Síntese e caracterização das propriedades fotofísicas de flavotionas

O presente trabalho descreve a síntese de 10 flavotionas e a sua caracterização espectroscópica e fotofísica, incluindo a determinação dos rendimentos quânticos de formação de tripleto e de produção de oxigénio singuleto. Os dados obtidos foram correlacionados com cálculos de orbitais moleculares de forma a racionalizar o efeito do padrão de substituição de grupo OH (hidroxilo) nas propriedades espectroscópicas e fotofísicas das flavotionas. Foi ainda estudada a fotodegradação dos compostos, isolados e identificados os fotoprodutos obtidos em diferentes meios, e proposto um mecanismo para a actuação destes compostos como fotosensitizadores. E finalmente, utilizar este conhecimento para desenvolver pesticidas activados pela absorção de luz, mais eficientes e amigos do ambiente.

Caracterização da resistência à antracnose dos frutos verdes do cafeeiro

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Biologia, especialidade Biologia Vegetal,pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Purificacion de antigenos somaticos del Paracoccidioides brasiliensis. Estudio preliminar

Se describen los procedimientos de purificación empleados para la separación de las fracciones antigénicas a partir de un material somático obtenido por rotura de células levaduras completas de P. brasiliensis. Dichas fracciones mostraron ser proteínas con pesos moleculares de 66 y 85 Kd; la primera de ellas reaccionó con sueros específicos produciendo una banda de precipitado idéntica a una de las 3 desarrolladas por el antígeno total. Los resultados señalan la posibilidad de obtener antígenos purificados, químicamente identificados y cuyo uso pudiera, en el futuro, representar ventajas para el diagnóstico serológico de la paracoccidioidomicosis, permitiendo separar, repetidamente, solo aquel componente reconocidamente activo.

Bioecologia e caracterização molecular de Bulinus globosus de Angola

Parasitologia médica

Obtenção e avaliação de antígenos de Aspergillus fumigatus

Antígenos de três amostras de A. fumigatus (354, 356, JIG) e antissoro contra a mistura destes antígenos foram produzidos e avaliados imunoquimicamente. Os antígenos de filtrado de cultura foram obtidos após concentração com acetona conforme adaptação da técnica descrita por Coleman & Kaufman. Em prova de ID obteve-se 100% de positividade com os soros de pacientes com aspergilose estudados. Com relação aos soros heterólogos encontramos reatividade com soro de um paciente com candidíase e com soro de um paciente com histoplasmose; foi encontrado padrão idêntico de resposta quando se utilizou o antígeno de referência. O antissoro foi titulado por ID, CIE e RFC MI contra o antígeno específico apresentando títulos respectivos de 1:32, 1:32 e 1:128, e utilizado para reagir contra o mesmo antígeno por IEF, demonstrando 8 linhas de precipitação, sendo 5 na região anódica e 3 na região catódica. O perfil de bandeamento do antígeno em eletroforese utilizando gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 12,5% apresentou-se complexo com 26 sub-unidades protéicas, cujos pesos moleculares variaram de 18 a > 100kDa. Quando estes componentes foram eletrotransferidos e reagidos com o antissoro específico ("immunoblotting"), verificou-se imunogenicidade em todas as frações bandeadas.

Interacção Parasita-Hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a fármacos

RESUMO As leishmanioses são doenças causadas por um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, do género Leishmania. Os parasitas são transmitidos aos hospedeiros vertebrados por dípteros pertencentes à sub-família Phlebotominae. Devido à inexistência de vacinas a quimioterapêutica continua a representar o único mecanismo de prevenção e controlo. Os fármacos de primeira linha para o tratamento da leishmaniose visceral continuam a ser os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B (AMB). A AMB lipossómica está a ser cada vez mais utilizada como 1ª linha. O conhecimento do(s) mecanismo(s) utilizados pelos parasitas, responsáveis pela resistência, é fundamental de modo a permitir o desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania que possam substituir e/ou complementar os fármacos existentes, de uma forma eficaz assim como contribuir para o desenvolvimento de metodologias para avaliar e monitorizar a resistência. Espera-se do modelo animal a reprodução da infecção na Natureza. Os modelos canino e murino têm ajudado na compreensão dos mecanismos responsáveis pela patogénese e pela resposta imunitária à infecção por Leishmania. Sendo o cão o principal hospedeiro da infecção por L. infantum e o principal reservatório doméstico da leishmaniose visceral humana, procedeu-se à caracterização da evolução da infecção experimental em canídeos de raça Beagle através da análise clínica, hematológica, histopatológica, parasitária, assim com através da resposta imunitária desenvolvida. As alterações hematológicas observadas foram as associadas à leishmaniose visceral: anemia, leucopenia, trombocitopenia com aumento das proteínas totais e da fracção gama-globulina, e diminuição da albumina. Histologicamente observou-se nos órgãos viscerais uma reacção inflamatória crónica, acompanhada por vezes da formação de granulomas ricos em macrófagos. Apesar de todos os animais terem ficado infectados (confirmado pela presença do parasita nos vários tecidos e órgãos recolhidos na necrópsia), os únicos sinais clínicos observados transitoriamente foram adenopatia e alopécia. As técnicas moleculares foram significativamente mais eficazes na detecção do parasita do que os métodos parasitológicos convencionais. As amostras não invasivas (sangue periférico e conjuntiva) mostraram ser significativamente menos eficazes na detecção de leishmanias. No nosso modelo experimental não se observou a supressão da resposta celular ao antigénio parasitário e confirmou-se que, apesar de não protectora, a resposta humoral específica é pronunciada e precoce. A bipolarização da resposta imunitária Th1 ou Th2, amplamente descrita nas infecções experimentais por L. major no modelo murino, não foram observadas neste estudo. O facto dos animais não evidenciarem doença apesar do elevado parasitismo nos órgãos viscerais poderá estar relacionado com a expressão simultânea de citocinas de ambos os tipos Th1 e Treg, no baço, fígado, gânglio, medula óssea e sangue periférico. Neste estudo também se caracterizou o efeito da saliva do vector Phlebotomus perniciosus na infecção experimental de murganhos BALB/c com estirpes de L. infantum selvagem e tratada com AMB, inoculadas por via intradérmica. A visceralização da infecção ocorreu após a utilização da via de administração do inóculo que mais se assemelha ao que ocorre na Natureza. Apesar da disseminação dos parasitas nos animais co-inoculados com extracto de uma glândula salivar ter sido anterior à do grupo inoculado apenas com parasitas, não se detectaram diferenças significativas na carga parasitária, entre os três grupos, ao longo do período de observação pelo que, embora a saliva do vector esteja descrita como responsável pela exacerbação da infecção, tal não foi observado no nosso estudo. O aumento de expressão de citocinas esteve relacionado com o aumento do parasitismo mas, tal como no modelo canino, não se observou bipolarização da resposta imunitária. Os animais dos três grupos infectados parecem ter desenvolvido nos diferentes órgãos uma resposta mista dos tipos Th1 e Th2/Treg. Contudo, verificou-se a predominância da expressão Th1 (TNF-α), no fim do período de observação, o que pode estar relacionado com a resolução da infecção. Por outro lado, a presença de parasitas na pele dos animais inoculados com a estirpe L. infantum tratada com AMB permite colocar a hipótese da existência de parasitas resistentes na Natureza e destes poderem ser transmitidos. Após se ter verificado que a estirpe de L. infantum tratada com AMB tinha a capacidade de infectar e visceralizar no modelo murino, analisou-se o seu comportamento em dois dos principais vectores de L. infantum, Lutzomyia longipalpis e P. perniciosus. Os parasitas tratados com AMB apresentaram uma menor capacidade de permanecerem no interior do vector assim como um desenvolvimento mais lento apontando para uma menor capacidade de transmissão das estirpes resistentes a este fármaco, pelo que o tratamento com AMB poderá ser favorável à prevenção e controlo através da interrupção do ciclo de vida do parasita. De modo a determinar in vitro a susceptibilidade de Leishmania aos diferentes fármacos utilizados na terapêutica da leishmaniose humana e canina (Glucantime®, Fungizone®, miltefosine e alopurinol) comparou-se o sistema de promastigotas axénicos com o sistema amatigota-macrófago. Verificou-se que, para as estirpes estudadas, os resultados de ambos os sistemas não apresentavam diferenças significativas sendo a utilização do primeiro mais vantajosa ao ser menos moroso e de mais fácil execução. Seleccionaram-se estirpes quimio-resistentes in vitro, por exposição prolongada a doses crescentes de AMB, tendo-se verificado que os parasitas tratados, apresentaram uma menor susceptibilidade do que os não tratados à acção dos fármacos estudados, com excepção do alopurinol. A diminuição da susceptibilidade das estirpes aos fármacos utilizados poderá facilitar a dispersão de parasitas multiresistentes. Sendo a apoptose um dos mecanismos utilizados pelos parasitas para evitar a indução de uma resposta imune por acção de compostos anti- Leishmania, determinou-se o número de amastigotas apoptóticos assim como a produção de TNF-α e IL-10 pelos macrófagos tratados. Concluiu-se que os compostos conseguiram suprimir a produção de IL-10, inibidora da activação dos macrófagos, contudo nem a produção da citocina pro-inflamatória TNF- α nem a apoptose pareceram ser os principais mecanismos responsáveis à sobrevivência dos parasitas ao contacto com os fármacos.

Febre purpúrica brasileira, virulência em modelo animal do Haemophilus Aegyptius (H. influenzae biogrupo aegyptius)

Febre Purpúrica Brasileira (FPB) é causada por cepas invasoras de Haemophilus aegyptius (H. influenzae biogrupo aegyptius, Hae). Estas cepas invasoras foram diferenciadas de cepas de Hae associadas apenas a conjuntivites (cepas não invasoras) através de marcadores moleculares específicos. Modelo de ratos recém nascidos depletados de complemento foi aplicado ao estudo de cepas de Hae, associadas e não associadas a FPB, com o objetivo de se caracterizar seus potenciais de virulência. Com dose infectante de 10(5) células, as cepas invasoras causaram bacteriemia em 80-100% dos ratos inoculados,.e a magnitude da bacteriemia variou de 10(2,5±0,49) a > 10(4,69) ufc/ml de sangue. Usando a mesma dose infectante as cepas controles não causaram bacteriemia frequente (0 a 50%) e a magnitude variou de 0 a 10(3,69±0,53) ufc/ml de sangue. As doses infectantes capazes de causar bacteriemia em 50% dos ratos inoculados (DB50%) para as cepas invasoras de Hae variaram de < 10³ a 10(4,2) bactérias, enquanto que para as cepas não invasoras, as DB50% variaram de 10(6,2) a > 10(7,3) bactérias. Imunização passiva com antissoros produzidos com cepas invasoras demonstrou que os ratos foram protegidos das bacteriemias causadas pelas cepas homólogas, mas não da infecção causada pela cepa heteróloga. Comparando a bacteriemia causada pelas cepas de Hae com a bacteriemia causada pelo H. influenzae b, cepa Eagan (Hib), foi demonstrado o maior potencial de invasibilidade de Hib. Este modelo animal demonstrou ser útil para esclarecer o maior potencial de virulência das cepas invasoras de Hae.

Minimização do ruído em imagens de mamografia por emissão de positrões através da optimização do tempo de aquisição e do tamanho de voxel

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Lenhina e o seu contributo na àrea alimentar

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Estudo dos genes humanos tipo Mob: hsMo4A e hsMob4B

Dissertação apresentada para a obtenção do grau de Doutor em Biologia,especialidade Genética Molecular pela Universidade Nova de Lisboa,Faculdade de Ciências e Tecnologia

Aspectos imunológicos do sistema enzimático fenoloxidase de Schistosoma mansoni

O sistema enzimático fenoloxidase (EC 1.10.3.1, EC 1.10.3.2) está amplamente distribuido entre os seres vivos, tendo sido descrito em diferentes espécies do reino animal e vegetal. Apesar de desempenhar um papel fundamental na formação da cápsula ou parede dos ovos de trematódeos, o sistema enzimático fenoloxidase (PO) tem sido pouco estudado nesses organismos. No presente trabalho são apresentados os resultados iniciais de imunizações de coelhos contra PO de fêmeas adultas de S. mansoni e tirosinase de cogumelo (Sigma). As análises imunológicas, realizadas através de imunodifusão dupla (teste de Ouchterlony) e imunoeletroforese, revelaram identidade imunitária parcial entre a PO de machos e fêmeas. Não se observou reação cruzada entre os antissoros de coelhos imunizados contra PO e aqueles com tirosinase, indicando que, embora os sítios catalíticos de ambas as enzimas devam ser semelhantes, já que atuam sobre os mesmos substratos, os determinantes antigênicos devem ser diferentes. Os resultados descritos no presente trabalho representam um primeiro passo no sentido da purificação das isoenzimas da fenoloxidase e sua posterior utilização ao estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na esclerotização da parede dos ovos de S. mansoni.

CONTRIBUIÇÃO PARA O DIAGNÓSTICO MOLECULAR DAS ONICOMICOSES

Resumo Onicomicose ou infecção fúngica das unhas das mãos ou dos pés pode ser provocada por fungos que invadem primariamente a lâmina ungueal saudável. Embora existam outros agentes, como por exemplo bactérias, que podem causar infecções ungueais, as infecções causadas por fungos são mais frequentes e são consideradas uma das principais onicopatias do homem. Os efeitos psicológicos e emocionais que resultam dos aspectos clínicos da onicomicose podem ser marcantes e ter um impacto significativo na qualidade de vida dos portadores. É uma doença com grande potencial crónico associada a uma séria dificuldade terapêutica, sendo estes os principais factores agravantes do seu prognóstico. Conforme a extensão do comprometimento e a porção da unha envolvida na onicomicose, a infecção causada por fungos pode ser classificada em 5 tipos: onicomicose subungueal distal e lateral, onicomicose superficial leitosa, onicomicose subungueal proximal, onicomicose com distrofia total e onicomicose por candidose. São causadas por diferentes agentes etiológicos sendo que os mais comuns são os fungos dermatófitos (80 a 90%), seguidos pelas leveduras (5 a 17%) e fungos filamentosos não dermatófitos (2 a 12%). Neste trabalho foram estudadas 54 amostras recolhidas de unhas de doentes com hipótese clínica de onicomicose, das quais 25,93% (14/54) pertenciam a indivíduos do sexo masculino e 74,07% (40/54) a indivíduos do sexo feminino. As técnicas convencionais de diagnóstico são morosas e muitas vezes de difícil caracterização a nível fenotipico, o que condiciona grandemente a implementação da terapêutica adequada. O presente trabalho teve como principal objectivo a aquisição de conhecimentos que permitissem um correcto diagnóstico micológico das onicomicoses, através do isolamento e identificação das espécies de fungos causadoras de infecção. De uma forma global, consistiu inicialmente no isolamento e posteriormente na identificação dos agentes etiológicos de onicomicoses, utilizando para tal metodologias convencionais e moleculares. Foi realizado o diagnóstico laboratorial baseado no exame directo e na cultura de fragmentos de unhas provenientes de doentes com infecção. Paralelamente, foi extraído o DNA fúngico das mesmas amostras clínicas que, após amplificação da região ITS dos genes ribossómicos foi utilizado para confirmação e comparação dos resultados. Foi igualmente estudada a ocorrência de fungos não dermatófitos responsáveis por onicomicose. Os métodos moleculares de diagnóstico podem não só constituir uma alternativa mais rápida de diagnóstico micológico como também, por serem mais sensíveis, permitir a detecção de espécies que, por serem de crescimento fastidioso, não se desenvolvem em cultura.

CONTRIBUIÇÃO PARA O DIAGNÓSTICO MOLECULAR DAS ONICOMICOSES

Onicomicose ou infecção fúngica das unhas das mãos ou dos pés pode ser provocada por fungos que invadem primariamente a lâmina ungueal saudável. Embora existam outros agentes, como por exemplo bactérias, que podem causar infecções ungueais, as infecções causadas por fungos são mais frequentes e são consideradas uma das principais onicopatias do homem. Os efeitos psicológicos e emocionais que resultam dos aspectos clínicos da onicomicose podem ser marcantes e ter um impacto significativo na qualidade de vida dos portadores. É uma doença com grande potencial crónico associada a uma séria dificuldade terapêutica, sendo estes os principais factores agravantes do seu prognóstico. Conforme a extensão do comprometimento e a porção da unha envolvida na onicomicose, a infecção causada por fungos pode ser classificada em 5 tipos: onicomicose subungueal distal e lateral, onicomicose superficial leitosa, onicomicose subungueal proximal, onicomicose com distrofia total e onicomicose por candidose. São causadas por diferentes agentes etiológicos sendo que os mais comuns são os fungos dermatófitos (80 a 90%), seguidos pelas leveduras (5 a 17%) e fungos filamentosos não dermatófitos (2 a 12%). Neste trabalho foram estudadas 54 amostras recolhidas de unhas de doentes com hipótese clínica de onicomicose, das quais 25,93% (14/54) pertenciam a indivíduos do sexo masculino e 74,07% (40/54) a indivíduos do sexo feminino. As técnicas convencionais de diagnóstico são morosas e muitas vezes de difícil caracterização a nível fenotipico, o que condiciona grandemente a implementação da terapêutica adequada. O presente trabalho teve como principal objectivo a aquisição de conhecimentos que permitissem um correcto diagnóstico micológico das onicomicoses, através do isolamento e identificação das espécies de fungos causadoras de infecção. De uma forma global, consistiu inicialmente no isolamento e posteriormente na identificação dos agentes etiológicos de onicomicoses, utilizando para tal metodologias convencionais e moleculares. Foi realizado o diagnóstico laboratorial baseado no exame directo e na cultura de fragmentos de unhas provenientes de doentes com infecção. Paralelamente, foi extraído o DNA fúngico das mesmas amostras clínicas que, após amplificação da região ITS dos genes ribossómicos foi utilizado para confirmação e comparação dos resultados. Foi igualmente estudada a ocorrência de fungos não dermatófitos responsáveis por onicomicose. Os métodos moleculares de diagnóstico podem não só constituir uma alternativa mais rápida de diagnóstico micológico como também, por serem mais sensíveis, permitir a detecção de espécies que, por serem de crescimento fastidioso, não se desenvolvem em cultura.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus neoformans

As micoses estão incluídas entre as doenças infecciosas mais ubíquas em todo o mundo, afectando todos os estratos sociais e todos os grupos etários numa variedade de manifestações superficiais, cutâneas, subcutâneas e sistémicas. Um diagnóstico rápido e eficaz destas doenças, com uma correcta identificação da espécie fúngica responsável pela infecção, é essencial para um planeamento do tratamento mais eficaz para o doente infectado. Tem-se registado um aumento da incidência das infecções fúngicas também em consequência do aumento do número de casos de doentes imunodeprimidos, devido particularmente à crescente utilização de terapêuticas imunossupressivas, procedimentos médicos invasivos, prescrição de tratamentos prolongados, entre outros aspectos. O aparecimento da epidemia da Imunodeficiência Humana no início da década de 80, causada pelo vírus VIH, contribuiu também decisivamente para o aumento das infecções fúngicas oportunistas. A Criptococose é uma infecção fúngica, predominantemente oportunista e com uma distribuição epidemiológica mundial, causada por leveduras encapsuladas do género Cryptococcus. A espécie clinicamente mais relevante é Cryptococcus neoformans, cujas estirpes têm sido tradicionalmente classificadas em cinco serotipos relacionados com os antigénios da respectiva cápsula polissacárida: A (C. neoformans var. grubii); D (C. neoformans var. neoformans); B e C (actualmente reconhecidos como uma espécie distinta mas filogeneticamente próxima, C. gattii); e AD (estirpes híbridas). O presente trabalho teve como principal objectivo determinar retrospectivamente os tipos moleculares de uma colecção alargada de estirpes de C. neoformans, isoladas e mantidas durante os últimos 18 anos no Laboratório de Micologia do IHMT/UNL. A maioria das estirpes foi isolada de doentes imunodeprimidos com criptococose, existindo também algumas estirpes de origem ambiental. Foi utilizada a técnica de PCR-RFLP do gene URA5 para diferenciar as estirpes de Cryptococcus neoformans, tendo sido detectados quatro tipos moleculares: VN1 e VN2 (relacionados com C. neoformans var. grubii, serotipo A); VN3 (relacionado com as estirpes híbridas de serotipo AD); e VN4 (relacionado com C. neoformans var. neoformans, serotipo D). Não foram encontrados entre os isolados de origem clínica perfis de restrição correspondentes aos tipos moleculares VG1, VG2, VG3 e VG4 (relacionados com C. gattii, serotipos B e C). O tipo molecular VN1 foi o mais abundante entre os isolados de origem clínica (45% dos isolados), seguindo-se o grupo de estirpes híbridas do tipo molecular VN3 (31%). Os tipos moleculares menos abundantes entre os isolados foram o VN2 (12%) e VN4 (12%). A estandardização do método de tipagem molecular utilizado neste trabalho permite comparar os resultados obtidos com os de outros estudos epidemiológicos semelhantes, realizados noutras regiões do globo e publicados em anos recentes, contribuindo para um conhecimento melhorado da epidemiologia global deste importante fungo patogénico. Em Portugal obteve-se uma percentagem mais elevada de isolados dos grupos moleculares VN1 e VN3 em relação a outros países da Europa e América Latina, em que os tipos mais abundantes são VN1 e VN2. Nestas mesmas regiões, o tipo molecular VN4, relacionado com as estirpes de C. neoformans var. neoformans do serotipo D, é muito raro. Esta variedade é mais comum em zonas mediterrâneas e está muito associada a casos clínicos de infecções cutâneas associadas a infecções do Sistema Nervoso Central. Este tipo molecular parece ser também significativamente mais abundante no nosso país.

Sistemas elastoméricos de rede aleatória: caracterização molecular, estrutural e dinâmica

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Doutor em Engenharia de Materiais, especialidade de Materiais Poliméricos, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia.