mélittine et la protéine Binder-of-SPerm 1 (BSP1) sur des membranes lipidiques modèles. Pour ce faire, des liposomes de différentes compositions sont préparés et incubés avec la mélittine ou la BSP1. L'association aux membranes est déterminée par la fluorescence intrinsèque des PEL, tandis que l'extraction est caractérisée par une plateforme analytique combinant des tests colorimétriques et des analyses en chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse (LCMS). La mélittine fait partie des peptides antimicrobiens cationiques, un groupe de PEL très répandu chez les organismes vivants. Ces peptides sont intéressants du point du vue médical étant donné leur mode d’action qui vise directement les lipides des membranes. Plusieurs de ceux-ci agissent sur les membranes des bactéries selon le mécanisme dit « en tapis », par lequel ils s’adsorbent à leur surface, forment des pores et ultimement causent leur fragmentation. Dans cette thèse, la mélittine est utilisée comme peptide modèle afin d’étudier le mécanisme par lequel les peptides antimicrobiens cationiques fragmentent les membranes. Les résultats montrent que la fragmentation des membranes de phosphatidylcholines (PC) est réduite par une déméthylation graduelle de leur groupement ammonium. L'analyse du matériel fragmenté révèle que les PC sont préférentiellement extraites des membranes, dû à un enrichissement local en PC autour de la mélittine à l'intérieur de la membrane. De plus, un analogue de la mélittine, dont la majorité des résidus cationiques sont neutralisés, est utilisé pour évaluer le rôle du caractère cationique de la mélittine native. La neutralisation augmente l'affinité du peptide pour les membranes neutres et anioniques, réduit la fragmentation des membranes neutres et augmente la fragmentation des membranes anioniques. Malgré les interactions électrostatiques entre le peptide cationique et les lipides anioniques, aucune spécificité lipidique n'est observée dans l'extraction. La BSP1 est la protéine la plus abondante du liquide séminal bovin et constitue un autre exemple de PEL naturel important. Elle se mélange aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et extrait des lipides de leur membrane, notamment le cholestérol et les phosphatidylcholines. Cette étape cruciale modifie la composition lipidique de la membrane du spermatozoïde, ce qui faciliterait par la suite la fécondation de l’ovule. Cependant, le contact prolongé de la protéine avec les spermatozoïdes endommagerait la semence. Cette thèse cherche donc à approfondir notre compréhension de ce délicat phénomène en étudiant le mécanisme moléculaire par lequel la protéine fragmente les membranes lipidiques. Les résultats des présents travaux permettent de proposer un mécanisme d’extraction lipidique en 3 étapes : 1) L'association à l’interface des membranes; 2) La relocalisation de l’interface vers le cœur lipidique; 3) La fragmentation des membranes. La BSP1 se lie directement à deux PC à l'interface; une quantité suffisante de PC dans les membranes est nécessaire pour permettre l'association et la fragmentation. Cette liaison spécifique ne mène généralement pas à une extraction lipidique sélective. L'impact des insaturations des chaînes lipidiques, de la présence de lysophosphatidylcholines, de phosphatidyléthanolamine, de cholestérol et de lipides anioniques est également évalué. Les présentes observations soulignent la complexe relation entre l'affinité d'un PEL pour une membrane et le niveau de fragmentation qu'il induit. L'importance de la relocalisation des PEL de l'interface vers le cœur hydrophobe des membranes pour permettre leur fragmentation est réitérée. Cette fragmentation semble s'accompagner d'une extraction lipidique préférentielle seulement lorsqu'une séparation de phase est induite au niveau de la membrane, nonobstant les interactions spécifiques PEL-lipide. Les prévalences des structures amphiphiles chez certains PEL, ainsi que de la fragmentation en auto-assemblages discoïdaux sont discutées. Finalement, le rôle des interactions électrostatiques entre les peptides antimicrobiens cationiques et les membranes bactériennes anioniques est nuancé : les résidus chargés diminueraient l'association des peptides aux membranes neutres suite à l'augmentation de leur énergie de solvatation.

A New Multi-Objective Approach for Molecular Docking Based on RMSD and Binding Energy

Ligand-protein docking is an optimization problem based on predicting the position of a ligand with the lowest binding energy in the active site of the receptor. Molecular docking problems are traditionally tackled with single-objective, as well as with multi-objective approaches, to minimize the binding energy. In this paper, we propose a novel multi-objective formulation that considers: the Root Mean Square Deviation (RMSD) difference in the coordinates of ligands and the binding (intermolecular) energy, as two objectives to evaluate the quality of the ligand-protein interactions. To determine the kind of Pareto front approximations that can be obtained, we have selected a set of representative multi-objective algorithms such as NSGA-II, SMPSO, GDE3, and MOEA/D. Their performances have been assessed by applying two main quality indicators intended to measure convergence and diversity of the fronts. In addition, a comparison with LGA, a reference single-objective evolutionary algorithm for molecular docking (AutoDock) is carried out. In general, SMPSO shows the best overall results in terms of energy and RMSD (value lower than 2A for successful docking results). This new multi-objective approach shows an improvement over the ligand-protein docking predictions that could be promising in in silico docking studies to select new anticancer compounds for therapeutic targets that are multidrug resistant.

Proteomic profile of acute myeloid leukaemia: A review update

Proteome analysis is a complex and dynamic process that encompasses several analytical platforms that include protein sequencing, structural or expression proteomics, protein modification, sub-cellular protein localization, protein-protein interaction and biological functional proteomics. In fact, expression proteomics is extensively applied in a majority of biomarker detection studies because it provides a detailed overview of differentially expressed proteins in cellular pathways and disease processes. Proteomics are also effective and dynamic in protein-protein interactions and cross-talks between interacting molecules of the cell. Proteomics has evolved into a crucial tool used to investigate the biochemical changes that possibly lead to development of cancer biomarkers. This review draws attention to the progress and advancements in cancer proteomics technology with the aim of simplifying the understanding of the mechanisms underlying the disease and to contribute to detection of biomarkers in addition to the development of novel treatments. Given that proteome is a dynamic entity of cellular functions in health and disease, it is capable of reflecting the immediate environmental state of cells and tissues as shown in this review. The review shows the possibility of elucidating the pathophysiology of acute myeloid leukaemia (AML) through proteome expressions, thus confirming the viability of proteome analysis in profiling AML.

Pathway analysis for identification of potential biomarkers in severe cutaneous drug hypersensitivity reactions

Purpose: To construct a cluster model or a gene signature for Stevens-Johnson syndrome (SJS) using pathways analysis in order to identify some potential biomarkers that may be used for early detection of SJS and epidermal necrolysis (TEN) manifestations. Methods: Gene expression profiles of GSE12829 were downloaded from Gene Expression Omnibus database. A total of 193 differentially expressed genes (DEGs) were obtained. We applied these genes to geneMANIA database, to remove ambiguous and duplicated genes, and after that, characterized the gene expression profiles using geneMANIA, DAVID, REACTOME, STRING and GENECODIS which are online software and databases. Results: Out of 193 genes, only 91 were used (after removing the ambiguous and duplicated genes) for topological analysis. It was found by geneMANIA database search that majority of these genes were coexpressed yielding 84.63 % co-expression. It was found that ten genes were in Physical interactions comprising almost 14.33 %. There were < 1 % pathway and genetic interactions with values of 0.97 and 0.06 %, respectively. Final analyses revealed that there are two clusters of gene interactions and 13 genes were shown to be in evident relationship of interaction with regards to hypersensitivity. Conclusion: Analysis of differential gene expressions by topological and database approaches in the current study reveals 2 gene network clusters. These genes are CD3G, CD3E, CD3D, TK1, TOP2A, CDK1, CDKN3, CCNB1, and CCNF. There are 9 key protein interactions in hypersensitivity reactions and may serve as biomarkers for SJS and TEN. Pathways related gene clusters has been identified and a genetic model to predict SJS and TEN early incidence using these biomarker genes has been developed.

Generation and screening of natural product-like compounds for antibiotic discovery

Avec l’apparition de plus en plus de souches de bactérie résistante aux antibiotiques, le développement de nouveaux antibiotiques est devenu une important problématique pour les agences de santé. C’est pour cela que la création de nouvelles plateformes pour accélérer la découverte de médicaments est devenu un besoin urgent. Dans les dernières décennies, la recherche était principalement orientée sur la modification de molécules préexistantes, la méta-analyse d’organismes produisant des molécules activent et l’analyse de librairies moléculaires pour trouver des molécules synthétiques activent, ce qui s’est avéré relativement inefficace. Notre but était donc de développer de nouvelles molécules avec des effets thérapeutiques de façon plus efficace à une fraction du prix et du temps comparé à ce qui se fait actuellement. Comme structure de base, nous avons utilisé des métabolites secondaires qui pouvaient altérer le fonctionnement des protéines ou l’interaction entre deux protéines. Pour générer ces molécules, j’ai concentré mes efforts sur les terpènes, une classe de métabolites secondaires qui possède un large éventail d’activités biologiques incluant des activités antibactériennes. Nous avons développé un système de chromosome artificiel de levure (YAC) qui permet à la fois l’assemblage directionnel et combinatoire de gènes qui permet la création de voies de biosynthèse artificielles. Comme preuve de concept, j’ai développé des YACs qui contiennent les gènes pour l’expression des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la -carotène et de l’albaflavenone et produit ces molécules avec un haut rendement. Finalement, Des YACs produits à partir de librairies de gènes ont permis de créer une grande diversité de molécules.

DESIGN, SYNTHESIS AND APPLICATIONS OF FLUORESCENT AND ELECTROCHEMICAL PROBES

“Seeing is believing” the proverb well suits for fluorescent imaging probes. Since we can selectively and sensitively visualize small biomolecules, organelles such as lysosomes, neutral molecules, metal ions, anions through cellular imaging, fluorescent probes can help shed light on the physiological and pathophysiological path ways. Since these biomolecules are produced in low concentrations in the biochemical pathways, general analytical techniques either fail to detect or are not sensitive enough to differentiate the relative concentrations. During my Ph.D. study, I exploited synthetic organic techniques to design and synthesize fluorescent probes with desirable properties such as high water solubility, high sensitivity and with varying fluorescent quantum yields. I synthesized a highly water soluble BOIDPY-based turn-on fluorescent probe for endogenous nitric oxide. I also synthesized a series of cell membrane permeable near infrared (NIR) pH activatable fluorescent probes for lysosomal pH sensing. Fluorescent dyes are molecular tools for designing fluorescent bio imaging probes. This prompted me to design and synthesize a hybrid fluorescent dye with a functionalizable chlorine atom and tested the chlorine re-activity for fluorescent probe design. Carbohydrate and protein interactions are key for many biological processes, such as viral and bacterial infections, cell recognition and adhesion, and immune response. Among several analytical techniques aimed to study these interactions, electrochemical bio sensing is more efficient due to its low cost, ease of operation, and possibility for miniaturization. During my Ph.D., I synthesized mannose bearing aniline molecule which is successfully tested as electrochemical bio sensor. A Ferrocene-mannose conjugate with an anchoring group is synthesized, which can be used as a potential electrochemical biosensor.

Generation and screening of natural product-like compounds for antibiotic discovery

Avec l’apparition de plus en plus de souches de bactérie résistante aux antibiotiques, le développement de nouveaux antibiotiques est devenu une important problématique pour les agences de santé. C’est pour cela que la création de nouvelles plateformes pour accélérer la découverte de médicaments est devenu un besoin urgent. Dans les dernières décennies, la recherche était principalement orientée sur la modification de molécules préexistantes, la méta-analyse d’organismes produisant des molécules activent et l’analyse de librairies moléculaires pour trouver des molécules synthétiques activent, ce qui s’est avéré relativement inefficace. Notre but était donc de développer de nouvelles molécules avec des effets thérapeutiques de façon plus efficace à une fraction du prix et du temps comparé à ce qui se fait actuellement. Comme structure de base, nous avons utilisé des métabolites secondaires qui pouvaient altérer le fonctionnement des protéines ou l’interaction entre deux protéines. Pour générer ces molécules, j’ai concentré mes efforts sur les terpènes, une classe de métabolites secondaires qui possède un large éventail d’activités biologiques incluant des activités antibactériennes. Nous avons développé un système de chromosome artificiel de levure (YAC) qui permet à la fois l’assemblage directionnel et combinatoire de gènes qui permet la création de voies de biosynthèse artificielles. Comme preuve de concept, j’ai développé des YACs qui contiennent les gènes pour l’expression des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la -carotène et de l’albaflavenone et produit ces molécules avec un haut rendement. Finalement, Des YACs produits à partir de librairies de gènes ont permis de créer une grande diversité de molécules.

Development of advanced analytical methodologies for Alzheimer’s disease drug discovery

Advanced analytical methodologies were developed to characterize new potential active MTDLs on isolated targets involved in the first stages of Alzheimer’s disease (AD). In addition, the methods investigated drug-protein bindings and evaluated protein-protein interactions involved in the neurodegeneration. A high-throughput luminescent assay allowed the study of the first in class GSK-3β/ HDAC dual inhibitors towards the enzyme GSK-3β. The method was able to identify an innovative disease-modifying agent with an activity in the micromolar range both on GSK-3β, HDAC1 and HDAC6. Then, the same assay reliably and quickly selected true positive hit compounds among natural Amaryllidaceae alkaloids tested against GSK-3β. Hence, given the central role of the amyloid pathway in the multifactorial nature of AD, a multi-methodological approach based on mass spectrometry (MS), circular dichroism spectroscopy (CD) and ThT assay was applied to characterize the potential interaction of CO releasing molecules (CORMs) with Aβ1-42 peptide. The comprehensive method provided reliable information on the different steps of the fibrillation process and regarding CORMs mechanism of action. Therefore, the optimal CORM-3/Aβ1−42 ratio in terms of inhibitory effect was identified by mass spectrometry. CD analysis confirmed the stabilizing effect of CORM-3 on the Aβ1−42 peptide soluble form and the ThT Fluorescent Analysis ensured that the entire fibrillation process was delayed. Then the amyloid aggregation process was studied in view of a possible correlation with AD lipid brain alterations. Therefore, SH-SY5Y cells were treated with increasing concentration of Aß1-42 at different times and the samples were analysed by a RP-UHPLC system coupled with a high-resolution quadrupole TOF mass spectrometer in comprehensive data-independent SWATH acquisition mode. Each lipid class profiling in SH-SY5Y cells treated with Aß1-42 was compared to the one obtained from the untreated. The approach underlined some peculiar lipid alterations, suitable as biomarkers, that might be correlated to Aß1-42 different aggregation species.