Impacto de andrógenos sobre a proliferação e atividade de fibroblastos e células epiteliais em cultura celular

Pós-graduação em Odontologia - FOAR

Effects of antihypertensive drugs in the differentiation and activation of human bone cells

O osso é um tecido metabolicamente ativo e a sua remodelação é importante para regular e manter a massa óssea. Esse processo envolve a reabsorção do material ósseo por ação dos osteoclastos e a síntese de novo material ósseo mediado pelos osteoblastos. Vários estudos têm sugerido que a pressão arterial elevada está associada a alterações no metabolismo do cálcio, o que leva ao aumento da perda de cálcio e da remoção de cálcio do osso. Embora as alterações no metabolismo ósseo sejam um efeito adverso associado a alguns fármacos antihipertensores, o conhecimento em relação a este efeito terapêutico ligado com os bloqueadores de canais de cálcio é ainda muito escasso. Uma vez que os possíveis efeitos no osso podem ser atribuídos à ação antihipertensiva dessas moléculas, ou através de um efeito direto nas atividades metabólicas ósseas, torna-se necessário esclarecer este assunto. Devido ao facto de que as alterações no metabolismo ósseo são um efeito adverso associado a alguns fármacos antihipertensores, o objetivo deste trabalho é avaliar o efeito que os bloqueadores dos canais de cálcio exercem sobre as células ósseas humanas, nomeadamente osteoclastos, osteoblastos e co-culturas de ambos os tipos celulares. Verificou-se que os efeitos dos fármacos antihipertensores variaram consoante o fármaco testado e o sistema de cultura usado. Alguns fármacos revelaram a capacidade de estimular a osteoclastogénese e a osteoblastogénese em concentrações baixas. Independentemente da identidade do fármaco, concentrações elevadas revelaram ser prejudiciais para a resposta das células ósseas. Os mecanismos intracelulares através dos quais os efeitos foram exercidos foram igualmente afetados de forma diferencial pelos diferentes fármacos. Em resumo, este trabalho demonstrou que os bloqueadores dos canais de cálcio utilizados possuem a capacidade de afetar direta- e indiretamente a resposta de células ósseas humanas, cultivadas isoladamente ou co-cultivadas. Este tipo de informação é crucial para compreender e prevenir os potenciais efeitos destes fármacos no tecido ósseo, e também para adequar e eventualmente melhorar a terapêutica antihipertensora de cada paciente.

Os efeitos do aumento das concentrações de dióxido de carbono e da turbulência na diatomácea, Chaetoceros sp.

Dissertação de Mestrado em Gestão e Conservação da Natureza.

A influência da idade nos parâmetros metabólicos na marcha com uma e duas bengalas

Introdução: A marcha implica o controlo do equilíbrio. Usando bengalas é aumentada a base de sustentação e reduzida a carga nos membros inferiores. No entanto, estão associadas ao aumento dos gastos metabólicos. Objetivo: Analisar a influência da idade nos parâmetros metabólicos na marcha com uma e duas bengalas, 3 pontos e 3 pontos modificada. Métodos: Estudo analítico transversal. Amostra: 11 jovens e 10 com idade superior a 60 anos, voluntários. Realizaram-se cinco recolhas de 10 minutos, medindo, através do aparelho “Cosmed K4b2”: consumo de oxigénio (VO2), dióxido de carbono expirado (VCO2) e quociente respiratório (R - substrato utilizado). Resultados: O CE foi significativamente inferior nos jovens relativamente ao “grupo de maiores de 60 anos” na 1BN (U=14.0 p=0.003), 2BN (U=10.0 p=0.001) e 2BM (U=18.0 p=0.008). No “grupo de maiores de 60 anos” o CE foi significativamente inferior, no sexo feminino em 1BM (U=15.0 p=0.008). A marcha 2BM apresenta CE e VCO2 significativamente mais elevado que a MN no “grupo de maiores de 60 anos”. No VCO2 não se observaram diferenças significativas entre grupos (p>0.05). No “grupo de mais de 60 anos”, na marcha 1BM (U=16.0 p=0.016), o VCO2 é significativamente superior no sexo masculino. O R apresenta-se signitivamente superior no grupo dos jovens em todas as marchas 1BN (U=0.00 p<0.05), 1BM (U=2.00 p<0.05), 2BN (U=2.00 p<0.05) e 2BM (U=0.00 p<0.05). Conclusão: A idade infuencia o CE na marcha com uma ou duas bengalas seja qual o tipo de marcha, consumindo os jovens menos O2 que o “grupo de maiores de 60 anos” e o tipo de substrato utilizado, tendo sido as proteinas o substrato mais utilizado nos jovens enquanto que nos maiores de 60 anos o substrato mais utilizado foi os lípidos.

Técnicas de eficiência energética em redes móveis usando o tráfego como referência

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia de Electrónica e Telecomunicações

“Papel dos recetores purinérgicos no crescimento e temodelação do tecido cavernoso”

A adenosina é um nucleósido ubíquo envolvido na regulação de controlo do tónus vascular do tecido cavernoso, desempenhando um papel importante na fisiopatologia da Disfunção Erétil (DE) resistente aos fármacos relaxantes musculares clássicos. Apesar da importância comprovada dos recetores da adenosina na fisiopatologia da DE no homem, pouca informação é conhecida no que diz respeito à expressão e localização dos recetores purinérgicos no Tecido Cavernoso de Ratazana (TCR). Neste trabalho avaliou-se o fenótipo dos recetores purinérgicos responsáveis pela regulação do tónus do tecido erétil de ratazana por imunofluorescência indireta aplicada à microscopia confocal em co-culturas de células endoteliais e musculares lisas do TCR. Para além da caracterização imunofenotípica, desenvolveu-se uma técnica que permite diferenciar funcionalmente em tempo real (por microscopia confocal funcional) células musculares lisas e células endoteliais isoladas de TCR em co-cultura marcadas com a sonda fluorescente Fluo-4NW. Esta técnica permite distinguir cada um dos subtipos celulares mediante o padrão e a magnitude das oscilações dos níveis intracelulares de Ca2+ ([Ca2+]i) em resposta ao ATP (agonista P2) e à fenilefrina (PE, agonista α-adrenérgico). Nas células musculares lisas, observou-se uma resposta mais acentuada ao agonista α-adrenérgico, PE, e uma resposta menos significativa ao ATP. O contrário foi observado relativamente às células endoteliais. A incubação das células musculares lisas e endoteliais com ATP (300 μM) causou um aumento dos níveis de [Ca2+]i. O efeito do ATP (300 μM) parece envolver a ativação de recetores dos subtipos P2X1 e P2X3 sensíveis ao bloqueio com NF023 (3μM) e A317491 (100 nM), respetivamente. Já o aumento dos níveis [Ca2+]i produzido pelo ADP (300 μM) parece envolver a ativação de recetores P2Y1, P2Y12 e P2Y13 mediante o antagonismo produzido pelos antagonistas MRS 2179 (0,3μM), AR-C66096 (0,1 μM) e MRS 2211 (10μM), respetivamente. Os dois tipos celulares expressam imunorreatividade contra recetores A2A, A2B, P2X1, P2X3, P2Y1, P2Y12 e P2Y13.

Characterization of the effects of antiepileptic drugs on bone metabolism: in vitro studies with human osteoblastic and osteoclastic cells

Bone is constantly being molded and shaped by the action of osteoclasts and osteoblasts. A proper equilibrium between both cell types metabolic activities is required to ensure an adequate skeletal tissue structure, and it involves resorption of old bone and formation of new bone tissue. It is reported that treatment with antiepileptic drugs (AEDs) can elicit alterations in skeletal structure, in particular in bone mineral density. Nevertheless, the knowledge regarding the effects of AEDs on bone cells are still scarce. In this context, the aim of this study was to investigate the effects of five different AEDs on human osteoclastic, osteoblastic and co-cultured cells. Osteoclastic cell cultures were established from precursor cells isolated from human peripheral blood and were characterized for tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity, number of TRAP+ multinucleated cells, presence of cells with actin rings and expressing vitronectin and calcitonin receptors and apoptosis rate. Also, the involvement of several signaling pathways on the cellular response was addressed. Osteoblastic cell cultures were obtained from femur heads of patients (25-45 years old) undergoing orthopaedic surgery procedures and were then studied for cellular proliferation/viability, ALP activity, histochemical staining of ALP and apoptosis rate. Also the expression of osteoblast-related genes and the involvement of some osteoblastogenesis-related signalling pathways on cellular response were addressed. For co-cultured cells, osteoblastic cells were firstly seeded and cultured. After that, PBMC were added to the osteoblastic cells and co-cultures were evaluated using the same osteoclast and osteoblast parameters mentioned above for the corresponding isolated cell. Cell-cultures were maintained in the absence (control) or in the presence of different AEDs (carbamazepine, gabapentin, lamotrigine, topiramate and valproic acid). All the tested drugs were able to affect osteoclastic and osteoblastic cells development, although with different profiles on their osteoclastogenic and osteoblastogenic modulation properties. Globally, the tendency was to inhibit the process. Furthermore, the signaling pathways involved in the process also seemed to be differently affected by the AEDs, suggesting that the different drugs may affect osteoclastogenesis and/or osteoblastogenesis through different mechanisms. In conclusion, the present study showed that the different AEDs had the ability to directly and indirectly modulate bone cells differentiation, shedding new light towards a better understanding of how these drugs can affect bone tissue.

SureThin: fixador de eleição em citologia de impressão ocular

A citologia de impressão da superfície ocular é uma técnica pouco invasiva que permite a análise de células da conjuntiva e da córnea, sendo uma alternativa aos esfregaços e punções. Desta forma, é indispensável garantir uma fase analítica eficiente. Na revisão bibliográfica encontram-se diversos agentes fixadores para este tipo de material, não sendo explícito o método de fixação mais eficaz. A fixação visa preservar os constituintes celulares quimicamente e estruturalmente, numa situação idêntica ao in vivo, estado este que é fundamental para a realização da técnica e consequente obtenção de um diagnóstico final correto. Objetivo do estudo - O objetivo deste estudo foi identificar o melhor fixador para amostras de citologia de impressão ocular – SureThin, PreservCyt, etanol a 95% e uma mistura constituída por formaldeído a 37%, ácido acético glacial e etanol a 70% (FAA 70%).

Caracterização do papel do gene bola: consequências na motilidade bacteriana e formação de biofilmes

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica

Thomsen-Friedenreich antigens in bladder cancer: evaluation of their prognostic value

RESUMO: Introdução. O cancro de bexiga é uma patologia comum que representa o 6° e o 5° cancro mais incidente em Portugal e na Itália, respetivamente. Em mais de metade dos casos ocorre reincidência durante o primeiro ano, requerendo acompanhamento clínico ao longo da vida. A instilação intravesical de Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (uma estirpe atenuada do Mycobacterium bovis) representa uma imunoterapia eficaz no combate ao cancro de bexiga, no entanto, muitos aspetos da interação de BCG com as células tumorais bem como com as células do sistema imunitário permanecem por desvendar. As células tumorais de bexiga expressam frequentemente as formas sialiladas dos antigénios de Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). Contudo ainda se desconhece o significado da sua expressão na malignidade tumoral e se afeta a eficácia da terapêutica BCG. Objetivo do estudo. Investigar o papel dos antigénios sT e sTn no fenótipo maligno de células de cancro de bexiga bem como na resposta mediada pelo sistema imunitário à terapia com BCG. Metodologia. Para tal, foram utilizadas as linhas celulares de cancro da bexiga HT1376 e MCR, geneticamente modificadas por transdução com vetores codificantes para as sialiltransferases ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, de forma a expressar homogeneamente os antigénios sT ou sTn respetivamente. Estes modelos celulares foram estudados após confronto com BCG. O nível de BCG internalizado foi avaliado por citometria de fluxo. O perfil global de expressão genética dos modelos celulares antes e após incubação com BCG foi analisado pela tecnologia de microarray. O perfil de citocinas secretadas pelos modelos celulares após incubação com BCG, bem como de macrófagos estimulados pelo secretoma de células de cancro de bexiga que por sua vez foram estimuladas previamente por BCG, foi estudado pelo sistema multiplex de “imuno-esferas”. Resultados. A análise do transcritoma dos modelos celulares revelou que grupos de genes envolvidos em funções específicas foram modulados em paralelo nos dois modelos celulares, após transdução, independentemente da sialiltransferase expressa. Ou seja, em células que expressavam a sialiltransferase ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, os genes envolvidos na regulação da segregação cromossómica e na reparação do DNA foram consistentemente regulados negativamente. Genes descritos na literatura como marcadores para o cancro de bexiga foram também modulados. A incubação com BCG resultou numa tendência ao aumento da expressão de genes relevantes na preservação e estabilidade genómica e menor malignidade, no entanto, apenas em células que expressavam sT ou sTn. Entre as dez citocinas testadas, apenas a IL-6 e IL-8 foram expressas pelas linhas celulares de cancro da bexiga, com indução destas após estimulação com BCG, e principalmente em células que expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1. Em macrófagos, citocinas inflamatórias, tais como IL-1β, IL-6 e TNFα, e a citocina anti-inflamatória IL-10, foram induzidas apenas pelo secretoma de células de cancro da bexiga confrontadas com BCG, com maior relevância quando estas expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, prevendo a estimulação de macrófagos semelhantes aos de tipo M1 e uma melhor resposta à terapia com BCG. Conclusões. O efeito geral da expressão destas sialiltransferases e dos produtos enzimáticos sT ou sTn nas células de cancro de bexiga conduz a um fenótipo de maior malignidade. Contudo, a maior avidez de estas na produção de citocinas inflamatórias após confronto com BCG, bem como a maior capacidade de estimulação de macrófagos, predirá uma resposta à terapia com BCG mais eficaz em tumores que expressem os antigénios de TF sialilados. Tais conclusões são totalmente concordantes com os nossos mais recentes dados clínicos obtidos em colaboração, que mostram que em doentes com cancro de bexiga que expressam sTn respondem melhor a terapia BCG. ----------ABSTRACT: Background. Bladder cancer is a common malignancy representing the 6th and the 5th most incident cancer in Portugal and in Italy, respectively. More than half of the cases relapse within one year, requiring though a lifelong follow-up. Intravesical instillation of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (an attenuated strain of Mycobacterium bovis) represents an effective immunotherapy of bladder cancer, although many aspects of the interaction of BCG with cancer cells and host immune cells remain obscure. Bladder cancer cells often express the sialylated forms of the Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). However, it’s still unknown the sense of such expression in tumour malignancy and in the BCG therapy efficacy. Aim of the study. To investigate the role of the sT and sTn antigens on the malignant phenotype of bladder cancer cells and the immune mediated response to BCG therapy. Experimental. We have utilized populations of the bladder cancer cell lines HT1376 and MCR, genetically modified by transduction with the sialyltransferases ST3GAL1 or ST6GALNAC1 to express homogeneously sT or sTn antigens. The level of BCG internalized was assessed by flow cytometry. The whole gene expression profile of BCG-challenged or unchallenged bladder cancer cell lines was studied by microarray technology. The profile of cytokines secreted by BCG-challenged bladder cancer cells and that of macrophages challenged by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells was studied by multiplex immune-beads assay. Results. Transcriptome analysis of the sialyltransferase-transduced cells revealed that groups of genes involved in specific functions were regulated in parallel in the two cell lines, regardless the sialyltransferase expressed. Namely, in sialyltransferase-expressing cells, genes involved in the proper chromosomal segregation and in the DNA repair were consistently down-regulated, while genes reported in literature as markers for bladder cancer were modulated. BCG-challenging induced a tendency to up-regulation of the genes preserving genomic stability and reducing malignancy, but only in cells expressing either sT or sTn. Among the ten cytokines tested, only IL-6 and IL-8 were expressed by bladder cancer cell lines and up-regulated by BCG-challenging, mainly in sialyltransferases-expressing cells. In macrophages, inflammatory cytokines, such as IL-1β, IL-6 and TNFα, and the antinflammatory IL-10 were induced only by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells, particularly when expressing either sialyltransferase, predicting the stimulation of M1-like macrophages and a better response to BCG therapy. Conclusions. The general effect of the expression of the two sialyltransferases and their products in the bladder cancer cells is toward a more malignant phenotype. However, the stronger ability of sialyltransferase expressing cells to produce inflammatory cytokines upon BCG-challenging and to stimulate macrophages predicts a more effective response to BCG in tumours expressing the sialylated TF antigens. This is fully consistent with our recent clinical data obtained in collaboration, showing that patients with bladder cancer expressing sTn respond better to BCG therapy.

Cenários de alterações de uso e ocupação do solo até 2040 em Portugal Continental

Uma previsão de alterações futuras, assim como a simulação de cenários, podem sobretudo auxiliar e permitir uma antevisão de políticas de desenvolvimento de ordenamento do território. O desenvolvimento dos Sistemas de Informação Geográfica (SIG) nesta área permite, em conjunto com modelos espaciais, a simulação de cenários alternativos de uso e ocupação do solo com base em alterações passadas. O presente estudo consiste, numa primeira parte, na previsão em termos quantitativos do uso e ocupação do solo em Portugal Continental, utilizando um modelo de Markov para os anos de 2020, 2030 e 2040, tendo como base as alterações ocorridas entre 1990 e 2000. Este modelo permite prever a mudança de forma quantitativa do uso e ocupação do solo com base nas alterações do período imediatamente anterior. Estas previsões foram feitas para todo o território continental e detalhadamente para cada uma das cinco regiões NUTS II. Numa segunda parte, o modelo espacial de simulação de alteração de uso e ocupação do solo para o ano de 2040 foi realizado com recurso a cadeias de Markov com Autómatos Celulares e com base em Regressão Logística. Foi através do modelo, baseado em Autómatos Celulares, e após validação positiva deste, que se simularam três cenários futuros: (1) cenário de sustentabilidade ambiental; (2) cenário de desenvolvimento industrial; e (3) cenário de desertificação utilizando como referência a previsão para 2040, considerando o cenário Business-as-Usual.

Non-cell autonomous neuroprotective effect of carbon monoxide : microglia-to-neuron communication

RESUMO: A isquémia cerebral é uma das doenças mais predominantes a nivel mundial, sendo uma das principais causas de mortalidade e invalidez. Parte da propagação de dano no cérebro é causado por inflamação descontrolada, causada principalmente por disfunção da microglia. Desta forma, existe a necessidade de tentar desenvolver estratégias para melhor compreender e modular as acções destas células. O monóxido de carbono (CO), é uma molécula endógena com provas dadas como anti-neuroinflamatório em vários modelos. Assim, o principal objectivo do trabalho foi o estudo do CO como um modulador da acção da microglia, com principal foco dado à comunicação entre estas células e neurónios, tentando entender se existe um efeito neuroprotector por inibição da inflamação. Um protocolo de meio condicionado foi estabelecido usando as linhas celulares BV2 e SH-SY5Y, de microglia e neurónio. A molécula CORM-A1, que liberta expontaniamente CO, foi usada como método de entrega da molécula às celulas. Demonstrámos que o pre-tratamento de células BV2 com CORM-A1 gera neuroprotecção já que reduz a morte celular de neurónios SH-SY5Y quando são incubados com meio condicionado de microglia activada em conjunto com o pró-oxidante t-BHP (tert-butil hidroperóxido). Assim, considerámos que o CO promove neuroprotecção ao inibir as acções inflamatórias da microglia. O papel anti-inflamatório da molécula CORM-A1 foi confirmado quando se verificou que pré-tratamento desta molécula em microglia BV2 limita a secreção de TNF-α mas estimula a secreção de IL-10. Por último, a CORM-A1 induziu a expressão do receptor da microglia CD200R1, molécula que participa na comunicação neurónio-microglia e fundamental para a modulação das acções inflamatórias destas últimas. Em suma, o nosso trabalho reforçou as propriedades anti-neuroinflamatórias do CO e uma capacidade de modular viabilidade neuronal através do seu efeito a nível de comunicação célula-célula. ---------------------------- ABSTRACT: Brain ischemia is a widespread disease worldwide, being one of the main causes of mortality and permanent disability. A portion of the damage that ensues following the ischemic event is caused by unrestrained inflammation, which is mainly orchestrated by exacerbated microglial activity. Hence, developing strategies for modulating microglial inflammation is a major concern nowadays. The endogenous molecule carbon monoxide (CO) has been shown to possess anti-neuroinflammatory properties using in vitro and in vivo approaches. Thus, our objective was to study CO as modulator of microglial activity, in particular in what concerns their communication with neurons, by promoting neuronal viability and limiting inflammatory output of activated microglia. A conditioned media strategy was established with BV2 microglia and SH-SY5Y neurons as cell models. CO-releasing molecule A1 (CORM-A1), a compound that releases CO spontaneously, was used as method of CO delivery to cells. We found that CORM-A1 pre-treatment in BV2 cells yields neuroprotective results, as it limits cell death when SH-SY5Y neurons are challenged with conditioned media from LPS-activated microglia and the pro-oxidant t-BHP (tert-butyl-hydroperoxide). Thus, we assumed carbon monoxide promotes neuroprotection via inhibition of microglial inflammation, displaying a non-cell autonomous role. CORM-A1 pre-treatment limited inflammation by inhibiting BV2 secretion of TNF-α and stimulating IL-10 production. These results reinforce that CO’s anti-inflammatory role confers neuroprotection, as the alterations in these cytokines occur concurrently with the increase in SH-SY5Y viability. Finally, we showed for the first time that carbon monoxide promotes the expression of CD200R1, a microglial receptor involved in neuron-glia communication and modulation of microglia inflammation. Further studies are necessary to clarify this role. Altogether, other than just highlighting CO as an anti-inflammatory and neuroprotective molecule, this work set the foundation for disclosing its involvement in cell-to-cell communication.

Study of glycosidic changes in lung cancer: potential effectors in hematogenous metastasis

RESUMO: O cancro do pulmão (LC), uma das principais causas de mortalidade relacionada com cancro em Portugal, pode levar à formação de metástases hematogénicas. A adesão das células tumorais ao endotélio é considerada um dos passos fundamentais envolvidos na metástase. Em células sanguíneas, esta adesão é mediada por ligandos de E-selectina (E-SL), glicoproteínas ou glicolípidos decorados principalmente com sialyl-Lewis x (sLex) e sialyl-Lewis a (sLea). Tem sido descrito a expressão destes antigénios em LC, contudo o seu papel funcional em permitir a adesão das células de LC ao endotélio é ainda pouco compreendido. Foram analisadas amostras emparelhadas normais e tumorais de pacientes com cancro de pulmão de não-pequenas células (NSCLC) e três linhas celulares de LC. Immunoblotting assays com anti-sLex/sLea e molécula quimérica de E-selectina demonstraram que tecidos tumorais de LC sobreexpressam significativamente E-SL e resultados de citometria de fluxo demonstraram uma expressão elevada de E-SL nas linhas celulares. Para compreender o mecanismo da sobreexpressão de E-SL em tecidos tumorais e linhas celulares de LC, foi analisada a expressão de genes envolvidos na biossíntese de E-SL, nomeadamente FUT3, FUT4, FUT6, FUT7, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, β4GALT1, GCNT1 e GALNT3. Observou-se a sobreexpressão das fucosiltransferases FUT3, FUT6 e FUT7 em tecidos tumorais de LC e FUT3 em linhas celulares de LC, sendo que neste último, esta expressão é correlacionada com um aumento da adesão das células de LC às selectinas endoteliais. Foi observado que uma baixa expressão de FUT4 em tecidos tumorais está associada com estadios menos avançados de NSCLC. Foram analisadas ainda proteínas decoradas com sLex/sLea, tendo-se identificado como E-SL o antigénio carcinoembrionário em NSCLC. Em resumo, esta tese contribuiu para uma melhor compreensão das alterações glicosídicas e moléculas que podem influenciar a progressão tumoral do LC, podendo permitir identificar futuramente novos biomarcadores de diagnóstico/prognóstico e potenciais alvos terapêuticos para o NSCLC.--------------------------ABSTRACT: Lung cancer (LC), one of the major causes of mortality related to cancer in Portugal, may lead to hematogenous metastasis. Adhesion of cancer cells to endothelium is considered one of the crucial steps involved in metastasis. In blood cells, this adhesion is initiated by endothelial selectin ligands (E-SL) that are glycoproteins or glycolipids decorated mostly with sialyl-Lewis x (sLex) and sialyl-Lewis a (sLea). While LC has been described as expressing these sialyl Lewis antigens, its functional role in allowing LC adhesion to endothelium is still poorly understood. We analyzed paired tumor and normal tissues samples from non-small cell lung cancer (NSCLC) patients and three LC cell lines. Immunoblotting assays with anti-sLex/sLea and E-selectin chimera demonstrated that LC tumor tissues significantly overexpress E-SL and flow cytometry results indicated that E-SL are also abundantly expressed in LC cell lines. To understand the mechanism behind the overexpression of E-SL in LC tissues and cell lines, we analyzed the expression of genes involved in its biosynthesis, namely FUT3, FUT4, FUT6, FUT7, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, β4GALT1, GCNT1 and GALNT3. It was observed the overexpression of fucosyltransferases FUT3, FUT6 and FUT7 in LC tumor tissues and FUT3 in LC cell lines, being this last one correlated with an increased reactivity of the LC cells to endothelial selectins. It was described that low expression of FUT4 in tumor tissues is correlated with early stages of NSCLC. We also analyzed scaffolds proteins of sLex/sLea and it was identified the carcinoembryonic antigen as an E-SL in NSCLC. In summary, this thesis contributed to a better understanding of the glycosidic changes and molecules that can influence tumor progression of LC, allowing identifying in the future new diagnosis/prognosis biomarkers and potential therapeutic targets for NSCLC.

Comportamento biológico "in vitro" de "novas espécies" de Leishmania no Velho Mundo

As leishmanioses são um grupo de doenças causadas pelo parasita protozoário Leishmania sp. Na Bacia mediterrânica, Leishmania infantum, é a principal espécie causadora de leishmaniose visceral, a forma mais severa da doença, sendo L. major um dos agentes etiológicos da leishmaniose cutânea. Apesar de se considerar que estes parasitas têm uma reprodução essencialmente clonal, nos últimos 20 anos tem vindo a ser descrita a recombinação genética entre diferentes estirpes e espécies, com ocorrência de híbridos naturais, quer no Velho quer no Novo Mundo. Recentemente, em Portugal, foram isoladas e identificadas pela primeira vez, estirpes híbridas de L. infantum/L. major. O presente estudo teve como principais objetivos, a pesquisa de “novas espécies” de Leishmania e a análise do comportamento “in vitro” de estirpes parentais e híbridas de L. infantum e L. major. Numa primeira parte do trabalho efetuou-se a cultura e pesquisa de DNA de Leishmania sp., em amostras de sangue medular de 229 cães provenientes de uma região endémica de Portugal, utilizando diferentes marcadores moleculares (kDNA, ITS1 e SSU rRNA) e protocolos de PCR. Não foi encontrado DNA de espécies híbridas, tendo-se no entanto, identificado DNA de Leishmania sp. em 45,85% (105/229) das amostras, incluindo cães sem sinais clínicos. Na segunda parte do trabalho, realizaram-se diversos ensaios “in vitro” com estirpes híbridas naturais L. infantum/L. major e parentais L. infantum e L. major. Em condições normais de crescimento, observou-se um padrão de crescimento distinto para cada estirpe estudada. Em condições de “stress” oxidativo, destacou-se uma diferença significativa entre as duas estirpes híbridas estudadas. Em condições de “stress” nutricional, as estirpes não apresentaram diferenças entre si. Após avaliação da suscetibilidade das estirpes na presença de Anfotericina B, todas se mostraram suscetíveis, com concentrações inibitórias (CI50) entre 0.21 e 1.15 μg/mL. Após infeção em linhas celulares monocíticas, não se verificaram diferenças estatisticamente significativas na taxa e intensidade de infeção das estirpes híbridas em comparação às putativas parentais. Os resultados obtidos, contribuíram para um melhor conhecimento sobre o comportamento biológico destas estirpes híbridas naturais L. infantum/L. major. Estas demonstraram um comportamento “in vitro” intermédio, relativamente às estirpes parentais. Estes resultados poderão servir de base para o desenvolvimento de outros estudos com estas “novas espécies”, nomeadamente estudos de patogenicidade “in vivo” e o papel de biomarcadores de virulência, que permitam um potencial prognóstico da infeção e avaliação do seu risco epidemiológico.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.